CN110305842A - 清除体内隐性感染的免疫细胞培养基及其制备方法与应用 - Google Patents
清除体内隐性感染的免疫细胞培养基及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110305842A CN110305842A CN201910629521.6A CN201910629521A CN110305842A CN 110305842 A CN110305842 A CN 110305842A CN 201910629521 A CN201910629521 A CN 201910629521A CN 110305842 A CN110305842 A CN 110305842A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- liquid
- cell
- ifn
- culture medium
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Hematology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种清除体内隐性感染的免疫细胞培养基及其制备方法与应用。本发明首先提供一种培养基组合物,其可用于免疫细胞SIET(Silent Infection Elimination T cells)的培养,其组分包括:A液和B液;其中,A液组成成分包括:基础培养基、IL‑2、IFN‑γ、GM‑CSF;还可进一步包括IL‑4和/或TNF‑α;B液组成成分包括:基础培养基、IL‑2、IFN‑γ;还可进一步包括IL‑15。本发明的培养基用于针对清除体内隐性感染的免疫细胞SIET的培养,可使免疫细胞的增殖速度更快、清除体内隐性感染的能力更强。
Description
技术领域
本发明是关于一种清除体内隐性感染的免疫细胞培养基及其制备方法与应用,属于细胞培养技术领域。
背景技术
隐性感染(Recessive infection)又称亚临床感染。是指病原体侵入人体后,仅引起机体产生特异性的免疫应答,不引起或只引起轻微的组织损伤,因而在临床上不显出任何症状、体征,甚至生化改变,只能通过免疫学检查才能发现。
癌症感染的因素有以下几个方面:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV),人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV),丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV),幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)等。根据HPV与宫颈癌的关系,可将其分为低危型和高危型两大类型。低危型主要指HPV-6、11型,高危型主要是指HPV-16、18型。有研究者发现在侵袭性宫颈癌中,有57.4%患者存在HPV-16、18型,其他学者也有相同发现。支原体是一种不同于细菌和真菌的另一类微小病原体,与人类有关的支原体有肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP),人型支原体(Mycoplasma hominis,MH)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum,UU)和生殖支原体(Mycoplasma genitalium,MG),前者引起肺炎,后三者引起泌尿生殖道感染。当人体感染支原体、衣原体后,产生特异性的免疫,但是这种免疫力较弱,持续时间短暂,因此,支原体、衣原体感染容易造成持续,反复感染,以及隐性感染。
随着时间的推移,免疫潜力的不断下降,免疫反应的基线愈来愈接近极限。从出生以来不断发生的免疫反应(肌体应对长期隐性感染的自我保护反应)重塑了免疫系统,免疫反应强度不断衰减而保持在一个过低的水平。
目前市场上现有免疫培养基配制技术还有待于改进和发展,特别是需要研发具有特定功能例如适合清除体内隐性感染的免疫细胞的专用培养基。
发明内容
本案发明人研发了一种免疫细胞,其是经激活和诱导的一群异质细胞,可同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子,兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点,能够发挥抗细菌、真菌、病毒及衣原体,巴尔通氏小体等外源因子,从而达到减少感染及清除隐性感染的目的,减少疾病的发生。本发明的一个目的在于提供一种可用于这种清除体内隐性感染的免疫细胞(Silent Infection Elimination T cells,本发明中简称为SIET或SIET细胞)快速扩增、增强其清除体内隐性感染能力的培养基组合物。
本发明的另一目的在于提供所述的培养基的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述的培养基的应用。
为实现上述目的,一方面,本发明提供了一种用于免疫细胞的培养基组合物,其组分包括:A液和B液。
其中,A液组成成分包括:基础培养基、IL-2(白介素-2)、IFN-γ(γ-干扰素)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子);还可进一步包括IL-4(白介素-4)和/或TNF-α(肿瘤坏死因子-α);
