CN110358730A - 一种用于capri细胞的培养基组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于CAPRI细胞的培养基组合物及其制备方法和应用。本发明的用于CAPRI细胞的培养基组合物，其组分包括：A液和B液；其中，A液组成成分包括：基础培养基、IL‑2、IFN‑γ、GM‑CSF；还可进一步包括IL‑15、IL‑18和IL‑4中的一种或多种；B液组成成分包括：基础培养基、IL‑2、IFN‑γ；还可进一步包括IL‑15和/或IL‑18。本发明的培养基可用于CAPRI细胞的培养，可缩短CAPRI细胞培养周期，增加细胞数量，细胞成分中有更多的CD8+T细胞，更低的Treg调节细胞，生产出的CAPRI细胞的杀伤能力更强，冻存后复苏率更高。

Description

一种用于CAPRI细胞的培养基组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明是关于一种用于CAPRI细胞的培养基组合物及其制备方法和应用，属于细胞培养技术领域。
背景技术
免疫细胞治疗技术是采集人体免疫细胞，在多种免疫活性因子的作用下，经过体外培养，消除患者体内的免疫抑制因素，筛选并大量扩增免疫效应细胞，然后再回输到体内，杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞。免疫细胞治疗又称细胞免疫治疗或细胞过继免疫治疗，近年来发展迅速，被誉为继手术、化疗、放疗后第四种最有前景的肿瘤治疗方法，其临床研究在国外非常活跃，某些种类的免疫细胞治疗也已经获得临床应用。细胞治疗包括使用基因工程合成的肿瘤多肽诱导T淋巴细胞以对抗相应的肿瘤抗原、淋巴因子激活的杀伤细胞(简称LAK细胞)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、抗原呈递细胞(DC)，链式激活的免疫细胞(简称CAPRI细胞)等。在CAPRI之前，临床使用上以CIK为最多，但总的来说都还缺乏临床治疗的有力数据。针对之前多种细胞疗法存在的不足之处，德国慕尼黑大学医学院免疫研究所教授Rudolf Wank在CIK细胞疗法上进行了改进，发明了CAPRI细胞疗法，CAPRI细胞疗法全称Cascade Primed Immune cells，即链式激活的免疫细胞，又名链式CIK，这种细胞疗法克服了之前几种细胞疗法的诸多不足，其杀伤机理比CIK更加优越，临床疗效更加显著。经过在德国十多年的临床观察，该疗法可提高患者免疫力和抵抗力、提高生活质量、巩固和强化其他治疗效果、预防和延缓复发与转移、延长生存期。该技术的原理是应用肿瘤病人的外周血淋巴细胞，经活化刺激，获得对肿瘤的特异性杀伤功能，再回输到病人体内以杀伤肿瘤细胞。
同临床使用最多的CIK相比，CAPRI细胞疗法具有四大优势：(1)主要效应细胞为Th、CTL、NKT、NK、DC，对表达MHC的肿瘤细胞也有杀伤作用；(2)高效杀伤活力：可以连续使用7次而杀伤活性不减；(3)记忆细胞比重达到49％；(4)解决免疫逃逸：上调HLA表达。由于CAPRI细胞是经过诱导、激活的患者自身的细胞，因此，治疗相当安全，仅有少量病例(约6-8％的患者)在细胞回输后2-10小时注射局部出现红肿等轻度局部过敏症状，一般不需治疗，12小时内症状消失。在德国十多年的临床实践中并没有发现其他副作用。
CAPRI细胞培养如何实现快速扩增，同时细胞冻存后复苏率更高，杀伤率更高，其细胞培养是关键，然而现有技术培养CAPRI细胞时其增长速度慢，细胞冻存后复苏率不高，杀伤率不高。
发明内容
基于现有技术存在的CAPRI细胞的扩增效率差、杀伤活性低等缺陷，本发明的目的在于提供一种用于CAPRI细胞的培养基组合物。
本发明的另一目的在于提供所述的培养基的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述的培养基的应用。
本发明的另一目的在于提供所述的培养基培养CAPRI细胞获得的免疫细胞。
为实现上述目的，一方面，本发明提供了一种用于CAPRI细胞的培养基组合物，其组分包括：A液和B液；
其中，A液组成成分包括：基础培养基、IL-2(白介素-2)、IFN-γ(γ-干扰素)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)；还可进一步包括IL-15(白介素-15)、IL-18(白介素-18)和IL-4(白介素-4)中的一种或多种；
B液组成成分包括：基础培养基、IL-2(白介素-2)、IFN-γ(γ-干扰素)；还可进一步包括IL-15(白介素-15)和/或IL-18(白介素-18)。
根据本发明的具体实施方案，本发明的培养基组合物中，IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-15、IL-18和IL-4在A液中的用量如下：
