CN111733130A - 一种诱导dc-cik扩增的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及培养方法技术领域，尤其是一种诱导DC‑CIK扩增的培养方法，包括桔梗皂苷D的分离纯化、PCD‑DC‑CIK细胞的制备、免疫细胞PCD‑DC‑CIK的回输、桔梗皂苷D诱导的PCD‑DC‑CIK细胞和常规诱导的DC‑CIK细胞的生长特性监测、荷瘤小鼠PCD‑DC‑CIK细胞治疗前后的生存期评价步骤，利用了桔梗皂苷D有效增加巨噬细胞的增殖和吞噬能力，从而协同发挥DC和CIK细胞的各自功能，通过该方法诱导培养的PCD‑DC‑CIK细胞，体外实验证实其增殖率较常规诱导得到显著提高，抑瘤活性显著增强；动物实验显示，经该法治疗荷瘤小鼠后，其肿瘤比重明显降低，生存期明显延长。
Description
技术领域
本发明涉及培养方法技术领域，尤其涉及一种诱导DC-CIK扩增的培养方法。
背景技术
自体免疫细胞治疗法是指从患者自身的外周血中分离单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)，经体外激活和扩增后回输至患者体内，使之发挥杀伤肿瘤或其它畸变细胞、并调节和增强机体免疫功能的作用。主要包括(1)细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-inducedkillercell，CIK)疗法。是利用白细胞介素2(Interleucin-2，IL-2)、γ型干扰素(Interferon-，IFN-γ)、CD3单克隆抗体等刺激PBMC后获得的一群对多种肿瘤细胞具杀伤活性的异质性细胞来治疗肿瘤的方法，效应细胞主要是CD3+CD56+NKT细胞；(2)自体活化的淋巴细胞(Autologousactivatedlymphocyte，AAL)疗法。早期主要用高浓度IL-2活化PBMC中的淋巴细胞，即淋巴因子激活的杀伤细胞(Lymphokine-activatedkillercell，LAK)。后主要以CD3抗体或CD3/CD28交联抗体从PBMC中活化扩增获得。主要效应细胞为CD3+CD8+T细胞。CD3抗体可直接通过T细胞受体(TCR)刺激T细胞活化与增殖，且能上调TCR的表达并减除TGF-b对细胞毒型T细胞(CTL)产生的抑制。CD28抗体可结合T细胞表面的CD28而产生促使T细胞活化的协同刺激信号，增强CD3抗体的作用且抑制活化导致的细胞死亡效应(Activation-inducedcelldeath，AICD)；(3)肿瘤特异性淋巴细胞(Tumor-reactivelymphocyte)疗法。主要由切除的肿瘤组织中分离的肿瘤浸润型淋巴细胞(Tumorinfiltratedlymphocyte，TIL)经CD3抗体与IL-2活化后用于肿瘤治疗；或由手术获取的淋巴组织中分离的淋巴细胞经CD3抗体与IL-2活化后用于肿瘤治疗；或将携肿瘤抗原的抗原提呈细胞、灭活的自体肿瘤细胞等诱导的PBMC用于肿瘤治疗。(4)自体树突状细胞(Dendriticcell，DC)疗法，即将PBMC或骨髓经GM-CSF及IL－4等细胞因子诱导后产生的DC细胞用TNF-a诱导分化，再回输体内用于诱导抗肿瘤免疫应答。上述的自体免疫细胞疗法在临床均取得了一定的效果，且未见明显的毒副反应，较为安全。但早期自体免疫细胞疗法的临床反应率并不高。比如ALL与CIK体外培养时间长，方法繁琐，肿瘤特异性不强；而TIL或淋巴组织中扩增CTL对材料的获取和培养技术要求均较高，不易实现。因此，寻找方法简单、来源简便及活性高的新免疫细胞疗法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种诱导DC-CIK扩增的培养方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计一种诱导DC-CIK扩增的培养方法，包括以下步骤：
