CN106190978A - 离体扩培非人灵长类动物造血干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及离体扩培非人灵长类动物造血干细胞的方法。本发明揭示了一种离体扩增非人灵长类动物的培养基和培养方法,通过所述培养基和培养方法可使非人灵长类动物造血干细胞在保持原来干性特征的基础上进行有效和大量的扩增,大大提高造血干细胞的体外扩增效率。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,更具体地,本发明涉及离体扩培非人灵长类动物造血干细胞的方法。
背景技术
干细胞(Stem Cells)是一类具有自我更新及多向分化潜能的细胞群体,即这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小,同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞,从而医学界称之为“万能细胞”。这种独一无二的特性使其成为再生医学和移植医学的一个不可缺少的细胞来源。也使它成为众多疾病,如血液疾病、帕金森病,糖尿病,脊髓损伤、癌症和心脏病等细胞治疗的最佳候选者,因此对于干细胞的研究在临床应用领域中意义重大。
造血干细胞(Hemopoietic Stem Cells,HSCs)是存在于造血组织中的一群原始造血细胞,造血干细胞在临床上的骨髓移植和恶性血液疾病治疗方面发挥着重要作用,主要来源有脐带血,骨髓及动员后的外周血。但由于这些来源中所含的造血干细胞数量有限,不能满足临床医治的需求。并且,造血干细胞在应用过程中一个瓶颈是不能够有效的体外扩增并且在体外扩增中会失去其干性。
已知的造血干细胞的扩增方法有使用饲养层细胞的方法,此方法不能使子干细胞维持与母干细胞相同的成熟状态,最佳可以扩增干细胞5倍左右,且引入了外源性的细胞干扰,不利于扩增后用于临床移植,易提高移植物抗宿主反应(GVHD)发生风险。
所以,将造血干细胞进行体外安全有效地扩增,并且扩增出能够切实地应用于动物、特别是灵长类动物的造血干细胞,仍是目前本领域研究的热点和难点。
发明内容
本发明的目的在于提供离体扩培非人灵长类动物造血干细胞的方法。
在本发明的第一方面,提供一种离体培养非人灵长类动物的造血干细胞的方法,所述方法包括:利用包含细胞因子组合物的培养基培养非人灵长类动物的CD34+造血干细胞;所述的细胞因子组合物包括:
在另一优选例中,所述的细胞因子组合物包括:
在另一优选例中,所述的包含细胞因子组合物的培养基是:添加有所述细胞因子组合物的IMDM培养基;较佳地,该培养基中还包括胎牛血清(较佳地为5~15%(v/v),如10%(v/v)胎牛血清)。
在另一优选例中,所述的方法包括:将CD34+造血干细胞接种于多孔板(如6孔板)中,接种密度为(1-10)×105个/孔,培养起始后第2~3天后以及第5~6天后分别更换新鲜培养基,适时分孔。
在本发明的另一方面,提供一种如前所述的包含细胞因子组合物的培养基在离体培养非人灵长类动物的CD34+造血干细胞中的用途。
在一个优选例中,所述的包含细胞因子组合物的培养基是:添加有所述细胞因子组合物的IMDM培养基;较佳地,该培养基中还包括胎牛血清(较佳地为5~15%(v/v),如10%(v/v)胎牛血清)。
在本发明的另一方面,提供一种包含细胞因子组合物的培养基在制备用于离体培养非人灵长类动物的CD34+造血干细胞的试剂盒中的用途;所述的细胞因子组合物包括:
在一个优选例中,所述的灵长类动物是猴。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、猴外周血来源的造血干细胞经体外扩增9天后的倍数及CD34阳性率。
A、体外扩增9天后,总细胞及CD34+细胞扩增倍数;
B、扩增前即第0天和扩增九天后CD34+比例。图中代表11只猴的平均扩增数据。
图2、猴外周血来源的造血干细胞扩增前(Pre-expansion)及体外扩增后(Post-expansion)的各系集落形成数目,包括粒系祖细胞集落(CFU-G)、粒系巨核系祖细胞集落(CFU-GM)、造血祖细胞集落(CFU-GEMM)、巨核系祖细胞集落(CFU-M)、红系祖细胞集落(BFU-E)。图中数据代表11只猴的平均数据。
