KR100895699B1 - 상피세포를 포함하는 세포 조성물을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

분화된 외분비선 조직으로부터 오르가노이드체로의 줄기세포의 집합을 포함하는 상피세포를 생산하기 위한 방법 및 오르가노이드체 또는 그로부터 성장하는 조직체의 적어도 한 부분이 상피 세포로 분화하는 것이 설명된다. 또한 배양기구, 특히 분화된 상피 세포의 발생을 위한 배양 기구가 설명된다.

상피세포, 오르가노이드체, 조직체, 분화, 배양배지, 줄기세포, 배양기구, 세포집합.

Description

상피세포를 포함하는 세포 조성물을 생산하는 방법{Process for Producing a Cellular Composition Containing Epithelial Cells}

본 발명은 상피 세포(epithelial cells)를 생산하는 방법, 상피 세포를 배양하는 방법, 상피 세포를 포함하는 세포 조성물(cellular composition), 상피 세포를 위한 배양 기구 및 상기 세포 조성물의 이용에 관한 것이다.

상피 조직은 일반적으로 다세포 유기체(organisms)의 모든 외부 및 내부 표면 위에 커버층(cover layers)을 형성하고, 한편으로는 기계적 보호 및 덮는 기능을 하며 다른 한편으로는 덮힌 조직과 주변 사이의 물질 교환을 좌우하는 상피 세포의 조직이다. 상피 조직은 대개 척추동물에서 다층(multilayered)으로 존재하며, 선택적으로 다양한 형태의 상피세포로 이루어져 있다. 외부 상피 세포는 기계적 마모에 의해 또는 죽어감으로(dying off) 제거되는 반면에 상피 세포는 분할 능력을 가지는 기저 층(basal layer)으로부터 내부 조직에서 복제된다.

상피 세포는 생명 공학 및 의학, 특히 개별 세포들을 포장하거나 세포 배양, 유기체에서 조직을 덮거나, 상처나 수술에 의해 발생할 수 있는 조직에서의 간격(gap)을 채우는 등의 이식 의학에서 매우 중요하다. 소위 특정 기원의 세포를 특정 기능 및/또는 형태를 가진 조직으로 만드는 조직 공학에서, 상피 세포는 인공적으로 생산되는 생물학적 세포의 조직에서 특히 캐리어 또는 매트릭스(matrix)의 기능을 할 수 있기 때문에 특히 중요하다.

그러나 유기체에서의 자연적 생산은 대개 상기 기저층으로 제한되는 사실로부터 이전의 상피세포의 사용에 문제점이 있으며, 예를 들어 조직공학에서는 이용이 어렵다. 더욱이, 이종 조직(heterologous)의 상피 세포를 가지고 세포 조제를 형성하는 경우에 이식 후의 거부 반응이 유기체에서 발생할 수 있다.

주요 상피 세포들은 또한 배아줄기세포(embryonic stem cells)의 전분화능(pluripotent)의 분화 능력에 기해서, 배아줄기세포로부터 분화에 의해 발생할 수 있다. 그러나 배아줄기세포로부터 상피 세포의 발생은 윤리적 이유 및 배아줄기세포의 제한된 유용성 때문에 제한이 따르며, 과거 실험들에서 아직 만족할 만한 결과가 달성되지 않고 있다.

본 발명의 목적은 종래 공정들의 불리한 점들을 극복하고, 특히 기저층 또는 배아줄기세포로부터 상피 세포를 얻는 것과 관련된 제한들을 극복할 수 있게 하는 상피 세포를 생성하는 개선된 공정(process)을 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 또한 낮은 비용으로 생산할 수 있고, 넓은 응용 범위를 가지는 개선된 세포 조성물(cellular composition)을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상피 세포를 생성하는 배양기구(cultivation device)를 제공하는 것이다.

이러한 목적들은 청구항 1의 특징을 가진 공정, 청구항 22의 특징을 가진 세포 조성물, 청구항 25의 특징을 가진 배양기구에 의해 성취된다. 본 발명의 바람직한 실시예 및 적용은 종속항으로부터 유도된다.

공정에 있어서, 상기 지적된 실시예는 유기체의 분화된 외분비선(exocrine gland) 조직으로부터 삼차원의 세포 집합체(cell aggregates)로 분리된(isolated) 줄기 세포의 집합체(aggregation of stem cell)에 의해, 그리고 그 후 적어도 한 부분의 세포 집합체가 상피세포로 분화됨으로써 실현된다. 세포 집합체는 또한 아래에서 오르가노이드체(organoid body)로 언급된다. 이러한 공정의 특별한 이점은 기저층 또는 배아줄기세포의 종래의 이용으로부터 상피 세포의 발생을 완전하게 분리하는 것에 있다.

본 발명자들은 외분비선 조직으로부터 분리된 줄기 세포들은 전분화능(pluripotent)이고, 높은 분열 능력과 강한 성장을 보인다는 것을 관찰했다. 그러므로 그들은 세포를 상피세포로 분화시키기 위한 출발 물질을 대규모로 제공하는 잠재성을 가진다.

본 발명과 관련하여 사용되는 외분비선 조직은 성체 유기체(adult organism), 미성숙 유기체(juvenile organism), 또는 인간이 아닌 태아 유기체에서 유래할 수 있으며, 바람직하게는 출생 직후의 유기체에서 유래할 수 있다. 그러므로 본 출원에서 사용되는 “성체”의 개념은 출발 조직의 발달 단계(developement stage of the stoarting tissue)를 가리키며, 조직이 유래하는 공여 유기체(donor organism)의 발달단계를 가리키는 것은 아니다. “성체”줄기세포는 비배아줄기세포이다.

외분비선 조직은 바람직하게는 침샘, 눈물샘, 피지샘, 땀샘으로부터, 전립선을 포함하는 생식기의 샘으로부터, 또는 췌장을 포함하는 위장조직으로부터, 또는 간의 분비조직으로부터 분리되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 실시예는 샘꽈리 조직(acinar tissue)이 관계된다. 샘꽈리 조직은 췌장, 귀밑샘 또는 턱밑 침샘에서 유래한다.

본 발명의 공정의 중요한 이점은 공여 유기체가 실질적으로 불리하게 영향을 받는 일 없이, 줄기세포가 살아있는 공여 유기체, 예를 들면 침샘으로부터 얻어질 수 있다는 것이다. 이는 공여 유기체에서의 이식에 대해 상기 언급된 거부 반응이 회피될 수 있는 자가 조직 상피 세포(autologous epithelial cells)를 발생하는 것이 가능하게 한다.

본 발명에 따르면 일반적으로 상피 조성물은 오르가노이드체(organoid body)로부터 직접 형성될 수 있다. 그러나 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 아래에서 조직체(tissue body)로 언급되는 더 큰 개체로의 오르가노이드체의 성장은, 예를 들면, 현탁 배양(suspension culture) 또는 영양분을 공급하는 접착 배양(adhesion culture)에서 우선 발생한다. 본 발명자들은 외분비선으로부터 분리된 줄기세포가, 영양분을 공급받는 동안 수 밀리미터 이상의 직경에 이르는 강한 성장을 나타내는 오르가노이드체를 형성한다는 것을 관찰했다. 조직체로부터 상피 세포의 조제는 더 많은 분야에서 이점 및 효과를 가진다.