S1、桔梗皂苷D的分离纯化，桔梗皂苷D经从桔梗乙醇提取后，提取经硅胶、色谱分离得到待用；
S2、PCD-DC-CIK细胞的制备，包括如下步骤，
1)、患者准备：根据免疫细胞PCD-DC-CIK治疗的适应症和禁忌症选择该治疗方法的患者，并且签署知情同意书，注明注意事项，对所有患者检测血常规；
2)、外周血采集：无菌管中含有肝素钠，静脉抽取肿瘤患者外周血50mL至无菌管中，充分混匀；
3)、肿瘤抗原获取：得到的外周血常温条件下2000rpm离心沉淀，收集上层血浆，将其加入PCD-DC-CIK诱导培养基中；离心所得沉淀为细胞沉淀物；
4)、单个核细胞分离：所得细胞沉淀物用生理盐水稀释至原体积，轻轻加入淋巴细胞分离液表面，650g离心转速下20分钟，结束后收集分离液表层细胞，加入生理盐水混匀，2000rpm离心，重复洗涤3次，收集细胞沉淀；
5)、PCD-DC-CIK细胞的诱导及培养：所得细胞沉淀物用含桔梗皂苷D的PCD-DC-CIK诱导培养基复悬，再稀释至适当浓度，在培养箱中培养至细胞数量达到回输所需；培养细胞形态如图1所示；
S3、免疫细胞PCD-DC-CIK的回输：包括如下步骤，
a)、预计细胞总数达要求的前三天时，进行微生物、细胞标志物检测(CD3、CD4、CD8及CD16/56)；
b)、细胞检测报告合格后进行回输：细胞总数达到4-5×109个后进行首次回输，每天回输一次，输入4-5天后结束疗程；回输过程密切关注患者的反应，作好不良反应的应急处理措施；
S4、桔梗皂苷D诱导的PCD-DC-CIK细胞和常规诱导的DC-CIK细胞的生长特性：常规分离的DC-CIK细胞用RPMI-1640培养基稀释至1×105/ml，接种于96孔板中，每孔加100μL，重复4孔/板，共3板；PCD-DC-CIK细胞采用同样操作步骤，接种于同一96孔板中，每孔加100μL，重复4孔/板，共3板；将96孔细胞培养板置于37摄氏度、5％CO2(V/V)的饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，分别于不同时间7、10、15天用MTT法测OD570值，根据OD570值计算存活率，如图2所示，在培养第6天，将PCD-DC-CIK细胞或DC-CIK细胞与人肺癌细胞A549数量比为10：1进行共培养，继续培养5天、7天、9天后测定对肿瘤细胞的杀伤作用，如图3所示；
S5、荷瘤小鼠PCD-DC-CIK细胞治疗前后的生存期评价：
复苏小鼠黑色瘤B16细胞后，培养至适当数量，接种于C57小鼠皮下，注射量为100μL，细胞浓度为2-3×107个/mL，共三十只，随机分为三组，另去C57小鼠脾脏，常规制备小鼠DC-CIK细胞，另制备PCD诱导的DC-CIK细胞，于荷鼠小鼠造模后三天起，每日注射诱导11天的DC-CIK细胞和PCD-DC-CIK细胞，注射剂量为0.5mL，细胞浓度均为1×106个/mL，空白对照组注射PBS溶液0.5mL，连续给药5天；记录各组小鼠的存活时间，结果如图2所示，对照组、DC-CIK、PCD-DC-CIK组的平均存活时间为20天、25天、30天。
优选的，所述含桔梗皂苷D的PCD-DC-CIK诱导培养，其桔梗皂苷D的浓度为10-80μg/mL。
优选的，所述DC-CIK细胞来源不限于外周血，可来源于脐血、骨髓。
本发明提出的一种诱导DC-CIK扩增的培养方法，有益效果在于：本发明采用常规提取分离技术得到的桔梗皂苷D，加入常规DC-CIK诱导培养基中，是为了利用桔梗皂苷D有效增加巨噬细胞的增殖和吞噬能力，从而协同发挥DC和CIK细胞的各自功能。通过该方法诱导培养的PCD-DC-CIK细胞，体外实验证实其增殖率较常规诱导得到显著提高，抑瘤活性显著增强；动物实验显示，经该法治疗荷瘤小鼠后，其肿瘤比重明显降低，生存期明显延长。
