CN105567631A - 一种用于培养链式激活的免疫细胞的试剂盒 - Google Patents

一种用于培养链式激活的免疫细胞的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于培养链式激活的免疫细胞的试剂盒，本发明的本试剂盒可高质量、高数量培养出CAPRI细胞，解决了现有的CAPRI细胞增殖能力差的问题，采用本方法制备CAPRI细胞数量是传统方法的4倍左右，并保留了CAPRI细胞杀伤能力。本试剂盒可规模化生产，运输方便，-80℃低温保存时间长。

Description

一种用于培养链式激活的免疫细胞的试剂盒
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种用于培养链式激活的免疫细胞的试剂盒。
背景技术
随着现在分子生物学技术和肿瘤免疫学的发展，肿瘤生物治疗已成为继手术、放疗和化疗后的第四种肿瘤治疗模式，以其安全有效、副作用小及适应症广等优点逐渐被广大医务工作者、患者及家属接受。肿瘤生物治疗首先采集病人自身的免疫细胞或应用干细胞，体外培养、激活、扩增，使其具有强大的识别和杀伤肿瘤细胞的能力，然后回输到病人体内，直接杀伤肿瘤细胞，同时激发自身免疫功能，达到治疗肿瘤的目的。链式激活的免疫细胞(CascadePrimedImmunecells,下简称CAPRI细胞)治疗是肿瘤生物治疗的非常重要的治疗方法，CAPRI细胞疗法的效应细胞包括：NK细胞、NKT细胞、DC细胞、以及CD4+的T辅助细胞(Th)和CD8+的细胞毒T细胞(CTL)，后两者是主要的杀伤效应细胞，在数量方面，Th和CTL细胞约占总数的80％，其余占20％。CAPRI细胞治疗适用于早、中、晚各期肿瘤病人，可应用于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肠癌、脑瘤、黑色素瘤、前列腺癌、头颈部肿瘤、食道癌、肾癌、肝癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胆囊癌、肉瘤、皮肤癌等二十多种实体肿瘤和血液肿瘤(T淋巴细胞瘤除外)的治疗。
传统的CAPRI细胞培养的方法包括以下几个步骤：
①起始的CD3激活阶段(2-4小时)；
②IL2辅助阶段(2-3小时)：加入20单位的IL2/ml；
③引发阶段(18-24小时)
④扩充阶段(72小时)：细胞因子加入20单位/ml的IL2
传统的CAPRI细胞培养的方法存在以下缺陷：
①传统的培养方法细胞增殖能力差，最后获CAPRI细胞仅扩增2-3倍，
②传统CAPRI细胞培养方法允许采用加入培养液10％胎牛血清；
③传统CAPRI细胞培养方法加入细胞因子比较单一，且浓度比较低。
④传统CAPRI细胞培养方法没有上升到试剂盒高度，故不能产业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于培养链式激活的免疫细胞的试剂盒，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种高增殖力链式激活的免疫细胞试剂盒，包含有如下的组分：
1)A号液：所述的A号液为稀释液；
2)B号液：所述的B号液为分离液；
3)C号液：所述的C号液为洗涤液；
4)D号液：所述的D号液为培养液；
5)E号液为CAPRI体外处理试剂，其中包括Ⅰ液，为rhIL-2和IFN-γ的混合液；Ⅱ液为rhIL-2、rhIL-15、rhIL-18和IFN-γ的混合液，
优选的，所述A号液为pH7.2～7.4的PBS释液液。
优选的，所述B号液为由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.077±0.001的分层液。
优选的，所述C号液为质量比0.9％生理盐水。
优选的，所述E号液中Ⅰ液为15000-25000U/mlrhIL-2和15000-25000U/mlIFN-γ的培养液。
优选的，E号液中Ⅱ液为27000-35000U/mlrhIL-2、500-600ng/mlrhIL-15、7500-12500U/mlrhIL-18和27000-35000U/mlIFN-γ的培养液。
本发明另一个方面还提供一种用于培养链式激活的免疫细胞的培养液，其组成包括：氯化钾28-32mg/ml、氯化钙38-42mg/ml、硫酸镁11-13mg/ml、氯化钠48-52mg/ml、磷酸二氢钾28-32mg/ml、碳酸氢钙11-12mg/ml、氨基酸13mg/ml、维生素21-22mg/ml、微量元素0.93mg/ml、白蛋白43-47mg/ml、胰岛素7.8-8.2mg/ml、亚油酸0.38-0.42mg/ml、油酸4.8-5.2mg/ml、谷胱甘肽2.3-2.7mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸14.5-15.5mg/ml、葡萄糖14.8-15mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml。