일반적으로, 오르가노이드체 또는 조직체의 분화는, 상피 세포를 발생하고 배양 배지에서 선택적으로 성장할 수 있도록 하기 위해, 예를 들면 분자 성장 요소(factor) 또는 분화된 상피 세포와 같은 분화 요소를 배양 배지에 추가함으로 개시될 수 있다. 그러나, 본 발명의 바람직한 변형에 따르면, 오르가노이드체의 상피세포로의 세포 분화는 주변 기체 환경과 접하는 액체 배지의 경계표면 위에서 배양에 의해 발생한다. 본 발명자들은 상피세포들이, 오르가노이드체 또는 조직체가 확장되거나, 또는 액체 배양 배지가 기체 환경, 예컨대 에워싼 공기로 발아(grown out)하자마자 자발적으로 형성되는 것을 관찰했다. 이러한 경우에, 배양 배지에 성장 요소 또는 자극 세포가 투여될 수 있고, 배양 배지는 성장 요소 또는 자극 세포에서 자유로울 수 있다. 기체 환경에 노출되는 오르가노이드체는 개별세포 아래에 수 개의 줄기세포로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 액체 배지의 액체 표면, 예컨대 배양 배지의 액체 표면이, 액체와 기체 배지 사이의 경계 표면 위에서 오르가노이드체를 배양하는 동안, 오르가노이드체의 표면에 대하여 위치가 변경되는데, 이는 오르가노이드체가 배양 단계의 과정에서 액체 배지 밖으로 점차 돌출하게 하기 위함이다.

액체 배지의 이러한 위치 변경은 다음의 과정 중 적어도 하나가 동시에 또는 연속적으로 제공됨으로 이루어진다. 액체 표면이 오르가노이드체 또는 조직체가 배양 배지에서 생기는 것에 기해서 위치 변경될 때, 분화율(differentiation rate)이 오르가노이드체의 성장률로 바람직하게 적응된다. 액체 배지의 액체 표면이 오르가노이드체 또는 조직체에 대해서 낮아질 때, 분화율은 바람직하게 영향을 받을 수 있다. 액체 표면이 조직이 성장하는 것보다 더 빠르게 낮아질 때, 분화율은 심지어 유리하게 증가될 수 있다. 동일한 것이 오르가노이드체를 가진 배양 기질(culture substrate)의 액체 배지 밖으로의 상승에 상응하는 방식에 적용된다.

액체 표면은, 오르가노이드체 또는 조직체의 집합된 세포가 상피세포로 분화되는 동안, 적응된 오르가노이드체 또는 조직체의 표면에 대해서 전환율(conversion rate)에 의한 비율로 이동하는 것이 특히 바람직하다. 오르가노이드체 내부의 세포들은 그들의 특별한 주위로 접착성 접촉의 고유한 재배열에 기해서 이동할 수 있기 때문에, 오르가노이드체에 대한 액체 표면의 이동 비율이 세포 접촉의 분자 결합율과 관련된 세포 이동률 이하이거나 동일하게 조절되는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로, 세포는 기체 배치에서 분화 조건에 적합하게 적응할 수 있다. 상대적인 비율은 예컨대, 1000㎛/h 보다 작거나 동일하다.

본 발명에 따른 공정의 특별한 이점은, 분화 과정이 형상화와 직접 연결되어 있다면 초래될 수 있다. 이러한 방식으로, 특정 조직의 조각들은 그 형상이 특정 응용, 예컨대 이식 작업 또는 조직 공학에 적응되는 형태로 생산될 수 있다. 이 때문에, 오르가노이드체 또는 조직체의 분화는 분화된 상피 세포가 뒤따르는 미리 예정된 형태를 가진 각인 표면의 바로 인접한 근처에서 발생하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 실시예는 분화된 상피 세포가 오르가노이드체 또는 조직체로부터 분리되고 각각 증식하는 분화된 상피 세포의 대량 형성을 제공한다. 이러한 증식은 상피 세포가 영양분을 가지고 모든 면 위에서 확실하게 공급되게 하기 위해, 액체 투과성의 배양 기질 위에서 발생하는 것이 바람직하다. 콜라겐 플리스(collagen fleece) 또는 직물 조직(textile tissue)이 배양 기질로서 바람직하게 사용된다. 이러한 물질들은 생체 적합성을 가지도록 선택될 수 있고, 심지어 사용 중에도 상피 세포 조성물의 구성성분으로 잔존할 수 있다. 바람직한 변형에 따르면, 상피 세포의 증식은 배양 기질의 변경된 표면, 예컨대 피브린(fibrin) 또는 키틴질(chitin)을 함유하는 표면 위에서 발생한다.

상피 세포의 증식이 변형 가능한 배양 기질 위에서 발생한다면, 상피 세포 조성물의 형태의 바람직한 응용으로의 적응을 위한 다른 이점이 초래될 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, 증식된 상피 세포의 배양이, 예컨대 날인(stamping) 또는 각인기구(imprinting device)를 가진 변형에 종속될 수 있다.

상피 세포를 발생하기 위해 사용되는 줄기 세포는 척추동물, 특히 어류, 조류, 포유동물, 특히 인간의 외분비선으로부터 바람직하게 분리된다. 인간의 줄기 세포의 분리의 경우에는, 분리가 어린이 또는 성인으로부터 발생한다.

배양 배지의 액체 표면이 주기적으로 또는 경계 표면 위에서 배양되는 동안 오르가노이드체 또는 조직체의 표면에 대해서 반대 방향으로 진동하도록 반복적으로 이동되고, 배양 배지를 가지고 상응하는 반복된 방식으로 오르가노이드체 또는 조직체가 세척되고 노출되면, 이것은 상피 세포의 촉진된 발생 및 그들의 공급에 있어서 이점을 초래한다.

적어도 하나의 상피 세포를 포함하거나 또는 완전히 상피 세포로 이루어지고 본 발명의 공정에 따라 생산되는 세포 조성물은 본 발명의 독립적인 주제를 나타낸다. 세포 조성물의 바람직한 응용은 약품, 특히 자가조직의 약품(autologous drugs)으로서 예컨대 이식물 또는 이식물의 부분과 같은 조직 공학 응용을 위한 물질로서 사용될 때 존재한다. 본 발명의 상피 세포 조성물의 바람직한 응용은 생물학적 조직의 합성 조제(preparation)에 있다.

기구에 관하여, 상기 언급된 문제는 액체 배양 배지를 수용하기 위한 배양 용기 내에 적어도 하나의 오르가노이드체 또는 조직체를 수용하기 위한 배양 기질을 포함하는 배양 기구, 및 배양 기질의 표면과 관련하여 배양 용기에서 배양액의 액체 표면을 조절하기 위해 제공되는 제어 수단(controlling means)을 제공함으로 해결된다. 본 발명의 첫 번째 실시예에 따르면, 제어 수단은 배양 기질을 배치 및/또는 배양 용기내에 미리 정해진 높이로 위치 변경시키는 배치 수단(placing means)을 포함한다. 선택적으로 또는 부가적으로, 제어 수단은 배양 용기에서 배양액의 채움 레벨(filling level)을 조절하기 위한 레벨 컨트롤(level control)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 배양 기구는 분화된 상피 조직을 형성하는 각인 표면을 가지는 각인 도구(imprinting tool)가 구비된다.

