CN117925521A - 用于培养nk细胞激活剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本公开是关于一种用于培养NK细胞的激活剂、激活培养基、以及使用该激活剂和/或激活培养基进行NK细胞的制备方法；所述激活剂包括：重组人FLT‑3配体蛋白、重组人SCF蛋白、重组人IL‑3蛋白、重组人IL‑7蛋白、重组人IL‑15蛋白和注射用重组人IL‑2蛋白；其中，所述重组人FLT‑3配体蛋白、重组人SCF蛋白、重组人IL‑3蛋白、重组人IL‑7蛋白和重组人IL‑15蛋白在所述激活剂中的浓度范围依次选自0.01～0.5μg/mL、0.01～0.5μg/mL、0.01～0.5μg/mL、0.01～0.5μg/mL和0.01～1μg/mL；本公开提供的方法步骤简单，可操作性强，缩短原代细胞的培养周期，获得的NK细胞状态稳定。
Description
技术领域
本公开涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于培养NK细胞的激活剂及其应用。
背景技术
NK细胞的发现距今已有几十年的历史，其属于固有免疫系统，是人体免疫系统的第一道防线。NK细胞约占血液中淋巴细胞的5％～15％，是一类无T和B细胞特征性标志的淋巴细胞，同时也存在于外周组织中，如肝脏、腹膜腔、胎盘等，在外周血中循环的NK细胞通常处于免疫静止状态，一旦被细胞因子激活，它们会渗透到大多数组织中攻击肿瘤细胞和病毒感染细胞。
NK细胞是固有免疫系统的重要组成部分，是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞，NK细胞识别靶细胞无MHC限制性，可以在无预先致敏的情况下杀伤肿瘤细胞。同时，还可以产生一系列的细胞因子，进而对机体的适应性免疫进行调节，是连接机体固有免疫和适应性免疫的桥梁。
发明内容
本公开提供一种用于培养NK细胞的激活剂、激活培养基、NK细胞的制备方法、NK细胞以及药物组合物，以解决相关技术中的不足。
根据本公开实施例的第一方面，提供一种用于培养NK细胞的激活剂，包括：重组人FLT-3配体蛋白、重组人SCF蛋白、重组人IL-3蛋白、重组人IL-7蛋白、重组人IL-15蛋白和注射用重组人IL-2蛋白；其中，所述重组人FLT-3配体蛋白、重组人SCF蛋白、重组人IL-3蛋白、重组人IL-7蛋白和重组人IL-15蛋白在所述激活剂中的浓度范围依次选自0.01～0.5μg/mL、0.01～0.5μg/mL、0.01～0.5μg/mL、0.01～0.5μg/mL和0.01～1μg/mL。
可选的，所述激活剂还包括：抗人CD16单克隆抗体、重组人anti-HER-2蛋白、RetroNectin、OK-432、抗人CD52单克隆抗体和抗人CD137单克隆抗体。
可选的，所述抗人CD16单克隆抗体、重组人anti-HER-2蛋白、RetroNectin、OK-432、抗人CD52单克隆抗体和抗人CD137单克隆抗体在所述激活剂中的浓度范围依次选自0.1～20μg/mL、0.01～0.5μg/mL、1～50μg/mL、0.1～20μg/mL、0.01～1μg/mL和0.01～1μg/mL。
可选的，所述激活剂还包括：重组人IL-1α蛋白、重组人IL-1β蛋白、重组人IL-12蛋白、重组人IL-18蛋白、重组人IL-21蛋白、重组人4-1BB蛋白和重组人OX-40配体蛋白。
可选的，所述重组人IL-1α蛋白、重组人IL-1β蛋白、重组人IL-12蛋白、重组人IL-18蛋白、重组人IL-21蛋白、重组人4-1BB蛋白和重组人OX-40配体蛋白在所述激活剂中的浓度范围依次选自0.005～0.1μg/mL、0.005～0.1μg/mL、0.05～0.5μg/mL、0.05～0.5μg/mL、0.05～0.6μg/mL、0～1μg/mL、0.01～5μg/mL。
可选的，所述注射用重组人IL-2蛋白在所述激活剂中的浓度范围选自1～5000IU/mL。
根据本公开实施例的第二方面，提供一种激活培养基，包括：前述激活剂、第一基础培养基和1％～15％的自体灭活血浆。
根据本公开实施例的第三方面，提供一种NK细胞的制备方法，所述方法包括使用前述激活剂和前述激活培养基对NK细胞进行诱导和/或扩增。
可选的，所述方法包括：
(1)培养板包被：使用OK-432、抗人CD52单克隆抗体、抗人CD137单克隆抗体、抗人CD16单克隆抗体、重组人anti-HER-2蛋白和RetroNectin中的至少一者包被培养板；
(2)复苏单个核细胞；
(3)静置单个核细胞：向包含密度为2×106～2×107个/mL的单个核细胞的培养基加入1％～15％的自体灭活血浆，在37℃的细胞培养箱中静置3～24小时；
(4)接种单个核细胞：向包含密度为1×106～1×107个/mL的单个核细胞的培养基加入前述激活剂和1％～15％的自体灭活血浆，进行接种培养；
(5)加入激活培养基：第3～4天向接种培养的单个核细胞补加前述激活培养基和1％～15％的自体灭活血浆；
(6)加入扩增培养基：第5～21天内，每隔1～2天，加入扩增培养基；所述扩增培养基包括扩增剂、第二基础培养基和0.5％～5％的自体灭活血浆；
(7)收获细胞。
可选的，所述扩增剂包括重组人IL-2蛋白和重组人IL-15蛋白，其中，所述重组人IL-2蛋白和重组人IL-15蛋白在所述扩增剂中的浓度范围依次选自100～5000IU/mL和0.01～0.5μg/mL。
可选的，在补加激活培养基的过程中，所述激活培养基的体积为原细胞培养体积的1～5倍。
可选的，所述单个核细胞为PBMC细胞。
根据本公开实施例的第四方面，提供一种NK细胞，所述NK细胞通过前述的制备方法得到。
根据本公开实施例的第五方面，提供一种用于抗肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包括有效治疗量的前述NK细胞。
可选的，所述NK细胞与肿瘤细胞的效靶比选自(0.25～80)：1。
可选的，所述NK细胞与肿瘤细胞的效靶比选自(0.25～10)：1。
可选的，所述NK细胞与肿瘤细胞的效靶比选自5：1。
可选的，所述肿瘤为泌尿系肿瘤。
可选的，所述药物组合物的作用时间选自0.5～48小时。
可选的，所述药物组合物的作用时间选自0.5～4小时。
本公开的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
由上述实施例可知，本公开提供了一种用于培养NK细胞的激活剂、激活培养基、以及使用该激活剂和/或激活培养基进行NK细胞的制备方法；该方法步骤简单，可操作性强，缩短原代细胞的培养周期，获得的NK细胞状态稳定。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。
图1是实施例1示出的NK细胞随时间变化的扩增图像。
图2是实施例1示出的不同天数下的细胞流式图。
图3是实施例2示出的NK细胞上一部分激活性受体、抑制性受体及免疫细胞激活表面标志分子不同天数下的变化。
图4是实施例2示出的NK细胞上另一部分激活性受体、抑制性受体及免疫细胞激活表面标志分子不同天数下的变化。
图5是实施例3示出的NK细胞随时间变化的扩增图像。
图6是实施例3示出的不同天数下的细胞流式图。
图7是实施例4示出的NK细胞上一部分激活性受体、抑制性受体及免疫细胞激活表面标志分子不同天数下的变化。
图8是实施例4示出的NK细胞上另一部分激活性受体、抑制性受体及免疫细胞激活表面标志分子不同天数下的变化。
图9是实施例5示出的NK细胞随时间变化的扩增图像。
图10是实施例5示出的不同天数下的细胞流式图。
图11是实施例6示出的NK细胞随时间变化的扩增图像。
图12是实施例6示出的不同天数下的细胞流式图。
图13是实施例7示出的NK细胞随时间变化的扩增图像。
图14是实施例7示出的不同天数下的细胞流式图。
图15是实施例8示出的NK细胞随时间变化的扩增图像。
图16是实施例8示出的不同天数下的细胞流式图。
图17是实施例9示出的NK细胞随时间变化的扩增图像。
图18是实施例9示出的不同天数下的细胞流式图。
图19是实施例10示出的NK细胞随时间变化的扩增图像。
图20是实施例10示出的不同天数下的细胞流式图。
图21是实施例11示出的NK细胞随时间变化的扩增图像。
图22是实施例11示出的不同天数下的细胞流式图。
图23是根据一示例性实施例示出的效靶比测试的图像。
图24是根据一示例性实施例示出的肿瘤杀伤效果的图像。
图25是根据另一示例性实施例示出的肿瘤杀伤效果的图像。
图26是根据一示例性实施例示出的药效实验的图像。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。
本公开提供了一种用于培养NK细胞的激活剂、激活培养基和NK细胞的制备方法；获得的NK细胞的纯度达到90％以上，扩增倍数在200倍以上，且在效靶比为10:1和孵育时间为1小时的条件下，NK细胞体外杀伤效果达到100％。
在本公开的一些实施例中，本公开所提供的激活剂和激活培养基用于将PBMC细胞在体外扩增培养成PB-NK细胞。
