CN105683361A - 使用小分子从人多能干细胞产生内分泌祖细胞 - Google Patents

使用小分子从人多能干细胞产生内分泌祖细胞 Download PDF

Info

Publication number
CN105683361A
CN105683361A CN201480047988.5A CN201480047988A CN105683361A CN 105683361 A CN105683361 A CN 105683361A CN 201480047988 A CN201480047988 A CN 201480047988A CN 105683361 A CN105683361 A CN 105683361A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
inhibitor
ngn3
double
gefitinib
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201480047988.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105683361B (zh
Inventor
U.多恩
N.S.克里斯托赫森
J.埃克伯格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novo Nordisk AS
Cellectis SA
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Cellectis SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk AS, Cellectis SA filed Critical Novo Nordisk AS
Publication of CN105683361A publication Critical patent/CN105683361A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105683361B publication Critical patent/CN105683361B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0613—Cells from endocrine organs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0678—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/22—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及干细胞向适于进一步分化为胰β细胞的均质内分泌祖细胞群的分化。本发明提供用于通过将前体细胞暴露于TGF-β？I型受体抑制剂、BMP拮抗剂、腺苷酸环化酶激活剂和烟酰胺和/或将前体细胞暴露于选择的小分子获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法。

Description

使用小分子从人多能干细胞产生内分泌祖细胞
技术领域
本发明涉及从人多能干细胞例如人胚胎干细胞和诱导多能干细胞产生内分泌祖细胞的方法。
发明背景
β细胞移植潜在地提供了I型糖尿病的最终治疗。然而，供体β细胞有限的可用性制约了该治疗作为临床治疗的用途。
多能干(PS)细胞可无限增殖和分化为多种细胞类型；因此，PS细胞为有希望的β细胞来源。然而，在PS细胞可用于治疗糖尿病前，其需要有效和可重复地分化为胰β细胞。在脊椎动物胚胎发育期间，多能细胞产生三个胚层：外胚层、中胚层和内胚层。
对于形成内胚层衍生组织例如胰组织，定形内胚层(DE)的诱导是第一步。从DE细胞产生胰内胚层(PE)为产生产胰岛素的β细胞所必需的。具有成为内分泌祖细胞(EP)潜能的PE细胞特征在于两个重要转录因子PDX1和NKX6.1的共表达。
对于从PS细胞产生胰细胞已经建立了分步体外分化方案。
这些方案一般模拟胰发育的主要事件，其包括几个阶段例如DE、原肠、后前肠、PE、EP和最后完全分化的胰β细胞的形成。
一些科学论文中描述的方案例示了用于从人胚胎干(hES)细胞和诱导多能干(iPS)细胞获得胰(-样)细胞的方案(Aoi等2008;D'Amour等2006;Jiang等2007;Kroon等2008;Takahashi等2007;Takahashi&Yamanaka2006；和Wernig等2007)。
迄今为止，hES细胞的有效DE分化已通过激活蛋白A和Wnt处理实现。DE细胞可使用视黄酸(RA)(Cai等2010;D'Amour等2006)和BMP抑制剂(Kunisada等2012;Schulz等2012;Zhang等2009)进一步分化为PE细胞。
在产生胰β细胞的途径中产生PE细胞之后的下一个步骤为产生表达NGN3和NKX2.2标志物的EP细胞。
Nostro等(2012)和Kunisada等(2011)描述了用于将PE分化为EP的方法。
然而，存在对更有效的将PE分化为EP的方法的需求。
发明概述
本发明提供改进的用于通过组合已知方案的特征从而增加NGN3/NKX2.2双阳性细胞的百分比将胰内胚层(PE)分化为内分泌祖(EP)细胞的方法。通过向前述方法添加小分子所述百分比可进一步增加。小分子的某些组合允许NGN3/NKX2.2双阳性百分比的进一步有利增加。
本发明进一步涉及通过本发明方法可获得的EP细胞。
本发明进一步涉及所述细胞尤其在治疗I型糖尿病中的医学用途。
本发明采用一种替代方法以改进人PE细胞向完全分化的β细胞分化的效率，即通过提供增加NGN3/NKX2.2双阳性细胞(EP细胞定型为内分泌细胞命运的标志物)百分比的方法。
在一个实施方案中，本发明提供改进的胰β细胞前体群，即，NGN3/NKX2.2双阳性细胞的百分比增加的EP细胞。
在另一个实施方案中本发明提供更均质的EP细胞群，这对于这些细胞向完全分化的胰β细胞进一步发育是重要的。
在另一个实施方案中，本发明还提供更同步的EP群，以到达分化的下一阶段，即葡萄糖响应的完全分化的β细胞。
在一方面，本发明提供用于获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法，其中将包含胰内胚层细胞的细胞群暴露于基础培养基中的TGF-βI型受体抑制剂和BMP拮抗剂和腺苷酸环化酶激活剂和烟酰胺。
在一方面，本发明提供用于获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法，其中将包含胰内胚层细胞的细胞群暴露于吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DAPT。
本发明还可解决将从示例性实施方案的公开内容中显而易见的其它问题。
附图简述
图1显示本发明方法在NGN3mRNA诱导中的有利作用。
图2显示本发明方法在产生NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞中的有利作用。
图3显示组合本发明小分子的个体作用和有利作用。
图4显示组合本发明几种小分子的个体作用和有利作用。
发明详述
本发明涉及从人源的多能干细胞例如胚胎干(ES)细胞和诱导多能干细胞产生内分泌祖(EP)细胞的方法。
干细胞为通过其在单细胞水平自我更新且分化产生子代细胞(包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞)的能力而界定的未分化细胞。干细胞特征还在于其体外从多胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化为各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多胚层的组织的能力。