본 발명의 다른 세부 사항과 이점은 다음에 첨부된 도면을 참조하여 설명한다.

도 1은 본 발명에 따른 방법의 실시예를 나타내는 플로차트를 나타낸다.

도 2는 일차 오르가노이드체의 형성의 도해를 나타낸다.

도 3은 본 발명에 따른 방법의 다른 세부점을 나타내는 플로차트를 나타낸다.

도 4는 이차 오르가노이드체의 형성을 나타낸다.

도 5는 오르가노이드체의 사진을 나타낸다.

도 6은 상피 세포의 광학 및 전자 현미경 모습을 나타낸다.

도 7은 본 발명에 따른 방법의 다른 세부점에 대한 플로차트를 나타낸다.

도 8은 본 발명에 따른 배양 기구의 특징으로 나타내는 개략적 도해를 나타 낸다.

도 9는 본 발명에 따른 방법의 다른 세부점에 대한 플로차트를 나타낸다.

도 10 및 도 11은 조직 공학을 위한 기구의 개략적인 도해를 나타낸다.

본 발명에 따른 생물학적 세포 및/또는 조직의 조성물을 생산하기 위해, 도 1에 따르면, 우선 공여 유기체로부터 분리된 줄기세포가 제공되고(스텝 100), 다음으로 그들이 오르가노이드체로 집합(aggregation)되고(스텝 200), 분화 및/또는 성장으로 이어지고(스텝 300), 마지막으로 수집(collection) 및 그 이상의 공정, 특히 증식(스텝 400)으로 이어진다. 스텝 100 및 200이 본 발명에 따라 본질적으로 집합시키는 단계를 포함한다 할지라도, 반면에 스텝 300 및 400은 본 발명에 따른 분화 단계를 나타내고 이들 두 복합체는 아래에서 개별적으로 논의된다. 또한 분화의 부분 단계들은 이미 집합의 테두리 내에서 발생할 수 있고, 반대로 집합의 부분 단계들이 조제(preparation)의 테두리 내에서 실현될 수 있다. 그러므로, 예컨대 오르가노이드체의 분화는 이미 집합의 테두리 내에서 시작되거나, 분리된 줄기 세포가 이미 예비 분화된(pre-differentiated) 오르가노이드체로 집합할 수 있다.

아래에서 설명되는 본 발명의 실시예들은 쥐 또는 인간으로부터 제거된 줄기 세포로부터 생물학적 물질 조성물의 생산을 예시로 언급한다. 그러나 본 발명의 실시는 이러한 유기체들로 제한되지 않고, 오히려 상응하는 공정들이, 샘꽈리조직(acinar tissue)을 가지는 분화된 외분비선을 가지는 모든 유기체들, 따라서 예컨대 췌장(pancreas gland)위에 샘꽈리조직을 가지는 어류 또는 소나 양 같은 포 유동물들에서 실현될 수 있다.

(Ⅰ) 살아있는 유기체의 분화된 외분비선으로부터 오르가노이드체 및/또는 조직체로의 줄기세포들의 집합

도 2에 나타낸 도표에 따르면, 세포를 얻기 위해, 샘꽈리조직, 바람직하게는 침샘 또는 복부의 침샘(췌장)의 샘꽈리조직이 기계적으로 및 효소적으로 세분된 형태로 배양(culture)에 수용된다(도 2의 스텝 10). Bachem et al., Gastroenterol. 115:421-432(1998) 및 Grosfils et al., Res. Comm. Chem. Path. Pharmacol. 79:99-115(1993)의 지시와는 상반되게, 샘꽈리의 세포 집합체가 가능한 최대 범위까지 손상되지 않고 남아있는 조건 하에, 세포들이 자라게 되어 있는 어떠한 조직 블록도 배양되지 않고 오히려 조직은 더욱 강력하게 세분된다.

이러한 세포와 세포 집합은 몇 주 동안 배양 용기에서 배양된다. 배지는 2 내지 3일마다 교체되고, 모든 분화된 세포들은 제거된다. 배지에 남아있는 세포들은 제한되지 않은 분열 능력을 가진 미분화 세포들이다.

유사한 세포들이 같은 조건 하에서 체장으로부터 분리되고 표시되었고 근섬유모세포(fibroblasts) 및 췌장 별세포(pancreatic star cells)의 형태로 명시되었다(Bachem et al., 1998). 그러나, 본 발명에 따른 세포들과는 대조적으로, 무한한 분열능력이 관찰될 수 없었다. 게다가, 이러한 세포들은 또한 생명력을 잃는 일 없이 제한되지 않은 방식으로 계대(passage)될 수 없었다.

두 번째 스텝(12)에서는 대략 400 내지 800개의 세포들이 현탁된 방울들(suspended drops)에서 20μl배지에 배양된다. 그 결과로 방울들은 세균 배양용 페트리 접시의 커버에 놓여지고, 뒤집어 놓은 후, 현적(hanging drops) 상태를 위한 배지로 놓여지게 된다.

이런 유형의 배양 결과, 오르가노이드체라고 일컬어지는 세포 집합(14)은 48시간 이내에 형성되고 약 6일 동안 현탁 배양하는 단계로 옮겨진다(16). 도 2에 있는 부분도(18)는 이러한 오르가노이드체(2)의 현미경 사진을 나타낸다.

또 다른 분화를 위한 출발물질로서 오르가노이드체를 제공하는 다양한 가능성들은 도 3의 다른 세부사항들에 따른다. 소위 일차 오르가노이드체로의 집합(스텝 220)은 상기 언급된 분리된 줄기세포를 현적(hanging drops)상태에서 배양(스텝 210)한 후 발생하는데, 일차 오르가노이드체는 직접적으로 분화 및 성장에 종속될 수 있다(도 1의 스텝 300).

대안으로서, 접착 배지를 만들기 위해 기질 위에 일차 오르가노이드체를 놓는 것(스텝 230)이 우선 발생한다(또한 도 4 참조). 본 발명자들은 현탁 배양에서 성장하는 일차 오르가노이드체가 접착 배양(adhesion culture)에서 새로운 오르가노이드체를 형성할 수 있음을 관찰했다. 세포 이동(cell migration)에 의해 기질 위에서 단일층이 형성(단계 240)되고, 이러한 단일층으로부터 소위 이차 오르가노이드체가 집합한다(스텝 250). 상기 이차 오르가노이드체는 그 이상의 분화 및/또는 성장에 직접적으로 영향을 받을 수 있다.(스텝 300).

또한 이차 오르가노이드체의 형성이 도 4에 나타낸다. 일차 오르가노이드체(2)는 우선 접착 배양의 기질, 예컨대 배양 접시(20)의 바닥 위에 세포(3)의 이동 또는 성장에 의해 단일층을 형성하고, 그후 그 단일층으로부터 이차 오르가노이드체(4)가 성장한다. 세포 물질의 다른 번식은 일차 오르가노이드체(2)가 이차 오르가노이드체(4)로 배양됨으로써 발생된다. 조직체는 다른 배양 동안 일차(2) 또는 이차 오르가노이드체(4) 각각으로부터 성장할 수 있다.

줄기세포의 분리 및 집합의 예시적 실시예

줄기세포의 분리와 집합은 다음의 제한되지 않은 실시예에서 상세하게 설명된다.

