CN103740644B - 一种基于3d培养体系的扩增造血干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于3D培养体系的造血干细胞扩增方法，该方法包括如下步骤：(1)将血液中分离出的造血干细胞悬液置入复合培养基中培养：复合培养基包括无血清干细胞基础培养基、SIFE生长因子、血清替代物、纤维蛋白凝胶；(2)将(1)的复合培养基置入低氧培养箱中，低氧培养箱维持的氧浓度为3～20％。本发明的优点为，复合培养基添加的纤维蛋白凝胶是一种高分子网络体系，能吸收大量的水份，其结构上也与细胞外基质极为相似，能够模拟体内造血干细胞的生长微环境，从而为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，降低了成本的同时显著增加细胞的扩增倍数，而且又维持造血干细胞的特性，防止其因分化而丧失干细胞的特性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种基于3D培养体系扩增造血干细胞的方法。
背景技术
造血干细胞在治疗白血病、恶性肿瘤、重症非恶性血液系统疾病以及某些遗传性疾病中有广泛的应用，是因为这类细胞具有自我更新、高度增殖、多向分化等能力，这也预示着体外扩增造血干细胞在临床应用上有着广阔的前景。
目前，在造血干细胞的体外培养中，首先是对骨髓、脐带血或者外周血进行密度梯度离心提取单个核细胞，接着进行磁珠分选得到CD34+细胞，然后将造血干细胞放入培养体系中扩增培养。最常使用的传统2D培养，是将造血干细胞悬浮培养于培养瓶或培养板中，再添加血清替代物和多种生长因子，血清替代物由转铁蛋白和人胰岛素等物质组成，生长因子包括干细胞因子(SCF)、FMS样酪氨酸激酶-3配体(FL)、促红细胞生成素(EPO)等。造血干细胞生长因子可调控造血干细胞的存活和增殖，在造血干细胞的培养中是必不可少的部分。
体内的造血干细胞主要存在于骨髓中，约占骨髓细胞总数的0.01％，在一般状态下造血干细胞数目保持不变，但是当有造血需要时，造血干细胞会进行显著的扩增，不同于体外培养，体内的造血干细胞在扩增过程中能够维持自我更新能力，因此体内细胞生长的微环境对于造血干细胞自我更新、扩增具有重要的作用。已有研究表明建立一种3D培养体系对于提高造血干细胞的体外扩增倍数，延长体外培养时间和维持自我更新能力有显著效果。Matthias P.Lutolf成功合成了一种聚乙二醇水凝胶微孔平台用于维持造血干细胞的自我更新和造血系统重塑能力。
生理性乏氧对造血干细胞的生物特性和功能具有保护作用。低氧环境下，体外培养的造血干细胞有更好的集落形成能力，低氧环境可以刺激VEGF、BNIP3、CXCR4等基因的表达，从而通过细胞旁分泌来调节造血干细胞的增殖、凋亡和分化。低氧环境能使造血干细胞扩增更多的较原始的AC133+CD34+造血干细胞和有活性的CD34+造血干细胞，维持较多的干细胞处于G0/G1期，促进各系集落(BFU-E、CFU-GM等)的生长，更好地维持造血干细胞的迁徙能力，但是目前，对影响造血干细胞扩增的氧浓度尚未有系统的确切的研究结果。
传统2D培养体系体外扩增造血干细胞的倍数约为10倍，扩增倍数不理想，且不能为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，使得造血干细胞迅速分化从而失去干细胞特性。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明公开了一种基于3D培养体系扩增造血干细胞的方法，该方法在培养体系中加入生物相容的支架，模拟体内骨髓造血干细胞生长的三维环境，为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，可增加细胞扩增的倍数，同时维持造血干细胞的表型，不易分化，保持造血干细胞的特性。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为，本发明公开了一种基于3D培养体系的造血干细胞扩增方法，方法包括如下步骤：(1)将血液中分离出的造血干细胞悬液置入复合培养基中培养：复合培养基包括无血清干细胞基础培养基、SIFE生长因子、血清替代物、纤维蛋白凝胶；