上述的培养液用于制备用于链式激活的免疫细胞培养的试剂盒；
本发明还提供上述高增殖力链式激活的免疫细胞试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)取抗凝外周加入A号液，混匀得混合液；
2)在离心管中加入B号液；
3)将步骤1)的混合液小心沿管壁加入B号液液面上；
4)以2500-3000转/分离心至离心管中由上至下细胞分为四层；
5)收集第二层细胞，用C号液混匀后，以1800-2000转/分离心，弃去上清留沉淀重新用C号液悬浮，洗涤得所需外周血单个核细胞(PBMC)；
6)将分离的部分外周血单个核细胞用D号液调整细胞浓度2×106，加入到抗CD3抗体和Retronectin-T100B包被的细胞培养瓶中；
7)在37℃、CO2浓度为5％细胞培养箱中培养2.5-3.5小时后，加入E号液试剂Ⅰ，调整细胞因子rhIL-2和IFN-γ终浓度分别为750-1250U/ml、750-1250U/ml；
8)继续培养2.5-.35小时后加入步骤5)分离的剩余的PBMC，混匀后继续培养，然后吸取收集培养的细胞，离心清洗后，悬浮培养在D号液中，加入E号液试剂Ⅱ，调整细胞因子rhIL-2、rhIL-15、rhIL-18和IFN-γ浓度分别为450-580U/ml、9-10ng/ml、120-200U/ml和500-600U/ml；
9)继续培养48小时后换液，补加D号液和E号液，继续培养24小时后倍量换液，继续培养48小时后收获冻存。
本发明的有益效果是：应用本试剂盒可高质量、高数量培养出CAPRI细胞，解决了现有的CAPRI细胞增殖能力差的问题，采用本方法制备CAPRI细胞数量是传统方法的4倍左右，并保留了CAPRI细胞杀伤能力。本试剂盒可规模化生产，运输方便，-80℃低温保存时间长。
附图说明
图1：传统方法培养CAPRI细胞与本发明技术培养CAPRI细胞数量比较。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1
一种高增殖力链式激活的免疫细胞试剂盒，该试剂盒内容物中包括试剂、耗材两大部分，其中试剂类包括A号液为稀释液，B号液为分离液，C号液为洗涤液，D号液为培养液，E号液为CAPRI体外处理试剂(包括Ⅰ液1ml四支，为一定浓度rhIL-2和IFN-γ的配制液，试剂瓶为蓝色帽；Ⅱ液1.5ml八支，为一定浓度rhIL-2、rhIL-15、rhIL-18和IFN-γ的配制液，试剂瓶为绿色帽)；耗材包括50ml一次性离心管8支，10ml一次性移液管8支，3ml巴氏吸管2支。
其中：①A号液稀释液为pH7.2～7.4的PBS释液液；
②B号液分离液由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.077±0.001的分层液；
③C号液洗涤液为0.9％生理盐水；
④D号液为培养液，其成分如下：氯化钾28-32mg/ml、氯化钙38-42mg/ml、硫酸镁11-13mg/ml、氯化钠48-52mg/ml、磷酸二氢钾28-32mg/ml、碳酸氢钙11-12mg/ml、氨基酸13mg/ml、维生素21-22mg/ml、微量元素0.93mg/ml、白蛋白43-47mg/ml、胰岛素7.8-8.2mg/ml、亚油酸0.38-0.42mg/ml、油酸4.8-5.2mg/ml、谷胱甘肽2.3-2.7mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸14.5-15.5mg/ml、葡萄糖14.8-15mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml；
⑤E号液试剂Ⅰ为15000-25000U/mlrhIL-2和15000-25000U/mlIFN-γ的培养液1ml。
⑥E号液试剂Ⅱ为27000-35000U/mlrhIL-2、500-600ng/mlrhIL-15、7500-12500U/mlrhIL-18和27000-35000U/mlIFN-γ的培养液2ml。
⑦E号液试剂Ⅰ、Ⅱ液盛放的包装袋为140×100mm的自封袋，透明，密封性好，材料加厚，不易破损，易消毒，耐受-80℃低温，运输方便。
⑧E号液试剂Ⅰ、Ⅱ液盛放的试剂瓶为1.8ml冻存管，材料为聚丙烯，外旋盖为聚乙烯，易消毒，耐受-80℃低温，不易破损。
实施例2
采用本发明技术培养CAPRI细胞(Cascadeprimedimmunecells)与传统方法培养CAPRI细胞比较。