생물학적 세포의 배양 및 특히 포유 동물에서의 공정을 위한 종래의 일반적인 작용 지침들이 준수된다. 더 이상의 설명이 없더라도 공정이 진행되는 동안 무균 환경이 모든 경우에 유지된다. 다음의 완충제와 배지가 사용되었다:

HEPES 원액 배지(pH 7.6)	100ml의 A.bidest. 당 2.383g의 HEPES
HEPES 이글 배지(pH 7.4)	90ml 변형 이글 배지 (MEN) 10ml HEPES 원액 배지
분리 배지(pH 7.4) 소화 배지(pH 7.4)	32ml HEPES 이글 배지 A.bidest에 5% BAS 8ml 0.1M CaCl2 300μl 트라시롤(Trasylol) (200,000 KIU) 100μl 20ml 분리 배지 4ml 콜라게나제 (Serva 제조 콜라게나제 NB 8)
인규베이션 배지	둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)
배양 배지	둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) DMEM +4500mg/l 글루코스 +L-글루타민 -피루브산(pyruvate) +20% FCS(비활성화됨) +1ml/100ml 페니실린/스트렙토마이신 (10000U/10000μg/ml) 또는 DMEM +10% 자가혈장 +1ml/100ml 페니실린/스트렙토마이신 사용 전 37℃까지 가열
분화 배지	DMEM 380ml 30분간 54℃에서 비활성화된 FCS 95ml 5ml 글루타민(GIBCO BRL) 5ml(PBS 5ml당 3,5μl β-메르캅토에탄올) 5ml 비필수 아미노산(GIBCO BRL) 5ml 페니실린/스트렙토마이신(GIBCO BRL) (10000U/10000μg/ml)

배양 배지와 분화배지에서 소태아혈청(fetal calf serum, FCS) 대신에, 자가혈장 또는 덜 바람직하지만, 조직 공여자의 자가 혈청 또한 옵션으로 사용될 수 있다. 이는 조직 공여자가 줄기세포 또는 그것에서 유래한 분화된 세포의 그 후 수용자와 동일할 때 특히 중요하다. 이러한 자가조직의 처리는 가능한 거부반응을 방지하기 위해 바람직하다.

DMEM 배양 배지 대신에, 배양 배지는 진핵 세포, 특히 포유동물세포를 배양하는데 적합한 기본 배지로 알려진 다른 것을 포함할 수 있는데, 그 배지에서 분화된 세포는 죽고 원하는 줄기세포는 증식한다. 분리 배지, 인큐베이션 배지, 분화 배지는 또는 다른 종래의 적합한 기본 배지를 포함할 수 있다.

다음의 실시예 1 및 2는 췌장의 샘꽈리 조직으로부터 성체 전분화능 줄기세포의 분리 및 배양에 대한 두 가지 작용 프로토콜을 상세히 설명한다. 실시예 3은 침샘의 샘꽈리 조직으로부터의 분리에 대한 상응하는 프로토콜을 설명한다.

실시예 1

1. 조직의 준비와 세포의 분리

10ml의 소화 배지를 주사기와 무딘 캐뉼러(blunt cannula)로 2년 내지 3년령 래트의 췌관으로 천천히 그리고 기포 없이 주입하였다. 전체 췌장은 이 과정에 의해 팽창되고, 따라서 더 쉽게 떼어져 준비될 수 있다. 그리고 나서, 췌장은 유리 비커로 옮겨지고, 또 다른 5ml의 소화 배지가 추가된다. 지방 조직과 림프절을 제거한 후, 조직은 세밀한 가위로 유리 비커에서 매우 세밀히 나누고, 상부에 떠다니는 지방조직은 흡입하여 제거하고, 현택액은 그 후에 1분간 카보젠(carbogen)으로 가스처리하고(필요하다면 반복해서), 200cycles/min인 교반기에서 알루미늄호일에 싸서 20분간 37℃에서 인큐베이션한다. 그리고 나서 배지는 흡입하여 조심스럽게 제거하고, 조직은 가위로 다시 나누고, 조직 단편들은 10ml의 분리 배지로 각각 두 번 세척하고, 그 후 5ml의 소화 배지를 조직에 다시 추가한다.

다시 약 1분간 카보젠으로 가스처리하고 그리고 200cycles/min인 교반기에서 37℃로 15분간 인큐베이션한 후, 조직 단편은 10ml, 5ml, 2ml 1ml의 유리 피펫으로 연속적으로 뽑아 넣은 것에 의해 나누고 한 겹의 필터 섬유를 통하여 압축한다. 이 런 식으로 분리된 세포들은 인큐베이션 배지(37℃)에서 5회 세척하고, 카보젠으로 가스처리하고, 매번 90g으로 5분간 원심분리한다. 최종적으로 얻어진 펠렛(pellet)은 인큐베이션 배지에서 재현탁되고, 가스처리되고, 조직배양접시에 분배된다.

2. 세포의 배양

분리된 세포를 가진 조직 배양 접시는 37℃, 5%의 CO₂로 인큐베이터에서 배양된다. 배지는 2일 내지 3일마다 교체하고, 이때 모든 분화된 세포는 제거된다.

배양 7일째 되는 날, 세포들은 2ml의 PBS, 1ml의 트립신, 2ml의 인큐베이션 배지로 이루어진 용액을 사용하여 계대한다. 이 과정에서, 세포들은 배양 접시의 바닥으로부터 떨어진다. 세포 현탁액은 5분간 원심분리되고, 상층액(supernatant)은 흡입하여 제거하고, 세포들은 2ml의 인큐베이션 배지에서 재현탁하고 중간 크기의 세포 배양 플라스크로 옮겨서 10ml의 인큐베이션 배지를 추가한다. 배지는 3일마다 교체한다.

배양 14일째 되는 날, 세포들은 다시 계대되는데, 그러나 이때에는 6ml의 PBS, 3ml의 트립신, 6ml의 인큐베이션 배지를 가지고 한다. 세포 현탁액을 5분간 원심분리하고, 상층액은 흡입하여 제거하고, 세포들은 6ml의 인큐베이션 배지에서 재현탁하고, 3개의 중간 크기의 세포 배양 플라스크로 옮겨서, 10ml의 인큐베이션 배지를 각각에 추가한다.

세포들은 반융합 내지는 융합 상태에 이를 때까지 세포들을 더 배양하고 계 대하고 접종(seed)한다.

실시예 2

췌장 샘꽈리는 수컷 스프라그-도리 래트(sprague-Dawley rats)(20 내지 300g)를 마취시키고(CO₂) 등 쪽의 대동맥을 통해 방혈하여 얻었다. 캐뉼러(cannula)는 십이지장을 가로질러 췌관으로 도입하였으며, HEPES 이글배지(pH 7.4), 0.1mM HEPES 완충제(pH 7.6), 70%(Vol./Vol.)의 변형이글배지, 0.5%(Vol./Vol.)의 트라시올(Trasyol, Bayer AG, Leverkusen, Germany), 1%(wt./Vol.)의 소혈청알부민, 2.4mM의 CaCl₂ 및 콜라게나제(0.63 P/mg, Serva, Heidelberg, Germany)를 포함하는 10ml의 소화 배지를 췌장으로 뒤따라 주입하였다.