B液组成成分包括:基础培养基、IL-2(白介素-2)、IFN-γ(γ-干扰素);还可进一步包括IL-15(白介素-15)。
根据本发明的具体实施方案,本发明的培养基组合物中,IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-4、TNF-α在A液中的用量如下所示:
在本发明的一些具体实施方案中,本发明的培养基组合物中,IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-4、TNF-α在A液中的用量如下所示:
在本发明的一些具体实施方案中,本发明的培养基组合物中,IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-4、TNF-α在A液中的用量如下所示:
根据本发明的具体实施方案,本发明的培养基组合物中,IL-2、IFN-γ、IL-15在B液中的用量如下所示:
在本发明的一些具体实施方案中,本发明的培养基组合物中,IL-2、IFN-γ、IL-15在B液中的用量如下所示:
在本发明的一些具体实施方案中,本发明的培养基组合物中,IL-2、IFN-γ、IL-15在B液中的用量如下所示:
根据本发明的具体实施方案,本发明的培养基组合物中,所述基础培养基为无血清细胞培养基或X-V1VO15培养基。
另一方面,本发明还提供了一种制备用于免疫细胞的培养基的方法,该方法包括:
以本发明所述的培养基组合物分别制备A液与B液,其中,
A液制备:无菌操作,向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、GM-CSF,加或者不加TNF-α和IL-4中的一种或两种,搅拌5-10min;
B液制备:无菌操作,向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ,加或者不加IL-15,搅拌5-10min;
将A液、B液分别调节pH值至7.2-7.4。
另一方面,本发明还提供了所述的培养基组合物在培养清除体内隐性感染的免疫细胞中的应用。
本发明的有益效果:
本发明的培养基用于针对清除体内隐性感染的免疫细胞SIET细胞,可使SIET细胞的增殖速度更快、清除体内隐性感染的能力更强。
附图说明
图1是采用实施例1提供的培养基培养得到的SIET细胞与对照的培养方法提供的培养基培养得到的细胞方法相比的增殖曲线对比图。
图2是实施例6对应用实施例1-5与对照组培养基培养出的细胞中细胞的类型进行流式细胞检测图。
图3是实施例7给乙肝患者注射实施例1与对照组细胞培养基对照组培养基培养出的细胞,并与未注射前的进行血清中HBV-DNA水平的比较对比图。
图4是实施例7给乙肝患者注射实施例2与对照组细胞培养基对照组培养基培养出的细胞,并与未注射前的进行血清中HBV-DNA水平的比较对比图。
图5是实施例7给乙肝患者注射实施例3与对照组细胞培养基对照组培养基培养出的细胞,并与未注射前的进行血清中HBV-DNA水平的比较对比图。
图6是实施例7给乙肝患者注射实施例4与对照组细胞培养基对照组培养基培养出的细胞,并与未注射前的进行血清中HBV-DNA水平的比较对比图。
图7是实施例7给乙肝患者注射实施例5与对照组细胞培养基对照组培养基培养出的细胞,并与未注射前的进行血清中HBV-DNA水平的比较对比图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解,现对本发明的技术方案进行以下详细说明,但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。各实施例中未详细说明的方法和操作条件,按照所述领域的常规技术或是按照仪器制造商建议的操作进行。
本发明提供了一种用于培养可以清除体内隐性感染的免疫细胞(本发明中为SIET细胞)的培养基组合物。
具体而言,本发明提供的SIET细胞培养基组合物,其组分包括:A液和B液。
其中,A液组成成分为:基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF;或者,A液组成成分为:基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF与IL-4;或者,A液组成成分为:基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF与TNF-α;或者,A液组成成分为:基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-4与TNF-α。
A液中各组分浓度如下所示:
B液组成成分为:基础培养基、IL-2、IFN-γ;或者,B液组成成分为:基础培养基、IL-2、IFN-γ与IL-15。
B液中各组分浓度如下所示:
在本发明提供的SIET细胞培养基中,所述基础培养基为无血清细胞培养基或X-V1VO15培养基。
本发明提供的SIET细胞培养基中,IL-2在A液中的剂量为200-5000IU/ml,在一些具体实施方案中为2000-4000IU/ml;IL-2在B液中的剂量为300-10000IU/ml,在一些具体实施方案中为4500-7500IU/ml。IL-2是由多细胞来源,主要由活化T细胞产生,又具有多向性作用的细胞因子,主要促进淋巴细胞生长、增殖、分化;IL-2对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用,能刺激已被特异性抗原或致丝裂因数启动的T细胞增殖;IL-2能活化T细胞,促进细胞因子产生;刺激细胞增殖,增强杀伤活性及产生细胞因子,诱导LAK细胞产生;促进B细胞增殖和分泌抗体;激活巨噬细胞。本发明对所述IL-2的来源没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的IL-2即可,如可以采用其市售商品。在本发明的具体实施例中,所述IL-2购买于R&D公司。