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的培养基组合物中，IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-15、IL-18和IL-4在A液中的用量见如下：
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的培养基组合物中，IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-15、IL-18和IL-4在A液中的用量如下：
根据本发明的具体实施方案，本发明的培养基组合物中IL-2、IFN-γ、IL-15和IL-18在B液中的用量如下：
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的培养基组合物中，IL-2、IFN-γ、IL-15和IL-18在B液中的用量如下：
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的培养基组合物中，IL-2、IFN-γ、IL-15和IL-18在B液中的用量如下：
根据本发明的具体实施方案，本发明的培养基组合物中，所述基础培养基为无血清细胞培养基或RPMI-1640培养基。在本发明的一些具体实施方案中，所述无血清细胞培养基为无血清细胞培养基X-V1VO15。
另一方面，本发明还提供了一种制备用于CAPRI细胞的培养基的方法，该方法包括：
以本发明所述的培养基组合物分别制备A液与B液，其中，
A液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，搅拌5-10min，然后再加入GM-CSF、加或者不加IL-15、IL-18和IL-4中的一种或多种，继续搅拌5-10min；
B液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，搅拌5-10min，加或者不加IL-15和/或IL-18，继续搅拌5-10min；
将A液、B液分别调节pH值至7.0-7.2，得到该培养基。
在本发明的一些具体实施方案中，采用1M pH值为8.0的PBS调节pH值。
另一方面，本发明还提供了所述的培养基组合物在培养CAPRI细胞中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种免疫细胞，其是采用上述的培养基组合物培养CAPRI细胞获得的。
上述的免疫细胞中，通过流式细胞仪检测所述免疫细胞表面白细胞分化抗原，其具有以下性能：
CD3+/CD8+/CD4-细胞(T杀伤细胞)≥61.8％，CD3+/CD4+/CD8-细胞(T辅助细胞)≤37.3％，CD4+/CD25+/FoxP3+细胞(Treg细胞)≤4.5％。
本发明的有益效果：
本发明提供的CAPRI细胞培养基安全性较好，在该培养基下培养的CAPRI细胞能快速稳定增殖，且对肿瘤细胞具有较好的杀伤活力。采用本发明提供培养基培养CAPRI细胞后，其CAPRI细胞的增殖数明显高于传统培养基，获得的CAPRI细胞的CD8+阳性表达量高于传统培养基，而Treg调节细胞的阳性表达量低于传统培养基，并且对肿瘤细胞的毒性效果优于传统培养基。
附图说明
图1是采用实施例1提供的培养基培养得到的CAPRI细胞与传统培养方法(Wank的专利WO 02/087612 A2)提供的培养基培养得到的CAPRI细胞的增殖曲线对比图。
图2是采用实施例1提供的培养基培养得到的CAPRI细胞与传统培养方法(Wank的专利WO 02/087612 A2)提供的培养基培养得到的CAPRI细胞对乳腺癌患者肿瘤细胞的杀伤率曲线对比图。
图3是采用实施例1提供的培养基培养得到的CAPRI细胞与传统培养方法(Wank的专利WO 02/087612 A2)提供的培养基培养得到的CAPRI细胞冻存后的细胞复苏率对比图。
图4是采用实施例2提供的培养基培养得到的CAPRI细胞与传统培养方法(Wank的专利WO 02/087612 A2)提供的培养基培养得到的CAPRI细胞的增殖曲线对比图。
图5是采用实施例2提供的培养基培养得到的CAPRI细胞与传统培养方法(Wank的专利WO 02/087612 A2)提供的培养基培养得到的CAPRI细胞对乳腺癌患者肿瘤细胞的杀伤率曲线对比图。
图6是采用实施例2提供的培养基培养得到的CAPRI细胞与传统培养方法(Wank的专利WO 02/087612 A2)提供的培养基培养得到的CAPRI细胞冻存后的细胞复苏率对比图。
图7是采用实施例3提供的培养基培养得到的CAPRI细胞与传统培养方法(Wank的专利WO 02/087612 A2)提供的培养基培养得到的CAPRI细胞的增殖曲线对比图。
图8是采用实施例3提供的培养基培养得到的CAPRI细胞与传统培养方法(Wank的专利WO 02/087612 A2)提供的培养基培养得到的CAPRI细胞对乳腺癌患者肿瘤细胞的杀伤率曲线对比图。
