CN104651312A - 一种高效免疫活性细胞CpG-DCIK的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效免疫活性细胞CpG-DCIK的制备方法及应用，所述制备方包括以下步骤：利用CpG及细胞因子诱导DC细胞，用细胞因子诱导同源CIK细胞，然后将所述DC细胞与所述CIK细胞混合培养，得到一种新的免疫效应细胞群，即：寡核苷酸诱导树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞，定名为CpG-DCIK。本发明采用体外CpG-ODN联合细胞因子诱导DC，然后与同源CIK共培养，以获得增殖活性和细胞毒活性更强的免疫效应细胞群，这对于丧失手术时机或处于晚期等原因难于获取肿瘤抗原的病例，同样可以诱导和扩增出较高抗癌活性的免疫细胞群，从而扩大了抗肿瘤的适用范围。

Description

一种高效免疫活性细胞CpG-DCIK的制备方法及应用

技术领域

本发明属于免疫活性细胞技术领域，特别涉及一种抗肿瘤免疫活性细胞CpG-DCIK的制备方法及应用。

背景技术

恶性肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之一，在传染病得到控制的国家，心脑血管疾病和恶性肿瘤已分别成为死亡原因的第一和第二位。2005年统计，我国城市居民死亡第一位是恶性肿瘤，是农村居民的第二位死因。

在肿瘤的治疗方法中，免疫治疗已经成为手术治疗、化疗和放疗之外，最重要、最有希望的治疗手段。在过去的20多年里，肿瘤特异性主动免疫治疗和过继性免疫治疗两个方面都有很大的发展。在肿瘤过继免疫治疗中，先后出现了五种引人注目的免疫效应细胞：淋巴因子诱导的杀伤细胞(LAK细胞)；肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)；抗白细胞分化抗原-3单克隆抗体(CD3单抗)和白细胞介素-2诱导的杀伤细胞(AK-T细胞)；细胞毒T淋巴细胞(CTL细胞)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。LAK细胞增殖性能不理想和细胞毒活性较低且维持时间较短而渐被淘汰。CTL和TIL，从理论上看最被看好的免疫效应细胞，CTL但目前尚无有效的扩增手段，TIL来源受限。AK-T细胞和CIK细胞都是用抗CD3单抗为刺激因子激发T淋巴细胞增殖，具相同的增殖活性。CIK细胞还有赖于其他细胞因子的参与，故CIK比AK-T细胞有更强的细胞毒活性。但是，CIK和AK-T及LAK细胞一样，也不具备特异性识别和杀伤肿瘤细胞的特性。

在众多肿瘤肿瘤特异性免疫治疗方法中，树突状细胞(DC)作为新一代疫苗的研究和应用，成为近年来主动免疫治疗研究中的热点，DC是已知的最主要的抗原提呈细胞，具有捕获、加工处理抗原和向T淋巴细胞提呈抗原分子,表达共刺激分子，释放细胞因子和白细胞介素等特性。因此，DC在肿瘤免疫应答中起主要免疫调节作用。

当DC与CIK共培养时，彼此能相互作用而诱导出比CIK细胞有更强增殖活性，更高的肿瘤细胞杀伤活性的细胞群。专利文献(公开号为CN1431298A，公开日为2003年07月23日)公开了一种抗肿瘤免疫活性细胞-DCIK细胞的制备方法及应用,主要是利用细胞因子诱导DC和CIK细胞,然后用肿瘤抗原冲击DC细胞，将经抗原冲击过的DC与CIK细胞按一定比例混合进行共培养，得到一种新的免疫效应细胞群,即DCIK细胞，与CIK细胞比较，DCIK细胞的增殖活性和细胞毒活性更强，细胞毒性比CIK高出10-20％，且表现对恶性细胞的特异性杀伤，主要用于自体瘤治疗,术后即时施治能有效防转移防复发,也可作化学疗法的辅助治疗。但是上述专利文献CN1431298A公开的技术方案也有一定的缺点和不足：肿瘤抗原冲击的DCIK细胞的制备必须要经过手术等方法取得新鲜肿瘤组织标本来提取抗原，而临床上相当部分病人丧失了手术机会，以及经过放化疗后的病人也难于获取肿瘤抗原。也就是说，肿瘤抗原来源有限，特别是经过放化疗后的肿瘤患者。

近年来的研究表明，细菌的CpG-ODN可以激活机体多种免疫细胞，诱生多种细胞因子，可以调节免疫应答向Th1型转化，并且人工合成的CpG寡核苷酸(CpG-oligodeoxy nucleotides,CpG-ODN)也可模拟上述反应。CpG-ODN与抗原刺激的DC细胞共同注射到患结肠癌的鼠体内，可明显提高DC的抗瘤活性，并且全身给药抑制肿瘤生长能力比5-FU和甲酰四氢叶酸强，但是，CpG-ODN直接体内注射需要剂量较大而且连续注射一周有组织坏死，出血等副作用。也就是说，如果为诱导更强的免疫效果而大剂量注射CpG-ODN，将会产生较大的副作用。