在本公开的一些实施例中，所述NK细胞的制备方法包括：将冻存的PBMC细胞在含10～15％自体血浆的IMDM基础培养基中复苏，并在37℃的细胞培养箱中静置培养培养3～24小时，然后按照1×106～1×107个/mL的细胞密度将细胞接种于含有激活培养基的细胞培养瓶中，培养至第3～4天，补加激活培养基，其中，所述激活培养基的体积为原细胞培养体积的1～2倍，在37℃下继续培养，从第5天开始，补加扩增培养基，其中，所述激活培养基的体积为原细胞培养体积的1～2倍，培养周期大约14～21天。
在本公开的一些实施例中，所述激活剂包括重组人FLT-3配体蛋白，所述重组人FLT-3配体蛋白在所述激活剂中的终浓度选自0.01～0.5μg/mL，具体的，所述重组人FLT-3配体蛋白在所述激活剂中的终浓度为0.25μg/mL。在本公开内容中，重组人FLT-3配体蛋白是调节早期造血细胞增殖的生长因子，并且可以与重组人IL-3蛋白、重组人IL-7蛋白和重组人SCF蛋白协同诱导祖细胞向NK细胞的分化增殖。
在本公开的一些实施例中，所述激活剂包括重组人SCF蛋白，所述SCF蛋白在所述激活剂中的终浓度选自0.01～0.5μg/mL，具体的，所述SCF蛋白在所述激活剂中的终浓度为0.05μg/mL。在本公开内容中，重组人SCF蛋白是一种造血生长因子，通过c-Kit受体信号传递发挥其活性；重组人SCF蛋白和c-Kit对支持黑素细胞和生殖细胞系的造血细胞的生存、增殖和分化至关重要；其可以和重组人FLT-3配体蛋白、重组人IL-3蛋白、重组人IL-7蛋白共同诱导CD34+造血干细胞向NK细胞分化。
在本公开的一些实施例中，所述激活剂包括重组人IL-3蛋白，所述重组人IL-3蛋白在所述激活剂中的终浓度选自0.01～0.5μg/mL，具体的，所述重组人IL-3蛋白在所述激活剂中的终浓度为0.25μg/mL。
在本公开的一些实施例中，所述激活剂包括重组人IL-7蛋白，所述重组人IL-7蛋白在所述激活剂中的终浓度选自0.01～0.5μg/mL，具体的，所述重组人IL-7蛋白在所述激活剂中的终浓度为0.25μg/mL。
在本公开的一些实施例中，所述激活剂包括重组人IL-15蛋白，所述重组人IL-15蛋白在所述激活剂中的终浓度选自0.01～1μg/mL，具体的，所述重组人IL-15蛋白在所述激活剂中的终浓度为0.25μg/mL。在本公开内容中，重组人IL-15蛋白蛋白用于促进NK细胞成熟和存活。
在本公开的一些实施例中，所述激活剂包括注射用重组人IL-2蛋白，所述注射用重组人IL-2蛋白在所述激活剂中的终浓度选自0～5000IU/mL，具体的，所述注射用重组人IL-2蛋白在所述激活剂中的终浓度为1000IU/mL。在本公开内容中，注射用重组人IL-2蛋白用于结合增强细胞溶解活化的NK细胞的活性和IFN-γ的产生，但抑制成熟状态的NK细胞扩增。
在本公开的一些实施例中，所述激活剂包括OK-432，OK-432在所述激活剂中的终浓度选自0.1～20μg/mL，具体的，OK-432在所述激活剂中的终浓度为5μg/mL。在本公开内容中，OK-432用于刺激淋巴细胞后，增强NK细胞的活化，并且可以诱导杀伤IFN-γ或者TNF-α处理的癌细胞。
在本公开的一些实施例中，所述激活剂包括抗人CD52单克隆抗体，所述抗人CD52单克隆抗体在所述激活剂中的终浓度选自0.01～1μg/mL，具体的，所述抗人CD52单克隆抗体在所述激活剂中的终浓度为0.1μg/mL。
在本公开的一些实施例中，所述激活剂包括抗人CD137单克隆抗体，所述抗人CD137单克隆抗体在所述激活剂中的终浓度选自0.01～1μg/mL，具体的，所述抗人CD137单克隆抗体在所述激活剂中的终浓度为0.1μg/mL。
在本公开的一些实施例中，所述激活剂包括重组人IL-1α蛋白，所述重组人IL-1α蛋白在所述激活剂中的终浓度选自0.005～0.1μg/mL，具体的，所述重组人IL-1α蛋白在所述激活剂中的终浓度为0.01μg/mL。
在本公开的一些实施例中，所述激活剂包括重组人IL-1β蛋白，所述重组人IL-1β蛋白在所述激活剂中的终浓度选自0.005～0.1μg/mL，具体的，所述重组人IL-1β蛋白在所述激活剂中的终浓度为0.05μg/mL。
在本公开的一些实施例中，所述激活剂包括重组人IL-12蛋白，所述重组人IL-12蛋白在所述激活剂中的终浓度选自0.05～0.5μg/mL，具体的，所述重组人IL-12蛋白在所述激活剂中的终浓度为0.05μg/mL。
在本公开的一些实施例中，所述激活剂包括重组人IL-18蛋白，所述重组人IL-18蛋白在所述激活剂中的终浓度选自0.05～0.5μg/mL，具体的，所述重组人IL-12蛋白在所述激活剂中的终浓度为0.25μg/mL。
在本公开的一些实施例中，所述激活剂包括重组人IL-21蛋白，所述重组人IL-21蛋白在所述激活剂中的终浓度选自0.05～0.6μg/mL，具体的，所述重组人IL-21蛋白在所述激活剂中的终浓度为0.25μg/mL。
在本公开的一些实施例中，所述激活剂包括重组人4-1BB蛋白，所述重组人4-1BB蛋白在所述激活剂中的终浓度选自0～1μg/mL，具体的，所述重组人4-1BB蛋白在所述激活剂中的终浓度为0.25μg/mL。在本公开内容中，重组人4-1BB蛋白广泛表达于激活后的T细胞、NK细胞等人体免疫细胞的表面；其可以通过在免疫细胞间传递活化、增殖或者凋亡信号来调节免疫细胞介导的免疫反应，刺激NK细胞增殖并产生抗肿瘤活性，并产生持久的记忆应答。
在本公开的一些实施例中，所述激活剂包括重组人OX-40配体蛋白，所述重组人OX-40配体蛋白在所述激活剂中的终浓度选自0.01～5μg/mL，具体的，所述重组人OX-40配体蛋白在所述激活剂中的终浓度为0.05μg/mL。
在本公开的一些实施例中，所述激活培养基，包括前述激活剂、第一基础培养基和1％～15％的自体灭活血浆。
在本公开的一些实施例中，所述第一基础培养基可以选自免疫细胞的培养基，例如：IMDM培养基、X-VIVO免疫细胞无血清培养基、NK扩增培养基，但不限于此。具体的，所述第一基础培养基可以为IMDM培养基；IMDM培养基是一种名为Iscove's Modified DμLbecco's Medium的细胞培养基，其包含多种氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、胰岛素和谷胱甘肽等，是一种低钠(约为DMEM的一半)和低胎牛血清(FBS)浓度的培养基。
在本公开的一些实施例中，本公开还使用抗人CD16单克隆抗体，所述抗人CD16单克隆抗体的终浓度选自0.1～20μg/mL，具体的，所述抗人CD16单克隆抗体的终浓度为3.2μg/mL。在本公开内容中，抗人CD16单克隆抗体属Ig超家族成员，其用于诱导NK细胞活化。
在本公开的一些实施例中，本公开还使用重组人anti-HER-2蛋白，所述重组人anti-HER-2蛋白的终浓度选自0.01～0.5μg/mL，具体的，所述重组人anti-HER-2蛋白的终浓度为0.125μg/mL。在本公开内容中，重组人anti-HER-2蛋白是人类表皮生长因子受体家族的成员之一，具有重要的信号转导作用。
在本公开的一些实施例中，本公开还使用RetroNectin，RetroNectin的终浓度选自1～50μg/mL，具体的，RetroNectin的终浓度为12.5μg/mL。在本公开内容中，RetroNectin即重组人纤维连接蛋白片段CH296(FN-CH296)，其最初用于驱动T细胞增殖，后来适应NK细胞扩增；其可以增强细胞和细胞因子单位面积的浓度，增强细胞因子活化细胞的效果。
在本公开的一些实施例中，所述扩增剂包括重组人IL-2蛋白，所述重组人IL-2蛋白在所述激活剂中的终浓度选自100～5000IU/mL，具体的，所述重组人IL-2蛋白在所述激活剂中的终浓度为1000IU/mL。
在本公开的一些实施例中，所述扩增剂包括重组人IL-15蛋白，所述重组人IL-15蛋白在所述激活剂中的终浓度选自0.01～0.5μg/mL，具体的，所述重组人IL-15蛋白在所述激活剂中的终浓度为0.25μg/mL。
在本公开的一些实施例中，所述扩增培养基，包括前述扩增剂、第二基础培养基和0.5％～5％的自体灭活血浆。
在本公开的一些实施例中，所述第二基础培养基可以选自免疫细胞的培养基，例如：IMDM培养基、X-VIVO免疫细胞无血清培养基、NK扩增培养基，但不限于此。具体的，所述第二基础培养基可以为IMDM培养基。
在本公开的一些实施例中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)培养板包被：使用抗人CD16单克隆抗体、重组人anti-HER-2蛋白、RetroNectin、OK-432、抗人CD52单克隆抗体和抗人CD137单克隆抗体中的至少一者包被培养板；所述抗人CD16单克隆抗体、重组人anti-HER-2蛋白、RetroNectin、OK-432、抗人CD52单克隆抗体和抗人CD137单克隆抗体的终浓度依次选自0.1～20μg/mL、0.01～0.5μg/mL、1～50μg/mL、0.1～20μg/mL、0.01～1μg/mL和0.01～1μg/mL。
(2)复苏单个核细胞；