附图说明
图1为培养的PCD-DC-CIK细胞形态图；
图2为PCD诱导的免疫细胞PCD-DC-CIK与常规DC-CIK的增殖图；
图3为PCD-DC-CIK细胞与常规DC-CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性评价图；
图4为PCD-DC-CIK细胞与常规DC-CIK细胞对荷瘤小鼠治疗前后生存期对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
参照图1-4，一种桔梗皂苷D诱导DC-CIK的方法，包括以下步骤：
S1、桔梗皂苷D的分离纯化，桔梗皂苷D经从桔梗乙醇提取后，提取经硅胶、色谱分离得到待用，含桔梗皂苷D的PCD-DC-CIK诱导培养，其桔梗皂苷D的浓度为40μg/mL；
S2、PCD-DC-CIK细胞的制备，包括如下步骤，
1)、患者准备：根据免疫细胞PCD-DC-CIK治疗的适应症和禁忌症选择该治疗方法的患者，并且签署知情同意书，注明注意事项，对所有患者检测血常规；
2)、外周血采集：无菌管中含有肝素钠，静脉抽取肿瘤患者外周血50mL至无菌管中，充分混匀，DC-CIK细胞来源不限于外周血，可来源于脐血、骨髓，
3)、肿瘤抗原获取：得到的外周血常温条件下2000rpm离心沉淀，收集上层血浆，将其加入PCD-DC-CIK诱导培养基中；离心所得沉淀为细胞沉淀物；
4)、单个核细胞分离：所得细胞沉淀物用生理盐水稀释至原体积，轻轻加入淋巴细胞分离液表面，650g离心转速下20分钟，结束后收集分离液表层细胞，加入生理盐水混匀，2000rpm离心，重复洗涤3次，收集细胞沉淀；
5)、PCD-DC-CIK细胞的诱导及培养：所得细胞沉淀物用含桔梗皂苷D的PCD-DC-CIK诱导培养基复悬，再稀释至适当浓度，在培养箱中培养至细胞数量达到回输所需；培养细胞形态如图1所示；
S3、免疫细胞PCD-DC-CIK的回输：包括如下步骤：
a)、预计细胞总数达要求的前三天时，进行微生物、细胞标志物检测(CD3、CD4、CD8及CD16/56)；
b)、细胞检测报告合格后进行回输：细胞总数达到4-5×109个后进行首次回输，每天回输一次，输入4-5天后结束疗程；回输过程密切关注患者的反应，作好不良反应的应急处理措施；
S4、桔梗皂苷D诱导的PCD-DC-CIK细胞和常规诱导的DC-CIK细胞的生长特性：常规分离的DC-CIK细胞用RPMI-1640培养基稀释至1×105/ml，接种于96孔板中，每孔加100μL，重复4孔/板，共3板；PCD-DC-CIK细胞采用同样操作步骤，接种于同一96孔板中，每孔加100μL，重复4孔/板，共3板；将96孔细胞培养板置于37摄氏度、5％CO2(V/V)的饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，分别于不同时间7、10、15天用MTT法测OD570值，根据OD570值计算存活率，如图2所示，在培养第6天，将PCD-DC-CIK细胞或DC-CIK细胞与人肺癌细胞A549数量比为10：1进行共培养，继续培养5天、7天、9天后测定对肿瘤细胞的杀伤作用，如图3所示；
S5、荷瘤小鼠PCD-DC-CIK细胞治疗前后的生存期评价：
