CN104651313B

CN104651313B - 级联激活的免疫细胞、制备方法以及应用

Info

Publication number: CN104651313B
Application number: CN201510074131.9A
Authority: CN
Inventors: 邹汉东; 于兆学; 夏凡
Original assignee: Guangzhou Dudd Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Dude Biotechnology Co ltd
Priority date: 2015-02-11
Filing date: 2015-02-11
Publication date: 2018-08-03
Anticipated expiration: 2035-02-11
Also published as: CN104651313A

Abstract

本发明提供一种级联激活的免疫细胞、制备方法以及应用，所述制备方法包括以下步骤：分离得到单核细胞；进行培养，加入CD3抗体和干扰素γ，初级刺激单核细胞，进入初级刺激孵育期，培养；加入IL‑2、IL‑4、IL‑1和巨噬细胞集落刺激因子,进一步活化培养，得到活化后的外周血单核细胞。通过上述方法得到的活化后的外周血单核细胞，可用于制备治疗乳腺癌、恶性黑色素瘤的药物。

Description

级联激活的免疫细胞、制备方法以及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种级联激活的免疫细胞、制备方法和应用。

背景技术

CD3体外活化T细胞在特定细胞因子环境下会引起其他细胞，特别是抗原呈递细胞(APC)的激活。抗原呈递细胞，也被称为信息细胞，在血液中循环，并提呈外源蛋白，肿瘤蛋白作为变异的非自体抗原也可被其提呈。在APC中，树突状细胞(DC)是抗原提呈效力最高的一种细胞，DC可通过特定细胞因子(如IL-4、GMCSF)活化外周血中的单细胞(monocytes)获得，肿瘤抗原加DC现正作为肿瘤疫苗在肿瘤治疗方面进行实验。如果未经活化的T细胞被加入到活化的呈递肿瘤抗原的APC中，T细胞的活化和启动可通过特异性I细胞受体完成，从而获得特异性识别和杀伤肿瘤的能力。这种利用抗原呈递细胞结合抗CD3单克隆抗体及特定细胞因子的两步法链式反应激活的细胞被称为CAPRI细胞。CAPRI细胞疗法的效应细胞(具有杀伤肿瘤细胞能力的细胞)有两种：以CD4+和CD8+为主的T辅助细胞和T杀伤细胞(细胞毒细胞)，约占80％，以CD3+和CD56+为主的NKT细胞、以及NK细胞和树突状细胞(DC)，这部分效应细胞约占20％。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新的激活的免疫细胞的制备方法。

实现上述目的的技术方案如下：

一种激活的免疫细胞的制备方法，包括以下步骤：

分离得到外周血单核细胞；

分离后的单核细胞与CD3抗体共培养2～4小时后，加入干扰素γ共培养20～24小时，初级刺激单核细胞，进入初级刺激孵育期；

加入IL-2(白细胞介素-2)、IL-4(白细胞介素-4)、IL-1(白细胞介素-1)和巨噬细胞集落刺激因子,进一步活化培养70～72小时，从而进入连续刺激效应细胞表达，得到级联激活的免疫细胞。

在其中一个实施例中，进行培养时单核细胞的接种密度为1～2x10⁹/L，0.5ml/孔，所述CD3的加入量为1～2ug，干扰素γ的加入量为1000～2000IU。

每孔中加入的所述IL-2、IL-4、IL-1和巨噬细胞集落刺激因子的量分别为：1000～2000IU、100～200ng、40～60ng和300～500ng。

本发明的另一个目的是提供一种级联激活的免疫细胞。

具体技术方案如下。

一种级联激活的免疫细胞，其通过上述制备方法得到。

本发明的另一目的是提供所述级联激活的免疫细胞的应用。

具体技术方案如下。

上述级联激活的免疫细胞，在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

本发明的另一目的是提供一种治疗乳腺癌的药物。

具体技术方案如下。

一种治疗乳腺癌的药物，其活性成分包括有上述级联激活的免疫细胞。

本发明的另一目的是提供一种治疗恶性黑色素瘤的药物。

具体技术方案如下。

上述活化后的级联激活的免疫细胞，在制备治疗恶性黑色素瘤的药物中的应用。

具体技术方案如下。

一种治疗恶性黑色素瘤的药物，其活性成分包括有上述级联激活的免疫细胞。

本发明的发明人通过长期的实验，发现初级刺激外周血单核细胞过程中，CD3抗体和干扰素γ的加入顺序和浓度的不同会对结果有较大影响，本发明的方案会对免疫细胞的增殖速率会有显著的提升；且本发明提供方案所得到的免疫细胞(CAPRI)的效应细胞CD3+CD56+的比值也有显著提升。链式激活的免疫细胞对乳腺癌细胞能有较好的裂解，且对恶性黑色素瘤细胞的增殖也有较好的抑制作用。CAPRI细胞用于临床上，整个治疗过程是安全的，没有负面效果。在一周内即可获得大量具有癌症特异性CAPRI细胞，可用以对不同类型的癌症进行有效的过继性细胞治疗。