本发明提供的SIET细胞培养基中,IFN-γ在A液中的剂量为500-10000IU/ml,在一些具体实施方案中为4500-6500IU/ml;IFN-γ在B液中的剂量为300-10000IU/ml,在一些具体实施方案中为4000-6000IU/ml。IFN-γ是由一族具有多种功能的多肽分子组成,可以激活巨噬细胞、NK细胞;能与细胞表面受体结合,诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白;能促进MHC I类及II类抗原的加工和提呈,在机体细胞免疫及体液免疫中发挥重要的作用。
本发明提供的SIET细胞培养基中,GM-CSF在A液的剂量为200-1500IU/ml,在一些具体实施方案中为700-1000IU/ml。GM-CSF属于造血生长因子,主要由T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞等产生,GM-CSF可促进DC的分化、成熟、活化;诱导单核细胞MHC II类分子的表达;能促进Th、NK在肿瘤部位的浸润。
本发明提供的SIET细胞培养基中,IL-4在A液的剂量为10-500IU/ml,在一些具体实施方案中为200-350IU/ml。IL-4是II型辅助T细胞(Th2细胞)分泌的细胞因子。IL-4可刺激活化B细胞和T细胞增殖、CD4+T细胞分化成II型辅助T细胞。IL-4在调节体液免疫和适应性免疫中起关键作用。IL-4可诱导B细胞抗体产生,上调第二型主要组织兼容性复合体的产生。
本发明提供的SIET细胞培养基中,TNF-α在A液中的剂量为20-1000IU/ml,在一些具体实施方案中为400-600IU/ml。TNF-α是一类重要的细胞因子,由活化的巨噬细胞和T细胞产生,在炎症反应、细胞免疫应答、肿瘤免疫中发挥关键作用。TNF刺激单核细胞和巨噬细胞分泌IL-1,并调节MHC II类抗原的表达。TNF-α是一种内源性热原质,引起发热,并诱导肝细胞急性期蛋白的合成。TNF-α可促进T细胞MHC I类抗原表达,增强IL-2依赖的胸腺细胞、T细胞增殖能力,促进IL-2、CSF和IFN-γ等淋巴因子产生,增强有丝分裂原或外来抗原刺激B细胞的增殖和IgG分泌。
本发明提供的SIET细胞培养基中,IL-15在B液中的剂量为100-1000IU/ml,在一些具体实施方案中为4000-7500IU/ml。IL-15可由活化的单核-巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生。IL-15的分子结构与IL-2有许多相似之外,因此可以利用IL-2受体的β链和γ链与靶细胞结合,发挥类似IL-2的生物学活性。IL-15可诱导B细胞增殖和分化,是唯一能部分取代IL-2诱导初期抗体产生的细胞因子;IL-15能够刺激T细胞和NK细胞增殖,诱导LAK细胞活性,还能与IL-12协同作用在体外扩增中显著提高NK、NKT细胞的比例,同时降低T细胞亚群中的CD4+T细胞和Treg细胞比例,以及升高CD8+T细胞比例,增强细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
本发明的有益效果在于以上多种细胞因子的组合,其中:
IL-2联合GM-CSF:可增强抗原提呈功能和对病原体的细胞毒作用。
IL-2联合IFN-γ:可激活Th1免疫应答,促进CD8+T细胞增殖,促进CTL活化。
GM-CSF联合IL-4:可诱导CD14+单核细胞分化为DC细胞。
IL-2联合IL15:可有效的诱导、刺激NK细胞增殖,促进其分化成熟。
IFN-γ联合GM-CSF:可增强免疫活性,激发细胞免疫和体液免疫。
IFN-γ对TNF-α的生物学作用有明显的增强作用,可能与增加细胞TNF-α受体的表达有关。
本发明提供的SIET细胞培养基中,基础培养基为无血清细胞培养基或无血清细胞培养基X-VIVO15,相比RPMI-1640培养基使用该培养基在使用时不需另外添加动物来源的血清,更符合GMP生产标准。
本发明还提出的上述SIET细胞培养基的制备方法,A液制备:无菌操作,基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、GM-CSF,加或者不加IL-4和TNF-α中的一种或两种,搅拌5-10min;B液制备:无菌操作,向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ,加或者不加IL-15,搅拌5-10min;将A液、B液混合物,调节pH值至7.2-7.4。检测合格后分别包装A液和B液为成品,即得到所述SIET细胞培养基。
实施例1
本实施例提供一种SIET细胞培养基,各组分的含量为:
A液中各组分浓度如下所示:
B液中各组分浓度如下所示:
基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO15。
其制备方法:
(1)A液制备:无菌操作,向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、GM-CSF,搅拌5-10min;
(2)B液制备:无菌操作,向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ,搅拌5-10min;
(3)将A液、B液混合物,调节pH值至7.2-7.4;然后得到所述SIET细胞培养基。
