CN105087483A - 一种免疫细胞培养基、免疫细胞的培养方法及人参皂苷的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种免疫细胞培养基、免疫细胞的培养方法及人参皂苷的应用，该培养基包括：无血清基础培养基、人参皂苷和细胞因子；所述人参皂苷在无血清基础培养基中的质量含量为4mg/mL～10mg/mL。本发明提供的免疫细胞培养基能够增殖免疫细胞的活性和增殖能力。实验结果表明：本发明提供的免疫细胞培养基培养CIK细胞14天后，增殖倍数为650～750倍、活率为97.78％～98.73％、CD3+CD56+效应细胞比例为37.4％～38.2％；培养NKT细胞14天后，增殖倍数为480～550倍、活率为96.73～98.78％、CD3+CD56+和CD161+总和效应细胞比例为42.6％～45.2％。

Description

一种免疫细胞培养基、免疫细胞的培养方法及人参皂苷的应用

技术领域

本发明属于免疫细胞培养技术领域，尤其涉及一种免疫细胞培养基、免疫细胞的培养方法及人参皂苷的应用。

背景技术

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，可以分为多种，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。在人体中，各种免疫细胞担任着重要的角色。

免疫细胞治疗是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增细胞免疫治疗强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。免疫细胞治疗的简要过程如下：在GMP实验室里，分离单个核细胞置于培养瓶中，加入培养液和细胞因子刺激细胞活化增值；经过7～14天细胞培养，细胞数增至原有数量的几百到上千倍，免疫杀伤能力增加20～100倍；采血后的第7～14天，开始回输免疫细胞。经过多个疗程的治疗，有效杀除患者体内肿瘤细胞，促进康复，改善患者的生活质量。

专利CN104371973A公开了一种用于培养免疫细胞的无血清培养基，将牛血清白蛋白5～10mg/mL、脂肪酸0.1～10μg/mL、胆固醇10～20μg/mL、胰岛素10～20μg/mL、转铁蛋白0.5～15μg/mL、2-巯基乙醇1.0～5.0μg/mL、丙谷二肽0.5～3mmol/L、甘油酯0.5～20μg/mL，加水溶解，pH值调节至6.8～7.2，制得无血清培养基。将脐血分离，采用上述无血清培养基对分离得到的免疫细胞进行培养，得到增殖后的免疫细胞。经测试，其增殖倍数为25～35倍，表面抗原CD3+CD56+表达率为24.9％～38.7％。

可见，现有的细胞培养基培养的免疫细胞的活性和增殖能力均较差。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种免疫细胞培养基、免疫细胞的培养方法及人参皂苷的应用，本发明提供的免疫细胞培养基能够增强免疫细胞活性和增殖能力。

本发明提供了一种免疫细胞培养基，包括：

无血清基础培养基、人参皂苷和细胞因子；

所述人参皂苷在无血清基础培养基中的质量含量为4mg/mL～10mg/mL。

优选地，还包括血浆；

所述血浆和无血清基础培养基的质量比为4～6:100。

优选地，所述细胞因子包括白细胞介素、抗CD3单克隆抗体和γ干扰素中的一种或多种。

优选地，所述细胞因子包括100～400U/mL白细胞介素-2、5～100ng/mL白细胞介素-15、5～100ng/mL白细胞介素-21和5～100ng/mL抗CD3单克隆抗体。