传统培养CAPRI细胞步骤：抽取健康志愿者肝素抗凝外周血100ml，加入两支50ml离心管中，以1600rpm/min离心20min后，吸取上清血浆并制备自体血清备用；向已吸取上清血浆的血细胞中加60ml生理盐水，小心混匀；取四支50ml离心管，每支加入12ml医用级人淋巴细胞分离液；将混合液小心沿管壁加入分离液液面上，每支离心管加20ml左右混合液；以2000转/分离心20分钟，此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层：血浆层，第二层：为环状乳白色淋巴细胞层，第三层：为透明分离液层，第四层：为红细胞层。用3ml巴氏吸管轻轻收集第二层细胞放入50ml离心管中，用生理盐水充分混匀后，1800转/分离心5分钟，弃去上清留沉淀重新悬起。重复洗涤2次既得所需外周血单个核细胞。将分离的一半单个核细胞用培养液(加10％肽牛血清，也可加自体血清)调整细胞浓度2×106/ml左右，加入到CD3单抗包被的培养瓶中。在37℃、CO2浓度为5％的细胞培养箱中培养3小时后，调整IL2浓度为20单位/ml，继续培养3小时后加入另一半淋巴细胞，混匀后继续培养16小时，然后吸取收集培养的细胞，离心清洗两次后，悬浮培养在培养液中，调整IL2浓度为20单位/ml，继续培养72小时后收获CAPRI细胞，手持式细胞计数器计数，计数3次，重复实验3次取均值，CAPRI细胞数量3.25±0.42×108个。同时采用流式细胞仪检测细胞免疫表型CD3、CD4、CD8、CD56的表达。
采用本试剂盒培养CAPRI细胞步骤：抽取健康志愿者肝素抗凝外周血100ml(或者采用离体的肝素抗凝外周血)，加入两支50ml离心管中，以1600rpm/min离心20min后，吸取上清血浆并制备自体血清备用；每支加入30mlA号液，小心混匀得混合液；取四支50ml离心管，每支加入15mlB号液；将混合液小心沿管壁加入B号液液面上，每支离心管加25ml混合液；以2500转/分离心20分钟；此时离心管中由上至下细胞分为四层，第一层：血浆层，第二层：为环状乳白色淋巴细胞层，第三层：为透明分离液层，第四层：为红细胞层；用3ml巴氏吸管轻轻收集第二层细胞放入50ml离心管中，用C号液充分混匀后，以1800转/分离心5分钟，弃去上清留沉淀用C号液重新悬起，重复洗涤2次既得所需外周血单个核细胞(PBMC)；将分离的一半外周血单个核细胞用D号液调整细胞浓度2×106左右，加入到CD3抗体(终浓度1ug/ml)和Retronectin-T100B(终浓度为12.5ug/ml)包被的细胞培养瓶中；在37℃、CO2浓度为5％细胞培养箱中培养3小时后，加入E号液试剂Ⅰ，调整细胞因子rhIL-2和IFN-γ浓度分别为800-1000U/ml、800-1000U/ml；继续培养3小时后加入另一半PBMC，混匀后继续培养16小时，然后吸取收集培养的细胞，C号液重新悬起离心清洗两次后，悬浮培养在D号液(可加5-10％自体血清)中，加入E号液试剂Ⅱ液，调整细胞因子rhIL-2、rhIL-18和IFN-γ浓度分别为500-600U/ml、150-200U/ml和500-600U/ml；继续培养48小时后换液，换液原则是补加半量的D号液和相应的细胞因子，继续培养24小时后倍量换液，继续培养48小时后收获冻存，期间倍量换液两次。两次收获后手持式细胞计数器计数，计数3次，重复实验3次取均值。数量12.91±0.37×108个。同时采用流式细胞仪检测细胞免疫表型CD3、CD4、CD8、CD56的表达。
采用本方法制备CAPRI细胞数量为12.91±0.37×108个，传统方法制备CAPRI细胞数量为3.25±0.42×108个，采用本方法制备CAPRI细胞数量是传统方法的3.97倍(图1)，具有统计学差异(P＜0.01)。表1可得，细胞免疫表型CD3、CD4、CD8、CD56的表达采用本方法制备CAPRI细胞略高于传统方法制备的CAPRI细胞，不存在统计学差异(P＞0.05)。
表1：CAPRI细胞免疫表型(细胞免疫表型阳性率％，x±s)
实施例3
传统方法培养CAPRI细胞与本发明技术培养CAPRI细胞体外毒性试验
将收获的两种CAPRI细胞作为效应细胞，对数生长期的人肺鳞状细胞癌NCI-H520细胞株用0.4％台盼兰染色并计数作为靶细胞，以不同效靶比5:1、10：1、20:1将效应细胞和靶细胞用无血清1640培养基调节细胞浓度为1×106/ml，加入96孔板，100μl/孔，另外设置空白对照孔，样品对照孔，样品最大酶活性对照孔，每孔设3个复孔，置于37℃、5％浓度CO2培养箱中培养24h，用LDH释放法检测杀伤活性。收集实验数据并经SPSS17.0统计软件处理，计量资料用均数标准差表示，组间比较采用两样本t检验，P﹤0.05具有统计学意义。实验结果如表2所示，从结果可知传统方法培养CAPRI细胞和本发明技术培养CAPRI细胞均对NCI-H520细胞均有显著的杀伤活性，杀伤活性不存在统计学差异(P＞0.05)，本发明技术培养的CAPRI细胞保留了CAPRI细胞杀伤能力。