(4)用(3)中的A、B混合培养基在37℃、5%CO2条件下培养SIET细胞,并检测细胞增殖情况,细胞杀瘤力等。取样时间为培养第0、3、5、7天。
实施例2
本实施提供一种SIET细胞培养基,各组分的含量为:
A液中各组分浓度如下所示:
B液中各组分浓度如下所示:
基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO15。
其制备方法:
(1)A液制备:无菌操作,向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-4,搅拌5-10min;
(2)B液制备:无菌操作,向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ,搅拌5-10min;
(3)将A液、B液混合物,调节pH值至7.2-7.4;然后得到所述SIET细胞培养基。
(4)用(3)中的A、B混合培养基在37℃、5%CO2条件下培养SIET细胞,并检测细胞增殖情况,细胞杀瘤力等。取样时间为培养第0、3、5、7天。
实施例3
本实施例提供一种SIET细胞培养基,各组分的含量为:
A液中各组分浓度如下所示:
B液中各组分浓度如下所示:
基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO15。
其制备方法:
(1)A液制备:无菌操作,向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-4、TNF-α,搅拌5-10min;
(2)B液制备:无菌操作,向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ,搅拌5-10min;
(3)将A液、B液混合物,调节pH值至7.2-7.4;然后得到所述SIET细胞培养基。
(4)用(3)中的A、B混合培养基在37℃、5%CO2条件下培养SIET细胞,并检测细胞增殖情况,细胞杀瘤力等。取样时间为培养第0、3、5、7天。
实施例4
本实施提供一种SIET细胞培养基,各组分的含量为:
A液中各组分浓度如下所示:
B液中各组分浓度如下所示:
基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO15。
其制备方法:
(1)A液制备:无菌操作,向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、GM-CSF,搅拌5-10min;
(2)B液制备:无菌操作,向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、IL-15,搅拌5-10min;
(3)将A液、B液混合物,调节pH值至7.2-7.4;然后得到所述SIET细胞培养基。
(4)用(3)中的A、B混合培养基在37℃、5%CO2条件下培养SIET细胞,并检测细胞增殖情况,细胞杀瘤力等。取样时间为培养第0、3、5、7天。
实施例5
本实施例提供一种SIET细胞培养基,各组分的含量为:
A液中各组分浓度如下所示:
B液中各组分浓度如下所示:
基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO15。
其制备方法:
(1)A液制备:无菌操作,向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-4、TNF-α,搅拌5-10min;
(2)B液制备:无菌操作,向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、IL-15,搅拌5-10min;
(3)将A液、B液混合物,调节pH值至7.2-7.4;然后得到所述SIET细胞培养基。
(4)用(3)中的A、B混合培养基在37℃、5%CO2条件下培养SIET细胞,并检测细胞增殖情况,细胞杀瘤力等。取样时间为培养第0、3、5、7天。
对照例
对照例内容及培养方法:
本对照例提供一种基础淋巴细胞培养基,各组分的含量为:
A液中各组分浓度如下所示:
B液中各组分浓度如下所示:
基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO15。
分离并纯化外周血单个核细胞(PBMC)的步骤为:
(1)一次抽血量:150ml,肝素抗凝。150ml全血正常情况下可得1.5-2×108个细胞,可种一个75cm2培养瓶;
(2)稀释血液:培养基等倍稀释血液;
(3)25ml血液小心置于12.5ml淋巴细胞分离液上,1800rpm,15min离心,升降速调至最低。
(4)取上层部分血浆留用,4℃冰箱保存;
(5)取淋巴细胞层,置于50ml离心管中,加入培养基至总体积50ml,1800rpm,5min离心
(6)弃上清,加入一定量培养基,混悬细胞,取少量计数。
(7)1800rpm,5min离心;
(8)弃上清,加入X-VIVO15细胞培养基50ml混悬细胞。
经过上述步骤得到对照组细胞PBMC。并检测细胞增殖情况等。取样时间为培养第0、3、5、7天。
由图1与对照组细胞培养基及其制备方法相比,SIET细胞在本发明配方实施例1-5培养第5-7天获得更多的SIET细胞(P<0.05)。其中实施例5能够在第7天获得最多细胞,且有统计学意义(P<0.001)。
实施例6:对应用实施例1-5与对照组培养基培养出的细胞中细胞的类型进行流式细胞检测
通过图2可看出,实施例1-5与对照相比,表明新配方能获得较多Th1细胞,较少Th2辅助细胞,较少Treg细胞,且有统计学意义(P<0.05)。