干细胞按照其发育潜能分为：(1)全能的，意指能够产生所有胚胎和胚外细胞类型；(2)多能的(pluripotent)，意指能够产生所有胚胎细胞类型；(3)多潜能的(multi-potent)，意指能够产生细胞谱系的子集，但所有均在一种特定组织、器官或生理系统内(例如，造血干细胞可产生的子代包括HSC(自我更新)、血细胞限制的寡能的祖细胞和为血液正常组分的所有细胞类型和成分(例如，血小板))；(4)寡能的，意指能够产生比多潜能干细胞更受限的细胞谱系子集；和(5)单能的，意指能够产生单细胞谱系(例如，产生精子的干细胞)。
成熟或分化的胰细胞的确不增殖而的确分泌高水平的胰内分泌激素或消化酶。例如，完全分化的β细胞响应葡萄糖而分泌高水平的胰岛素。当细胞丧失未分化细胞的标志物或获得分化细胞的标志物时，出现细胞相互作用变化和成熟。丧失或获得单个标志物可指示细胞已经“成熟或完全分化”。
本发明采用一种替代方法以改进人PE细胞向完全分化的β细胞分化的效率，即通过提供增加NGN3/NKX2.2双阳性细胞百分比的方法，所述NGN3/NKX2.2为EP细胞群的标志物，所述EP细胞群是到达产胰岛素胰β细胞所必需的细胞阶段之一。
此外，本发明提供更均质和同步的EP细胞群，这对于这些细胞向产胰岛素的β细胞进一步发育是重要的。
本发明还可解决将从示例性实施方案的公开内容中显而易见的其它问题。
如本文所使用的，“产胰岛素细胞”指响应葡萄糖产生和储存或分泌可检测量的胰岛素的细胞。“产胰岛素细胞”可为单个细胞或细胞集合。
如本文所使用的术语“β细胞”指位于胰内称为胰岛的小细胞簇中的细胞。β细胞通过分泌肽激素胰岛素响应高血糖水平，所述肽激素胰岛素作用于其它组织以促进从血液吸收葡萄糖，例如在肝脏中，其中其促进能量经由糖原合成而储存。
如本文所使用的“分化(differentiate)”或分化“(differentiation)”指细胞从未分化状态发展至分化状态，从不成熟状态发展至较不成熟状态或从不成熟状态发展至成熟状态的过程。例如，早期未分化的胚胎胰细胞能够增殖和表达特征标志物，如PDX1、NKX6.1和PTF1a。
术语“分化因子”指加至ES-或胰前体细胞以促进其分化为EP细胞的化合物。分化因子还可驱使进一步分化为成熟β细胞。
示例性的分化因子包括肝细胞生长因子、角质形成细胞生长因子、毒蜥外泌肽(exendin)-4、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、神经生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、胰高血糖素样肽1、吲哚内酰胺V（indolactamV）、IDE1&2和视黄酸。
在一些方面，细胞的分化包括在包含一种或多种分化因子的培养基中培养细胞。
在一个实施方案中本发明涉及向在其产物中缺乏至少一种胰激素的哺乳动物提供胰内分泌功能的方法，所述方法包括植入足以在所述哺乳动物中产生可测量的所述至少一种胰激素的量的通过本发明的任何方法获得的细胞的步骤。
在一个实施方案中，根据本发明方法制备的EP细胞群可用于，例如通过植入需要此种治疗的患者中治疗糖尿病。
如本文所使用的，术语“人多能干(hPS)细胞”指可从任何来源衍生的并且能够在适当条件下产生人不同细胞类型(其为所有3个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物)子代的细胞。hPS细胞具有在8-12周龄SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在组织培养物中形成所有三个胚层的可鉴别细胞的能力。人多能干细胞的定义中包括各种类型的胚胎细胞，包括文献中人胚泡衍生的干(hBS)细胞(常称作人胚胎干(hES)细胞)。
本文中描述的各种方法和其它实施方案可能需要或利用多种来源的hPS细胞。例如，适用的hPS细胞可从发育的胚胎获得。另外或替代地，合适的hPS细胞可从已建立的细胞系和/或人诱导多能干(hiPS)细胞获得。
如本文所使用的术语“hiPS细胞”指人诱导多能干细胞。
如本文所使用的，术语“胚泡-衍生的干细胞”标记为BS细胞，并且人形式称为“hBS细胞”。在文献中该细胞常常被称为胚胎干细胞，更特别为人胚胎干细胞(hESC)。本发明继而使用的多能干细胞因此可为从胚泡制备的胚胎干细胞，如例如WO03/055992和WO2007/042225中所述，或可为市售可得的hBS细胞或细胞系。然而，进一步设想本发明继而可使用任何人多能干细胞，包括分化成体细胞，其通过例如用某些转录因子例如OCT4、SOX2、NANOG和LIN28处理成体细胞而重编程为多能细胞。
如本文所使用的，“EP细胞群”为其中至少5%的细胞群为NGN3/NKX2.2双阳性的胰β细胞前体群。
如本文所使用的，术语“PDX1”指胰发育中牵涉的同源结构域转录因子。如本文所使用的“NGN3”为碱性环-螺旋环转录因子的neurogenin家族的成员。如本文所使用的“NKX2.2”和“NKX6.1”为NKX转录因子家族的成员。如本文所使用的“Islet-1”或“IsI-1”为转录因子的LIM/同源结构域家族成员，并且在发育的胰中表达。如本文所使用的“MafA”为在胰中表达的转录因子，并控制胰岛素生物合成和分泌中涉及的基因的表达。
在一个实施方案中本发明提供替代的或比本领域已知的更有效的用于将PE细胞分化为EP细胞从而产生更均质的EP群的方法。
对于进一步分化为完全分化的β细胞均质的EP群为期需的起点。
在一个实施方案中以这样的方式处理PE细胞使得NGN3/NKX2.2双阳性在所得群中的百分比比使用已知用于将PE细胞群分化为EP细胞群的方案可达到的更高。
在一个使用本发明方法的实施方案中，当与用基础培养基处理相比时观察到NGN3mRNA的600倍上调。
在一个实施方案中使用已知的用于将PE分化为EP细胞的方法，以改进所得EP细胞群中NGN3/NKX2.2双阳性的百分比。
在一个实施方案中协同使用已知的用于使PE分化为EP细胞的方法，以改进所得EP细胞群中NGN3/NKX2.2双阳性的百分比。
在一个实施方案中协同使用已知的用于使PE分化为EP细胞的方法的元素，以改进所得EP细胞群中NGN3/NKX2.2双阳性的百分比。
在一个实施方案中，实施例2的方法产生至少8%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法产生至少9%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法产生至少10%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法产生至少15%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，本发明方法产生15-100%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中使用小分子以增加PE至EP分化过程中NGN3/NKX2.2双阳性的百分比。
在一个实施方案中组合使用小分子以增加PE至EP分化过程中NGN3/NKX2.2双阳性的百分比。
在一个实施方案中组合使用小分子以协同增加PE至EP分化过程中NGN3/NKX2.2双阳性的百分比。
在下列实施方案中列出了可用于促进PE向EP分化的许多小分子和浓度。
在一个实施方案中发现可用于促进PE向EP分化的小分子为吉非替尼。在一个实施方案中吉非替尼以0.1-100μM的浓度使用。在一个实施方案中吉非替尼以1-10μM的浓度使用。在一个实施方案中吉非替尼以5μM的浓度使用。