(3)单个核细胞静置培养：向包含密度为2×106～2×107个/mL的单个核细胞的培养基加入1％～15％的自体灭活血浆，在37℃的细胞培养箱中静置3～24小时；
(4)接种单个核细胞：向包含密度为1×106～1×107个/mL的单个核细胞的培养基加入前述激活剂和1％～15％的自体灭活血浆，进行接种培养；
(5)加入激活培养基：第3～4天向接种培养的单个核细胞补加前述激活培养基和1％～15％的自体灭活血浆；
(6)加入扩增培养基：第5～21天内，每隔1～2天，加入扩增培养基；所述扩增培养基包括扩增剂、第二基础培养基和0.5％～5％的自体灭活血浆；
(7)收获细胞。
在本公开的一些实施例中，在复苏单个核细胞之前，还包括培养板包被的过程，其具体包括以下步骤：
使用OK-432、抗人CD52单克隆抗体、抗人CD137单克隆抗体、抗人CD16单克隆抗体、重组人anti-HER-2蛋白和RetroNectin包被培养板；其中，所述抗人CD16单克隆抗体、重组人anti-HER-2蛋白、RetroNectin、OK-432、抗人CD52单克隆抗体和抗人CD137单克隆抗体的终浓度依次选自0.1～20μg/mL、0.01～0.5μg/mL、1～50μg/mL、0.1～20μg/mL、0.01～1μg/mL和0.01～1μg/mL；使用PBS与以上三者混合，吹打混匀10次，加入到24孔板或6孔板中，4℃孵育过夜备用。
在本公开的一些实施例中，复苏单个核细胞具体包括以下步骤：
取出冻存的PBMC细胞，放置在37℃的水浴锅中溶解，溶解2～3分钟，不需要等到其完全融化，含少量处于结冰状态的细胞时即取出，用1mL移液器在冻存管中各吹打1次细胞悬液，将得到的1mL细胞悬液转移至50mL离心管中，缓慢加入9mL IMDM基础培养基中，取1mL细胞悬液加入冻存管，吹打1次用于清洗冻存管剩余细胞，转移至50mL离心管中，用10mL移液器吹打两次，混匀，此时PBMC细胞单个存在，无絮状细胞团，然后在500g下离心5分钟，弃置上清液。
在本公开的一些实施例中，接种单个核细胞具体包括以下步骤：
从37℃的培养箱中取出静置3～24小时的PBMC细胞，加入前述激活剂，吹打3次，混匀重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；将PBMC细胞接种在前述包被的细胞培养板中，然后在37℃的培养箱中静置培养3～4天。
在本公开的一些实施例中，加入激活培养基的过程具体包括以下步骤：
按照原细胞培养体积的1～5倍的比例补加激活培养基，然后在37℃的细胞培养箱中培养。
在本公开的一些实施例中，加入激活培养基的过程具体包括以下步骤：
按照原细胞培养体积的1:1的比例补加激活培养基，然后在37℃下培养。
在本公开的一些实施例中，加入扩增培养基的过程具体包括以下步骤：
第5～21天，每隔1～2天，加入扩增培养基，并且根据细胞培养基体积的增多进行细胞转瓶。每天观察培养基颜色、细胞集落大小及细胞密度，及时补液；每次补液前，轻轻拍打培养瓶侧侧壁，使贴壁的集落悬浮，吹打细胞2-3次，取适量细胞进行细胞计数。
在本公开的一些实施例中，在加入扩增培养基的过程中，所述扩增培养基的体积为原细胞培养体积的1～5倍，补液后的细胞密度为5×105～2×106个/mL。
下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，但这些具体实施例并不能被理解为是对本发明保护范围的限制。本领域技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可对这些具体实施例作出多种变更或修改，所述变更和修改后的实施方案仍落入本发明的保护范围。
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。
在实施例中，为了评估PB-NK细胞体外培养过程中NK细胞表面激活性受体、抑制性受体和活化标志分子的变化，利用各种荧光标记抗体对培养过程中的PB-NK细胞进行染色。通过流式细胞术分析细胞表面分子的表达情况。
本公开的实施例中所使用的试剂和细胞因子产品皆来自于同立海源。
实施例1：
实施例1包括以下步骤：
1、第-1天，细胞培养板包被激活剂。
激活剂A包括如下抗体：抗人CD16单克隆抗体的终浓度为3.2μg/mL，重组人anti-HER-2蛋白的终浓度为0.125μg/mL，RetroNectin的终浓度为12.5μg/mL，OK-432的终浓度为1μg/mL，抗人CD52单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，抗人CD137单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，用PBS与前述6种激活剂混合，吹打混匀10次，加入到24孔板或者6孔板中，4℃孵育过夜备用。
2、第0天，复苏PBMC细胞。
(1)从液氮罐中取出冻存的样本1的PBMC细胞，放置在37℃水浴锅中迅速溶解，大约用时2分钟，含少量处于结冰状态的细胞时取出(不需要等到完全融化)；用1mL移液器在冻存管中各吹打1次细胞悬液，将1mL细胞悬液转移至50mL离心管中，缓慢加入9mL IMDM基础培养基中，取1mL悬液加入冻存管，吹打1次(清洗冻存管剩余细胞)，转移至50mL离心管中，用10mL移液器吹打两次，混匀。此时PBMC细胞单个存在，无絮状细胞团。500g离心5分钟，弃上清。
(2)用3mL含10％自体血浆的IMDM培养基重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照6×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞在37℃的培养箱中静置3～24小时。
3、第0天，接种PBMC细胞。
从37℃的培养箱中取出静置3～24小时的PBMC细胞，加入激活剂(激活剂包括5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)，吹打3次，混匀重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照1.5×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞接种在第-1天包被的细胞培养板中。37℃的培养箱中静置培养4天。
4、第4天，按照1:1的比例补加激活培养基(包括IMDM培养基、5％自体血浆和激活剂)(激活剂包括：5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)，37℃培养。
5、第5天至21天，每隔1-2天，按照1:1的比例补加新鲜的扩增培养基，扩增培养基包括IMDM培养基、2.5％自体血浆和扩增剂，扩增剂包括1000IU/mL重组人IL-2蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白；并根据细胞培养基体积的增多进行细胞转瓶。每天观察培养基颜色、细胞集落大小及细胞密度，及时补液。每次补液前，轻轻拍打培养瓶侧侧壁，使贴壁的集落悬浮。
6、在第0天、第7天、第14天和第21天分别对PBMC细胞进行细胞计数和流式细胞术检测NK(CD3-CD56+)比例。
图1展示了实施例1的NK细胞随时间变化的扩增图像，a图展示了实施例1的不同时间点的NK细胞活率的变化，b图展示了实施例1的不同时间点的细胞扩增倍数的变化，c图展示了实施例1的不同时间点的细胞PB-NK比例的变化，可以看到，扩增倍数可以达到200以上，NK细胞存活率也能达到80％。
图2展示了实施例1的不同天数下的细胞流式图，可以看到，第7天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为43.1％，第14天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为74.5％，第18天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为78.9％，第21天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为82.5％。
7、细胞收获。
将细胞吹打两次，转移至50mL离心管中，500g离心5分钟，其上清。用40mL培养基重悬洗涤细胞两次。最后用1％注射用人血白蛋白的生理盐水重悬细胞。使用孔径为70μm的细胞筛过滤细胞，留小样质检。剩余细胞使用CS10冻存液进行细胞冻存，冻存密度为1×107～3×108个/mL。
实施例2：
实施例2包括以下步骤：
1、第-1天，细胞培养板包被激活剂。
激活剂A包括如下抗体：抗人CD16单克隆抗体的终浓度为3.2μg/mL，重组人anti-HER-2蛋白的终浓度为0.125μg/mL，RetroNectin的终浓度为12.5μg/mL，OK-432的终浓度为1μg/mL，抗人CD52单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，抗人CD137单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，用PBS与前述6种激活剂混合，吹打混匀10次，加入到24孔板或者6孔板中，4℃孵育过夜备用。