(2)将(1)的复合培养基置入低氧培养箱中，低氧培养箱维持的氧浓度为3～20％。体内的造血干细胞主要存在于骨髓中，约占骨髓细胞总数的0.01％，在平时状态下造血干细胞数目保持不变，但是当有造血需要时，造血干细胞会进行显著的扩增，不同于体外培养，体内的造血干细胞扩增过程中能够维持自我更新能力，因此体内细胞生长的微环境对于造血干细胞自我更新、扩增具有重要的作用，本发明中添加的纤维蛋白凝胶是一种高分子网络体系，能吸收大量的水份，其结构与细胞外基质极为相似，能够在体外模拟体内造血干细胞的生长微环境，从而为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，而且纤维蛋白凝胶生理、无菌、无毒且具有良好的生物相容性，可通过释放β转化因子和血小板衍生生长因子等来促进细胞粘附、增殖并分泌基质，能够显著增加细胞扩增倍数，同时维持造血干细胞的特性，防止其因分化而丧失干细胞的特性。
步骤(1)复合培养基中，造血干细胞悬液的体积分数为15％、血清替代物的体积分数为15％、纤维蛋白凝胶的体积分数为15-25％、SIFE生长因子包括干细胞因子(SCF)、FMS样酪氨酸激酶-3配体(FL)、促红细胞生成素(EPO)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，各成份在复合培养基中的终浓度依次为50～100ng/mL、25～40ng/mL、0.5～1U/mL、3～5ng/mL、3～5ng/mL、3～5ng/mL、3～5ng/mL，余量为无血清干细胞基础培养基。
步骤(1)纤维蛋白凝胶的制备方法为，①将氨基酸序列为mqaqqyqqqrrkfaaaflaf ifilaavdta eagkkekpek kvkksdcgew qwsvcvptsgdcglgtregt rtgaeckqtm ktqrckipcn wkkqfgaeck yqfqawgecd lnta lktrtg的多肽与50-75mg冻干的纤维蛋白原偶联；②配制2000KIU/mL抑肽酶，取配制好的抑肽酶1mL溶解多肽偶联的冻干纤维蛋白原，即得溶液A，③将凝血酶加入40mmol/L CaCl2溶液中，配制出凝血酶浓度为250-400u/mL的溶液B；④将溶液A和溶液B混合，在底面积为0.25cm2模具中制作成为圆柱形的复合物，置37℃保温1h，即得到纤维蛋白凝胶，4℃冰箱保存备用。本发明的纤维蛋白凝胶可为造血干细胞提供生物支架，为其提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，更有利于维持造血干细胞的表型。
综上所述，本发明提供的一种基于3D培养体系的造血干细胞扩增方法，其有益效果是，所使用的复合培养基中添加的纤维蛋白凝胶是一种高分子网络体系，能吸收大量的水份，其结构上也与细胞外基质极为相似，能够在体外模拟体内造血干细胞的生长微环境，从而为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，降低了成本的同时显著增加细胞扩增倍数，而且又维持造血干细胞的特性，防止其因分化而丧失干细胞的特性；方法当中用到的低氧环境进一步提高造血干细胞扩增效率。又由于复合培养基中加入了纤维蛋白凝胶，可节省生长因子的用量，生长因子的用量降低到现有生长因子用量的1/2～1/3，生长因子和纤维蛋白凝胶的结合使用，降低成本的同时又提高了造血干细胞的扩增效率，非常适于规模化应用。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明发明内容。
实施例一：本发明开发出的一种基于3D培养体系的造血干细胞扩增方法，包括如下步骤：(1)将血液中分离出的造血干细胞悬液置入复合培养基中培养：复合培养基包括无血清干细胞基础培养基、SIFE生长因子、血清替代物、纤维蛋白凝胶；