图3、猴造血干细胞自体移植后,血象恢复时间图。血象指标包括:
A、白细胞(WBC);
B、血小板(PLT);
C、中性粒细胞(NEU);
D、淋巴细胞(LMP)。
包括了空白对照组(Blank Ctrl)、阴性对照组(Negative Ctrl)和实验组(Experiment Group)的各个动物在移植后指标恢复正常的时间。图中每一个点代表1只猴的数据,总共是9只存活并恢复正常的猴的数据。因为空白对照(共3只)和阴性对照(共3只)在自体移植后5天各有1只死亡,所以这两组各剩2只存活。实验组(共5只)全部存活。例如:空白对照组2只存活,则有2个数据点,对应这2只在这个指标的恢复时间。
图4、实验组动物(5只食蟹猴,编号E-1~E-5)造血干细胞自体移植一个月,流式检测外周血和骨髓中,GFP(+)细胞在CD45+细胞群中的比例。
A、移植一个月内,不同时间点采集外周血,流式检测CD45+细胞群中GFP(+)比例;
B、移植一个月后,采集5只动物骨髓,流式检测各个动物骨髓CD45+细胞群中GFP(+)比例。
具体实施方式
针对现有技术中难以实现灵长类动物(如猴)的造血干细胞高效扩增的技术问题,本发明人经过深入的研究,开发了一种离体扩增造血干细胞的培养基和培养方法,通过所述培养基和培养方法可使非人灵长类动物造血干细胞在保持原来干性特征的基础上进行有效和大量的扩增,大大提高造血干细胞的体外扩增效率。
如本文所用,术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成(制成)”“基本上由……构成”、和“由……构成”。
细胞因子组合物及培养基
本发明人优化了用于离体扩增造血干细胞的细胞因子。提供了一种细胞因子组合物。
所述的细胞因子组合物包括:干细胞因子(SCF)、flt3-配体(FLT-3L)、血小板因子(TPO)、中性粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素3(IL3)、白介素6(IL6)和Sall样蛋白4B(Sall4B)。上述各细胞因子以适合的比例添加到细胞生长培养基中,可为非人灵长类动物造血干细胞提供适合的离体生长环境的培养基,促进造血干细胞的生长和扩增。作为本发明的优选方式,用于配制本发明的培养基的各组分的用量如表1所示。
表1
表1配方的细胞因子被溶于细胞培养基中,得到适宜培养的培养基,从而为非人灵长类动物的造血干细胞提供适宜的生长和扩增环境。所述的细胞培养基可以选择IMDM培养基或类似的细胞培养基。
用于配制培养基的Sall4B、SCF、TPO、Flt-3L、G-CSF、IL3和IL6均是本领域技术人员易于获得的,例如可通过商业途径购买,或可通过人工合成或重组表达获得。
培养方法
本发明还提供了一种扩增培养非人灵长类动物的造血干细胞的方法,所述方法包括:应用所述的细胞因子组合物添加到细胞生长培养基中,培养造血干细胞。较佳地,所述方法包括:将CD34+造血干细胞接种于多孔板(如6孔板)中,接种密度为(1-10)×105个/孔,培养起始后第2~3天后以及第5~6天后分别更换新鲜培养基,适时分孔。
本发明将非人灵长类动物的造血干细胞通过优化的干细胞生长培养基于体外安全高效扩增,可以大量获得可供干细胞研究实验室科研研究或供临床试验的细胞。
本领域临床实验中,已经存在一些方案来扩增造血干细胞,但在干细胞的分裂过程当中,一个子细胞保留与母干细胞相同成熟状态,但另一个则出现了分化的情况,已经存在的方案就是会使干细胞扩增仅仅一代或两代,在此之后保持原来干性的细胞数量大大下降。本发明使用含有Sall4B、SCF、TPO、Flt-3L、G-CSF、IL3和IL6的体外扩增造血干细胞的配方来高效扩增造血干细胞的技术,与传统的造血干细胞扩增方法相比,具有如下几个主要特点和优势:第一,不引入外源性基因表达,避免了外源基因对原干细胞的基因组稳定性的干扰;第二,不涉及饲养层细胞等外源性细胞混杂而导致的干细胞移植安全问题;第三,本发明可使干细胞体外培养9天内将CD34+干祖细胞数量增加接近70倍,总有核细胞总数在培养9天时增加至少160倍,培养16天时总有核细胞可增加数百倍或更多。