2、第0天，复苏PBMC细胞。
(1)从液氮罐中取出冻存的样本1的PBMC细胞，放置在37℃水浴锅中迅速溶解，大约用时2分钟，含少量处于结冰状态的细胞时取出(不需要等到完全融化)；用1mL移液器在冻存管中各吹打1次细胞悬液，将1mL细胞悬液转移至50mL离心管中，缓慢加入9mL IMDM基础培养基中，取1mL悬液加入冻存管，吹打1次(清洗冻存管剩余细胞)，转移至50mL离心管中，用10mL移液器吹打两次，混匀。此时PBMC细胞单个存在，无絮状细胞团。500g离心5分钟，弃上清。
(2)用3mL含10％自体血浆的IMDM培养基重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照6×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞在37℃的培养箱中静置3～24小时。
3、第0天，接种PBMC细胞。
从37℃的培养箱中取出静置3～24小时的PBMC细胞，加入激活剂(激活剂包括5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)，吹打3次，混匀重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照1.5×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞接种在第-1天包被的细胞培养板中。37℃的培养箱中静置培养4天。
4、第4天，按照1:1的比例补加激活培养基(包括IMDM培养基、5％自体血浆和激活剂)(激活剂包括：5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)，37℃培养。
5、第5天至21天，每隔1-2天，按照1:1的比例补加新鲜的扩增培养基，扩增培养基包括IMDM培养基、2.5％自体血浆和扩增剂，扩增剂包括1000IU/mL重组人IL-2蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白；并根据细胞培养基体积的增多进行细胞转瓶。每天观察培养基颜色、细胞集落大小及细胞密度，及时补液。每次补液前，轻轻拍打培养瓶侧侧壁，使贴壁的集落悬浮。
6、在第0天、第3天、第7天、第10天、第14天和第17天，检测PB-NK细胞扩增培养过程中NK细胞(CD3、CD56和CD16等)上激活性受体(NKp30、NKp46、CD226和NKG2D等)、抑制性受体(KIR2DL1、KIR3DL1和NKG2A等)及免疫细胞激活表面标志分子(CD25和CD69等)的变化，正常健康状态下的NK细胞上的激活受体和抑制受体维持动态平衡。
图3和图4展示了实施例2中的NK细胞上激活性受体、抑制性受体及免疫细胞激活表面标志分子的变化，可以看到，细胞表面受体的变化随着细胞因子的激活而变化，在扩培至17天，激活受体NKp30和NKG2D表达升高，抑制性受体NKG2A表达升高，部分抑制性受体表达升高，NK细胞活化受体CD25和CD69表达升高，说明NK细胞被激活，成为成熟的具有杀伤功能的NK细胞。NK细胞表面的CD16分子由低表达变为高表达，ADCC作用增强。
7、细胞收获。
将细胞吹打两次，转移至50mL离心管中，500g离心5分钟，其上清。用40mL培养基重悬洗涤细胞两次。最后用1％注射用人血白蛋白的生理盐水重悬细胞。使用孔径为70μm的细胞筛过滤细胞，留小样质检。剩余细胞转移至输液袋中，留存备用。
实施例3：
实施例3包括以下步骤：
1、第-1天，细胞培养板包被激活剂。
激活剂A包括如下抗体：抗人CD16单克隆抗体的终浓度为3.2μg/mL，重组人anti-HER-2蛋白的终浓度为0.125μg/mL，RetroNectin的终浓度为12.5μg/mL，OK-432的终浓度为1μg/mL，抗人CD52单克隆抗体的终浓度为0.1
μg/mL，抗人CD137单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，用PBS与前述6种激活剂混合，吹打混匀10次，加入到24孔板或者6孔板中，4℃孵育过夜备用。
2、第0天，复苏PBMC细胞。
(1)从液氮罐中取出冻存的样本2的PBMC细胞，放置在37℃水浴锅中迅速溶解，大约用时2分钟，含少量处于结冰状态的细胞时取出(不需要等到完全融化)；用1mL移液器在冻存管中各吹打1次细胞悬液，将1mL细胞悬液转移至50mL离心管中，缓慢加入9mL IMDM基础培养基中，取1mL悬液加入冻存管，吹打1次(清洗冻存管剩余细胞)，转移至50mL离心管中，用10mL移液器吹打两次，混匀。此时PBMC细胞单个存在，无絮状细胞团。500g离心5分钟，弃上清。
(2)用3mL含10％自体血浆的IMDM培养基重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照6×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞在37℃的培养箱中静置3～24小时。
3、第0天，接种PBMC细胞。
从37℃的培养箱中取出静置3～24小时的PBMC细胞，加入激活剂(激活剂包括5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)，吹打3次，混匀重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照1.5×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞接种在第-1天包被的细胞培养板中。37℃的培养箱中静置培养4天。
4、第4天，按照1:1的比例补加激活培养基(包括IMDM培养基、5％自体血浆和激活剂)(激活剂包括：5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)，37℃培养。
5、第5天至21天，每隔1-2天，按照1:1的比例补加新鲜的扩增培养基，扩增培养基包括IMDM培养基、2.5％自体血浆和扩增剂，扩增剂包括1000IU/mL重组人IL-2蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白；并根据细胞培养基体积的增多进行细胞转瓶。每天观察培养基颜色、细胞集落大小及细胞密度，及时补液。每次补液前，轻轻拍打培养瓶侧侧壁，使贴壁的集落悬浮。
6、第7天、第14天和第21天分别对PBMC细胞进行细胞计数和流式细胞术检测NK(CD3-CD56+)比例。
图5展示了实施例3的NK细胞随时间变化的扩增图像，a图展示了实施例3的不同时间点的NK细胞活率的变化，b图展示了实施例3的不同时间点的细胞扩增倍数的变化，c图展示了实施例3的不同时间点的细胞PB-NK比例的变化，可以看到，扩增倍数可以达到350倍以上，NK细胞存活率能达到85％，NK细胞的比例能达到95％。
图6展示了实施例3的不同天数下的细胞流式图，可以看到，第7天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为23.8％，第14天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为95.4％，第18天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为98％。
7、细胞收获。
将细胞吹打两次，转移至50mL离心管中，500g离心5分钟，其上清。用40mL培养基重悬洗涤细胞两次。最后用1％注射用人血白蛋白的生理盐水重悬细胞。使用孔径为70μm的细胞筛过滤细胞，留小样质检。剩余细胞转移至输液袋中，留存备用。
实施例4：
实施例4包括以下步骤：
1、第-1天，细胞培养板包被激活剂。
激活剂A包括如下抗体：抗人CD16单克隆抗体的终浓度为3.2μg/mL，重组人anti-HER-2蛋白的终浓度为0.125μg/mL，RetroNectin的终浓度为12.5μg/mL，OK-432的终浓度为1μg/mL，抗人CD52单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，抗人CD137单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，用PBS与前述6种激活剂混合，吹打混匀10次，加入到24孔板或者6孔板中，4℃孵育过夜备用。
2、第0天，复苏PBMC细胞。
(1)从液氮罐中取出冻存的样本2的PBMC细胞，放置在37℃水浴锅中迅速溶解，大约用时2分钟，含少量处于结冰状态的细胞时取出(不需要等到完全融化)；用1mL移液器在冻存管中各吹打1次细胞悬液，将1mL细胞悬液转移至50mL离心管中，缓慢加入9mL IMDM基础培养基中，取1mL悬液加入冻存管，吹打1次(清洗冻存管剩余细胞)，转移至50mL离心管中，用10mL移液器吹打两次，混匀。此时PBMC细胞单个存在，无絮状细胞团。500g离心5分钟，弃上清。