因此，改善现有技术中抗肿瘤免疫效应细胞在增殖性能和细胞毒活性以及对肿瘤细胞特异性识别和攻击活性的不足，从而开发出一种新的抗肿瘤免疫效应细胞，成为迫切的现实需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种高表达CD3-CD56、增殖活性高、释放细胞因子量大、细胞毒活性高的高效免疫活性细胞CpG-DCIK的制备方法及应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明涉及一种高效免疫活性细胞CpG-DCIK的制备方法，包括以下步骤：先利用CpG及细胞因子诱导DC细胞，再用细胞因子诱导同源CIK细胞，然后将所述DC细胞与所述CIK细胞混合培养，即得：寡核苷酸诱导树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞，定名为CpG-DCIK。

本发明中，所述高效免疫活性细胞CpG-DCIK可以通过以下具体步骤获得：

步骤(1)外周血单个核细胞(PBMC)的制备

取肿瘤病人抗凝外周血20-50ml，用生理盐水对倍稀释后，用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，所述分离采用水平转头的离心机，离心的速度为2000rpm,离心的时间我20分钟，然后用Hanks平衡液洗涤2-3次再进行显微镜下细胞计数，最后用淋巴细胞培养液调节细胞密度成3-5x10^-6/ml的细胞悬液；

步骤(2)外周血淋巴细胞(PBL)和粘附细胞的分离

将步骤(1)所述细胞悬液移入6孔板，每孔3-5ml，置37℃、体积比5％CO₂、饱和湿度的培养箱中温育2-3小时，然后用移液管冲洗细胞，将非黏附的细胞收集在50ml离心管中作为外周血淋巴细胞(PBL)悬液，6孔板留下的粘附细胞用于DC的诱导；

步骤(3)CIK细胞的诱导和扩增

在外周血淋巴细胞(PBL)悬液中添加重组人干扰素-γ，重组人干扰素-γ的终浓度为1000单位/毫升，然后移入表面积为75平方厘米的培养瓶中，每个培养瓶装量20毫升，置于37℃、体积比5％CO₂、饱和湿度的培养箱中温育24小时，然后添加CD3单抗、IL-1和IL-2，终浓度分别为50纳克/毫升、100微克/毫升和800单位/毫升，继续培养48-72小时后，显微镜下细胞计数，然后用CIK培养液调解细胞浓度为3x10^-5/毫升，分配到75平方厘米培养瓶中，每瓶20毫升，进行扩大培养，此后，每瓶48-72小时按上述相同条件扩大培养一次，培养至第8天收集CIK细胞待用；

步骤(4)DC的诱导和扩增

在步骤(2)中的留有粘附细胞的6孔板中，每孔加入含有重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的DC培养液3毫升，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的终浓度分别是1000单位/毫升和500单位/毫升，然后置于37℃、体积比5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养3天，然后在各孔中加入CpG-ODN2006，CpG-ODN2006的终浓度3微摩尔/毫升，继续培养至第5天，加入肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子的终浓度为100单位/毫升，培养至第8天，用移液管冲洗，收集非粘附和半粘附的DC待用；

步骤(5)DC与CIK细胞共培养制备CpG-DCIK细胞

将步骤(4)获得的DC与步骤(3)获得的CIK细胞分别计数，离心弃上清后，分别用CIK培养液调节细胞密度为6x10^-5/ml和2x10^-5/ml，再等体积混合后移入75平方厘米培养瓶中，每瓶20ml，每隔48-72小时按上述细胞密度分瓶扩大培养一次，即得CpG-DCIK细胞。

本发明中，所述淋巴细胞培养液可以采用完全F12/DMEM1:1、完全PRMI-1640或者完全AIM-V。

本发明中，所述CIK培养液可以采用含白细胞介素-1和白细胞介素-2的完全F12/DMEM1:1或者AIM-V。

本发明中，所用移液管和离心管可以为聚丙烯材料(polypropylene),6孔板和培养瓶可以为聚苯乙烯材料(polystyrene)。若改用其他规格培养器皿，应根据培养面积大小调整上述细胞悬液接种量。

第二方面，本发明还涉及上述高效免疫活性细胞CpG-DCIK在制备抗肿瘤药物中的应用，较优选在制备抗人体前列腺癌药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明通过共培养得到的CpG-DCIK细胞与LAK、CIK细胞一样为非均质细胞群，其主要生物学特性有：