在一个实施方案中发现可用于促进PE向EP分化的小分子为JNK抑制剂VIII。在一个实施方案中JNK抑制剂VIII以0.1-100μM的浓度使用。在一个实施方案中JNK抑制剂VIII以1-10μM的浓度使用。在一个实施方案中JNK抑制剂VIII以10μM的浓度使用。
在一个实施方案中发现可用于促进PE向EP分化的小分子为DNA-PK抑制剂V。在一个实施方案中DNA-PK抑制剂V以0.1-100μM的浓度使用。在一个实施方案中DNA-PK抑制剂V以1-10μM的浓度使用。在一个实施方案中DNA-PK抑制剂V以5μM的浓度使用。
在一个实施方案中发现可用于促进PE向EP分化的小分子为DAPT。在一个实施方案中，DAPT以0.1-100μM的浓度使用。在一个实施方案中，DAPT以1-10μM的浓度使用。在一个实施方案中，DAPT以2.5μM的浓度使用。
在一个实施方案中发现可用于促进PE向EP分化的小分子为吉非替尼和JNK抑制剂VIII。在一个实施方案中JNK抑制剂VIII和吉非替尼以0.1-100μM的浓度使用。在一个实施方案中JNK抑制剂VIII和吉非替尼以1-10μM的浓度使用。在一个实施方案中JNK抑制剂VIII和吉非替尼分别以5和10μM的浓度使用。
在一个实施方案中吉非替尼的浓度约为JNK抑制剂VIII浓度的两倍。
在一个实施方案中除了JNK抑制剂VIII和吉非替尼之外还加入一种或多种小分子。
在一个实施方案中DAPT以任何上述DAPT浓度例如2.5μM与吉非替尼和JNK抑制剂VIII一起使用。
在一个实施方案中DNA-PK抑制剂V以任何上述DNA-PK抑制剂V浓度例如5μM与吉非替尼和JNK抑制剂VIII一起使用。
在一个实施方案中吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DNA-PK抑制剂V以0.1-100μM的个体浓度组合使用。在一个实施方案中吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DNA-PK抑制剂V以1-10μM的个体浓度组合使用。
在一个实施方案中使用1-100μM吉非替尼、1-100μMJNK抑制剂VIII、0.5-50μMDAPT和1-100μMDNA-PK抑制剂V。在一个实施方案中组合使用1-10μM吉非替尼、5-20μMJNK抑制剂VIII、1-10μMDAPT和1-10μMDNA-PK抑制剂V。在一个实施方案中，组合使用5μM吉非替尼、10μMJNK抑制剂VIII和5μMDNA-PK抑制剂V。
在一个实施方案中DAPT、DNA-PK抑制剂V、吉非替尼和JNK抑制剂VIII以任何上述对于各个化合物的浓度组合使用。
在一个实施方案中吉非替尼、JNK抑制剂VIII、DAPT和DNA-PK抑制剂V以0.1-100μM的个体浓度组合使用。在一个实施方案中吉非替尼、JNK抑制剂VIII、DAPT和DNA-PK抑制剂V以1-10μM的个体浓度组合使用。在一个实施方案中组合使用5μM吉非替尼、10μMJNK抑制剂VIII、2.5μMDAPT和5μMDNA-PK抑制剂V。
在一个实施方案中使用一种或多种下列化合物将PE分化为EP：Rockout、BPIQ-I、PD174265、p38抑制剂III、PD169316、DMBI、Syk抑制剂、PD98059、DNA-PK抑制剂V、TGF-βRI抑制剂III、L-685、458、CompoundE。在一个实施方案中Rockout以5-10μM的浓度使用。在一个实施方案中p38抑制剂III以5-10μM的浓度使用。在一个实施方案中PD16931以1-5μM的浓度使用。
在一个实施方案中DMBI以1-50μM的浓度使用。在一个实施方案中DMBI以10μM的浓度使用。
在一个实施方案中Syk抑制剂以1-50μM的浓度使用。在一个实施方案中Syk抑制剂以1μM的浓度使用。
在一个实施方案中BPIQ-I以0.1-100μM的浓度使用。
在一个实施方案中BPIQ-I以1-50μM的浓度使用。在一个实施方案中BPIQ-I以10μM的浓度使用。
在一个实施方案中PD174265以0.1-100μM的浓度使用。在一个实施方案中PD174265以的1-50μM浓度使用。在一个实施方案中PD174265以10μM的浓度使用。在一个实施方案中PD174265以1μM的浓度使用。
在一个实施方案中DNA-PK抑制剂V以0.1-100μM的浓度使用。在一个实施方案中DNA-PK抑制剂V以1-10μM的浓度使用。在一个实施方案中DNA-PK抑制剂V以5μM的浓度使用。
在一个实施方案中TGF-βRI抑制剂III以0.1-100μM的浓度使用。
在一个实施方案中TGF-βRI抑制剂III以1-10μM的浓度使用。在一个实施方案中TGF-βRI抑制剂III以5μM的浓度使用。
在一个实施方案中L6以0.1-100μM的浓度使用。在一个实施方案中L6以1-10μM的浓度使用。在一个实施方案中L6以5μM的浓度使用。
在一个实施方案中CompoundE以50nM-5μM的浓度使用。在一个实施方案中CompoundE以100nM-1μM的浓度使用。在一个实施方案中CompoundE以500nM的浓度使用。
在一个实施方案中，可通过本发明方法获得的EP细胞为产胰岛素细胞，任选和向产胰高血糖素、生长抑素、胰多肽和/或生长素释放肽(ghrelin)的细胞分化的细胞。
在一个实施方案中，包含EP细胞的细胞群从体细胞群获得。在一些方面，体细胞群已被诱导而去分化为胚胎-样干细胞(即，多能)。这样的去分化细胞还称为诱导多能干细胞(iPS)。
在一个实施方案中，包含EP细胞的细胞群继而从胚胎干细胞获得。
在一个实施方案中，包含EP细胞的细胞群继而从hiPS细胞获得。
在一个实施方案中分化在胚状体和/或在单层细胞培养物或其组合中发生。
使用所述小分子增加NGN3/NKX2.2双阳性细胞量的效果的实例在本文档的实施例以及图3和4中显示。
在一个实施方案中用所述小分子处理经历向NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞分化的细胞。
在一个实施方案中，实施例2的方法，加入所述小分子，产生150-400%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法，加入所述小分子，产生150-300%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法，加入所述小分子，产生至少150%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法，加入所述小分子，产生至少200%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法，加入所述小分子，产生至少300%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法，加入所述小分子，产生至少400%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法，加入所述小分子，本发明产生至多400%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，在用所述小分子处理之前，将经历向NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞分化的细胞暴露于基础培养基中的TGF-βI型受体抑制剂、BMP拮抗剂、腺苷酸环化酶激活剂和烟酰胺。
在一个实施方案中TGF-βI型受体抑制剂为SB431542并且所述BMP拮抗剂为头蛋白。
在一个实施方案中所述腺苷酸环化酶激活剂为弗斯扣林.