(2)用3mL含10％自体血浆的IMDM培养基重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照6×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞在37℃的培养箱中静置3～24小时。
3、第0天，接种PBMC细胞。
从37℃的培养箱中取出静置3～24小时的PBMC细胞，加入激活剂(激活剂包括5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)，吹打3次，混匀重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照1.5×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞接种在第-1天包被的细胞培养板中。37℃的培养箱中静置培养4天。
4、第4天，按照1:1的比例补加激活培养基(包括IMDM培养基、5％自体血浆和激活剂)(激活剂包括：5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)，37℃培养。
5、第5天至21天，每隔1-2天，按照1:1的比例补加新鲜的扩增培养基，扩增培养基包括IMDM培养基、2.5％自体血浆和扩增剂，扩增剂包括1000IU/mL重组人IL-2蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白；并根据细胞培养基体积的增多进行细胞转瓶。每天观察培养基颜色、细胞集落大小及细胞密度，及时补液。每次补液前，轻轻拍打培养瓶侧侧壁，使贴壁的集落悬浮。
6、在第0天、第3天、第7天、第10天、第14天和第17天，检测PB-NK细胞扩增培养过程中NK细胞(CD3、CD56和CD16等)上激活性受体(NKp30、NKp46、CD226和NKG2D等)、抑制性受体(KIR2DL1、KIR3DL1和NKG2A等)及免疫细胞激活表面标志分子(CD25和CD69等)的变化。
图7和图8展示了实施例4中的NK细胞上激活性受体、抑制性受体及免疫细胞激活表面标志分子的变化，可以看到，细胞表面受体的变化随着细胞因子的激活而变化，在扩培至17天，激活受体NKp30和NKG2D表达升高，抑制性受体NKG2A表达升高，部分抑制性受体表达升高，NK细胞活化受体CD25和CD69表达升高，说明NK细胞被激活，成为成熟的具有杀伤功能的NK细胞，NK细胞表面的CD16分子由低表达变为高表达，ADCC作用增强。
7、细胞收获。
将细胞吹打两次，转移至50mL离心管中，500g离心5分钟，其上清。用40mL培养基重悬洗涤细胞两次。最后用1％注射用人血白蛋白的生理盐水重悬细胞。使用孔径为70μm的细胞筛过滤细胞，留小样质检。剩余细胞转移至输液袋中，留存备用。
实施例5：
实施例5包括以下步骤：
1、第-1天，细胞培养板包被激活剂。
激活剂A包括如下抗体：抗人CD16单克隆抗体的终浓度为3.2μg/mL，重组人anti-HER-2蛋白的终浓度为0.125μg/mL，RetroNectin的终浓度为12.5μg/mL，OK-432的终浓度为1μg/mL，抗人CD52单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，抗人CD137单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，用PBS与前述6种激活剂混合，吹打混匀10次，加入到24孔板或者6孔板中，4℃孵育过夜备用。
2、第0天，复苏PBMC细胞。
(1)从液氮罐中取出冻存的样本3的PBMC细胞，放置在37℃水浴锅中迅速溶解，大约用时2分钟，含少量处于结冰状态的细胞时取出(不需要等到完全融化)；用1mL移液器在冻存管中各吹打1次细胞悬液，将1mL细胞悬液转移至50mL离心管中，缓慢加入9mL IMDM基础培养基中，取1mL悬液加入冻存管，吹打1次(清洗冻存管剩余细胞)，转移至50mL离心管中，用10mL移液器吹打两次，混匀。此时PBMC细胞单个存在，无絮状细胞团。500g离心5分钟，弃上清。
(2)用3mL含10％自体血浆的IMDM培养基重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照6×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞在37℃的培养箱中静置3～24小时。
3、第0天，接种PBMC细胞。
从37℃的培养箱中取出静置3～24小时的PBMC细胞，加入激活剂(激活剂包括5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)，吹打3次，混匀重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照1.5×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞接种在第-1天包被的细胞培养板中。37℃的培养箱中静置培养4天。
4、第4天，按照1:1的比例补加激活培养基(包括IMDM培养基、5％自体血浆和激活剂)(激活剂包括：5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)，37℃培养。
5、第5天至21天，每隔1-2天，按照1:1的比例补加新鲜的扩增培养基，扩增培养基包括IMDM培养基、2.5％自体血浆和扩增剂，扩增剂包括1000IU/mL重组人IL-2蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白；并根据细胞培养基体积的增多进行细胞转瓶。每天观察培养基颜色、细胞集落大小及细胞密度，及时补液。每次补液前，轻轻拍打培养瓶侧侧壁，使贴壁的集落悬浮。
6、第7天、第14天和第21天分别对PBMC细胞进行细胞计数和流式细胞术检测NK(CD3-CD56+)比例。
图9展示了实施例5的NK细胞随时间变化的扩增图像，a图展示了实施例5的不同时间点的NK细胞活率的变化，b图展示了实施例5的不同时间点的细胞扩增倍数的变化，c图展示了实施例5的不同时间点的细胞PB-NK比例的变化。
图10展示了实施例5的不同天数下的细胞流式图，可以看到，第7天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为40.3％，第14天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为91.3％，第18天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为95.8％。
7、细胞收获。
将细胞吹打两次，转移至50mL离心管中，500g离心5分钟，其上清。用40mL培养基重悬洗涤细胞两次。最后用1％注射用人血白蛋白的生理盐水重悬细胞。使用孔径为70μm的细胞筛过滤细胞，留小样质检。剩余细胞转移至输液袋中，留存备用。
实施例6：
实施例6包括以下步骤：
1、第-1天，细胞培养板包被激活剂。
激活剂A包括如下抗体：抗人CD16单克隆抗体的终浓度为3.2μg/mL，重组人anti-HER-2蛋白的终浓度为0.125μg/mL，RetroNectin的终浓度为12.5μg/mL，OK-432的终浓度为1μg/mL，抗人CD52单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，抗人CD137单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，用PBS与前述6种激活剂混合，吹打混匀10次，加入到24孔板或者6孔板中，4℃孵育过夜备用。
2、第0天，接种PBMC细胞。
将激活剂(激活剂包括5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)添加到新鲜的样本4的PBMC细胞中，吹打3次，混匀重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照1.5×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞接种在第-1天包被的细胞培养板中。37℃的培养箱中静置培养4天。
3、第4天，按照1:1的比例补加激活培养基(包括IMDM培养基、5％自体血浆和激活剂)(激活剂包括：5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)，37℃培养。