췌장을 떼어내기 전에, 부착해 있는 지방조직, 림프절, 혈관을 부분적으로 제거하였다. 그리고 나서 건강한 췌장조직은 소화 배지(20℃, 더 낮은 대사)에 두고, 췌장 조직을 가위로 매우 세밀하게 나누고, 상부에 떠 있는 지방조직을 흡입하여 제거하고, 조직 현탁액은 노즐을 세포가 있는 배지에 넣지 않고(물리적 힘의 감소) 카보젠(Messer, Krefeld, Germany)으로 가스처리하였으며, 이러한 방식으로 pH를 7.4로 조절하였다. 그리고 나서, 현탁액은 연속적으로 교반하면서(150 내지 200 cycles/min), 10ml의 소화 배지에서 37℃로 25ml의 삼각플라스크(알루미늄호일로 덮음)에서 인큐베이션하였다. 15 내지 20분 후, 상부에 떠있는 지방 및 배지는 흡입으로 제거하고, 조직은 다시 나누고 콜라게나제(collogenase) 없이 배지로 세척되었고(적어도 2회 공정을 반복, 바람직하게는 세포 단편이 투명해질 때까지), 그 후에 소화 배지를 추가하여 혼합물을 약 1분간 카보젠(carbogen)으로 다시 가스처리하였다. 동일한 완충액을 사용하여 교반기에서 37℃로 15분간 다시 콜라게나제를 가지고 소화시켰다. 소화 후에, 샘꽈리는 좁은 통로를 가진 10ml, 5ml, 2ml의 유리 피펫을 통해 연속적으로 잡아당겨 꺼내어 분리하였고, 약 250μm의 망을 가진 단층 나일론 망(Polymon PES-200/45, Angst & Pfister AG, Zurich, Switzerland)을 통해 여과하였다. 샘꽈리는 원심분리하였고(37℃에서 600 내지 800rpm으로, 약 90g에 상응하는 Beckman GPR 원심분리기에서), 24.5mM의 HEPES(pH 7.5), 96mM의 NaCl, 6mM의 KCl, 1mM의 MgCl₂, 2.5mM의 NaH₂PO₄, 0. mM의 CaCl₂, 11.5mM의 글루코스, 5mM의 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 5mM의 글루타민산 나트륨(sodium glutamate), 5mM의 푸마르산 나트륨(sodium fumarate), 1%(Vol./Vol.)의 변형 이글 배지, 1%(wt./Vol)의 소혈청알부민을 포함하는 인큐베이션 배지에서 세척하여 더욱 정제한 후, 카보젠으로 평형을 유지하였고, pH를 7.4로 조절하였다. 세척과정(원심분리, 흡입 제거, 재현탁)은 5회 반복하였다. 특별한 언급이 없는 한, 상기한 분리 과정은 약 20℃에서 수행되었다.

샘꽈리는 인큐베이션배지에서 재현탁되었고, 5%의 CO₂를 가진 습한 대기에서 37℃로 배양되었다. 샘꽈리 조직은 이러한 조건 하에서 빠르게 죽었고(2일 이내), 죽어가는 분화된 세포는 인접하는 세포들로부터 그들을 손상시키지 않고 분리되었고(부드러운 분리), 반면에 죽어가지 않는 줄기세포들은 바닥으로 가라앉아, 스스 로 달라붙었다. 분화된 샘꽈리 세포들은 이렇게 하는 것이 가능하지 않았다. 인큐베이션 배지는 자유롭게 떠다니는 샘꽈리 및 샘꽈리 세포를 제거하면서, 접종 후 2일째 또는 3일째에 처음으로 교체하였다. 이 시점에서 첫 번째 줄기세포 또는 그들의 전구체들은 스스로 바닥에 달라붙었고, 분리되기 시작했다. 그리고 나서 3일마다 다시 배지를 교체하였고 분화된 샘꽈리 췌장 세포들은 배지가 교체될 대마다 제거되었다.

배양 7일째 되는 날, 세포들은 2ml의 PBS, 1ml의 트립신(+0.05% EDTA) 및 2ml의 인큐베이션 배지로 이루어진 용액으로 계대되었고, 그 후에 세포들이 배양 접시의 바닥으로부터 분리되었다. 세포 현탁액은 5분 동안 약 1000rpm으로 원심분리 되었고(Beckmann GPR 원심분리기), 상층액은 흡입하여 제거되었으며, 세포는 2ml의 인큐베이션 배지에서 재현탁되었고, 중간 크기의 세포 배양 플라스크로 이동시켰고, 10ml의 인큐베이션 배지가 추가된다.

배양 14일째 되는 날, 세포들은 다시 계대되었는데, 그러나 이번에는 6ml의 PBS, 3ml의 트립신/EDTA 및 6ml의 인큐베이션 배지를 사용하였다. 세포 현탁액은 5분간 1000rpm으로 원심분리되었고, 상층액은 흡입으로 제거되었으며 세포들은 6ml의 인큐베이션 배지에서 재현탁되었고, 세 개의 중간 크기의 세포 배양 플라스크로 옮겨서 10ml의 인큐베이션 배지가 각각에 추가되었다.

17일째 되는 날, 세 번째 계대가 총 6개의 중간 크기의 세포 배양 플라스크에서 실시되었고, 24일째 되는 날, 네 번째 계대가 총 12개의 중간 크기의 세포 배양 플라스크에서 실시되었다. 이제 최종적으로 줄기세포들을 제외한 모든 일차 세 포들을 세포 배양액으로부터 제거하였다.

줄기세포들은 더 배양되고, 계대 및 접종이 원하는 만큼 자주 실시된다. 접종은 바람직하게는 2×10⁵ 내지 4×10⁵ 세포수/cm²의 밀도로 인큐베이션 배지에서 실시된다.

실시예 3

인간의 귀밑샘선의 외분비선으로부터의 분리 및 배양은 다음의 변경사항들을 가지고 췌장 프로토콜과 유사하게 실시되었다.

1. 귀밑샘선의 외분비선 조직은 샘꽈리조직과 관상조직의 혼합이었다.

2. 침샘이 췌장보다 프로테아제 및 아밀라아제를 적게 함유하기 때문에, 조직을 지나치게 손상시키는 일 없이 정밀검사(workup) 전에 약 4℃에서 냉장 하에서 잠시 동안 침샘 조직을 저장하는 것이 가능하다. 구체적인 예로서, 저장 시간은 15시간이었고, 원하는 줄기세포의 분리에 대해 어떠한 부정적인 영향도 없었다.

아래의 실시예 4는 오르가노이드체를 생산하기 위한 작용 프로토콜을 상세하게 기술한다.

실시예 4

미분화세포들을 10ml의 PBS, 4ml의 트립신 및 8ml의 분화 배지의 용액으로 트립신처리하고 나서, 5분 동안 원심분리한다. 결과 펠렛을 100μl의 배지당 3000 개의 세포들의 희석이 성립되도록 하기 위해 분화 배지에서 재현탁한다. 그리고 나서 세포들을 3ml의 피펫으로 다시 잘 현탁한다.

커버를 플레이트당 15ml의 PBS(37℃)로 미리 코팅된 세균 배양용 페트리 접시로부터 제거한후, 뒤집는다. 자동 피펫을 사용하여, 약 50개의 20μl 방울들을 각 커버 위에 놓는다. 커버는 그 후에 빠르게 뒤집어서, 방울들이 늘어지도록 분화배지로 채워진 페트리 접시 위에 놓는다. 페트리 접시들은 그리고 나서 인큐베이터에 조심스럽게 놓고 48시간 동안 인큐베이션한다.