目前使用已经发明的离体干细胞的培养基扩增干细胞其扩增效率目前报道的为5倍左右,需要引入外源性基因表达而进行的干细胞扩增最佳可以达到160倍至200倍的扩增效果,并且对于造血干细胞的干性和基因稳定性造成了干扰。而本发明因使用了特定配方的培养物扩增造血干细胞使扩增效率大大提高,与传统培养配方相比具有显著的更高的扩增效率,而且能够很好的保持干细胞自我更新和多能分化等基本特征。
本发明人利用新型的对造血干细胞进行体外有效扩增的技术,使造血干细胞在保持原来干性特征的基础上进行有效和大量的扩增。对于扩增后的造血干细胞,需要动物实验验证其在体内的安全有效性。
因此,针对扩增获得的细胞,本发明人进一步进行了临床前动物实验,以确认扩增后造血干细胞的体内外干性和造血重建能力。所述的临床前动物实验主要包括:通过建立猴骨髓抑制模型,扩增后的获得的造血干细胞在动物自体移植上的应用价值。
造血干细胞来源于食蟹猴动员后外周血(主要是CD34+细胞),通过体外培养扩增后,可满足自身移植需求。食蟹猴经环磷酰胺注射造成骨髓抑制,通过回输之前扩增的造血干细胞,可有效帮助动物血象恢复。移植前的细胞体外多系克隆形成实验,及移植后动物血常规的监测、流式监测结果说明采用该技术扩增后的造血干细胞能保持多系分化潜能,体内能帮助骨髓抑制动物的血象恢复。
本发明因使用了特定配方的培养物扩增猴造血干细胞,能够很好的保持干细胞自我更新和多能分化等基本特征,而且不需引入外源基因和饲养层细胞,降低了GVHD发生风险。另外,本发明用食蟹猴做骨髓抑制模型进行动物体内实验,从移植后的血象恢复等指标对扩增后的造血干细胞在体内的功能发挥进行有效评价。与常规进行的NOD/SCID小鼠体内实验相比,非人灵长类动物食蟹猴模型更适于临床前实验,所得数据结果更能为该技术的临床应用的安全性和稳定性提供参考资料。使用非人灵长类动物作为造血干细胞移植的模型,传统手法是对动物进行高剂量的辐射彻底破坏动物自身骨髓造血功能,因为辐射剂量较高,动物免疫力完全破坏,在后续实验中会出现动物并发症感染或者死亡。本发明人采用环磷酰胺对动物造成骨髓抑制模型,在动物血象恢复的观察窗内可获得有效的实验数据,通过比较对照组和实验组的各指标恢复所需时间,即可说明扩增后的造血干细胞在体内的功能发挥。另外,由于环磷酰胺的毒性有限,动物自身也具有一定的恢复能力,可以避免由于辐射引发的较高死亡率。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、造血干细胞的分离
试验用11只食蟹猴,按照体重每天皮下注射G-CSF(200μg/kg)和SCF(200μg/kg),连续注射五天动员骨髓释放CD34+造血干细胞到外周血中,于注射第6天和第7天,连续两天每天采集猴外周血15ml,使用美天旎公司MACS磁珠分选系统分离CD34+细胞,针对11只猴,分离所得的造血干细胞分别约2~3×106个细胞/只。
实施例2、造血干细胞的扩增培养
以Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)作为基础培养基,在其中加入10%胎牛血清(v/v)以及终浓度如表1的细胞因子。
表1
配方1(单位:ng/ml) | |
Sall4B | 3ng/ml |
SCF | 100ng/ml |
FLT-3L | 100ng/ml |
TPO | 20ng/ml |
G-CSF | 12.5ng/ml |
IL3 | 25ng/ml |
IL6 | 12.5ng/ml |