4、第5天至21天，每隔1-2天，按照1:1的比例补加新鲜的扩增培养基，扩增培养基包括IMDM培养基、2.5％自体血浆和扩增剂，扩增剂包括1000IU/mL重组人IL-2蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白；并根据细胞培养基体积的增多进行细胞转瓶。每天观察培养基颜色、细胞集落大小及细胞密度，及时补液。每次补液前，轻轻拍打培养瓶侧侧壁，使贴壁的集落悬浮。6、第7天、第14天和第21天分别对PBMC细胞进行细胞计数和流式细胞术检测NK(CD3-CD56+)比例。
图11展示了实施例6的NK细胞随时间变化的扩增图像，a图展示了实施例6的不同时间点的NK细胞活率的变化，b图展示了实施例6的不同时间点的细胞扩增倍数的变化，c图展示了实施例6的不同时间点的细胞PB-NK比例的变化。
图12展示了实施例6的不同天数下的细胞流式图，可以看到，第5天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为29.8％，第7天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为39.0％，第12天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为89.3％，第14天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为95.8％。
5、细胞收获。
将细胞吹打两次，转移至50mL离心管中，500g离心5分钟，其上清。用40mL培养基重悬洗涤细胞两次。最后用1％注射用人血白蛋白的生理盐水重悬细胞。使用孔径为70μm的细胞筛过滤细胞，留小样质检。剩余细胞转移至输液袋中，留存备用。
实施例7：
实施例7包括以下步骤：
1、第-1天，细胞培养板包被激活剂。
激活剂A包括如下抗体：抗人CD16单克隆抗体的终浓度为3.2μg/mL，重组人anti-HER-2蛋白的终浓度为0.125μg/mL，RetroNectin的终浓度为12.5μg/mL，OK-432的终浓度为1μg/mL，抗人CD52单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，抗人CD137单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，用PBS与前述6种激活剂混合，吹打混匀10次，加入到24孔板或者6孔板中，4℃孵育过夜备用。
2、第0天，接种PBMC细胞。
将激活剂(激活剂包括5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)添加到新鲜的样本4的PBMC细胞中，吹打3次，混匀重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照1.5×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞接种在第-1天包被的细胞培养板中。37℃的培养箱中静置培养4天。
3、第4天，按照1:1的比例补加激活培养基(包括IMDM培养基、5％自体血浆和激活剂)(激活剂包括：5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)，37℃培养。
4、第5天至21天，每隔1-2天，按照1:1的比例补加新鲜的扩增培养基，扩增培养基包括IMDM培养基、2.5％自体血浆和扩增剂，扩增剂包括1000IU/mL重组人IL-2蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白；并根据细胞培养基体积的增多进行细胞转瓶。每天观察培养基颜色、细胞集落大小及细胞密度，及时补液。每次补液前，轻轻拍打培养瓶侧侧壁，使贴壁的集落悬浮。6、第7天、第14天和第21天分别对PBMC细胞进行细胞计数和流式细胞术检测NK(CD3-CD56+)比例。
图13展示了实施例7的NK细胞随时间变化的扩增图像，a图展示了实施例7的不同时间点的NK细胞活率的变化，b图展示了实施例7的不同时间点的细胞扩增倍数的变化，c图展示了实施例7的不同时间点的细胞PB-NK比例的变化。
图14展示了实施例7的不同天数下的细胞流式图，可以看到，第7天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为80.4％，第14天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为99.3％。
5、细胞收获。
将细胞吹打两次，转移至50mL离心管中，500g离心5分钟，其上清。用40mL培养基重悬洗涤细胞两次。最后用1％注射用人血白蛋白的生理盐水重悬细胞。使用孔径为70μm的细胞筛过滤细胞，留小样质检。剩余细胞转移至输液袋中，留存备用。
实施例8：
实施例8包括以下步骤：
1、第-1天，细胞培养板包被激活剂。
激活剂A包括如下抗体：抗人CD16单克隆抗体的终浓度为3.2μg/mL，重组人anti-HER-2蛋白的终浓度为0.125μg/mL，RetroNectin的终浓度为12.5μg/mL，OK-432的终浓度为1μg/mL，抗人CD52单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，抗人CD137单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，用PBS与前述6种激活剂混合，吹打混匀10次，加入到24孔板或者6孔板中，4℃孵育过夜备用。
2、第0天，接种PBMC细胞。
将激活剂(激活剂包括5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)添加到新鲜的样本4的PBMC细胞中，吹打3次，混匀重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照1.5×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞接种在第-1天包被的细胞培养板中。37℃的培养箱中静置培养4天。
3、第4天，按照1:1的比例补加激活培养基(包括IMDM培养基、5％自体血浆和激活剂)(激活剂包括：5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)，37℃培养。
4、第5天至21天，每隔1-2天，按照1:1的比例补加新鲜的扩增培养基，扩增培养基包括IMDM培养基、2.5％自体血浆和扩增剂，扩增剂包括1000IU/mL重组人IL-2蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白；并根据细胞培养基体积的增多进行细胞转瓶。每天观察培养基颜色、细胞集落大小及细胞密度，及时补液。每次补液前，轻轻拍打培养瓶侧侧壁，使贴壁的集落悬浮。6、第7天、第14天和第21天分别对PBMC细胞进行细胞计数和流式细胞术检测NK(CD3-CD56+)比例。
图15展示了实施例8的NK细胞随时间变化的扩增图像，a图展示了实施例8的不同时间点的NK细胞活率的变化，b图展示了实施例8的不同时间点的细胞扩增倍数的变化，c图展示了实施例8的不同时间点的细胞PB-NK比例的变化。
图16展示了实施例8的不同天数下的细胞流式图，可以看到，第7天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为61.0％，第14天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为97.3％。
5、细胞收获。
将细胞吹打两次，转移至50mL离心管中，500g离心5分钟，其上清。用40mL培养基重悬洗涤细胞两次。最后用1％注射用人血白蛋白的生理盐水重悬细胞。使用孔径为70μm的细胞筛过滤细胞，留小样质检。剩余细胞转移至输液袋中，留存备用。
实施例9：
实施例9包括以下步骤：
1、第-1天，细胞培养板包被激活剂。
激活剂A包括如下抗体：抗人CD16单克隆抗体的终浓度为3.2μg/mL，重组人anti-HER-2蛋白的终浓度为0.125μg/mL，RetroNectin的终浓度为12.5μg/mL，OK-432的终浓度为1μg/mL，抗人CD52单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，抗人CD137单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，用PBS与前述6种激活剂混合，吹打混匀10次，加入到24孔板或者6孔板中，4℃孵育过夜备用。
2、第0天，接种PBMC细胞。
将激活剂(激活剂包括5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)添加到新鲜的样本4的PBMC细胞中，吹打3次，混匀重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照1.5×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞接种在第-1天包被的细胞培养板中。37℃的培养箱中静置培养4天。