优选地，所述细胞因子包括200～500U/mL白细胞介素-2、5～100ng/mL白细胞介素-15和5～100ng/mL抗CD3单克隆抗体。

优选地，所述细胞因子包括400～1000U/mL白细胞介素-2。

优选地，所述细胞因子包括100～400U/mL白细胞介素-2、5～100ng/mLγ干扰素和5～100ng/mL抗CD3单克隆抗体。

优选地，所述无血清基础培养基包括X-VIVO15无血清培养基。

本发明提供了一种免疫细胞的培养方法，包括以下步骤：

将外周血进行分离，得到PBMC细胞；

将所述PBMC细胞接种于上述技术方案所述的免疫细胞培养基，进行诱导培养，得到免疫细胞。

本发明提供了一种人参皂苷在制备免疫细胞培养基中的应用。

本发明提供了一种免疫细胞培养基，包括：无血清基础培养基、人参皂苷和细胞因子；所述人参皂苷在无血清基础培养基中的质量含量为4mg/mL～10mg/mL。本发明提供的免疫细胞培养基能够提高免疫细胞的活性和增殖能力。实验结果表明：本发明提供的免疫细胞培养基培养CIK细胞14天后，增殖倍数为650～750倍、活率为97.78％～98.73％、CD3+CD56+效应细胞比例为37.4％～38.2％；培养NKT细胞14天后，增殖倍数为480～550倍、活率为96.73％～98.78％、CD3+CD56+和CD161+总和效应细胞比例为42.6％～45.2％。

附图说明

图1为本发明实施例1的人参皂苷浓度和CIK细胞的增殖倍数曲线图；

图2为本发明实施例2中对照组1的流式细胞图；

图3为本发明实施例2中实验组10的流式细胞图。

具体实施方式

本发明提供了人参皂苷在制备免疫细胞培养基中的应用。

在本发明中，所述人参皂苷在制备免疫细胞培养中作为免疫细胞增殖促进剂和/或免疫细胞活性促进剂。

在本发明中，所述人参皂苷应用时的剂量优选为4～10mg/mL。

本发明提供了一种免疫细胞培养基，包括：

无血清基础培养基、人参皂苷和细胞因子；

所述人参皂苷在无血清基础培养基中的质量含量为4mg/mL～10mg/mL。

本发明提供的免疫细胞培养基包括无血清基础培养基。本发明对所述无血清基础培养基的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的无血清培养基即可，如可以采用其市售商品。在本发明中，所述无血清基础培养基优选为X-VIVO15无血清培养基。

本发明提供的免疫细胞培养基包括人参皂苷，所述人参皂苷在无血清基础培养基中的质量含量为4mg/mL～10mg/mL。在本发明具体实施例中，所述人参皂苷在无血清基础培养基中的质量含量可以为4mg/mL，也可以为6mg/mL，还可以为10mg/mL；本发明对人参皂苷没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的人参皂苷即可，如可以采用其市售商品，也可以采用本领域技术人员熟知的制备人参皂苷的制备技术方案自行制备。在本发明中，所述人参皂苷的制备方法优选包括以下步骤：

将人参茎叶粗粉提取，过滤，得到一次滤液；

将所述滤液除杂，再过滤，得到二次滤液；

将所述二次滤液调节pH值至中性，得到中性液体；

将所述中性液体依次进行水洗和醇洗，得到醇洗脱液；

将所述醇洗脱液中醇类化合物去除，得到人参皂苷。

本发明将人参茎叶粗粉提取，过滤，得到一次滤液。本发明对人参茎叶粗粉的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的人参茎叶粗粉即可，如可以采用其市售商品。本发明优选将人参茎叶粗粉置于水中进行提取。在本发明中，所述人参茎叶粗粉的质量和水的体积比优选为(18～22)g：(800～1500)mL，更优选为20g：1200mL。在本发明中，所述提取的温度优选为80℃～90℃；所述提取的时间优选为0.8～1.2h，更优选为1h。本发明优选采用棉花进行过滤。

得到一次滤液，本发明优选将所述一次滤液除杂，再过滤，得到二次滤液。本发明优选将一次滤液和石灰乳混合进行除杂。在本发明中，所述石灰乳的质量分数优选为40％～80％；所述石灰乳和一次滤液的体积比优选为1：2。本发明优选将除杂后的一次滤液调节pH值至9～10放置10min后再过滤，得到二次滤液。