1.细胞组成：CpG-DCIK细胞中T淋巴细胞占98％以上和少量DC，T淋巴细胞中个亚群所占比例具有个体差异和印体外培养时间长短而有一定变化范围，一般为CD3+CD4+T细胞20-40％，CD3+CD8+T细胞50-80％，CD3+CD56+T细胞20-60％；

2.增殖活性高：CpG-DCIK细胞的增殖活性比同源DCIK和CIK细胞强大，体外扩增3周后，CpG-DCIK细胞比同源DCIK细胞和CIK细胞分别大1-1.5倍和4-8倍；

3.释放细胞因子量大：CpG-DCIK细胞释放IFN-γ的量是同源CIK细胞的3-6倍，是同源DCIK细胞的0.5-1倍；

4.细胞毒活性高：与同源CIK细胞比较CpG-DCIK细胞体外对特异靶细胞的杀伤作用高出20-30％，略高于同源DCIK细胞，人癌动物模型治疗试验表明，CpG-DCIK细胞组动物的平均存活期是CIK组动物的3倍，是同源DCIK组动物的0.5倍。

因此，由于CpG-ODN能够增强DC的抗原提呈能力，促进DC的功能成熟，同时DC与CIK共培养可以显著提高CIK的增殖能力和细胞毒活性，故采用体外CpG-ODN联合细胞因子诱导DC，然后与同源CIK共培养，以获得增殖活性和细胞毒活性更强的免疫效应细胞群，而且CpG-ODN可以人工合成，来源易得，这对于丧失手术时机以及处于晚期等各种原因难于获取病人肿瘤抗原的病例，同样可以诱导和扩增出较高抗癌活性的免疫细胞群。本发明提供的CpG-DCIK细胞主要用于自体瘤的治疗，术后即时施治有效防转移防复发，也能够作为化疗的辅助治疗，此外，CpG-DCIK细胞也能够用于某些传染性疾病的免疫治疗。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1高效免疫活性细胞CpG-DCIK的制备

包括如下步骤：

步骤(1)外周血单个核细胞(PBMC)的制备

取肿瘤病人抗凝外周血20-50ml，用生理盐水对倍稀释后，用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，所述分离采用水平转头的离心机，离心的速度为2000rpm，离心的时间我20分钟，然后用Hanks平衡液洗涤2～3次再进行显微镜下细胞计数，最后用淋巴细胞培养液完全F12/DMEM1:1调节细胞密度成3～5x10^-6/ml的细胞悬液；

步骤(2)外周血淋巴细胞(PBL)和粘附细胞的分离

将步骤(1)所述细胞悬液移入6孔板，每孔3～5ml，置37℃、体积比5％CO₂、饱和湿度的培养箱中温育2～3小时，然后用移液管冲洗细胞，将非黏附的细胞收集在50ml离心管中作为外周血淋巴细胞(PBL)悬液，6孔板留下的粘附细胞用于DC的诱导；

步骤(3)CIK细胞的诱导和扩增

在外周血淋巴细胞(PBL)悬液中添加重组人干扰素-γ，重组人干扰素-γ的终浓度为1000单位/毫升，然后移入表面积为75平方厘米的培养瓶中，每个培养瓶装量20毫升，置于37℃、体积比5％CO₂、饱和湿度的培养箱中温育24小时，然后添加CD3单抗、IL-1和IL-2，终浓度分别为50纳克/毫升、100微克/毫升和800单位/毫升，继续培养48-72小时后，显微镜下细胞计数，然后用CIK培养液调节细胞浓度为3x10^-5/毫升(CIK细胞培养液为完全F12/DMEM1：1或者AIM-V，含浓度分别是100u/ml、800u/ml的IL-1和IL-2)，分配到75平方厘米培养瓶中，每瓶20毫升，进行扩大培养，此后，每瓶48-72小时按上述相同条件扩大培养一次，培养至第8天收集CIK细胞待用；

步骤(4)DC的诱导和扩增

在步骤(2)中的留有粘附细胞的6孔板中，每孔加入含有重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的DC培养液3毫升，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的终浓度分别是1000单位/毫升和500单位/毫升，然后置于37℃、体积比5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养3天，然后在各孔中加入CpG-ODN2006(CpG-ODN2006为人工合成的寡核苷酸，可以通过公开途径购买获得，其序列为：5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’，整个序列硫代化修饰，其中的CpG基序均为去甲基化的，CpG-ODN2006的合成及稀释过程均要求无菌)，CpG-ODN2006的终浓度为3微摩尔/毫升，继续培养至第5天，加入肿瘤坏死因子(TNF-a)，肿瘤坏死因子(TNF-a)的终浓度为100单位/毫升，培养至第8天，用移液管冲洗，收集非粘附和半粘附的DC待用；