(2)将(1)的复合培养基置入低氧培养箱中，低氧培养箱维持的氧浓度为3～20％。
步骤(1)复合培养基中各成份的量为，每200ul的复合培养基中造血干细胞悬液的体积分数为15％、血清替代物的体积分数为15％、纤维蛋白凝胶的体积分数为15％、SIFE生长因子包括干细胞因子(SCF)、FMS样酪氨酸激酶-3配体(FL)、促红细胞生成素(EPO)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，各成份在复合培养基中的终浓度依次为50ng/mL、25ng/mL、0.5U/mL、3ng/mL、3ng/mL、3ng/mL、3ng/mL，余量为无血清干细胞基础培养基。
步骤(1)纤维蛋白凝胶的制备方法为，①将氨基酸序列为mqaqqyqqqrrkfaaaflaf ifilaavdta eagkkekpek kvkksdcgew qwsvcvptsgdcglgtregt rtgaeckqtm ktqrckipcn wkkqfgaeck yqfqawgecd lntalktrtg的多肽与50-75mg冻干的纤维蛋白原偶联；②配制2000KIU/mL抑肽酶，取配制好的抑肽酶1mL溶解多肽偶联的冻干纤维蛋白原，即得溶液A，③将凝血酶加入40mmol/L CaCl2，配制出凝血酶浓度为250-400u/mL的溶液B；④将溶液A和溶液B混合，在底面积为0.25cm2模具中制作成为圆柱形的复合物，置37℃保温1h，即得到纤维蛋白凝胶，4℃冰箱保存备用。
步骤(1)的30ul造血干细胞悬液中含有的造血干细胞个数为1-2×105个。
本发明所用到的试剂信息如下：冻干人纤维蛋白原：购自上海莱士血制品有限公司，0.5g/瓶，凝血酶：购自南京金康制药有限公司，500U/瓶，抑肽酶：购自兰州大得利生物化学制药有限公司，100000KIU/瓶，血清替代物和无血清干细胞基础培养基：购自Life Technologies公司，生长因子均购自Stem cell Technologies公司。
以下通过实验说明应用本发明方法对造血干细胞的扩增作用，造血干细胞从血液中分离：在离心管中加入Ficoll-Hypaque，抗凝血液与无血清1640培养基等倍混匀，稀释后的血液沿离心管壁缓缓叠加于分层液面上，注意保持液面界面清晰，2500rpm离心20min，小心吸取中间云雾层细胞，无血清1640培养基或PBS洗涤两次，使用MACS-CD34isolationkit，免疫磁珠法分选CD34+细胞。流式细胞仪检测造血干细胞纯度，分离出的细胞待用；
细胞接种：将两片纤维蛋白凝胶放入96孔板，每孔加入30uL含1-2×105个造血干细胞的悬液，细胞悬液小心加在纤维蛋白凝胶上方，防止吸头与纤维蛋白凝胶接触，添加SIFE生长因子和血清替代物，再小心加入适量无血清干细胞基础培养基，放入37℃，氧浓度为3-20％的低氧培养箱中。每天半量换液，补充生长因子，进行形态学观察并用台盼蓝进行细胞计数。设置2D对照组。
其中2D对照组培养体系中不加纤维蛋白凝胶，只添加无血清干细胞基础培养基、体积分数为15％的血清替代物和150ng/mL SCF、80ng/mL FL、2U/mL EPO、10ng/mL IL-3、10ng/mL IL-6、10ng/mL GM-CSF、10ng/mLG-CSF。
流式细胞仪检测免疫表型
收集培养前(day0)脐血单个核细胞，于培养第12天(day12)收集3D组细胞及2D组细胞各1-2×105个，2％FBS-PBS洗一次，加入CD34-FITC，CD38-PE，10μL，4℃避光放置30—40分钟，2％FBS—PBS洗一次，加入200μL2％FBS-PBS重悬细胞，进行流式细胞仪检测免疫表型。
细胞集落形成实验检测造血干细胞增殖能力：