本发明进一步的实施方案：
实施方案1：用于获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法，其中将包含胰内胚层细胞的细胞群暴露于基础培养基中的
TGF-βI型受体抑制剂，和
BMP拮抗剂，和
腺苷酸环化酶激活剂，和
烟酰胺。
实施方案2：实施方案1的方法，其中所述TGF-βI型受体抑制剂为SB431542并且所述BMP拮抗剂为头蛋白。
实施方案3：实施方案1或2的方法，其中所述腺苷酸环化酶激活剂为弗斯扣林。
实施方案4：实施方案1-3的方法，其中所述基础培养基为RPMI1640。
实施方案5：实施方案1-4的方法，其中将内分泌祖细胞另外暴露于DNA-PK抑制剂V、吉非替尼、JNK抑制剂VIII或DAPT或所述小分子的任何组合。
实施方案6：实施方案1-4的方法，其中将吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DNA-PK抑制剂V组合。
实施方案7：实施方案1-4的方法，其中将吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DAPT组合。
实施方案8：实施方案1-4的方法，其中将吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DNA-PK抑制剂V组合。
实施方案9：实施方案1-4的方法，其中使用1-100μM吉非替尼、1-100μMJNK抑制剂VIII、0.5-50μMDAPT和1-100μMDNA-PK抑制剂V。
实施方案10：实施方案9的方法，其中使用1-10μM吉非替尼、5-20μMJNK抑制剂VIII、1-10μMDAPT和1-10μMDNA-PK抑制剂V。
实施方案11：根据实施方案1-8的方法获得的细胞。
实施方案12：用于药物中的根据实施方案1-8获得的细胞。
实施方案13：用于治疗糖尿病的根据实施方案1-8获得的细胞。
实施方案14：根据实施方案1-8的方法获得的细胞用于治疗糖尿病的用途。
实施方案15：用于获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法，其中将包含胰内胚层细胞的细胞群暴露于吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DAPT。
令人惊讶地，关于将PE分化为EP细胞，通过组合已知适于将PE细胞分化为EP细胞的两个已公开的方案的步骤可取得有利效果。同样令人惊讶地显示某些小分子及其组合可进一步驱动PE向EP分化并从而增加EP细胞的产率(导致使用本发明方法制备的细胞群中更高的EP百分比)。
实施例
缩略词表
DAPT：(二氯苯乙酰基)-丙氨酰-苯基甘氨酸-叔丁酯
DMBI：(Z)-3-[4-(二甲氨基)亚苄基]二氢吲哚-2-酮
CompE：CompoundE
DE：定型内胚层
DEF-CS：DEF培养系统
DNA-Pki：DNA-PK抑制剂V
EP：内分泌祖细胞
hBS：人胚泡衍生的干
hES：人胚胎干
hESC：人胚胎干细胞
hiPS：人诱导多能干
HSC：造血干细胞
iPS：诱导多能干
iPSC：诱导多能干细胞
KOSR：KnockOut?血清替代物
PE：胰内胚层
PEST：青霉素链霉素
SC：干细胞
Rockout：Rho激酶抑制剂III
实施例1：PE细胞群的制备
将hES细胞(DEF-hESSA121)或iPS细胞(DEF-CHiPS2)培养在补充30ng/mlbFGF(Peprotech#100-18B)和10ng/ml头蛋白(Peprotech#120-10C)的DEF培养基(Cellectis)中。DEF培养基或DEF-CS培养基/系统为用于人多能干细胞建立和增殖的规定的平衡培养基，DEF-CS培养基/系统。
使用下列方案在T75培养瓶中将hES细胞分化为DE：将汇合的培养物在RPMI1640(Gibco#61870)中洗涤一次并用3μMCHIR99021(Axon#1386)/RPMI1640，0.1%PEST(Gibco#15140)处理。24小时后细胞用RPMI1640，0.1%PEST洗涤并用100ng/ml激活蛋白A(Peprotech#120-14E)/RPMI1640，0.1%PEST处理。24小时后，向激活蛋白A培养基中加入2%B27(Invitrogen#17504-044)持续2天，每天更换培养基。分化期间将细胞在增湿培养箱中维持在37℃和5%CO2下。
DE细胞使用TrypleSelect(Invitrogen,#12563-029)胰蛋白酶消化并作为单细胞重新接种在200K/cm2光学96-孔多盘(Corning#3340)中的补充100ng/ml激活蛋白A、2%B27和0.1%PEST的RPMI1640中。
使用下列方案让DE细胞粘附和分化为PE细胞：DE培养物洗涤一次并用50nMLDN-193189(Stemgent#04-0074)/RPMI1640,0.1%PEST,12%KOSR(Gibco#10828)处理。四天后细胞用RPMI1640洗涤并用1μMAM580(Enzo#BML-GR104)、10μMJNK抑制剂II(Calbiochem#420119)、50nMLDN-193189和64ng/mLbFGF/RPMI1640，0.1%PEST，12%KOSR分化持续7天。分化期间将细胞在增湿培养箱中维持在37℃和5%CO2下，每天更换培养基。
实施例2：使用组合方案的PE向EP的分化
根据实施例1获得的PE细胞用6μMSB4311542(Sigma#S4317)、50ng/ml头蛋白(Peprotech#120-10c)、10μM弗斯扣林(Sigma#F6886)和10mM烟酰胺(Calbiochem#481907)/RPMI16400.1%PEST和2%B27分化达三天。分化期间将细胞在增湿培养箱中维持在37℃和5%CO2下，每天更换培养基。
实施例3：实施例2的方法与已知方案的比较
将实施例2的方法分别与Kunisada等(2011)(方案K)和Nostro等(2012)(方案N)中描述的方法比较。
方案K