附图说明

图1为实施例1中级联激活的免疫细胞的制备步骤示意图；

图2为实施例2中CAPRI细胞培养过程中细胞状态示意图；

图3为实施例2中细胞流式检测示意图；

图4为实施例3中细胞增殖和流式检测结果比对图；

图5为实施例4中级联激活的CAPRI细胞对乳腺癌细胞的裂解测试结果示意图；

图6为实施例5中级联激活的CAPRI细胞对恶性黑色素瘤细胞增殖的MTT抑制实验检测示意图。

具体实施方式

实施例1

本实施例所述的级联激活的免疫细胞通过以下方法得到。

1.单核细胞的获得(见附图1)

1.1新鲜乳腺癌患者外周血(山东省某医学院附属医院患者提供)(肝素抗凝20u/ml)取样(供后续检测备用)，将剩余外周血与生理盐水照按1：1稀释；

1.2在50ml离心管中预先加入淋巴细胞分离液15ml，再加入稀释好的外周血25ml；

1.3小心的将稀释后的血液加到分离液的上面；

1.4离心：转速：1500r/min，温度20℃～28℃，时间：20min；

1.5离心管内顺次为血浆－－单个核细胞层－－分离液－－红细胞；

1.6用移液管吸出单个核细胞层，重悬于2～5倍体积的生理盐水中；

1.7离心：转速：2000～2300r/min，时间：10min，温度：4℃；

1.8离心后，弃上清液，细胞沉淀重悬于1ml完全培养基中(含10％FCS的RPM-1640培养液)。

2.CD3抗体和干扰素γ，初级刺激单核细胞(见附图1)

2.1调整细胞密度为1～2x10⁹/L，放入48孔培养板，0.5ml/孔，CD3的加入量为1ug，置于37℃，5％CO2的恒温二氧化碳培养箱中培养4小时；

2.2每孔加入1500IU干扰素γ再次活化效应细胞；

2.3将初次激活的细胞置于37℃，5％CO2的恒温二氧化碳培养箱中培养20小时。

3.单核细胞的第二步激活(见附图1)

3.1将2.3中培养20小时后培养物收集到50ml离心管中，750G离心8分钟，去上清，用50ml RPMI1640重悬细胞，计数，离心。

3.2用完全培养基将所有细胞重悬，调整细胞密度为1～2x10⁹/L，放入48孔培养板，0.5ml/孔，加入IL-2、IL-4、IL-1和巨噬细胞集落刺激因子，每孔加入量分别为：1500IU、1500ng、50ng和400ng。

3.3将培养板放置于37℃，5％CO2的恒温二氧化碳培养箱中培养72小时。

4.级联激活的免疫细胞的扩增培养和收获(见附图1)

4.1将经72小时培养的培养物(CAPRI细胞)收集到50ml离心管中，750G离心8分钟，去上清，用生理盐水重悬细胞，计数，离心。

4.2再次离心后可得有活性的级联激活的免疫细胞(CAPRI细胞)，用盐水重悬后备用。

实施例2

1.按上述实施例1中方法获得级联激活的免疫细胞(CAPRI细胞)，期间进行细胞状态观察(见附图2)；

2.将得到的免疫细胞(CAPRI细胞)，用盐水调整细胞密度为1～2x10⁹/L，取2ml细胞悬液留样，待流式检测；

3.准备流式抗体，三种双色抗体组合物分别为：FITC-IgG/PE-IgG,FITC-CD3/PE-CD56,FITC-CD4/PE-CD25；

4.将实施例1和2中的待检样品用上述抗体分别染色、固定后，上机检测；

5.上述方法得到的免疫细胞(CAPRI细胞)的流式鉴定显示：CD3+CD56+为35.98％(见附图3A)，CD4+CD25+为5.11％(见附图3B)，而外周血中细胞的流式鉴定显示：CD3+CD56+为8.38％(见附图3C)，CD4+CD25+为19.52.11％(见附图3D)。

实施例3

1.按上述实施例1中方法从外周血中分离获得单核细胞；

2.CD3抗体和干扰素γ，初级刺激单核细胞；

2.1实验组a、实验组b：调整细胞密度为1～2x10⁹/L，放入48孔培养板，0.5ml/孔，a、b两组CD3的加入量分别为1ug、2ug，置于37℃，5％CO2的恒温二氧化碳培养箱中培养4小时；实验组a每孔加入1000IU干扰素γ，实验组b每孔加入1500IU干扰素γ，再次活化效应细胞；将细胞置于37℃，5％CO2的恒温二氧化碳培养箱中培养20小时；