分别收集培养前(day0)造血干细胞和培养第12天3D组细胞及2D组细胞，重悬于2％FBS-IMDM，调整细胞至1-2x105/mL，取300μL细胞悬液加入3mL Methocult培养基(Stem Cell Tech.)中，即为溶液A，静置5分钟除去气泡。3mL注射器16-g针头吸取1.1mL溶液A，缓慢注入一个35mm培养皿中，每组设2个重复培养皿，置饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中培养12-14天。倒置显微镜下计算细胞数大于50个的细胞克隆(红系克隆BFU-E，粒巨系克隆CFU-G/GM)，计算红系和粒巨系克隆数。
利用本发明的3D培养方法与传统的2D培养方法相比，造血干细胞的扩增倍数可达15倍。由于培养体系中加入了纤维蛋白凝胶，可降低生长因子的使用浓度，从而节省生长因子的用量，生长因子的用量降低到常规生长因子用量的1/3-1/2，生长因子和纤维蛋白凝胶的配合使用，不仅增加了造血干细胞的扩增倍数，而且降低了成本，非常适于规模化应用。
实施例二：本发明开发出的一种基于3D培养体系的造血干细胞扩增方法，该方法包括如下步骤：(1)将血液中分离出的造血干细胞悬液置入复合培养基中培养：复合培养基包括无血清干细胞基础培养基、SIFE生长因子、血清替代物、纤维蛋白凝胶；
(2)将(1)的复合培养基置入低氧培养箱中，低氧培养箱维持的氧浓度为3～20％。
步骤(1)复合培养基中各成份的量为，每200ul复合培养基包括造血干细胞悬液30ul、血清替代物在复合培养基中的体积分数分别为15％、纤维蛋白凝胶在复合培养基中的体积分数为25％、SIFE生长因子包括干细胞因子(SCF)、FMS样酪氨酸激酶-3配体(FL)、促红细胞生成素(EPO)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，各成份在复合培养基中的终浓度依次为100ng/mL、40ng/mL、1U/mL、5ng/mL、5ng/mL、5ng/mL、5ng/mL，余量为无血清干细胞基础培养基。
步骤(1)纤维蛋白凝胶的制备方法为，①将氨基酸序列为mqaqqyqqqrrkfaaaflaf ifilaavdta eagkkekpek kvkksdcgew qwsvcvptsgdcglgtregt rtgaeckqtm ktqrckipcn wkkqfgaeck yqfqawgecd lntalktrtg的多肽与50-75mg冻干的纤维蛋白原偶联；②配制2000KIU/mL抑肽酶，取配制好的抑肽酶1mL溶解多肽偶联的冻干纤维蛋白原，即得溶液A，③将凝血酶加入40mmol/L CaCl2溶液中，配制出凝血酶浓度为250-400u/mL的溶液B；④将溶液A和溶液B混合，在底面积为0.25cm2模具中制作成为圆柱形的复合物，置37℃保温1h，即得到纤维蛋白凝胶，4℃冰箱保存备用。
步骤(1)的30ul造血干细胞悬液中含有的造血干细胞个数为1-2×105个。
利用实施例二实验方法，使用本实施例方法扩增出的造血干细胞为18倍。
本发明多肽的合成：近年来研究表明人多效生长因子(pleiotrophin，PTN)在促进造血干细胞的生长和增殖方面有着重要的作用，故我们选择了PTN的一段氨基酸序列合成一段多肽，进一步研究其作用。多肽的氨基酸序列见序列表。
实施例三：本发明开发出的一种基于3D培养体系的造血干细胞扩增方法，包括如下步骤：(1)将血液中分离出的造血干细胞悬液置入复合培养基中培养：复合培养基包括无血清干细胞基础培养基、SIFE生长因子、血清替代物、纤维蛋白凝胶；
(2)将(1)的复合培养基置入低氧培养箱中，低氧培养箱维持的氧浓度为3～20％。
步骤(1)复合培养基中各成份的量为，每200ul复合培养基包括造血干细胞悬液30ul、血清替代物在复合培养基中的体积分数分别为15％、纤维蛋白凝胶在复合培养基中的体积分数为20％、SIFE生长因子包括干细胞因子(SCF)、FMS样酪氨酸激酶-3配体(FL)、促红细胞生成素(EPO)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，各成份在复合培养基中的终浓度依次为80ng/mL、35ng/mL、0.8U/mL、4ng/mL、4ng/mL、4ng/mL、4ng/mL，余量为无血清干细胞基础培养基。