根据实施例1获得的PE细胞用10μM弗斯扣林(Sigma#F6886)和10mM烟酰胺(Calbiochem#481907)/RPMI1640,0.1%PEST和2%B27分化达3天。分化期间将细胞在增湿培养箱中维持在37℃和5%CO2下，每天更换培养基。
方案N
根据实施例1获得的PE细胞用6μMSB4311542(Sigma#S4317),50ng/ml头蛋白(Peprotech#120-10c)/RPMI1640,0.1%PEST和2%B27分化达3天。分化期间将细胞在增湿培养箱中维持在37℃和5%CO2下，每天更换培养基。
获得下列结果：
响应于方案K和方案N以及组合方案K&N(实施例2)的3天EP分化的内分泌祖细胞标志物NGN3的相对基因表达水平。基因表达相对于在基础培养基中分化的培养物中存在的基因表达（其设为1）显示。
EP第4天收获细胞，使用RNeasyPlusMiniKit(Qiagen#74134)提取总RNA并用NanoDropND-1000分光光度计(ThermoScientific)测量RNA浓度。使用iScriptcDNASynthesisKit(Bio-Rad)按照制造商的说明将RNA反转录为cDNA。每个实验使用固定量的RNA(500ng)用于cDNA合成。反应混合物如下孵育：25℃5min，42℃30min和85℃5min。
定量实时聚合酶链反应(qPCR)在10μl反应中使用1/100cDNA/反应、Taqman基因表达测定(库存的(inventoried)针对NGN3或管家基因GAPDH的引物集)和Taqman快速通用PCR预混液一式两份运行。qPCR在Mx3005PqPCR系统(Agilent)上使用快速两步程序进行：95℃初始变性3分钟，随后为95℃15秒和60℃20秒的40个循环。将原始数据从MxPro软件导出并使用MicrosoftExcel和GraphPadPrism分析。基因表达的相对定量使用比较循环阈值(DDCt)方法(Schmittgen和Livak,2008)用GAPDH作为内部参考进行。
结果以相对NGN3表达的形式在下表1和图1中示出。结果显示当组合两个个体方案(方案K&方案N)以制备内分泌祖细胞时，我们可协同提高EP细胞群中的NGN3mRNA表达水平。
表1：相对NGN3表达
方案 相对NGN3 mRNA表达
基础 1
方案N 63
方案K 338
实施例2的方法 634
EP分化3天后，EP的第四天，吸去培养基，然后用4%低聚甲醛(VWR,97.131.000)室温固定细胞30分钟。细胞用PBS洗涤并用0.5%TritonX-100(Sigma,9002-93-1)透化10分钟，洗涤并在0.5%TNB-缓冲液(PerkinElmer)中室温封闭30分钟。将第一抗体，绵羊抗-NGN3(R&D系统#AF3444)和兔抗-NKX2.2(Sigma#HPA003468)分别在0.1%TritonX-100/PBS中1:1000和1:500稀释，并加入各个孔中以在4℃过夜孵育。用PBS洗涤细胞3次。将DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚,Applichem,A4099.0010)和第二抗体，AlexaFluor488驴-抗山羊和AlexaFluor594驴抗-兔(均为Invitrogen)在0.1%TritonX-100/PBS中1:1000稀释，并加入每个孔中维持45分钟。将细胞洗涤5次，保持在200μLPBS中用于成像。
成像使用InCell分析仪2000(GEHealthcare)进行。用10×物镜捕获4个视野/孔。总细胞数目基于DAPI复染，NGN3/NKX2.2双阳性细胞数目使用InCellDeveloperToolbox1.8(GEHealthcare)测定。将NGN3/NKX2.2双阳性细胞分数使用InCelldevelopertoolbox软件(GEHealthcare)定量，归一化至每个板的组合方案K&N(实施例2)并计算%效果(%效果NGN3/NKX2.2双阳性=((S-Sneg)/(│Spos-Sneg│))*100)。其中S为给定化合物组合的%NGN3/NKX2.2双阳性细胞，Sneg和Spos分别为阴性对照和组合方案K&N的%NGN3/NKX2.2双阳性细胞)。
结果以%效果NGN3/NKX2.2双阳性细胞的形式在下表2和图2中示出。
表2：%效果NGN3/NKX2.2双阳性细胞
方案 %效果NGN3 / NKX2.2双阳性细胞
基础 0.1
方案N 7.3
方案K 7.6
实施例2的方法 100
结果显示当组合两个独立的方案(方案K&方案N)以制备内分泌祖细胞时，我们可协同提高EP细胞群中的NGN3/NKX2.2双阳性细胞水平。
实施例4：小分子诱导的EP分化
在下列条件下检验了某些分子诱导和增加PE向EP分化的能力：
根据实施例1和2制备EP细胞群。然而，除了实施例2中使用的试剂外还以下表3中所示浓度指定的浓度加入表3中列出的小分子达三天。
EP分化3天后，吸去培养基，然后用4%低聚甲醛(VWR,97.131.000)室温固定细胞30分钟。细胞用PBS洗涤并用0.5%TritonX-100(Sigma,9002-93-1)透化10分钟，洗涤并在0.5%TNB-缓冲液(PerkinElmer)中室温封闭30分钟。将第一抗体，绵羊抗-NGN3(R&D系统#AF3444)和兔抗-NKX2.2(Sigma#HPA003468)分别在0.1%TritonX-100/PBS中1:1000和1:500稀释，加入各个孔中以在4℃过夜孵育。用PBS洗涤细胞3次。将DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚,Applichem,A4099.0010)和第二抗体，AlexaFluor488驴-抗山羊和AlexaFluor594驴抗-兔(均为Invitrogen)在0.1%TritonX-100/PBS中1:1000稀释，并加入每个孔中维持45分钟。将细胞洗涤5次，保持在200μLPBS中用于成像。