3、第4天，按照1:1的比例补加激活培养基(包括IMDM培养基、5％自体血浆和激活剂)(激活剂包括：5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)，37℃培养。
4、第5天至21天，每隔1-2天，按照1:1的比例补加新鲜的扩增培养基，扩增培养基包括IMDM培养基、2.5％自体血浆和扩增剂，扩增剂包括1000IU/mL重组人IL-2蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白；并根据细胞培养基体积的增多进行细胞转瓶。每天观察培养基颜色、细胞集落大小及细胞密度，及时补液。每次补液前，轻轻拍打培养瓶侧侧壁，使贴壁的集落悬浮。6、第7天、第14天和第21天分别对PBMC细胞进行细胞计数和流式细胞术检测NK(CD3-CD56+)比例。
图17展示了实施例9的NK细胞随时间变化的扩增图像，a图展示了实施例9的不同时间点的NK细胞活率的变化，b图展示了实施例9的不同时间点的细胞扩增倍数的变化，c图展示了实施例9的不同时间点的细胞PB-NK比例的变化。
图18展示了实施例9的不同天数下的细胞流式图，可以看到，第7天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为44.0％，第14天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为96.1％。
5、细胞收获。
将细胞吹打两次，转移至50mL离心管中，500g离心5分钟，其上清。用40mL培养基重悬洗涤细胞两次。最后用1％注射用人血白蛋白的生理盐水重悬细胞。使用孔径为70μm的细胞筛过滤细胞，留小样质检。剩余细胞转移至输液袋中，留存备用。
实施例10：
实施例10包括以下步骤：
1、第-1天，细胞培养板包被激活剂。
激活剂A包括如下抗体：抗人CD16单克隆抗体的终浓度为3.2μg/mL，重组人anti-HER-2蛋白的终浓度为0.125μg/mL，RetroNectin的终浓度为12.5μg/mL，OK-432的终浓度为1μg/mL，抗人CD52单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，抗人CD137单克隆抗体的终浓度为0.1μg/mL，用PBS与前述6种激活剂混合，吹打混匀10次，加入到24孔板或者6孔板中，4℃孵育过夜备用。
2、第0天，复苏PBMC细胞。
(1)从液氮罐中取出冻存的样本1的PBMC细胞，放置在37℃水浴锅中迅速溶解，大约用时2分钟，含少量处于结冰状态的细胞时取出(不需要等到完全融化)；用1mL移液器在冻存管中各吹打1次细胞悬液，将1mL细胞悬液转移至50mL离心管中，缓慢加入9mL市售基础培养基K中，取1mL悬液加入冻存管，吹打1次(清洗冻存管剩余细胞)，转移至50mL离心管中，用10mL移液器吹打两次，混匀。此时PBMC细胞单个存在，无絮状细胞团。500g离心5分钟，弃上清。
(2)用3mL含10％自体血浆的竞品K培养基重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照6×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞在37℃的培养箱中静置3～24小时。
3、第0天，接种PBMC细胞。
从37℃的培养箱中取出静置3～24小时的PBMC细胞，加入激活剂(激活剂包括5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)，吹打3次，混匀重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照1.5×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞接种在第-1天包被的细胞培养板中。37℃的培养箱中静置培养4天。
4、第4天，按照1:1的比例补加激活培养基(包括竞品K培养基、5％自体血浆和激活剂)(激活剂包括：5μg/mL OK-432、0.25μg/mL重组人FLT3配体蛋白、0.25μg/mL重组人IL-3蛋白、0.25μg/mL重组人IL-7蛋白、0.25μg/mL重组人IL-18蛋白、0.25μg/mL重组人IL-21蛋白、0.05μg/mL重组人IL-1β蛋白、0.1μg/mL抗人CD52单克隆抗体、0.1μg/mL抗人CD137单克隆抗体、0.05μg/mL重组人SCF蛋白、0.05μg/mL重组人IL-12蛋白、0.05μg/mL重组人OX-40配体蛋白、0.25μg/mL重组人4-1BB蛋白、0.01μg/mL重组人IL-1α蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白和1000IU/mL注射用重组人IL-2蛋白等抗体或细胞因子)，37℃培养。
5、第5天至21天，每隔1-2天，按照1:1的比例补加新鲜的扩增培养基，扩增培养基包括竞品K培养基、2.5％自体血浆和扩增剂，扩增剂包括1000IU/mL重组人IL-2蛋白、0.25μg/mL重组人IL-15蛋白；并根据细胞培养基体积的增多进行细胞转瓶。每天观察培养基颜色、细胞集落大小及细胞密度，及时补液。每次补液前，轻轻拍打培养瓶侧侧壁，使贴壁的集落悬浮。
6、第7天、第14天和第21天分别对PBMC细胞进行细胞计数和流式细胞术检测NK(CD3-CD56+)比例。
图19展示了实施例10的NK细胞随时间变化的扩增图像，a图展示了实施例10的不同时间点的NK细胞活率的变化，b图展示了实施例10的不同时间点的细胞扩增倍数的变化，c图展示了实施例10的不同时间点的细胞PB-NK比例的变化。
图20展示了实施例10的不同天数下的细胞流式图，可以看到，第7天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为49.8％，第14天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为73.0％，第21天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为84.8％。
7、细胞收获。
将细胞吹打两次，转移至50mL离心管中，500g离心5分钟，其上清。用40mL培养基重悬洗涤细胞两次。最后用1％注射用人血白蛋白的生理盐水重悬细胞。使用孔径为70μm的细胞筛过滤细胞，留小样质检。剩余细胞转移至输液袋中，留存备用。
实施例11：
实施例11包括以下步骤：
1、第-1天，细胞培养板包被激活剂。
将1mL竞品K的激活剂(1mL/T75细胞培养板)和9mL PBS混匀，加入到24孔板或者6孔板中，4℃孵育过夜备用。
2、第0天，复苏PBMC细胞。
(1)从液氮罐中取出冻存的样本1的PBMC细胞，放置在37℃水浴锅中迅速溶解，大约用时2分钟，含少量处于结冰状态的细胞时取出(不需要等到完全融化)；用1mL移液器在冻存管中各吹打1次细胞悬液，将1mL细胞悬液转移至50mL离心管中，缓慢加入9mL市售基础培养基K中，取1mL悬液加入冻存管，吹打1次(清洗冻存管剩余细胞)，转移至50mL离心管中，用10mL移液器吹打两次，混匀。此时PBMC细胞单个存在，无絮状细胞团。500g离心5分钟，弃上清。
(2)用3mL含10％自体血浆的竞品K培养基重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照6×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞在37℃的培养箱中静置3～24小时。
3、第0天，接种PBMC细胞。
从37℃的培养箱中取出静置3～24小时的PBMC细胞，加入1000U/mL IL-2和50ng/mL IL15，吹打3次，混匀重悬PBMC细胞，取20μL进行3次重复细胞计数；按照1.5×106个/mL的细胞数比例，将PBMC细胞接种在第-1天包被的细胞培养板中。37℃的培养箱中静置培养4天。
4、第4天，按照1:1的比例补加新鲜培养基(包括竞品K培养基、5％自体血浆、2000U/mL IL-2和100ng/mL IL15)，37℃培养。
5、第5天至21天，每隔1-2天，按照1:1的比例补加新鲜的扩增培养基，扩增培养基包括竞品K培养基、2.5％自体血浆、1000U/mL重组人IL-2蛋白和50ng/mL重组人IL-5蛋白；自体血浆随着补液逐次减倍，并根据细胞培养基体积的增多进行细胞转瓶。每天观察培养基颜色、细胞集落大小及细胞密度，及时补液。每次补液前，轻轻拍打培养瓶侧侧壁，使贴壁的集落悬浮。
6、第7天、第14天和第21天分别对PBMC细胞进行细胞计数和流式细胞术检测NK(CD3-CD56+)比例。收获NK细胞。
图21展示了实施例11的NK细胞随时间变化的扩增图像，a图展示了实施例11的不同时间点的NK细胞活率的变化，b图展示了实施例11的不同时间点的细胞扩增倍数的变化，c图展示了实施例11的不同时间点的细胞PB-NK比例的变化。