实施例7:给乙肝患者注射实施例1-5与对照组细胞培养基对照组培养基培养出的细胞,并与未注射前的进行血清中HBV-DNA水平的比较
由图3-图7的实施例1-5可见与对照组细胞培养基及其制备方法相比,SIET细胞在本发明配方中能有效降低乙肝患者血清HBV-DNA水平,且有统计学意义(P<0.05)。
Claims (10)
1.一种用于免疫细胞的培养基组合物,其组分包括:A液和B液;
其中,A液组成成分包括:基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF;还可进一步包括IL-4和/或TNF-α;
B液组成成分包括:基础培养基、IL-2、IFN-γ;还可进一步包括IL-15。
2.根据权利要求1所述的培养基组合物,其中,IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-4、TNF-α在A液中的用量为:
IL-2,200-5000IU/ml;
IFN-γ,500-10000IU/ml;
GM-CSF,200-1500IU/ml;
IL-4,0-500IU/ml或者10-500IU/ml;
TNF-α,0-1000IU/ml或者20-1000IU/ml。
3.根据权利要求1所述的培养基组合物,其中,IL-2、IFN-γ、IL-15在B液中的用量为:
IL-2,300-10000IU/ml;
IFN-γ,300-10000IU/ml;
IL-15,0-10000IU/ml或者100-10000IU/ml。
4.根据权利要求1所述的培养基组合物,其中,所述基础培养基为无血清细胞培养基或X-V1VO15培养基。
5.根据权利要求1所述的培养基组合物,其中,
IL-2在A液与B液中的剂量分别为2000-4000IU/ml、4500-7500IU/ml。
6.根据权利要求1所述的培养基组合物,其中,
IFN-γ在A液与B液中的剂量分别为4500-6500IU/ml、4000-6000IU/ml。
7.根据权利要求1所述的培养基组合物,其中,GM-CSF在A液的剂量为700-1000IU/ml;
IL-4在A液的剂量为200-350IU/ml;
TNF-α在A液中的剂量为400-600IU/ml。
8.根据权利要求1所述的培养基组合物,其中,IL-15在B液中的剂量为4000-7500IU/ml。
9.一种制备用于免疫细胞的培养基的方法,该方法包括:
以权利要求1~8任一项所述的培养基组合物分别制备A液与B液,其中,
A液制备:无菌操作,向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、GM-CSF,加或者不加TNF-α和IL-4中的一种或两种,搅拌5-10min;
B液制备:无菌操作,向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ,加或者不加IL-15,搅拌5-10min;
将A液、B液分别调节pH值至7.2-7.4。
10.权利要求1~8任一项所述的培养基组合物在培养清除体内隐性感染的免疫细胞中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910629521.6A CN110305842A (zh) | 2019-07-12 | 2019-07-12 | 清除体内隐性感染的免疫细胞培养基及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910629521.6A CN110305842A (zh) | 2019-07-12 | 2019-07-12 | 清除体内隐性感染的免疫细胞培养基及其制备方法与应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110305842A true CN110305842A (zh) | 2019-10-08 |
Family
ID=68079892
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910629521.6A Pending CN110305842A (zh) | 2019-07-12 | 2019-07-12 | 清除体内隐性感染的免疫细胞培养基及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110305842A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115433714A (zh) * | 2022-04-15 | 2022-12-06 | 广东汉氏干细胞生物科技有限公司 | 一种免疫细胞在治疗疾病中的应用及其制备方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002087612A2 (de) * | 2001-04-26 | 2002-11-07 | Rudolf Wank | Verwendung von stimulierten mononukleären zellen des peripheren blutes zur behandlung von krebserkrankungen |
CN104911148A (zh) * | 2015-07-14 | 2015-09-16 | 奥思达干细胞有限公司 | 一种人免疫活性细胞dc-cik细胞制剂及其有效制备方法 |