成像使用InCell分析仪2000(GEHealthcare)进行。用10×物镜捕获4个视野/孔。总细胞数目基于DAPI复染，NGN3/NKX2.2双阳性细胞数目使用InCellDeveloperToolbox1.8(GEHealthcare)测定。将NGN3/NKX2.2双阳性细胞分数使用InCelldevelopertoolbox软件(GEHealthcare)定量，归一化至每个板的组合方案K&N并计算%效果(%效果NGN3/NKX2.2双阳性=((S-Sneg)/(│Spos-Sneg│))*100)。其中S为给定化合物组合的%NGN3/NKX2.2双阳性细胞，Sneg和Spos分别为阴性对照和组合方案K&N的%NGN3/NKX2.2双阳性细胞)。超过150%效果的值归类为命中。
已经发现多个分子促进PE细胞向EP细胞分化。这些分子在下表3中列出。
此外，通过加入靶向γ-分泌酶、JNK、Rho激酶、P38MAPK、SYK、DNA-PK、PI3K、PDGFR、FGFR或EGFR的小抑制剂甚至可进一步提高通过NGN3/NKX2.2双阳性细胞测量的该组合方案的效率。
结果在下表4和图3中示出。
表4：%效果NGN3/NKX2.2双阳性细胞
化合物 %效果NGN3/NKX2.2双阳性细胞
实施例2的方法 100
实施例2的方法 + 10 μM JNK VIII 308
实施例2的方法 + 5 μM JNK VIII 315
实施例2的方法 + 1 μM JNK VIII 204
实施例2的方法 + 0.5 μM JNK VIII 156
实施例2的方法 + 0.1 μM JNK VIII 160
实施例2的方法 + 10 μM Rockout 199
实施例2的方法 + 5 μM Rockout 208
实施例2的方法 + 5 μM 吉非替尼 325
实施例2的方法 + 1 μM 吉非替尼 311
实施例2的方法 + 0.5 μM 吉非替尼 242
实施例2的方法 + 0.1 μM 吉非替尼 222
实施例2的方法 + 10 μM BPIQ-I 350
实施例2的方法 + 10 μM PD174265 274
实施例2的方法 + 5 μM PD174265 374
实施例2的方法 + 1 μM PD174265 240
实施例2的方法 + 10 μM p38抑制剂III 153
实施例2的方法 + 5 μM p38抑制剂III 191
实施例2的方法 + 5 μM PD169316 154
实施例2的方法 + 1 μM PD169316 152
实施例2的方法 + 10 μM DMBI 231
实施例2的方法 + 5 μM DMBI 167
实施例2的方法 + 1 μM Syk抑制剂 157
实施例2的方法 + 1 μM PD98059 165
实施例2的方法 + 5 μM DNA-PK抑制剂V 370
实施例2的方法 + 5 μM TGFbRI抑制剂III 182
实施例2的方法 + 25 μM DAPT 300
实施例2的方法 + 2.5 μM DAPT 350
实施例2的方法 + 0.5 μM DAPT 150
实施例2的方法 + 50 μM L6 150
实施例2的方法 + 500 nM CompE 395
实施例2的方法 + 50 nM CompE 325
实施例2的方法 + 5nM CompE 250
实施例5：小分子组合诱导的PE向EP的分化
在下列条件下检验了表3的某些分子和其组合诱导和增加PE向EP分化的能力。
根据实施例2制备EP细胞群。然而，除了实施例2中使用的试剂外，EP分化的三天期间单独或组合加入表3中列出的某些小分子。
EP分化3天后，吸去培养基，然后用4%低聚甲醛(VWR,97.131.000)室温固定细胞30分钟。细胞用PBS洗涤并用0.5%TritonX-100(Sigma,9002-93-1)透化10分钟，洗涤并在0.5%TNB-缓冲液(PerkinElmer)中室温封闭30分钟。将第一抗体，绵羊抗-NGN3(R&D系统#AF3444)和兔抗-NKX2.2(Sigma#HPA003468)分别在0.1%TritonX-100/PBS中1:1000和1:500稀释，加入各个孔中以在4℃过夜孵育。用PBS洗涤细胞3次。将DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚,Applichem,A4099.0010)和第二抗体，AlexaFluor488驴-抗山羊和AlexaFluor594驴抗-兔(均为Invitrogen)在0.1%TritonX-100/PBS中1:1000稀释，并加入每个孔中维持45分钟。将细胞洗涤5次，保持在200μLPBS中用于成像。
成像使用InCell分析仪2000(GEHealthcare)进行。用10×物镜捕获4个视野/孔。总细胞数目基于DAPI复染，NGN3/NKX2.2双阳性细胞数目使用InCellDeveloperToolbox1.8(GEHealthcare)测定。将NGN3/NKX2.2双阳性细胞分数使用InCelldevelopertoolbox软件(GEHealthcare)定量，归一化至每个板的组合方案K&N并计算%效果(%效果NGN3/NKX2.2双阳性=((S-Sneg)/(│Spos-Sneg│))*100)。其中S为对于一个给定化合物组合的%NGN3/NKX2.2双阳性细胞，Sneg和Spos分别为阴性对照和组合方案K&N的%NGN3/NKX2.2双阳性细胞。
结果以%效果NGN3/NKX2.2双阳性细胞的形式在下表5和图4中示出。结果显示当DAPT与JNK抑制剂VIII或吉非替尼或JNK抑制剂III加吉非替尼一起加入时实施例2和4的方案的分化效率增加。
表5：%效果NGN3/NKX2.2双阳性细胞
尽管本发明的某些特征已经在本文中说明和描述，但现在本领域普通技术人员将想到许多修饰、取代、变更和等同物。因此，应理解的是，所附权利要求书意在涵盖落在本发明真实精神内的所有这些修饰和变更。
参考文献
Aoi,T.,Yae,K.,Nakagawa,M.,Ichisaka,T.,Okita,K.,Takahashi,K.,Chiba,T.和Yamanaka,S.(2008).Generationofpluripotentstemcellsfromadultmouseliverandstomachcells(从成年鼠肝和胃细胞产生多能干细胞).Science321,699-702.