다음으로, 현적 상태(hanging drop)에서 집합된 세포들은, 오르가노이드체를 형성하면서, 4개의 커버로부터 각각 20%의 FCS를 포함한 5ml의 인큐베이션 배지를 가지는 세균 배양용 페트리 접시로 옮겨지고, 96시간 동안 더 배양된다.

오르가노이드체들은 그리고 나서 피펫으로 조심스럽게 모아지고, 분화 배지를 함유하고 0.1%의 젤라틴으로 코팅된 세포 배양 용기로 옮겨진다. 이 방법의 특히 바람직한 실시예로서, 0.1%의 젤라틴으로 코팅된 6cm의 페트리 접시들을 배양 용기로서 사용한다; 4ml의 분화 배지를 각각 미리 놓고, 그리고 나서 그들을 여섯 개의 오르가노이드체로 각각 채운다. 또 다른 바람직한 배양 용기는 각각 놓여진 3ml의 분화 배지를 가진 0.1%의 젤라틴으로 코팅되고 그 후 3개 내지 8개의 오르가노이드체 각각으로 채워진 챔버 슬라이드로 이루어진다. 게다가, 웰(well)당 1.5ml의 분화 배지가 놓여진 0.1%의 젤라틴으로 코팅되고 그 후 4개의 오르가노이드체 각각이 채워진 24-웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트 또한 사용될 수 있다.

이런 식으로 배양할 때, 세포가 오르가노이드체로 분화하는 능력을 활성화되 고 세포는 특히 외배엽(ectoderm) 세포로 분화할 수 있다. 세포들은 개별 세포로서뿐만 아니라 오르가노이드체로서 저장되고 배양될 수 있고, 그들의 전분화능(pluripotency)을 유지한다.

(Ⅱ) 오르가노이드체 및/또는 조직체에서의 분화

오르가노이드체 또는 조직체에서 세포의 분화는 분화에 영향을 미치는 첨가물을 가지는 배양 배지에서, 또는 기체 또는 증기 환경을 가지는 배양 배지의 경계 위에서 일반적으로 발생할 수 있다. 다음의 실시예 5 및 실시예 6은 양 변이들의 작용 프로토콜을 기술한다.

실시예 5

분화 유도를 위해, 바람직하게는 배양 42일 후의 줄기세포를 사용한다. 세 번째 또는 네 번째 계대 후 줄기세포들 또는 12 내지 18개월 동안 액체 질소의 온도에서 문제없이 저장된 세포들을 사용하는 것도 또한 가능하다.

우선, 세포들은 상기 조성물을 가지는 분화 배지로 옮겨지고, 예컨대 배양 배지에서 줄기세포 배양의 트립신 처리, 5분간 1000rpm으로 원심분리 및 분화 배지에서 펠렛을 재현탁하고, 필요한 만큼 많이 희석함으로, 약 3×10⁴ 세포수/ml의 밀도로 조절된다.

그리고 나서, 20μl의 피펫을 사용하여, 약 50개의 20μl의 방울들(600 세포 수/20μl)을 세균배양용 페트리 접시의 커버 내부에 놓고(스토퍼 팁:stoppered tip), 커버들을 방울들이 늘어지도록 PBS로 채워진 페트리 접시 위에 조심스럽게 뒤집어놓는다. 새로운 팁이 각각의 커버에 사용된다. 페트리 접시들을 그리고 나서 조심스럽게 인큐베이터 안에 놓고, 37℃에서 48시간동안 배양하였다.

다음으로 현적 상태에서 집합된 세포들, 예컨대 오르가노이드체들을 4개의 커버 각각으로부터 20% FCS를 가진 5ml의 인큐베이션 배지를 가진 하나의 세균 배양용 페트리 접시 각각으로 옮겼고(커버를 비스듬하게 붙잡고 약 2.5ml의 배양 배지를 가지고 오르가노이드체를 세척함), 그리고 나서 5일 내지 9일 이상, 바람직하게는 96시간 동안 배양하였다.

오르가노이드체들을 그리고 나서 피펫을 사용하여 조심스럽게 모으고, 0.1%의 젤라틴으로 코팅되고 분화 배지를 포함하는 세포 배양 용기로 옮겼다. 그리고 나서 오르가노이드체들은 증식되었고, 그 후 더 증식될 수 있고, 분리되고, 다시 증식하는, 부분적으로 분리된 세포 콜로니(colony)들로 성장한다. 이 방법의 특히 바람직한 실시예에서는, 0.1%의 젤라틴으로 코팅되고 4ml의 배양 배지가 이미 놓여져 있는 6cm의 페트리 접시가 배양 용기로서 사용되고, 각각의 페트리 접시는 6개의 오르가노이드체로 채워진다. 또 다른 바람직한 배양 용기는 0.1%의 젤라틴으로 코팅되고, 3ml의 분화 배지가 놓여지고, 그 후 각각이 8개의 오르가노이드체로 채워지는 챔버 슬라이드와 전자 현미경 연구를 위한 서마녹스 플레이트(thermanox plate)(Nalge Nonc International, USA)이다. 또 다른 대안은 0.1%의 젤라틴으로 코팅되고 각 웰에 1.5mL의 분화 배지가 놓여진 24-웰(well) 마이크로타이터 플레이트(microtiter plates)인데, 그 후 각각에 4개의 오르가노이드체가 채워진다.

이 방법의 바람직한 실시예에서, 오르가노이드체는 약 7주 동안 젤라틴으로 코팅된 6cm의 페트리 접시들에서 배양되었고, 그 후 개별 오르가노이드체는 제조사의 지침에 따라 마이크로디섹터(microdissector)(Eppendorf, Hamburg, Germany)를 사용하여 잘라냈고, 그 후 새로운 6cm 페트리 접시, 예를 들면 챔버 슬라이드 또는 서마녹스 플레이트로 옮겼다.

실시예 6

도 5는 접착 배지에서 성장하는 조직체(5)(흰 선은 원형에서 2mm의 길이에 해당한다.)를 예시적으로 나타내는데, 조직체의 일부분이 배양 배지 밖으로 확장한다. 조직체(5)는 위에서 지적한 공정 중에 하나에 따라서 형성되는 오르가노이드체에서 생긴다. 상피세포(6)는 외부 대기에서 점선으로 표시된 조직체(5)의 부분에서 발생한다. 플레이트 상피세포는 수 밀리미터의 크기로 생산된다. 도 6은 분화된 상피세포의 밝은 전자 현미경 사진을 나타낸다(마지막 이미지의 검은 선은 원형에서 약 7μm의 길이에 해당한다).