得到二次滤液后，本发明优选将所述二次滤液调节pH值至中性，得到中性液体。本发明优选采用浓硫酸调节二次滤液的pH值。在本发明中，所述二次滤液的pH值优选调节至7。

得到中性液体后，本发明优选将所述中性液体依次进行水洗和醇洗，得到醇洗脱液。本发明优选采用本领域技术人员熟知的大孔树脂柱进行水洗和醇洗。本发明优选先采用蒸馏水水洗至无色，再采用70％的乙醇洗至无色，得到醇洗脱液。

得到醇洗脱液后，本发明优选将所述醇洗脱液中醇类化合物去除，得到人参皂苷。本发明优选在40℃～60℃下进行蒸发，去除醇类化合物。在本发明中，所述人参皂苷为黄白色。

本发明提供的免疫细胞培养基包括细胞因子。在本发明中，所述细胞因子为了诱导细胞，然后进行增殖。本发明对所述细胞因子的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的细胞因子即可，如可以采用其市售商品。在本发明中，所述细胞因子优选包括白细胞介素、抗CD3单克隆抗体和γ干扰素中的一种或多种；在本发明的某些实施例中，所述细胞因子包括100～400U/mL白细胞介素-2(IL-2)、5～100ng/mL白细胞介素-15(IL-15)、5～100ng/mL白细胞介素-21(IL-21)和5～100ng/mL抗CD3单克隆抗体(CD3)；在本发明的某些实施例中，所述细胞因子包括200～500U/mL白细胞介素-2、5～100ng/mL白细胞介素-15(IL-15)和5～100ng/mL抗CD3单克隆抗体；在本发明的某些实施例中，所述细胞因子包括400～1000U/mL白细胞介素-2；在本发明的某些实施例中，所述细胞因子包括100～400U/mL白细胞介素-2、5～100ng/mLγ干扰素和5～100ng/mL抗CD3单克隆抗体。

本发明提供的免疫细胞培养基优选还包括血浆；所述血浆和无血清基础培养基的质量比优选为4～6:100，更优选为4.5～5.5:100。在本发明中，所述免疫细胞培养基中添加血浆后，培养的免疫细胞状态和增殖效果更好。

在本发明中，所述免疫细胞培养基的方法优选包括以下步骤：

将无血清基础培养基、人参皂苷和细胞因子混合，所述人参皂苷在无血清基础培养基中的质量含量为4mg/mL～10mg/mL，得到免疫细胞培养基。

在本发明中，所述无血清基础培养基、人参皂苷和细胞因子的种类和来源与上述技术方案所述无血清基础培养基、人参皂苷和细胞因子的种类和来源一致，在此不再赘述。

本发明优选在无血清基础培养基、人参皂苷和细胞因子混合时，还加入血浆。在本发明中，所述血浆和无血清基础培养基的质量比优选为4～6:100，更优选为4.5～5.5:100。

本发明提供了一种免疫细胞的培养方法，包括以下步骤：

将外周血进行分离，得到PBMC细胞；

将所述PBMC细胞接种于上述技术方案所述的细胞培养基，进行诱导培养，得到免疫细胞。

本发明将外周血进行分离，得到PBMC细胞，即外周血单个核细胞。在本发明中，将外周血进行分离得到PBMC细胞的具体过程为：将外周血离心，得到上层血浆和下层细胞；

将下层细胞进行Ficoll分离，离心，得到PBMC细胞。

本发明将外周血进行离心，得到上层血浆和下层细胞。本发明优选将上层血浆灭活、离心和过滤，备用。在本发明中，所述上层血浆灭活的温度优选为55℃～60℃，更优选为56℃；所述灭活的时间优选为25～35min，更优选为30min。在本发明中，所述上层血浆离心的转速优选为2900g，离心的时间优选为5min。本发明优选对离心后的上层血浆进行过滤。本发明优选采用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤。本发明优选在4℃下保存上层血浆，备用。本发明对上层血浆过滤的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的过滤技术方案即可。

本发明对外周血的离心方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的外周血离心的技术方案即可。在本发明中，所述外周血离心的转速优选为700g，离心的时间优选为10min。