Cai,J.,Yu,C.,Liu,Y.,Chen,S.,Guo,Y.,Yong,J.,Lu,W.,Ding,M.和Deng,H.(2010).GenerationofhomogeneousPDX1(+)pancreaticprogenitorsfromhumanEScell-derivedendodermcells(从人ES细胞衍生的内胚层细胞产生均质的PDX1(+)胰祖细胞).J.Mol.CellBiol.2,50-60.
D'Amour,K.A.,Bang,A.G.,Eliazer,S.,Kelly,O.G.,Agulnick,A.D.,Smart,N.G.,Moorman,M.A.,Kroon,E.,Carpenter,M.K.和Baetge,E.E.(2006).Productionofpancreatichormone-expressingendocrinecellsfromhumanembryonicstemcells(从人胚胎干细胞产生胰激素-表达内分泌细胞).Nat.Biotechnol.24,1392-1401.
Jiang,J.,Au,M.,Lu,K.,Eshpeter,A.,Korbutt,G.,Fisk,G.和Majumdar,A.S.(2007).Generationofinsulin-producingislet-likeclustersfromhumanembryonicstemcells(从人胚胎干细胞产生产胰岛素的胰岛样簇).StemCells25,1940-1953.
Kroon,E.,Martinson,L.A.,Kadoya,K.,Bang,A.G.,Kelly,O.G.,Eliazer,S.,Young,H.,Richardson,M.,Smart,N.G.,Cunningham,J.,Agulnick,A.D.,D'Amour,K.A.,Carpenter,M.K.和Baetge,E.E.(2008).Pancreaticendodermderivedfromhumanembryonicstemcellsgeneratesglucose-responsiveinsulin-secretingcellsinvivo(从人胚胎干细胞衍生的胰内胚层在体内产生葡萄糖-响应的胰岛素-分泌细胞).Nat.Biotechnol.26,443-452.
Kunisada,Y.,Tsubooka-Yamazoe,N.,Shoji,M.和Hosoya,M.(2012).Smallmoleculesinduceefficientdifferentiationintoinsulin-producingcellsfromhumaninducedpluripotentstemcells(小分子诱导从人诱导多能干细胞向产胰岛素细胞的有效分化).StemCellRes.8,274-284.
Nostro,M.C.,Sarangi,F.,Ogawa,S.,Holtzinger,A.,Corneo,B.,Li,X.,Micallef,S.J.,Park,I.H.,Basford,C.,Wheeler,M.B.,Daley,G.Q.,Elefanty,A.G.,Stanley,E.G.和Keller,G.(2011).Stage-specificsignalingthroughTGFbetafamilymembersandWNTregulatespatterningandpancreaticspecificationofhumanpluripotentstemcells(通过TGFβ家族成员和WNT的阶段特异性信号传导调节人多能干细胞的模式和胰腺特化).Development138,861-871.
Schulz,T.C.,Young,H.Y.,Agulnick,A.D.,Babin,M.J.,Baetge,E.E.,Bang,A.G.,Bhoumik,A.,Cepa,I.,Cesario,R.M.,Haakmeester,C.,Kadoya,K.,Kelly,J.R.,Kerr,J.,Martinson,L.A.,McLean,A.B.,Moorman,M.A.,Payne,J.K.,Richardson,M.,Ross,K.G.,Sherrer,E.S.,Song,X.,Wilson,A.Z.,Brandon,E.P.,Green,C.E.,Kroon,E.J.,Kelly,O.G.,D'Amour,K.A.和Robins,A.J.(2012).Ascalablesystemforproductionoffunctionalpancreaticprogenitorsfromhumanembryonicstemcells(用于从人胚胎干细胞生产功能胰祖细胞的可扩展系统).PLoS.One.7,e37004.
Takahashi,K.,Tanabe,K.,Ohnuki,M.,Narita,M.,Ichisaka,T.,Tomoda,K.和Yamanaka,S.(2007).Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors(通过限定的因子从成年人成纤维细胞诱导多能干细胞).Cell131,861-872.
Takahashi,K.和Yamanaka,S.(2006).Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors(通过限定的因子从小鼠胚胎和成年成纤维细胞培养物诱导多能干细胞).Cell126,663-676.
Wernig,M.,Meissner,A.,Foreman,R.,Brambrink,T.,Ku,M.,Hochedlinger,K.,Bernstein,B.E.和Jaenisch,R.(2007).InvitroreprogrammingoffibroblastsintoapluripotentES-cell-likestate(成纤维细胞向多能ES-细胞样状态的体外重编程).Nature448,318-324.