步骤(5)DC与CIK细胞共培养制备CpG-DCIK细胞

将步骤(4)获得的DC与步骤(3)获得的CIK细胞分别计数，离心弃上清后，分别用上述CIK培养液调节细胞密度为6x10^-5/ml和2x10^-5/ml，再等体积混合后移入75平方厘米培养瓶中，每瓶20ml，每隔48-72小时按上述细胞密度分瓶扩大培养一次，即可获得CpG-DCIK细胞。

实施例2高效免疫活性细胞CpG-DCIK的抗肿瘤应用

裸鼠右耳皮下接种人源前列腺癌细胞(Alva41)1x10^-7/只，一周后成瘤率100％，14天后会阴部转移100％，开始连续腹腔接种实施例1获得的CpG-DCIK细胞悬液2-3x10^-8/只/次，隔日一次，共4次，至35天，生理盐水对照组生存率0％(0/4),CIK细胞治疗组20％(1/5)，DCIK细胞治疗组50％(3/6)，CpG-DCIK治疗组为70％(6/8)，而CpG-DCIK组瘤重明显小于CIK细胞组瘤重，与DCIK组瘤重差异不明显，说明上述实施例1获得的CpG-DCIK具有明显的抗肿瘤免疫活性。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (6)

1.一种高效免疫活性细胞CpG-DCIK的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：先利用CpG及细胞因子诱导DC细胞，再用细胞因子诱导同源CIK细胞，然后将所述DC细胞与所述CIK细胞混合培养，即得：寡核苷酸诱导树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞，定名为CpG-DCIK。

2.如权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

步骤(1)外周血单个核细胞的制备

取肿瘤病人抗凝外周血20-50ml，用生理盐水对倍稀释后，用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，所述分离采用水平转头的离心机，离心的速度为2000rpm，离心的时间为20分钟，然后用Hanks平衡液洗涤2-3次再进行显微镜下细胞计数，最后用淋巴细胞培养液调节细胞密度成3-5x10^-6/ml的细胞悬液；

步骤(2)外周血淋巴细胞和粘附细胞的分离

将步骤(1)所得的细胞悬液移入6孔板，每孔3-5ml，置37℃、5％(体积)CO₂、饱和湿度的培养箱中温育2-3小时，然后用移液管冲洗细胞，将非黏附的细胞收集在50ml离心管中作为外周血淋巴细胞悬液，6孔板留下的粘附细胞用于DC的诱导；

步骤(3)CIK细胞的诱导和扩增

在外周血淋巴细胞悬液中添加重组人干扰素-γ，重组人干扰素-γ的终浓度为1000单位/毫升，然后移入表面积为75平方厘米的培养瓶中，每个培养瓶装量20毫升，置于37℃、5％(体积)CO₂、饱和湿度的培养箱中温育24小时，然后添加CD3单抗、IL-1和IL-2，终浓度分别为50纳克/毫升、100微克/毫升和800单位/毫升，继续培养48-72小时后，显微镜下细胞计数，然后用CIK培养液调节细胞浓度为3x10^-5/毫升，分配到75平方厘米培养瓶中，每瓶20毫升，进行扩大培养，此后，每瓶48-72小时按上述相同条件扩大培养一次，培养至第8天收集CIK细胞待用；

步骤(4)DC的诱导和扩增

在步骤(2)中所得的留有粘附细胞的6孔板中，每孔加入含有重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4的DC培养液3毫升，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4的终浓度分别是1000单位/毫升和500单位/毫升，然后置于37℃、5％(体积)CO₂、饱和湿度的培养箱中培养3天，然后在各孔中加入CpG-ODN2006，CpG-ODN2006的终浓度3微摩尔/毫升，继续培养至第5天，加入肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子的终浓度为100单位/毫升，培养至第8天，用移液管冲洗，收集非粘附和半粘附的DC待用；

步骤(5)DC与CIK细胞共培养制备CpG-DCIK细胞

将步骤(4)获得的DC与步骤(3)获得的CIK细胞分别计数，离心弃上清后，分别用CIK培养液调节细胞密度为6x10^-5/ml和2x10^-5/ml，再等体积混合后移入75平方厘米培养瓶中，每瓶20ml，每隔48-72小时按上述细胞密度分瓶扩大培养一次，即得CpG-DCIK细胞。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述淋巴细胞培养液为完全F12/DMEM1:1、完全PRMI-1640或者完全AIM-V。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述CIK培养液为含白细胞介素-1和白细胞介素-2的完全F12/DMEM1:1或者AIM-V。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述移液管和离心管为聚丙烯材料,所述6孔板和培养瓶为聚苯乙烯材料。

6.权利要求1至5任一项所述制备方法获得的高效免疫活性细胞CpG-DCIK在制备抗肿瘤药物中的应用。