图9是采用实施例3提供的培养基培养得到的CAPRI细胞与传统培养方法(Wank的专利WO 02/087612 A2)提供的培养基培养得到的CAPRI细胞冻存后的细胞复苏率对比图。
图10是采用实施例4提供的培养基培养得到的CAPRI细胞与传统培养方法(Wank的专利WO 02/087612 A2)提供的培养基培养得到的CAPRI细胞的增殖曲线对比图。
图11是采用实施例4提供的培养基培养得到的CAPRI细胞与传统培养方法(Wank的专利WO 02/087612 A2)提供的培养基培养得到的CAPRI细胞对乳腺癌患者肿瘤细胞的杀伤率曲线对比图。
图12是采用实施例3提供的培养基培养得到的CAPRI细胞与传统培养方法(Wank的专利WO 02/087612 A2)提供的培养基培养得到的CAPRI细胞冻存后的细胞复苏率对比图。
图13是采用实施例1-4提供的培养基培养得到的CAPRI细胞增殖曲线对比图。
图14是采用实施例1-4提供的培养基培养得到的CAPRI细胞对乳腺癌患者肿瘤细胞的杀伤率曲线对比图。
图15是采用实施例1-4提供的培养基培养得到的CAPRI细胞与传统培养方法(Wank的专利WO 02/087612 A2)提供的培养基培养得到的CAPRI细胞的冻存后细胞复苏率曲线对比图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。各实施例中未详细说明的方法和操作条件，按照所述领域的常规技术或是按照仪器制造商建议的操作进行。
本发明提供了一种用于CAPRI细胞的培养基组合物。
具体而言，本发明提供的CAPRI细胞的培养基组合物的组分包括：A液和B液。
其中，A液组成成分为：基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF；或者，A液组成成分为：基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF与IL-15；或者，A液组成成分为：基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF与IL-18；或者，A液组成成分为：基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF与IL-4；或者，A液组成成分为：基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-15与IL-18；或者，A液组成成分为：基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-15与IL-4；或者，A液组成成分为：基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-18与IL-4；或者，A液组成成分为：基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-15、IL-18与IL-4。
A液中各组分浓度如下：
B液组成成分为：基础培养基、IL-2、IFN-γ；或者，B液组成成分为：基础培养基、IL-2、IFN-γ与IL-15；或者，B液组成成分为：基础培养基、IL-2、IFN-γ、IL-15与IL-18。
B液中各组分浓度如下：
在本发明提供的CAPRI细胞的培养基中，所述基础培养基为无血清细胞培养基X-V1VO15。
本发明提供的CAPRI细胞的培养基中，IL-2在A液中的剂量为50-5000IU/ml，在本发明的一些具体实施方案中为500-2000IU/ml；IL-2在B液中的剂量为100-5000IU/ml，在本发明的一些具体实施方案中为500-4000IU/ml。IL-2是由多细胞来源，主要由活化T细胞产生，又具有多向性作用的细胞因子，主要促进淋巴细胞生长、增殖、分化；IL-2对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用，能刺激已被特异性抗原或致丝裂因数启动的T细胞增殖；IL-2能活化T细胞，促进细胞因子产生；刺激细胞增殖，增强杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK细胞产生；促进B细胞增殖和分泌抗体；激活巨噬细胞。本发明对所述IL-2的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的IL-2即可，如可以采用其市售商品。在本发明的具体实施例中，所述IL-2购买于R&D公司。
本发明提供的CAPRI细胞的培养基中，IFN-γ在A液中的剂量为200-10000IU/ml，在本发明的一些具体实施方案中为2000-4000IU/ml；IFN-γ在B液中的剂量为200-10000IU/ml，在本发明的一些具体实施方案中为2000-4000IU/ml。IFN-γ是由一族具有多种功能的多肽分子组成，可以激活巨噬细胞、NK细胞；能与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白；能促进MHC I类及II类抗原的加工和提呈，在机体细胞免疫及体液免疫中发挥重要的作用。