CN105238753A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-01-13 | 成都百赛泰科生物科技有限公司 | 一种用于制备ctl的试剂盒及其应用 |
-
2019
- 2019-07-12 CN CN201910629521.6A patent/CN110305842A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002087612A2 (de) * | 2001-04-26 | 2002-11-07 | Rudolf Wank | Verwendung von stimulierten mononukleären zellen des peripheren blutes zur behandlung von krebserkrankungen |
CN104911148A (zh) * | 2015-07-14 | 2015-09-16 | 奥思达干细胞有限公司 | 一种人免疫活性细胞dc-cik细胞制剂及其有效制备方法 |
CN105238753A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-01-13 | 成都百赛泰科生物科技有限公司 | 一种用于制备ctl的试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
王建六: "《肿瘤免疫研究进展》", 31 July 1997 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115433714A (zh) * | 2022-04-15 | 2022-12-06 | 广东汉氏干细胞生物科技有限公司 | 一种免疫细胞在治疗疾病中的应用及其制备方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105062968B (zh) | 一种dc-cik细胞培养试剂及其培养方法 | |
CN103756963A (zh) | 一种体外扩增nk细胞的方法 | |
JP6337262B2 (ja) | 耐塩性乳酸菌、耐塩性乳酸菌の培養方法、及び免疫賦活剤 | |
CN101514333B (zh) | 一种免疫耐受型树突状细胞及其制备方法与专用培养基 | |
CN102719402B (zh) | Hla-a0201限制性抗hpv抗原特异性ctl的制备方法 | |
JP2014030375A (ja) | 単球またはnk細胞を入手する方法 | |
CN115521914A (zh) | 一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系及方法 | |
CN110305842A (zh) | 清除体内隐性感染的免疫细胞培养基及其制备方法与应用 | |
CN105018427B (zh) | 一种增强ctl免疫反应的dc细胞培养方法 | |
CN105106237B (zh) | 一种高效杀伤肿瘤细胞生物制剂 | |
Kodama et al. | Potential antitumor activity of a low-molecular-weight protein fraction from Grifola frondosa through enhancement of cytokine production | |
AU2020103625A4 (en) | Applications of bacillus calmette-guerin (bcg) polysaccharide and nucleic acid in in-vitro culture of cytokine-induced-killer (cik) cells and preparation of antitumor drugs | |
CN107312751A (zh) | 一种诱导小鼠骨髓细胞稳定分化为未成熟树突状细胞的专用培养基及培养方法 | |
CN107502591A (zh) | 一种浓度梯度rhIL‑2依赖的iNKT细胞扩增方法及其应用 | |
CN101481678B (zh) | 一种自然杀伤细胞及其培养方法 | |
CN110358730A (zh) | 一种用于capri细胞的培养基组合物及其制备方法和应用 | |
CN111117959A (zh) | Dc-cik细胞培养基、dc-cik细胞的培养方法及应用 | |
CN1223675C (zh) | 一种抗肿瘤免疫活性细胞-dcik细胞、其制备方法及应用 | |
CN110358728A (zh) | 一种预防肿瘤发生的免疫细胞培养基及其制备方法与应用 | |
CN101037670A (zh) | 一种预防和治疗cea阳性肿瘤的效应细胞及其制备方法和应用 | |
WO2022032665A1 (zh) | 一种制备通用型免疫细胞的方法及其应用 | |
Chen et al. | Effects of fermentation products of Ganoderma lucidum on growth performance and immunocompetence in weanling pigs | |
CN1787835A (zh) | 人淋巴细胞疫苗佐剂 | |
CN102851256B (zh) | 促树突状细胞成熟的体外培养方法及专用培养基 | |
CN114517181B (zh) | 一种人t淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191008 |