本发明优选将下层细胞先采用本领域技术人员公知的生理盐水稀释后再进行Ficoll分离。在本发明中，所述Ficoll分离为单次密度梯度离心法。在本发明中，所述生理盐水和下层细胞的体积比优选为1:2。在本发明中，进行Ficoll分离时，本发明优选将稀释后的下层细胞缓慢倒入Ficoll分离液中。本发明对Ficoll分离液和稀释后的下层细胞的混合液进行离心，得到白膜层细胞，即PBMC细胞。在本发明中，所述Ficoll分离液和稀释后的下层细胞的混合液离心的转速优选为700g，离心的时间优选为20min。

完成Ficoll分离液和稀释后的下层细胞的混合液离心后，本发明优选将得到的白膜层细胞进行清洗。本发明优选采用本领域技术人员公知的生理盐水进行清洗。本发明采用生理盐水将白膜层细胞重悬和离心，弃去上清液，再次重悬和离心，得到PBMC细胞。本发明优选再次重悬白膜层细胞时取部分细胞悬液进行细胞计数。

得到PBMC细胞后，本发明将所述PBMC细胞接种于上述技术方案所述的细胞培养基，进行诱导培养，得到免疫细胞。

在本发明中，所述接种的细胞密度优选为1×10⁶～1.5×10⁶个/mL。

在诱导培养过程中，本发明根据免疫细胞种类的不同，添加不同的细胞因子。在本发明中，所述免疫细胞优选包括NKT细胞、NK细胞、LAK细胞和CIK细胞中的一种或多种。本发明根据免疫细胞种类的不同添加对应的细胞因子进行培养。

在本发明中，所述免疫细胞为NK细胞，所述细胞因子优选包括100～400U/mL白细胞介素-2、5～100ng/mL白细胞介素-15、5～100ng/mL白细胞介素-21和5～100ng/mL抗CD3单克隆抗体；

在本发明中，所述免疫细胞为NKT细胞，所述细胞因子优选包括200～500U/mL白细胞介素-2、5～100ng/mL白细胞介素-15和5～100ng/mL抗CD3单克隆抗体。

在本发明中，所述免疫细胞为LAK细胞，所述细胞因子优选包括400～1000U/mL白细胞介素-2。

在本发明中，所述免疫细胞为CIK细胞，所述细胞因子优选包括100～400U/mL白细胞介素-2、5～100ng/mLγ干扰素和5～100ng/mL抗CD3单克隆抗体。

本发明优选在诱导培养的第四天进行补液。本发明优选控制细胞密度为0.5～1×10⁶个/mL来控制补液的体积；本发明可以采用上述技术方案中的无血清基础培养基进行补液，也可以采用上述技术方案所述的无血清基础培养基和血浆的混合物进行补液；所述无血清基础培养基和血浆的质量比为100:4～6。

进行补液后，本发明优选再向其中添加人参皂苷和细胞因子，使得人参皂苷和细胞因子满足上述技术方案所述人参皂苷和细胞因子所述的质量含量。

本发明优选在第一次补液后，每3天进行一次补液；每3天补液需控制补液后的细胞密度为1×10⁶～1.5×10⁶个/mL。

在本发明中，所述诱导培养的时间优选为12～14天，更优选为13天。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种免疫细胞培养基、免疫细胞的培养方法及人参皂苷的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例中均采用市售商品。

对比例1

将牛血清白蛋白8mg/mL、脂肪酸5μg/mL、胆固醇15μg/mL、胰岛素15μg/mL、转铁蛋白8μg/mL、2-巯基乙醇2.5.0μg/mL、丙谷二肽1.5mmol/L、甘油酯10μg/mL，加水溶解，pH值调节至6.8～7.2，制得无血清培养基。

实施例1

取40mL外周血，采用Ficoll分离法获得PBMC(单个核细胞)4×10⁷个，分为10组，每组4×10⁶个细胞，将其接种于X-VIVO15无血清培养基(购买于LONZA公司)中，向其中添加人参皂苷，使得人参皂苷的浓度分别为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL；