本发明提供的CAPRI细胞的培养基中，GM-CSF在A液的剂量为150-1500IU/ml，在本发明的一些具体实施方案中为300-1000IU/ml。GM-CSF属于造血生长因子，主要由T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞等产生，GM-CSF可促进DC的分化、成熟、活化；诱导单核细胞MHC II类分子的表达；能促进Th、NK在肿瘤部位的浸润。
本发明提供的CAPRI细胞的培养基中，IL-15在A液的剂量为200-1000IU/ml，在本发明的一些具体实施方案中为300-700IU/ml。IL-15在B液的剂量为300-10000IU/ml，在本发明的一些具体实施方案中为300-700IU/ml。IL-15的分子结构与IL-2有许多相似之外，因此可以利用IL-2受体的β链和γ链与靶细胞结合，发挥类似IL-2的生物学活性。IL-15可诱导B细胞增殖和分化，能够刺激T细胞和NK细胞增殖，诱导LAK细胞活性，还能与IL-12协同刺激NK细胞产生IFN-γ。
本发明提供的CAPRI细胞的培养基中，IL-18在A液的剂量为50-5000IU/ml，在本发明的一些具体实施方案中为200-1000IU/ml。IL-18在B液的剂量为100-2000IU/ml，在本发明的一些具体实施方案中为200-1000IU/ml。IL-18可以激活T细胞、NK细胞；诱导T细胞产生IFN-γ，促进TNFα、IL-1β、IL-8、GM-CSF的生成。
本发明提供的CAPRI细胞的培养基中，IL-4在A液的剂量为20-2000IU/ml，在本发明的一些具体实施方案中为400-1000IU/ml。IL-4是II型辅助T细胞(Th2细胞)分泌的细胞因子。IL-4可刺激活化B细胞和T细胞增殖、CD4+T细胞分化成II型辅助T细胞。IL-4在调节体液免疫和适应性免疫中起关键作用。IL-4可诱导B细胞抗体产生，上调第II型主要组织兼容性复合体的产生。
本发明的有益效果在于以上多种细胞因子的组合，其中：
IL-2联合GM-CSF：可增强抗原提呈功能和对病原体的细胞毒作用。
IL-2联合IFN-γ：可激活Th1免疫应答，促进CD8+T细胞增殖，促进CTL活化。
IFN-γ联合GM-CSF：可增强免疫活性，激发细胞免疫和体液免疫。
IL-2联合IL-15：可有效的诱导和刺激NK细胞的增殖、分化、成熟，促进CD8+记忆细胞的分化，并且经IL-15刺激的记忆细胞存活期较长。
IL-2联合IL-18：可促进T细胞的增殖、激活Th1免疫应答；IFN-γ联合IL-2：可促进CD8+T细胞增殖。
IL-4联合GM-CSF：可诱导CD14+单核细胞分化为DC细胞。
IL-4联合IL-18：可激活Th2免疫应答；上调MHC II类分子的表达；促进CTL的活化。
本发明提供的CAPRI细胞的培养基中，其中，基础培养基为无血清细胞培养基或RPMI-1640培养基。在本发明的一些具体实施方案中为无血清细胞培养基X-VIVO15(Lonza公司)。相比RPMI-1640培养基，使用该培养基X-VIVO15在使用时不需另外添加动物来源的血清，更符合GMP生产标准。
本发明还提出的上述CAPRI细胞的培养基的制备方法，A液制备：无菌操作，基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，搅拌5-10min，然后再加入GM-CSF，最后加或者不加IL-15、IL-18和IL-4中的一种或多种，继续搅拌5-10min；B液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，搅拌5-10min，然后加或者不加IL-15和/或IL-18，继续搅拌5-10min；将A液、B液的混合物，分别调节pH值至7.0-7.2。检测合格后分别包装A液和B液为成品，即得到所述CAPRI细胞的培养基。
实施例1：
本实施例提供一种CAPRI细胞的培养基，各组分的含量为：
A液中各组分浓度如下：
B液中各组分浓度如下：
基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO15。
其制备方法：
(1)A液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，搅拌10min，然后再加入GM-CSF，继续搅拌10min，得到混合物；
(2)B液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，搅拌10min，得到混合物；
(3)将A液、B液的混合物，用1M pH值为8.0的PBS调节pH值至7.2；然后得到所述CAPRI细胞的培养基。使用时将A液和B液的混合物混合使用。
(4)用(3)中的A、B混合培养基在37℃、5％CO2条件下培养CAPRI细胞，并检测细胞增殖情况，细胞杀瘤力等。取样时间为培养第0、3、5、7天。