도 7은 액체-고체 경계 표면 위에서 상피세포의 발생에 있어서 본 발명에 따른 공정의 다른 세부 사항들을 나타낸다. 위에서 기술한 공정에 따라 생산된 오르가노이드체 또는 조직체들을 스텝 310에서 배양 기질위에 놓는다. 그후 오르가노이드체 또는 조직체의 상부가 액체 표면에 닿을 때까지 배양 배지의 액체 표면의 이동이 된다.(스텝 320). 세포의 다른 분화가 설명된 세 가지 방식 중 적어도 하나, 즉, 배양 배지에서의 발아(스텝 321), 배양 배지의 레벨(level) 낮춤(스텝 322), 및/또는 배양 기질을 이동(스텝 323)으로 발생한다. 그후에 생성된 상피세포들이 그 후에 분리되고(스텝 330), 다른 증식에 제공된다.(도 1의 스텝 400 참조)

도 8에서는 이동될 수 있고, 배양 용기(20)에서 특정 위치에 고정될 수 있는 방식으로 배열된 배양 기질(10)을 가진 본 발명에 따른 배양 기구의 중요한 구성요소를 도식적으로 나타낸다. 이 때문에, 위치 수단(30)은 예를 들면 압전기 작동기로, 배양 기질(10)을 위치시킬 수 있는 제어 수단(controlling means)으로 제공된다. 더욱이, 배양액의 채움 레벨(filling level)(21)은 배양 용기 내에서 예컨대 밸브 및 펌프와 같은 알려져 있는 유동성 구성요소를 포함하는 레벨 컨트롤(level control)(40)을 가지고 조절할 수 있다. 센서(22)는 배양 용기(20) 내에서의 배양액의 채움 상태(21)를 모니터하기 위해 제공된다. 센서(22)는 예컨대, 광학 센서(optical sensor) 또는 공지된 방법으로 채움 레벨을 감지할 수 있는 전도성 센서(conductivity sensor)이다. 센서 신호는 컨트롤 회로의 테두리 내에서 위치 수단(30) 및/또는 레벨 컨트롤(40)을 작동시키도록 사용될 수 있다.

조직체(5)의 표면 위에서 형성하는 상피세포 위에 특정 형태를 찍을 수 있는 각인 표면(51)을 가진 각인 도구(50)가 액체 표면(21) 위에 위치한다.

배양 기구의 작동은 첫 번째 또는 수개의 조직체(5)가 배양 기질(10)에 위치하는 것과 같은 방식으로 도 7의 개요에 따라 발생한다. 그 후 조직체(5)의 성장, 배양 기질(10)의 이동 및/또는 조직체(5)의 일부분이 배양 배지 밖으로 확장될 때까지의 채움 레벨(21)의 조절 그리고 상피세포로의 분화가 그 후에 발생한다.

도 8에 따른 각인 도구(50)의 사용은 반드시 필요한 것은 아니다. 상피조직의 형성은 그 후에 분화된 상피세포의 다른 증식에서 발생할 수 있다(스텝 400, 도 1 참조). 다른 증식의 전형적인 공정 스텝들은 도 9에 따른다.

변형 기질 위에 분화된 상피세포들을 놓는 것(스텝 410)이 우선 발생한다. 그 후에 기질 표면의 이동(스텝 420)이 상피세포들이 원하는 외형을 형성하기 위해 그 후에 발생한다. 이러한 이동은 각인 도구를 가지고 부가적인 형상화와 결합할 수 있다. 마지막으로, 상피세포체의 분리(430)가 발생한다.

세부사항들은 도 10 및 도 11 참조하여 기술되는데, 변형 기질은 그들의 형상화뿐만 아니라 상피세포들의 수용 및 성장에 기여한다. 각인 도구가 작동하는 동안 상피세포들의 캐리어로서 변형 가능한 표면 그 자체 및/또는 기능을 가질 수 있다.

도 10은 기부(base part, 도시되지 않음)에 부착된 위치 수단(62)으로 개별적으로 이동될 수 있는 다수의 형성 소자(forming elements)(61)를 포함하는 변형기질(60)을 나타낸다. 각각의 형성 소자(61)는 상부에 마름돌(ashlar)형태를 가진다. 형성 소자 위에 배열된 모든 수의 상부 또는 적어도 하나의 유연하고 층상의 커버 소자(63)는 상피세포 조성물(6)위에서 형상화를 위해 사용되는 변형 기질(60)의 표면을 형성한다. 형성 소자(61)의 상부는 0.01mm 내지 5mm의 범위에서 전형적인 치수를 가진다. 상부가 직선 및 기둥으로 구성된 매트릭스 배열을 형성하는 것과 같은 방식으로 형성 소자(61)가 일직선으로 배열된다. 기부에 대한 형성 소자(61)의 이동은 예컨대 서보모터 또는 압전기 추진력으로 발생한다. 표면은 형성 소자(61)의 선택된 상승에 따라 구조화된다.

커버링 소자(63)는 도구 표면의 국부적으로 평탄해지고, 도구로부터 세포 물질(6)의 제거는 촉진된다는 이점을 가진다. 커버링 소자(63)는 예를 들면, 호일(예컨대, 폴리우레탄) 또는 모든 형성 소자(61) 위에 미치고 그 위에 세포가 배열되는 막을 포함한다. 선택적으로, 하나 또는 그 이상의 커버링 소자는 하나 또는 몇 개의 형성 소자의 부분 그룹에 미치도록 제공될 수 있다. 커버링 소자가 얼마의 또는 모든 형성 소자(61)의 상부에 분리할 수 있도록 접착하는 것이 제공될 수 있다.

커버링 소자(63)는 합성 폴리머 물질 및/또는 생물학적 유기체에 자연적으로 존재하는 물질, 예컨대 하나 또는 그 이상의 층에서 키틴 또는 골격 매트릭스 물질과 같은 것으로 구성되어 있다. 더욱이, 커버링 소자(63)는 한편으로는 부분 지역에서 생물학적 세포들의 접착성 접착을 촉진하고, 다른 한편으로는 다른 부분 지역에서는 방해하는 구조화된 코팅을 포함할 수 있다.

상피세포 물질(6)을 형상화하기 위해, 우선 변형 기질(60)의 표면 위 즉, 모든 상부 또는 공통된 커버링 소자(63)에 배열된다. 이로 인해, 예컨대 다수의 오르가노이드체 또는 조직체의 침적(deposit)이 배양 용기(70)에서 배양 배지(71)에 제공된다. 그 결과로서, 오르가노이드체 또는 조직체의 성장 및, 형성 소자(61)를 특정한 원하는 위치로 전진시킴으로 인한 변형 기질(60)의 표면의 이동이 발생한다. 이러한 전진은 세포 물질이 변형되는 동안 손상 없이 치환되고 재배열 될 수 있도록 상기 지적한 세포들의 분자 결합율에서 발생한다. 변형 기질(60)으로부터 상피세포체로서의 세포 물질의 분리는 그 후에 발생한다.

도 10에 따른 변형 기질은 선택적으로 각인 도구(50)로서 사용될 수 있는데, 도 11에 따른 이미지 순서로 나타낸 것과 같다. 변형된 상피세포물질(6)이 지지체(80)위에서 부분이미지 (A)에 따라 최초 위치에 존재한다. 다수의 이동 가능한 형성 소자(51)를 가진 각인도구(50)가 우선 자유로운 세포물질(6)의 표면에 배열된다. 이 경우에 각인 도구(50)는 아래쪽으로 향하는 상부가 세포물질(6)과 접촉하도록 세포물질(6)에 접근한다. 그 후에, 부분 이미지(B)에 따르면, 각인 도구(50)의 각인 표면의 조절이 개별 형성 소자(51)의 의도적인 전진에 의해 발생한다. 전진 이동이 상기 지적된 생물학적 세포들의 분자 결합율로 발생한다. 개별 형성 소자(51)는 손상 없이 세포 물질에서 세포를 치환한다.