在康宁公司低吸附6孔细胞培养板上进行体外培养和扩增,细胞接种密度为5×105个/孔,每孔含培养基2ml,培养板置于培养箱中(37℃,5%CO2)。在培养第3天和第5天,对培养板每孔更换新鲜培养基,并适时分孔以保持孔内细胞密度处于合适状态。在培养第6天,将扩增后的细胞(仅对实验组的5只猴来源的细胞)进行GFP慢病毒转染标记:用移液枪吸弃每孔培养基上清约800μl后,再加入GFP慢病毒60μl和Polybrene 5μl,进行GFP慢病毒转染标记,放入培养箱12h后取出培养板,将细胞板内细胞吸出,1200rpm/min离心5min,弃去上清,用培养基重悬细胞沉淀,并再次接种到6孔板内继续培养。慢病毒构建所需质粒(psPAX2质粒,pMD2G质粒和GFP基因组质粒)来源于纽约州立大学石溪分校(Aguila,J.R.,Liao,W.,Yang,J.,Avila,C.,Hagag,N.,Senzel,L.,and Ma,Y.(2011)SALL4is a robust stimulator for the expansionof hematopoietic stem cells.Blood 118,576-585)。
体外培养9天后,总细胞扩增约8.6倍,CD34+细胞扩增约8倍,可达到自体移植所需细胞量(2×106/kg CD34+细胞),CD34+比例与扩增前相比仍保持较高水平(扩增前CD34+比例70%,扩增后63%),如图1。
(1)293T细胞培养。培养基为DMEM,加10%胎牛血清,加1%青链霉素。培养容器为T75cm2培养瓶。培养至细胞密度在70%左右,可进行转染病毒质粒,进行病毒包装的过程。
(2)病毒质粒转染及病毒包装。
(a)提前30分钟将293T的培养基换成不含有青链霉素的DMEM加20%胎牛血清的培养基;
(b)准备以下两个溶液,一是1.8ml Opti-MEM中加入75微升脂质体2000;二是在1.8ml Opti-MEM中加入10微克psPAX2质粒,5微克pMD2G质粒和15微克病毒的基因组质粒,混匀;
(c)将两种溶液混合,室温孵育20-30分钟,不要超过30分钟;
(d)将混合溶液加入到293T细胞培养瓶中;
(e)12-16小时之后将培养基换成如下培养基:DMEM加20%胎牛血清,加1%青链霉素,加1mM浓度的丙酮酸钠;
(3)慢病毒的收集
在上一步换液之后的12小时,36小时和60小时分别收集培养液。前两次收集的同时,再加入培养基(DMEM加20%胎牛血清,1%青链霉素和1mM浓度的丙酮酸钠。
(4)病毒的浓缩
(a)将收集的病毒液离心,速度300g,时间10分钟;
(b)收集上清,用0.22微米的滤膜过滤;
(c)将过滤后的病毒液进行离心,速度23000rpm,时间3小时;
(d)弃上清,加入500ul DMEM培养基,室温放置30分钟,然后重选病毒;
(e)浓缩后病毒的滴度约为108IU;
(5)病毒的保存:-80℃冰箱。
冻存GFP慢病毒转染标记后的细胞。在自体移植前复苏细胞,进行克隆形成实验,各细胞系克隆数目与之前未扩增的造血干细胞形成的克隆进行比较,无显著差异,如图2。该结果说明扩增后,细胞在体外仍保持了多系分化潜能。
实施例3、回输试验
检测11只试验猴的血常规及生命体征,在各指标处于正常水平时,根据猴体重连续2天静脉注射环磷酰胺(50mg/Kg)造成骨髓抑制,即白细胞总数,粒细胞,淋巴细胞,单核细胞,血小板均显著下降。
继续注射环磷酰胺,在环磷酰胺注射后第5天,对猴实施造血干细胞自体移植术,其中空白对照组3只,只给予生理盐水回输;阴性对照组3只,回输等量生理盐水,内含CD34-细胞(2×107/kg)(在使用美天旎公司MACS磁珠分选系统分离CD34+细胞过程中,收集流出液即CD34-细胞);实验组5只,回输等量生理盐水,内含如前扩增培养的CD34+细胞(2×106/kg)和CD34-细胞(2×107/kg)。在回输后血常规监测各组血象恢复情况,及动物身体状态,11只食蟹猴的状况如表1。
移植后5天,空白对照组和阴性对照组各有一只死亡,病理解剖死亡病因一致,疑似急性肾衰,实验组全部存活。从自体移植术后开始至移植后一个月内,每隔3到5天对各组实验动物采集外周血,进行血常规检测,观察血象恢复情况。实验组白细胞总数,中性粒细胞恢复时间约在移植后两周恢复正常,较空白组及阴性对照组快1周。血小板恢复时间,空白组14天,阴性对照11天,实验组10天。三组的淋巴细胞恢复时间均在移植后三周左右,无明显差异(图3)。