实施例2：
本实施提供一种CAPRI细胞的培养基，各组分的含量为：
A液中各组分浓度如下：
B液中各组分浓度如下：
基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO15。
其制备方法：
(1)A液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，搅拌8min，然后再加入GM-CSF、IL-15，继续搅拌8min，得到混合物；
(2)B液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，搅拌8min；然后再加入IL-15，继续搅拌8min，得到混合物；
(3)将A液、B液的混合物，用1M pH值为8.0的PBS调节pH值至7.1；然后得到所述CAPRI细胞的培养基，使用时将A液和B液的混合物混合使用。
(4)用(3)中的A、B混合培养基在37℃、5％CO2条件下培养CAPRI细胞，并检测细胞增殖情况，细胞杀瘤力等。取样时间为培养第0、3、5、7天。
实施例3：
本实施例提供一种CAPRI细胞的培养基，各组分的含量为：
A液中各组分浓度如下：
B液中各组分浓度如下：
基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO15。
其制备方法：
(1)A液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，搅拌6min，然后再加入GM-CSF、IL-15、IL-18，继续搅拌6min，得到混合物；
(2)B液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，搅拌6min，然后再加入IL-15、IL-18，继续搅拌6min，得到混合物；
(3)将A液、B液的混合物，用1M pH值为8.0的PBS调节pH值至7.05；然后得到所述CAPRI细胞的培养基。使用时将A液和B液的混合物混合使用。
(4)用(3)中的A、B混合培养基在37℃、5％CO2条件下培养CAPRI细胞，并检测细胞增殖情况，细胞杀瘤力等。取样时间为培养第0、3、5、7天。
实施例4：
本实施提供一种CAPRI细胞的培养基，各组分的含量为：
A液中各组分浓度如下：
B液中各组分浓度如下所示：
基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO15。
其制备方法：
(1)A液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，搅拌5min，然后再加入GM-CSF、IL-15、IL-18、IL-4，继续搅拌5min，得到混合物；
(2)B液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，搅拌5min，然后再加入IL-15、IL-18，继续搅拌5min，得到混合物；
(3)将A液、B液的混合物，用1M pH值为8.0的PBS调节pH值至7.0；然后得到所述CAPRI细胞的培养基。使用时将A液和B液的混合物混合使用。
(4)用(3)中的A、B混合培养基在37℃、5％CO2条件下培养CAPRI细胞，并检测细胞增殖情况，细胞杀瘤力等。取样时间为培养第0、3、5、7天。
对比例：
传统CAPRI细胞的培养基及其制备方法(Wank的专利WO 02/087612 A2中的方法)，实验结果图中各组分的含量及实验条件所取数值为传统方法范围的中间值，杀伤实验中的效应细胞来源于新鲜培养物：
1、15百万PBMC(经Ficoll分级离心分离)重悬至11毫升培养基中(例如RPMI1640加10％小牛血清)，置于经CD3抗体包被的培养瓶中。
2、经2.5小时的CD3刺激后加入20IU/ml的IL2，以便支持CD3刺激并防止细胞凋亡。
3、经IL-2刺激2.5小时后，未经刺激的PBMC中的APC被活化，此时再加入15百万的未经激活的PBMC。
4、经定向培养的PBMC(现已是CAPRI细胞)经计数，用含20IUIL2的完全培养基重悬至0.3百万细胞/ml。
5、经72小时扩增，细胞可收获并以2百万/安瓶冻存或用于治疗。
由图1、图4、图7、图10、图13可以看出，对照传统CAPRI细胞的培养基及其制备方法，CAPRI细胞在本发明配方培养第5-7天获得更多的CAPRI细胞。
由图2、图5、图8、图11、图14可以看出，对照传统CAPRI细胞培养基及其制备方法，CAPRI细胞在本发明配方中靶效比(E:T)比为40:1至20:1的情况下与传统配方获得的CAPRI细胞对自体肿瘤细胞系的杀伤无显著性差异，而在低E:T比条件下，新配方获得的CAPRI细胞的杀伤率有显著性优势。更为重要的是，在临床应用中，CAPRI细胞的全身用量约为1×108～3×109，在肿瘤局部的E:T比较低，所以在低E:T比下仍能维持较好杀伤作用的培养方案对于临床治疗特别是对于带瘤生存患者的治疗是至关重要的。