그 후에, 각인 도구(50)는 부분 이미지(C)에 따르면 제거되다. 도구의 표면 모양은 세포 물질(6)에서 상보적인 구조로 남는다. 세포물질(6)로부터 각인도구(50)의 분리를 촉진하기 위해, 형성소자(51)의 상부는 세포 접착이 방지되는 코팅을 가지고 제공될 수 있다. 코팅은, 예를 들면, 폴리머 polyHEMA를 가지고 발생한다. 결국, 세포물질에서 각인된 간격(gaps)들은 부분 이미지D 에 따르면 다른 세포(7) 또는 합성 매트릭스 물질로 채워질 수 있다.

모양의 선택 및 세포 또는 세포 물질 내로 도입되는 세포 또는 첨가물의 임의 선택은 조직공학의 테두리 내에서 구체적 목적에 따라 발생한다. 예를 들면, 미리 예정된 구조를 가진 상피세포들은 도 11에 따르면 순서를 가지고 조직 세포와의 결합으로 만들어질 수 있다.

상기 명세서, 청구항, 도면에서 나타낸 본 발명의 특징은 그것의 다양한 실시예에서 본 발명의 실현을 위해 조합해서뿐만 아니라 개별적으로 중요할 수 있다.

본 발명의 목적은 종래 공정들의 불리한 점들이 극복되고, 특히 기저층 또는 배아 줄기 세포로부터 상피 세포를 얻는 것과 관련된 제한들을 극복하게 하는 상피 세포를 생성하는 개선된 공정을 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 또한 낮은 비용으로 생산될 수 있고, 넓은 응용 범위를 가지는 개선된 세포 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상피 세포를 생성하는 배양 기구를 제공하는 것이다.

Claims (29)

1. 분화된 외분비선 조직으로부터 분리된 줄기세포를 오르가노이드체로 집합시키는 단계, 오르가노이드체 또는 그로부터 성장한 조직체의 적어도 한 부분이 액체 배지에서 상피세포로 분화하는 단계를 포함하는 상피세포의 생산 방법에 있어서,

   상기 오르가노이드체 또는 조직체의 분화는 주변 기체 환경과 접하는 액체 배지의 경계표면 위에서의 배양을 포함하는 상피세포의 생산 방법
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서, 경계표면 위에서 배양되는 동안 배양 배지의 액체 표면이 오르가노이드체 또는 조직체의 표면에 대해서 이동하는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
4. 청구항 3에 있어서, 액체 표면의 이동은 동시에 또는 연속적으로,

   -배양 배지로부터 오르가노이드체 또는 조직체의 발아(321) 단계

   -배양 배지의 액체 표면의 낮춤(322) 단계, 그리고

   -배양 배지로부터 오르가노이드체 또는 조직체를 가진 배양 기질의 상승(323) 단계 중 적어도 하나의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
5. 청구항 3에 있어서, 상기 액체 표면은 오르가노이드체 또는 조직체의 세포들이 상피세포로 분화될 때의 전환율(conversion rate)에 따른 비율로, 오르가노이드체 또는 조직체의 표면에 대하여 이동하는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
6. 청구항 3에 있어서, 상기 액체 표면은 오르가노이드체 또는 조직체의 세포들의 분자 결합율보다 작거나 동일한 비율로, 오르가노이드체 또는 조직체의 표면에 대하여 이동하는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
7. 청구항 5 또는 청구항 6에 있어서, 상기 비율이 1000μm/h이하인 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
8. 청구항 1, 3 또는 4 중 어느 한 항에 있어서, 오르가노이드체 또는 조직체의 분화는, 각인 표면의 형태에 상응하는 기하학적 배열이 상피세포 위에 각인되는 것과 같은 방식으로, 각인 표면의 인접한 근처에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포의 집합은, 외분비선으로부터 일차적으로 분리된 줄기세포의 일차 오르가노이드체로의 조합(association)을 포함하거나, 또는 일차 오르가노이드체로부터 유래한, 줄기세포의 이차 오르가노이드체로의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
10. 청구항 1에 있어서, 분화된 상피세포들이 오르가노이드체 또는 조직체로부터 분리되고, 증식되는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 상피 세포의 증식이 액체-투과성 배양 기질 위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 상피 세포의 증식이 콜라겐 플리스(collagen fleece) 또는 직물 조직 위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
13. 청구항 10에 있어서, 상기 상피 세포의 증식이 피브린 함유 표면 위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
14. 청구항 10에 있어서, 상기 상피 세포의 증식이 키틴 함유 표면 위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
15. 청구항 10에 있어서, 상기 상피 세포의 증식은 변형 가능한 배양 기질(60) 위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
16. 청구항 10에 있어서, 증식된 상피세포들의 배양은 각인 도구(imprinting tool)(50)를 이용한 변형에 의해 영향을 받는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
17. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 척추동물의 분비 기관(gland)으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
18. 청구항 17에 있어서, 상기 줄기세포는 어류, 조류 또는 포유동물의 분비기관으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
19. 청구항 18에 있어서, 상기 줄기세포는 어린이 또는 성인 인간으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
20. 청구항 3, 9, 10 또는 17 중 어느 한 항에 있어서, 경계 표면 위에서 배양하는 동안, 배양 배지의 액체 표면이 오르가노이드체 또는 조직체가 반복적으로 잠기고 그리고 배양 배지로부터 다시 나타나도록 오르가노이드체 또는 조직체의 표면에 대해서 반대 방향으로 반복적으로 이동하는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
21. 청구항 20에 있어서, 상기 경계 표면 위에서의 배양은 오르가노이드체 또는 조직체의 표면에 대한 배양 배지의 액체표면의 주기적인 이동을 포함하는 것을 특징으로 하는 상피세포의 생산 방법.
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 적어도 하나의 오르가노이드체 또는 조직체를 수용하기 위한 배양 기질(10),

    액체 배양 배지를 수용하기 위한 배양 용기(20), 및

    배양 기질(10)의 표면에 비례해서 배양 용기에서 배양액의 액체 표면을 조절하기 위한 제어 수단(30,40)을 포함하는 분화된 상피 세포를 발생시키기 위한 배양 기구.
26. 청구항 25에 있어서, 상기 제어수단이 배양 용기(20)에서 미리 예정된 높이로 배양 기질(10)을 위치 또는 이동하기 위한 위치 수단(30)을 포함하는 것을 특징으로 하는 배양 기구.
27. 청구항 25 또는 청구항 26에 있어서, 상기 제어 수단은 배양 용기(20)에서 배양액의 채움 레벨(filling level)을 조절하기 위한 레벨 컨트롤(level control)(40)을 포함하는 것을 특징으로 하는 배양 기구.
28. 청구항 25에 있어서, 상기 제어 수단은 배양용기에서 배양 기질의 표면에 대하여 반대 방향으로 배양액의 액체 표면을 반복적으로 이동할 수 있도록 설계되는 것을 특징으로 하는 배양 기구.
29. 청구항 25에 있어서, 상기 배양 기구는 분화된 상피세포 조직위에 형상화를 위한 각인 도구(imprintiong tool)(50)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배양 기구.

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