复苏小鼠黑色瘤B16细胞后，培养至适当数量，接种于C57小鼠皮下，注射量为100μL，细胞浓度为2-3×107个/mL，共三十只，随机分为三组，另去C57小鼠脾脏，常规制备小鼠DC-CIK细胞，另制备PCD诱导的DC-CIK细胞，于荷鼠小鼠造模后三天起，每日注射诱导11天的DC-CIK细胞和PCD-DC-CIK细胞，注射剂量为0.5mL，细胞浓度均为1×106个/mL，空白对照组注射PBS溶液0.5mL，连续给药5天；记录各组小鼠的存活时间，结果如图2所示，对照组、DC-CIK、PCD-DC-CIK组的平均存活时间为20天、25天、30天。
实施例二
参照图1-4，一种桔梗皂苷D诱导DC-CIK的方法，包括以下步骤：
S1、桔梗皂苷D的分离纯化，桔梗皂苷D经从桔梗乙醇提取后，提取经硅胶、色谱分离得到待用，含桔梗皂苷D的PCD-DC-CIK诱导培养，其桔梗皂苷D的浓度为60μg/mL；
S2、PCD-DC-CIK细胞的制备，包括如下步骤，
1)、患者准备：根据免疫细胞PCD-DC-CIK治疗的适应症和禁忌症选择该治疗方法的患者，并且签署知情同意书，注明注意事项，对所有患者检测血常规；
2)、外周血采集：无菌管中含有肝素钠，静脉抽取肿瘤患者外周血50mL至无菌管中，充分混匀，DC-CIK细胞来源不限于外周血，可来源于脐血、骨髓，
3)、肿瘤抗原获取：得到的外周血常温条件下2000rpm离心沉淀，收集上层血浆，将其加入PCD-DC-CIK诱导培养基中；离心所得沉淀为细胞沉淀物；
4)、单个核细胞分离：所得细胞沉淀物用生理盐水稀释至原体积，轻轻加入淋巴细胞分离液表面，650g离心转速下20分钟，结束后收集分离液表层细胞，加入生理盐水混匀，2000rpm离心，重复洗涤3次，收集细胞沉淀；
5)、PCD-DC-CIK细胞的诱导及培养：所得细胞沉淀物用含桔梗皂苷D的PCD-DC-CIK诱导培养基复悬，再稀释至适当浓度，在培养箱中培养至细胞数量达到回输所需；培养细胞形态如图1所示；
S3、免疫细胞PCD-DC-CIK的回输：包括如下步骤：
a)、预计细胞总数达要求的前三天时，进行微生物、细胞标志物检测(CD3、CD4、CD8及CD16/56)；
b)、细胞检测报告合格后进行回输：细胞总数达到4-5×109个后进行首次回输，每天回输一次，输入4-5天后结束疗程；回输过程密切关注患者的反应，作好不良反应的应急处理措施；
S4、桔梗皂苷D诱导的PCD-DC-CIK细胞和常规诱导的DC-CIK细胞的生长特性：常规分离的DC-CIK细胞用RPMI-1640培养基稀释至1×105/ml，接种于96孔板中，每孔加100μL，重复4孔/板，共3板；PCD-DC-CIK细胞采用同样操作步骤，接种于同一96孔板中，每孔加100μL，重复4孔/板，共3板；将96孔细胞培养板置于37摄氏度、5％CO2(V/V)的饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，分别于不同时间7、10、15天用MTT法测OD570值，根据OD570值计算存活率，如图2所示，在培养第6天，将PCD-DC-CIK细胞或DC-CIK细胞与人肺癌细胞A549数量比为10：1进行共培养，继续培养5天、7天、9天后测定对肿瘤细胞的杀伤作用，如图3所示；
S5、荷瘤小鼠PCD-DC-CIK细胞治疗前后的生存期评价：
复苏小鼠黑色瘤B16细胞后，培养至适当数量，接种于C57小鼠皮下，注射量为100μL，细胞浓度为2-3×107个/mL，共三十只，随机分为三组，另去C57小鼠脾脏，常规制备小鼠DC-CIK细胞，另制备PCD诱导的DC-CIK细胞，于荷鼠小鼠造模后三天起，每日注射诱导11天的DC-CIK细胞和PCD-DC-CIK细胞，注射剂量为0.5mL，细胞浓度均为1×106个/mL，空白对照组注射PBS溶液0.5mL，连续给药5天；记录各组小鼠的存活时间，结果如图2所示，对照组、DC-CIK、PCD-DC-CIK组的平均存活时间为20天、25天、30天。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种桔梗皂苷D诱导DC-CIK的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、桔梗皂苷D的分离纯化：桔梗皂苷D经从桔梗乙醇提取后，提取经硅胶、色谱分离得到待用；