接种密度均为1×10⁶个/mL；接种后的第一天添加细胞因子INF-γ至终浓度为30ng/mL；第二天补加细胞因子至终浓度为IL-2为100U/mL、OKT-3至终浓度为80ng/mL；

每3天补液一次，并根据补液后的总体积添加细胞因子IL-2至终浓度为300U/mL；培养14天后，得到增殖后的CIK细胞。

本发明将增殖后的CIK细胞进行计数，并绘制人参皂苷浓度与CIK细胞增殖倍数曲线，如图1所示，图1为本发明实施例1的人参皂苷浓度和CIK细胞的增殖倍数曲线图。从图1可以看出：从倍增曲线可知，人参皂苷浓度从3mg/mL到4mg/mL，增殖倍数出现激增，在7mg/mL浓度位置增殖倍数最高，在10mg/mL位置增殖倍数趋于稳定，人参皂苷浓度增加，细胞增殖倍数变化不大，所以人参皂苷浓度在4～10mg/mL范围，细胞增殖效率最高。

实施例2

取40mL外周血，采用Ficoll分离法获得PBMC(单个核细胞)4×10⁷个，分10组，每组4×10⁶个细胞；

第1,2组作为对照组1和2：第1,2组采用对比例1中的无血清培养基诱导培养CIK细胞；

第3,4组作为对照组3和4：第3,4组采用美国LONZA公司生产的X-VIVO15无血清培养基诱导培养CIK细胞；

第5～10组作为本发明实验组，其中，第5,6组接种于X-VIVO15无血清培养基中，诱导培养CIK细胞，人参皂苷含量为4mg/mL；

第7,8组接种于X-VIVO15无血清培养基中，诱导培养CIK细胞，人参皂苷含量为10mg/mL；

第9,10组接种于X-VIVO15无血清培养基中，诱导培养CIK细胞，人参皂苷含量为6mg/mL；

第1～10组的接种密度均为1×10⁶个/mL；接种后的第一天每组均添加细胞因子INF-γ至终浓度为50ng/mL；第二天每组均补加细胞因子至终浓度为IL-2为300U/mL、OKT-3至终浓度为50ng/mL；

每3天每组均补液一次，并根据补液后的总体积每组均添加细胞因子IL-2至终浓度为300U/mL；培养14天后，得到增殖后的CIK细胞。

本发明对得到的免疫细胞进行细胞总量、增殖倍数、活率和CD3+CD56+效应细胞比例进行统计和鉴定，结果如表1所示，表1为实施例2中对照组和实验组培养的CIK细胞的统计和鉴定结果：

表1实施例2中对照组和实验组培养的CIK细胞的统计和鉴定结果

从表1中可以看出：添加人参皂苷的实验组细胞增殖倍数明显优于其他组，流式检测结果效应细胞比例也明显高于其他组。

本发明对第1组和第10组分别进行流式细胞鉴定，结果分别如图2和图3所示，图2为本发明实施例2中对照组1的流式细胞图，图3为本发明实施例2中实验组10的流式细胞图。从图2可以看出，对照组1培养的CIK细胞对CD3+CD56+效应细胞比例为24.9％。从图3可以看出，实验组10培养的CIK细胞对CD3+CD56+效应细胞比例为38.2％。