步骤(1)纤维蛋白凝胶的制备方法为，①将氨基酸序列为mqaqqyqqqrrkfaaaflaf ifilaavdta eagkkekpek kvkksdcgew qwsvcvptsgdcglgtregt rtgaeckqtm ktqrckipcn wkkqfgaeck yqfqawgecd lntalktrtg的多肽与50-75mg冻干的纤维蛋白原偶联；②配制2000KIU/mL抑肽酶，取配制好的抑肽酶1mL溶解多肽偶联的冻干纤维蛋白原，即得溶液A，③将凝血酶加入40mmol/L CaCl2中，配制出凝血酶浓度为250-400u/mL的溶液B；④将溶液A和溶液B混合，在底面积为0.25cm2模具中制作成为圆柱形的复合物，置37℃保温1h，即得到纤维蛋白凝胶，4℃冰箱保存备用。
步骤(1)的30ul造血干细胞悬液中含有的造血干细胞个数为1-2×105个。
利用实施例二实验方法，可以得出本发明方法扩增造血干细胞的倍数为20倍。
本实施例仅为进一步说明本发明，并非对发明做出的任何限制，凡在本发明实质内容上做出的简单修改和改进均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种基于3D培养体系的扩增造血干细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)将血液中分离出的造血干细胞悬液置入复合培养基中培养：复合培养基包括无血清干细胞基础培养基、SIFE生长因子、血清替代物、纤维蛋白凝胶；
(2)将(1)的复合培养基置入低氧培养箱中，低氧培养箱维持的氧浓度为3～20％；
上述SIFE生长因子为干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶-3配体、促红细胞生成素、白细胞介素-3、白细胞介素-6、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子组成；
上述纤维蛋白凝胶的制备过程为：①将氨基酸序列为mqaqqyqqqr rkfaaaflaf ifilaavdta eagkkekpek kvkksdcgew qwsvcvptsg dcglgtregt rtgaeckqtm ktqrckipcn wkkqfgaeck yqfqawgecd lntalktrtg的多肽与50-75mg冻干的纤维蛋白原偶联；②配制2 000KIU/mL抑肽酶，取配制好的抑肽酶1mL溶解多肽偶联的冻干纤维蛋白原，即得溶液A，③将凝血酶加入40mmol/LCaCl2溶液中，配制出凝血酶浓度为250-400u/mL的溶液B；④将溶液A和溶液B混合，在底面积为0.25cm2模具中制作成为圆柱形的复合物，置37℃保温1h，即得到纤维蛋白凝胶，4℃冰箱保存备用。
2.根据权利要求1所述一种基于3D培养体系的扩增造血干细胞的方法，其特征在于，步骤(1)复合培养基中，造血干细胞悬液的体积分数为15％、血清替代物的体积分数为15％、纤维蛋白凝胶的体积分数为15-25％、SIFE生长因子中的干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶-3配体、促红细胞生成素、白细胞介素-3、白细胞介素-6、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子在复合培养基中的终浓度依次为50～100ng/mL、25～40ng/mL、0.5～1U/mL、3～5ng/mL、3～5ng/mL、3～5ng/mL、3～5ng/mL，余量为无血清干细胞基础培养基。
3.根据权利要求2所述一种基于3D培养体系的扩增造血干细胞的方 法，其特征在于，造血干细胞悬液中，每30μl含有的造血干细胞个数为1-2×105个。
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