2.2实验组c、实验组d：调整细胞密度为1～2x10⁹/L，放入48孔培养板，0.5ml/孔，c、d两组干扰素γ的加入量分别为1000IU、1500IU，置于37℃，5％CO2的恒温二氧化碳培养箱中培养4小时后，实验组c每孔加入1ug CD3，实验组d每孔加入2ug CD3，再次活化效应细胞；将细胞置于37℃，5％CO2的恒温二氧化碳培养箱中培养20小时；

3.单核细胞的第二步激活及级联激活的免疫细胞的扩增培养和收获均按上述实施例1中方法，72小时后得到免疫细胞(CAPRI细胞)，分别取样计数，计算各实验组细胞的增殖速率进行差异性比较，结果发现实验组b的细胞增殖速率明显高于其它三组(见附图4A)；

4.用盐水调整细胞密度为1～2x10⁹/L，取2ml细胞悬液留样，用两种双色抗体组合物：FITC-IgG/PE-IgG,FITC-CD3/PE-CD56，按上述实施例2中方法对各实验组进行流式检测，结果进行差异性比较，显示实验组b的效应细胞CD3+CD56+的比值明显高于其它三组(见附图4B)。

实施例4

1.按实施例1中方法得到级联激活的免疫细胞(CAPRI细胞)，期间进行细胞状态观察，见附图5B；

2.用1640将CAPRI细胞重悬，调整细胞密度为1～2x10⁹/L；

3.将CAPRI细胞悬液与正在培养过程中的人乳腺癌细胞(实施例1中山东省某医学院附属医院患者手术提供组织，按照常规方法细胞传代制备所得)共培养24h，进行铬释放试验；

4.上述实验结果发现大多数乳腺癌细胞与CAPRI细胞共培养24h后细胞被裂解了(见附图5C)，CAPRI细胞在5:1的效靶比(E:T)时癌细胞的裂解比例是27.1％并且E：T比值为20:1时癌细胞裂解89.9％(见附图5D)。

实施例5

1.单核细胞的获得：按实施例1中方法得到级联激活的免疫细胞(CAPRI细胞)，新鲜恶性黑色素瘤患者外周血(山东省某医学院附属医院患者提供)；

2.用1640将CAPRI细胞重悬，调整细胞密度为4x10⁹/L作为效应细胞；

3.将人恶性黑色素瘤细胞(实施例4中山东省某医学院附属医院患者手术提供组织，按常规方法分离细胞制备所得)培养到对数生长期，作为靶细胞；

4.将CAPRI细胞悬液与恶性黑色素瘤细胞效靶比为20:1，共培养72小时，期间进行MTT抑制实验检测，结果发现共培养48小时，抑制率达74.51％，共培养72小时，抑制率可达91.38％(见附图6)。

在以上实施案例中，CD3抗体和干扰素γ合适的加入时间、顺序和浓度会对免疫细胞的增殖速率会有很大的提升，从而在一周以内获得大量的免疫细胞；且本发明提供方案所得到的免疫细胞的效应细胞CD3+CD56+的比值有明显提升，由外周全血中的8.38％提升到35.98％，抑制细胞CD4+CD25+由外周全血的19.52.11％降至5.11％；案例中链式激活的免疫细胞对乳腺癌细胞有较好的裂解，对恶性黑色素瘤细胞的增殖也有很好的抑制作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种级联激活的免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分离得到外周血单核细胞；

(2)分离得到的单核细胞与CD3抗体共培养2～4小时后，加入干扰素γ共培养20～24小时，初级刺激单核细胞，进入初级刺激孵育期；

(3)在上述(2)步中共培养20～24小时结束后，加入IL-2、IL-4、IL-1和巨噬细胞集落刺激因子,进一步活化培养70～72小时，得到级联激活的免疫细胞；

步骤(2)中进行培养时单核细胞的接种密度为1～2x10⁹/L，0.5mL/孔；所述CD3的加入量为1～2μg/孔，干扰素γ的加入量为1000～2000IU/孔；

步骤(3)中，每孔中加入的所述IL-2、IL-4、IL-1和巨噬细胞集落刺激因子的量分别为：1000～2000IU、100～200ng、40～60ng和300～500ng。

2.根据权利要求1所述的激活的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述CD3的加入量为2μg/孔，干扰素γ的加入量为1500IU/孔。

3.权利要求1-2任一项所述的制备方法得到的级联激活的免疫细胞。

4.权利要求3所述的级联激活的免疫细胞在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

5.一种治疗乳腺癌的药物，其特征在于，其活性成分包括权利要求3所述的级联激活的免疫细胞。

6.权利要求3所述的级联激活的免疫细胞在制备治疗恶性黑色素瘤的药物中的应用。

7.一种治疗恶性黑色素瘤的药物，其特征在于，其活性成分包括权利要求4所述的级联激活的免疫细胞。