图22展示了实施例11的不同天数下的细胞流式图，可以看到，第7天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为8.77％，第14天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为20.2％，第18天时，CD3-CD56+的NK细胞含量为16.3％。
7、细胞收获。
将细胞吹打两次，转移至50mL离心管中，500g离心5分钟，其上清。用40mL培养基重悬洗涤细胞两次。最后用1％注射用人血白蛋白的生理盐水重悬细胞。使用孔径为70μm的细胞筛过滤细胞，留小样质检。剩余细胞转移至输液袋中，留存备用。
效靶比测试：收集实施例8扩增培养至第14天的PB-NK细胞，按照0:1、1.25:1、2.5:1、5:1、10:1、20:1、40:1、80:1等效靶比，与肿瘤细胞系共孵育1小时，显微镜观察NK细胞的杀伤效果。如图23所示，其在效靶比为5:1时，即可对肿瘤细胞达到100％的杀伤。
肿瘤杀伤效果测试：
(1)收集实施例8扩增培养至第14天的PB-NK细胞，按照5:1的效靶比，与A、B、C和D等4种肿瘤细胞系共孵育1小时(A、B、C和D四种肿瘤细胞为同一前列腺癌肿瘤的不同细胞系，其分别为LNCap细胞系、22RV1细胞系、C4-2细胞系、PC3细胞系)，收集NK细胞，300g离心5分钟，弃上清，用100μLPBS和1μL荧光标记的CD107a抗体重悬NK细胞，4℃孵育30分钟，加入1mL PBS洗掉多余的荧光染料，流式上机检测NK细胞表面的脱颗粒程度(CD107a)，判断NK细胞的杀伤效果。结果如图24所示。PB-NK细胞对不同肿瘤细胞系的杀伤效果有所区别，其对A肿瘤细胞系(LNCap细胞系)的杀伤能力最强。
(2)收集实施例8扩增培养至第14天的PB-NK细胞，按照5:1的效靶比，与A、B、C和D等4种肿瘤细胞系共孵育1小时，收集细胞上清，300g离心5分钟，收集上清液，设置两种梯度(细胞上清原液和稀释20倍)，具体操作参考Human IFN-γ说明书，检测OD值，判断NK细胞的杀伤效果。结果如图25所示。PB-NK细胞对不同肿瘤细胞系的杀伤效果有所区别，其对C肿瘤细胞系(C4-2细胞系)的杀伤能力最强，IFN-γ分泌量更多。
药效实验：收集实施例8扩增培养至第14天的PB-NK细胞，按照效靶比0.25:1、1:1和10:1等3种梯度，与BIU-87膀胱癌肿瘤细胞系(1000万细胞/只)混合，通过皮下注射接种，探究NK细胞对人膀胱癌皮下小鼠模型药效实验。临床观察：每2天1次，游标卡尺测量肿瘤的最大径和最小径，测量小鼠体重，3～4周的生存期观察，记录死亡动物时间。动物实验结果如图26所示，表明NK细胞对人膀胱癌肿瘤细胞的杀伤效果呈梯度依赖性，且均有较好的治疗效果。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的公开后，将容易想到本公开的其它实施方案。本公开旨在涵盖本公开的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本公开的一般性原理并包括本公开未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本公开的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
应当理解的是，本公开并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本公开的范围仅由所附的权利要求来限制。
Claims (16)
1.一种用于培养NK细胞的激活剂，其特征在于，所述激活剂包括：重组人FLT-3配体蛋白、重组人SCF蛋白、重组人IL-3蛋白、重组人IL-7蛋白、重组人IL-15蛋白和注射用重组人IL-2蛋白；
其中，所述重组人FLT-3配体蛋白、重组人SCF蛋白、重组人IL-3蛋白、重组人IL-7蛋白和重组人IL-15蛋白在所述激活剂中的浓度范围依次选自0.01～0.5μg/mL、0.01～0.5μg/mL、0.01～0.5μg/mL、0.01～0.5μg/mL和0.01～1μg/mL。
2.根据权利要求1所述的激活剂，其特征在于，所述激活剂还包括：抗人CD16单克隆抗体、重组人anti-HER-2蛋白、RetroNectin、OK-432、抗人CD52单克隆抗体和抗人CD137单克隆抗体；
其中，所述抗人CD16单克隆抗体、重组人anti-HER-2蛋白、RetroNectin、OK-432、抗人CD52单克隆抗体和抗人CD137单克隆抗体在所述激活剂中的浓度范围依次选自0.1～20μg/mL、0.01～0.5μg/mL、1～50μg/mL、0.1～20μg/mL、0.01～1μg/mL和0.01～1μg/mL。
3.根据权利要求1所述的激活剂，其特征在于，所述激活剂还包括：重组人IL-1α蛋白、重组人IL-1β蛋白、重组人IL-12蛋白、重组人IL-18蛋白、重组人IL-21蛋白、重组人4-1BB蛋白和重组人OX-40配体蛋白。
4.根据权利要求2所述的激活剂，其特征在于，所述重组人IL-1α蛋白、重组人IL-1β蛋白、重组人IL-12蛋白、重组人IL-18蛋白、重组人IL-21蛋白、重组人4-1BB蛋白和重组人OX-40配体蛋白在所述激活剂中的浓度范围依次选自0.005～0.1μg/mL、0.005～0.1μg/mL、0.05～0.5μg/mL、0.05～0.5μg/mL、0.05～0.6μg/mL、0.01～1μg/mL、0.01～5μg/mL。
5.根据权利要求1所述的激活剂，其特征在于，所述注射用重组人IL-2蛋白在所述激活剂中的浓度范围选自1～5000IU/mL。
6.一种激活培养基，其特征在于，所述激活培养基包括：权利要求1～4任一项所述的激活剂、第一基础培养基和1％～15％的自体灭活血浆。
7.一种NK细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1～5任一项所述的激活剂和/或权利要求6所述的激活培养基对NK细胞进行诱导和/或扩增。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)培养板包被：使用OK-432、抗人CD52单克隆抗体、抗人CD137单克隆抗体、抗人CD16单克隆抗体、重组人anti-HER-2蛋白和RetroNectin中的至少一者包被培养板；
(2)复苏单个核细胞；
(3)静置单个核细胞：向包含密度为2×106～2×107个/mL的单个核细胞的培养基加入1％～15％的自体灭活血浆，在37℃的细胞培养箱中静置3～24小时；
(4)接种单个核细胞：向包含密度为1×106～1×107个/mL的单个核细胞的培养基加入权利要求1～4任一项所述的激活剂和1％～15％的自体灭活血浆，进行接种培养；
(5)加入激活培养基：第3～4天向接种培养的单个核细胞补加权利要求5所述的激活培养基和1％～15％的自体灭活血浆；
(6)加入扩增培养基：第5～21天内，每隔1～2天，加入扩增培养基；所述扩增培养基包括扩增剂、第二基础培养基和0.5％～5％的自体灭活血浆；
(7)收获细胞。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述扩增剂包括重组人IL-2蛋白和重组人IL-15蛋白，其中，所述重组人IL-2蛋白和重组人IL-15蛋白在所述扩增剂中的浓度范围依次选自100～5000IU/mL和0.01～0.5μg/mL。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在补加激活培养基的过程中，所述激活培养基的体积为原细胞培养体积的1～5倍。
11.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述单个核细胞为PBMC细胞。
12.一种NK细胞，其特征在于，所述NK细胞通过权利要求7～11任一项所述的制备方法得到。
13.一种用于抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括有效治疗量的权利要求12所述的NK细胞。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述NK细胞与肿瘤细胞的效靶比选自(0.25～10)：1。
15.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述肿瘤为泌尿系肿瘤。
16.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的作用时间选自0.5～4小时。
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| CN202410124868.6A CN117925521A (zh) | 2024-01-29 | 2024-01-29 | 用于培养nk细胞激活剂及其应用 |
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