表2：两种CAPRI细胞的体外细胞毒性试验比较
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种高增殖力链式激活的免疫细胞试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有如下的组分：
1)A号液：所述的A号液为稀释液；
2)B号液：所述的B号液为分离液；
3)C号液：所述的C号液为洗涤液；
4)D号液：所述的D号液为培养液；
5)E号液为CAPRI体外处理试剂，其中包括Ⅰ液，为rhIL-2和IFN-γ的混合液；Ⅱ液为rhIL-2、rhIL-15、rhIL-18和IFN-γ的混合液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的A号液为pH7.2～7.4的PBS释液液。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的B号液为由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.077±0.001的分层液。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的C号液为质量比为0.9％生理盐水。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的E号液中Ⅰ液为15000-25000U/mlrhIL-2和15000-25000U/mlIFN-γ的培养液。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的E号液中Ⅱ液为27000-35000U/mlrhIL-2、500-600ng/mlrhIL-15、7500-12500U/mlrhIL-18和27000-35000U/mlIFN-γ的培养液。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的D号液为培养液，其组成包括：氯化钾28-32mg/ml、氯化钙38-42mg/ml、硫酸镁11-13mg/ml、氯化钠48-52mg/ml、磷酸二氢钾28-32mg/ml、碳酸氢钙11-12mg/ml、氨基酸13mg/ml、维生素21-22mg/ml、微量元素0.93mg/ml、白蛋白43-47mg/ml、胰岛素7.8-8.2mg/ml、亚油酸0.38-0.42mg/ml、油酸4.8-5.2mg/ml、谷胱甘肽2.3-2.7mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸14.5-15.5mg/ml、葡萄糖14.8-15mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml。
8.权利要求1-7任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的方法，包括如下步骤：
1)取抗凝外周加入A号液，混匀得混合液；
2)在离心管中加入B号液；
3)将步骤1)的混合液小心沿管壁加入B号液液面上；
4)以2500-3000转/分离心至离心管中由上至下细胞分为四层；
5)收集第二层细胞，用C号液混匀后，以1800-2000转/分离心，弃去上清留沉淀重新用C号液悬浮，洗涤得所需外周血单个核细胞(PBMC)；
6)将分离的部分外周血单个核细胞用D号液调整细胞浓度2×106，加入到抗CD3抗体和Retronectin-T100B包被的细胞培养瓶中；
7)在37℃、CO2浓度为5％细胞培养箱中培养2.5-3.5小时后，加入E号液试剂Ⅰ，调整细胞因子rhIL-2和IFN-γ终浓度分别为750-1250U/ml、750-1250U/ml；
8)继续培养2.5-.35小时后加入步骤5)分离的剩余的PBMC，混匀后继续培养，然后吸取收集培养的细胞，离心清洗后，悬浮培养在D号液中，加入E号液试剂Ⅱ，调整细胞因子rhIL-2、rhIL-15、rhIL-18和IFN-γ浓度分别为450-580U/ml、9-10ng/ml、120-200U/ml和500-600U/ml；
9)继续培养48小时后换液，补加D号液和E号液，继续培养24小时后倍量换液，继续培养48小时后收获冻存。
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