实施例3

诱导培养NKT细胞：

取40mL脐带血，采用Ficoll分离法获得PBMC(单个核细胞)4×10⁷个，分10组，每组4×10⁶个细胞；

第1,2组作为对照组1和2：第1,2组接种对比例1提供的无血清培养基诱导培养NKT细胞；

第3,4组作为对照组3和4：第3,4组接种于LONZA的X-VIVO15无血清培养基中，诱导培养NKT细胞；

第5～10组作为本发明实验组，其中，第5,6组接种于X-VIVO15无血清培养基中，诱导培养NKT细胞，人参皂苷含量为4mg/mL；

第7,8组接种于X-VIVO15无血清培养基中，诱导培养NKT细胞，人参皂苷含量为10mg/mL；

第9,10组接种于X-VIVO15无血清培养基中，诱导培养NKT细胞，人参皂苷含量为6mg/mL；

第1～10组的接种密度均为1×10⁶个/mL；接种后的第一天每组均添加细胞因子IL-2至终浓度为400U/mL、IL-15至终浓度为100ng/mL、OKT-3至终浓度为100ng/mL；

第4天补液，并根据补液后的总体积每组均添加细胞因子IL-2至终浓度为200U/mL、IL-15至终浓度为100ng/mL、OKT-3至终浓度为100ng/mL；

后面每3天每组均补液一次，每次根据补液后的总体积每组均添加IL-2浓度为150U/mL、IL-15为100ng/mL；培养14天后，得到增殖后的NKT细胞。

本发明对得到的免疫细胞进行细胞总量、增殖倍数、活率和CD3+CD56+效应细胞比例进行统计和鉴定，结果如表2所示，表2为实施例3中对照组和实验组培养的NKT细胞的统计和鉴定结果：

表2实施例3中对照组和实验组培养的NKT细胞的统计和鉴定结果

从表2中可以看出：添加人参皂苷的实验组细胞增殖倍数明显优于其他组，流式检测结果效应细胞比例也明显高于其他组。

由以上实施例可知，本发明提供了一种免疫细胞培养基，包括：无血清基础培养基、人参皂苷和细胞因子；所述人参皂苷在无血清基础培养基中的质量含量为4mg/mL～10mg/mL。本发明提供的免疫细胞培养基能够提高免疫细胞的活性和增殖能力。实验结果表明：本发明提供的免疫细胞培养基培养CIK细胞14天后，增殖倍数为650～750倍、活率为97.78％～98.73％、CD3+CD56+效应细胞比例为37.4％～38.2％；培养NKT细胞14天后，增殖倍数为480～550倍、活率为96.73％～98.78％、CD3+CD56+和CD161+总和效应细胞比例为42.6％～45.2％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种免疫细胞培养基，包括：

无血清基础培养基、人参皂苷和细胞因子；

所述人参皂苷在无血清基础培养基中的质量含量为4mg/mL～10mg/mL。

2.根据权利要求1所述的免疫细胞培养基，其特征在于，还包括血浆；

所述血浆和无血清基础培养基的质量比为4～6:100。

3.根据权利要求1所述的免疫细胞培养基，其特征在于，所述细胞因子包括白细胞介素、抗CD3单克隆抗体和γ干扰素中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的免疫细胞培养基，其特征在于，所述细胞因子包括100～400U/mL白细胞介素-2、5～100ng/mL白细胞介素-15、5～100ng/mL白细胞介素-21和5～100ng/mL抗CD3单克隆抗体。

5.根据权利要求1所述的免疫细胞培养基，其特征在于，所述细胞因子包括200～500U/mL白细胞介素-2、5～100ng/mL白细胞介素-15和5～100ng/mL抗CD3单克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的免疫细胞培养基，其特征在于，所述细胞因子包括400～1000U/mL白细胞介素-2。

7.根据权利要求1所述的免疫细胞培养基，其特征在于，所述细胞因子包括100～400U/mL白细胞介素-2、5～100ng/mLγ干扰素和5～100ng/mL抗CD3单克隆抗体。

8.根据权利要求1所述的免疫细胞培养基，其特征在于，所述无血清基础培养基包括X-VIVO15无血清培养基。

9.一种免疫细胞的培养方法，包括以下步骤：

将外周血进行分离，得到PBMC细胞；

将所述PBMC细胞接种于权利要求1～8任意一项所述的免疫细胞培养基，进行诱导培养，得到免疫细胞。

10.人参皂苷在制备免疫细胞培养基中的应用。