由图3、图6、图9、图12、图15可以看出，对照传统CAPRI细胞的培养基及其制备方法，CAPRI细胞在本发明配方培养后第5-7天获得的细胞复苏率更高。
表1为分别采用4个实施例提供的培养基培养得到的CAPRI细胞与传统培养方法(Wank的专利WO 02/087612 A2)提供的培养基培养得到的CAPRI细胞表型对照表。
表1
通过表1可看出，实施例1-4与对照相比(*，**，***项P<0.05)，表明新配方能获得较多CD8+T杀伤细胞，较少CD4+T辅助细胞，最为关键的是按新配方制备的细胞中起免疫负调节功能的Treg细胞明显少于传统配方获得的产品。具体地，本发明培养的细胞，CD3+/CD8+/CD4-(T杀伤细胞)在61％以上(通常为50.4％±6.9％)，CD3+/CD4+/CD8-(T辅助细胞)在37.3％以下(通常为46.6％±4.3％)，CD4+/CD25+/FoxP3+(Treg细胞)在4.5％以下(通常为11.3％±4.1％)。
采用本发明提供的CAPRI细胞的培养基培养CAPRI细胞，能使其快速稳定增殖，且对肿瘤细胞具有较好的杀伤活力。实验结果表明：采用本发明提供培养基培养CAPRI细胞后，其CAPRI细胞的增殖数明显高于传统培养基，获得的CAPRI细胞的CD8+阳性表达量高于传统培养基，有较少CD4T辅助细胞，而Treg调节细胞的阳性表达量低于传统培养基。

Claims (10)

1.一种用于CAPRI细胞的培养基组合物，其组分包括：A液和B液；
其中，A液组成成分包括：基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF；还可进一步包括IL-15、IL-18和IL-4中的一种或多种；
B液组成成分包括：基础培养基、IL-2、IFN-γ；还可进一步包括IL-15和/或IL-18。
2.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中，IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-15、IL-18和IL-4在A液中的用量为：
IL-2：50-5000 IU/ml，IFN-γ：200-10000 IU/ml，GM-CSF：150-1500 IU/ml，IL-15：0-1000 IU/ml或200-1000 IU/ml，IL-18：0-5000 IU/ml或50-5000 IU/ml，IL-4：0-2000IU/ml或20-2000 IU/ml。
3.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中，IL-2、IFN-γ、IL-15和IL-18在B液中的用量为：
IL-2：100-5000 IU/ml，IFN-γ：200-10000 IU/ml，IL-15：0-10000 IU/ml或300-10000IU/ml，IL-18：0-2000 IU/ml或100-2000 IU/ml。
4.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中，所述基础培养基为无血清细胞培养基或RPMI-1640培养基。
5.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中，IL-2在A液和B液中的用量分别为：500-2000 IU/ml、500-4000 IU/ml。
6.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中，IFN-γ在A液和B液中的用量分别为：2000-4000 IU/ml、2000-4000 IU/ml。
7.一种制备用于CAPRI细胞的培养基的方法，该方法包括：
以权利要求1～6任一项所述的培养基组合物分别制备A液与B液，其中，
A液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，搅拌5-10min，然后再加入GM-CSF、加或者不加IL-15、IL-18和IL-4中的一种或多种，继续搅拌5-10min；
B液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，搅拌5-10min，加或者不加IL-15和/或IL-18，继续搅拌5-10min；
将A液、B液分别调节pH值至7.0-7.2。
8.权利要求1～6任一项所述的培养基组合物在培养CAPRI细胞中的应用。
9.一种免疫细胞，其是采用权利要求1～6任一项所述的培养基组合物培养CAPRI细胞获得的。
10.根据权利要求9所述的免疫细胞，其中，通过流式细胞仪检测所述免疫细胞表面白细胞分化抗原，其具有以下性能：
CD3+/CD8+/CD4-细胞≥61.0％，CD3+/CD4+/CD8-细胞≤37.3％，CD4+/CD25+/FoxP3+细胞≤4.5％。
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