S2、PCD-DC-CIK细胞的制备：包括如下步骤，
1)、患者准备：根据免疫细胞PCD-DC-CIK治疗的适应症和禁忌症选择该治疗方法的患者，并且签署知情同意书，注明注意事项，对所有患者检测血常规；
2)、外周血采集：无菌管中含有肝素钠，静脉抽取肿瘤患者外周血50mL至无菌管中，充分混匀；
3)、肿瘤抗原获取：得到的外周血常温条件下2000rpm离心沉淀，收集上层血浆，将其加入PCD-DC-CIK诱导培养基中；离心所得沉淀为细胞沉淀物；
4)、单个核细胞分离：所得细胞沉淀物用生理盐水稀释至原体积，轻轻加入淋巴细胞分离液表面，650g离心转速下20分钟，结束后收集分离液表层细胞，加入生理盐水混匀，2000rpm离心，重复洗涤3次，收集细胞沉淀；
5)、PCD-DC-CIK细胞的诱导及培养：所得细胞沉淀物用含桔梗皂苷D的PCD-DC-CIK诱导培养基复悬，再稀释至适当浓度，在培养箱中培养至细胞数量达到回输所需，培养细胞形态如图1所示；
S3、免疫细胞PCD-DC-CIK的回输：包括如下步骤，
a)、预计细胞总数达要求的前三天时，进行微生物、细胞标志物检测(CD3、CD4、CD8及CD16/56)；
b)、细胞检测报告合格后进行回输：细胞总数达到4-5×109个后进行首次回输，每天回输一次，输入4-5天后结束疗程；回输过程密切关注患者的反应，作好不良反应的应急处理措施；
S4、桔梗皂苷D诱导的PCD-DC-CIK细胞和常规诱导的DC-CIK细胞的生长特性：常规分离的DC-CIK细胞用RPMI-1640培养基稀释至1×105/ml，接种于96孔板中，每孔加100μL，重复4孔/板，共3板；PCD-DC-CIK细胞采用同样操作步骤，接种于同一96孔板中，每孔加100μL，重复4孔/板，共3板；将96孔细胞培养板置于37摄氏度、5％CO2(V/V)的饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，分别于不同时间7、10、15天用MTT法测OD570值，根据OD570值计算存活率，如图2所示，在培养第6天，将PCD-DC-CIK细胞或DC-CIK细胞与人肺癌细胞A549数量比为10：1进行共培养，继续培养5天、7天、9天后测定对肿瘤细胞的杀伤作用，如图3所示；
S5、荷瘤小鼠PCD-DC-CIK细胞治疗前后的生存期评价：
复苏小鼠黑色瘤B16细胞后，培养至适当数量，接种于C57小鼠皮下，注射量为100μL，细胞浓度为2-3×107个/mL，共三十只，随机分为三组，另去C57小鼠脾脏，常规制备小鼠DC-CIK细胞，另制备PCD诱导的DC-CIK细胞，于荷鼠小鼠造模后三天起，每日注射诱导11天的DC-CIK细胞和PCD-DC-CIK细胞，注射剂量为0.5mL，细胞浓度均为1×106个/mL，空白对照组注射PBS溶液0.5mL，连续给药5天；记录各组小鼠的存活时间，结果如图2所示。对照组、DC-CIK、PCD-DC-CIK组的平均存活时间为20天、25天、30天。
2.根据权利要求1所述的采用桔梗皂苷D诱导DC-CIK方法，其特征在于，所述含桔梗皂苷D的PCD-DC-CIK诱导培养，其桔梗皂苷D的浓度为10-80μg/mL。
3.根据权利要求1所述的采用桔梗皂苷D诱导DC-CIK方法，其特征在于，所述DC-CIK细胞来源不限于外周血，可来源于脐血、骨髓。
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