移植后一个月内,每隔3~5天采集外周血样本检测其中CD45细胞群(CD45是白细胞共同抗原标志物,即表达在)中GFP+比例,维持在1%~2%,说明回输细胞在猴体内持续存活增殖。移植后一个月抽取实验组猴骨髓,流式细胞仪检测其中CD45细胞群中GFP+比例,在1.8%~4.1%,说明并有少数细胞植入骨髓中(图4)。由此,体内外实验说明,采用该新型技术扩增后的造血干细胞能保持多系分化潜能,体内能帮助骨髓抑制动物的血象恢复。
在后续的检测点(移植后三个月,六个月,九个月,及一年),对动物生命体征如血常规,体重,废食情况等继续监测,实验组动物均无异常,进一步说明了本发明的新型离体扩增造血干细胞技术的安全性,有效性和稳定性。
表2
B-1~B-3为:空白对照组,自体移植时仅回输约50ml的生理盐水。
N-1~N-3为:阴性对照组,自体移植时回输等量的生理盐水,其中含有自身CD34-细胞。
E-1~E-5为:实验组,自体移植时回输等量的生理盐水,其中含有自身CD34-细胞和体外扩培后的CD34+细胞。
实施例4、其它配方培养猴造血干细胞
基于所述的细胞因子,发明人还配制了其它一些配方,以Iscove’sModified Dulbecco’s Medium(IMDM)作为细胞培养基,添加10%胎牛血清(v/v)其中分别加入如表3所示配方的细胞因子。获得配方。
表3
配方2(ng/ml) | 配方3(ng/ml) | 配方4(ng/ml) | |
Sall4B | 3ng/ml | 3ng/ml | 3ng/ml |
SCF | 100ng/ml | 150ng/ml | 150ng/ml |
FLT-3L | 150ng/ml | 150ng/ml | 200ng/ml |
TPO | 25ng/ml | 50ng/ml | 50ng/ml |
G-CSF | 12.5ng/ml | 25ng/ml | 50ng/ml |
IL3 | 25ng/ml | 50ng/ml | 100ng/ml |
IL6 | 25ng/ml | 50ng/ml | 50ng/ml |
采用如实施例2相同的培养条件,分别应用配方2、3或4作为培养基,培养猴造血干细胞。结果,CD34+细胞平均扩增倍数高位数为10.9倍,低位数为5.6倍;因此,扩繁效果较为理想。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种离体培养非人灵长类动物的造血干细胞的方法,其特征在于,所述方法包括:利用包含细胞因子组合物的培养基培养非人灵长类动物的CD34+造血干细胞;所述的细胞因子组合物包括:
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的细胞因子组合物包括:
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的包含细胞因子组合物的培养基是:添加有所述细胞因子组合物的IMDM培养基;较佳地,该培养基中还包括胎牛血清。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的方法包括:将CD34+造血干细胞接种于多孔板中,接种密度为(1-10)×105个/孔,培养起始后第2~3天后以及第5~6天后分别更换新鲜培养基,适时分孔。
5.如权利要求1-4任一所述的方法,其特征在于,所述的非人灵长类动物是:猴。
6.一种包含细胞因子组合物的培养基在离体培养非人灵长类动物的CD34+造血干细胞中的用途;所述的细胞因子组合物包括:
7.如权利要求6所述的用途,其特征在于,所述的细胞因子组合物包括:
8.如权利要求6所述的用途,其特征在于,所述的包含细胞因子组合物的培养基是:添加有所述细胞因子组合物的IMDM培养基;较佳地,该培养基中还包括胎牛血清。
9.一种包含细胞因子组合物的培养基在制备用于离体培养非人灵长类动物的CD34+造血干细胞的试剂盒中的用途;所述的细胞因子组合物包括:
10.如权利要求6-9任一所述的用途,其特征在于,所述的非人灵长类动物是:猴。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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