Zhang,D.,Jiang,W.,Liu,M.,Sui,X.,Yin,X.,Chen,S.,Shi,Y.和Deng,H.(2009).HighlyefficientdifferentiationofhumanEScellsandiPScellsintomaturepancreaticinsulin-producingcells(人ES细胞和iPS细胞向成熟胰产胰岛素细胞的高效分化).CellRes.19,429-438。

Claims (15)

1.用于获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法，其中将包含胰内胚层细胞的细胞群同时暴露于基础培养基中的：
a)TGF-βI型受体抑制剂，
b)BMP拮抗剂，其中所述BMP拮抗剂为头蛋白（noggin），
c)腺苷酸环化酶激活剂，和
d)烟酰胺。
2.权利要求1的方法，其中所述TGF-βI型受体抑制剂为SB431542。
3.权利要求1或2中任一项的方法，其中所述腺苷酸环化酶激活剂为弗斯扣林(forskolin)。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述内分泌祖细胞为至少8%效果NGN3/NKX2.2双阳性。
5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述内分泌祖细胞为至少10%效果NGN3/NKX2.2双阳性。
6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述内分泌祖细胞为10-100%效果NGN3/NKX2.2双阳性。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述基础培养基为RPMI1640。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中将内分泌祖细胞另外暴露于DNA-PK抑制剂V、吉非替尼（gefitinib）、JNK抑制剂VIII或DAPT或所述分子的任何组合。
9.权利要求1-7中任一项的方法，其中将吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DNA-PK抑制剂V组合。
10.权利要求1-7中任一项的方法，其中将吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DAPT组合。
11.权利要求1-7中任一项的方法，其中将吉非替尼、JNK抑制剂VIII、DAPT和DNA-PK抑制剂V组合。
12.权利要求1-7中任一项的方法，其中使用1-100μM吉非替尼、1-100μMJNK抑制剂VIII、0.5-50μMDAPT和1-100μMDNA-PK抑制剂V。
13.权利要求8-12中任一项的方法，其中使用1-10μM吉非替尼、5-20μMJNK抑制剂VIII、1-10μMDAPT和1-10μMDNA-PK抑制剂V。
14.根据权利要求1-13中的方法获得的细胞。
15.头蛋白与TGF-βI型受体抑制剂、腺苷酸环化酶激活剂和烟酰胺组合以从多能干细胞诱导胰内胚层细胞的用途。
CN201480047988.5A 2013-08-30 2014-08-29 使用小分子从人多能干细胞产生内分泌祖细胞 Active CN105683361B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13182440 2013-08-30
EP13182440.1 2013-08-30
US201361875191P 2013-09-09 2013-09-09
US61/875191 2013-09-09
PCT/EP2014/068393 WO2015028614A1 (en) 2013-08-30 2014-08-29 Generation of endocrine progenitor cells from human pluripotent stem cells using small molecules

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105683361A true CN105683361A (zh) 2016-06-15
CN105683361B CN105683361B (zh) 2021-04-02

Family

ID=49080758

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480047988.5A Active CN105683361B (zh) 2013-08-30 2014-08-29 使用小分子从人多能干细胞产生内分泌祖细胞

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20160208215A1 (zh)
EP (1) EP3039122B1 (zh)
JP (1) JP6636427B2 (zh)
CN (1) CN105683361B (zh)
DK (1) DK3039122T3 (zh)
WO (1) WO2015028614A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108165531A (zh) * 2017-12-23 2018-06-15 淮北智淮科技有限公司 一种造血干细胞用的脐带血单核细胞培养方法
CN111108190A (zh) * 2017-09-11 2020-05-05 诺沃挪第克公司 在体外从干细胞衍生的nkx6.1和c-肽共表达细胞的富集

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3008170A4 (en) 2013-06-11 2016-11-09 Harvard College SC-CELLS AND COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF
EP4374863A2 (en) 2014-12-18 2024-05-29 President and Fellows of Harvard College Methods for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof
US10443042B2 (en) 2014-12-18 2019-10-15 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof
US10253298B2 (en) 2014-12-18 2019-04-09 President And Fellows Of Harvard College Methods for generating stem cell-derived beta cells and methods of use thereof
EP3420073B1 (en) * 2016-02-24 2023-11-08 Novo Nordisk A/S Generation of functional beta cells from human pluripotent stem cell-derived endocrine progenitors
AU2018370029A1 (en) 2017-11-15 2020-07-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Islet cell manufacturing compositions and methods of use
WO2019142883A1 (ja) 2018-01-18 2019-07-25 第一三共株式会社 ジヒドロインドリジノン誘導体
AU2019320072A1 (en) 2018-08-10 2021-02-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived islet differentiation
CA3110932A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 Novo Nordisk A/S Generation of functional beta cells from human pluripotent stem cell-derived endocrine progenitors
US20220177849A1 (en) 2019-04-08 2022-06-09 Novo Nordisk A/S Generation of pancreatic endoderm from stem cell derived definitive endoderm
TW202115245A (zh) 2019-06-27 2021-04-16 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 安全免疫隱形細胞
EP4204542A1 (en) 2020-08-28 2023-07-05 Novo Nordisk A/S Method for screening in vitro population of stem cell derived beta like cells and novel markers thereof
TW202242095A (zh) 2020-12-18 2022-11-01 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 安全免疫隱形細胞
WO2022136215A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 Novo Nordisk A/S Safe immuno-stealth cells
WO2024008810A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Novo Nordisk A/S Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102093977A (zh) * 2010-11-29 2011-06-15 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种诱导iPS细胞向心肌细胞分化的诱导因子及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011008992A2 (en) * 2009-07-15 2011-01-20 The Regents Of The University Of California Peptides whose uptake in cells is controllable
DK2650359T3 (da) * 2006-03-02 2022-06-13 Viacyte Inc Endokrine prekursorceller, pancreatiske hormon-udtrykkende celler og fremstillingsfremgangsmåder
US7695965B2 (en) * 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
US20120021519A1 (en) * 2008-09-19 2012-01-26 Presidents And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
ES2634445T3 (es) * 2008-10-31 2017-09-27 Janssen Biotech, Inc. Diferenciación de las células madre embrionarias humanas con el linaje endocrino pancreático
US20120207744A1 (en) * 2009-03-19 2012-08-16 Mendlein John D Reprogramming compositions and methods of using the same
US8932853B2 (en) * 2009-12-29 2015-01-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for manufacturing pancreatic-hormone-producing cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102093977A (zh) * 2010-11-29 2011-06-15 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种诱导iPS细胞向心肌细胞分化的诱导因子及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《中国组织工程研究与临床康复》杂志社学术部: "关于多功能干细胞（iPS细胞）的研究", 《中国组织工程研究与临床康复》 *
LIN M ET AL.: "RNA-Seq of human neurons derived from iPS cells reveals candidate long non-coding RNAs involved in neurogenesis and neuropsychiatric disorders.", 《PLOS ONE》 *
YUYA KUNISADA ET AL.: "Small molecules induce efficient differentiation into insulin-producing cells from human induced pluripotent stem cell", 《STEM CELL RESEARCH》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111108190A (zh) * 2017-09-11 2020-05-05 诺沃挪第克公司 在体外从干细胞衍生的nkx6.1和c-肽共表达细胞的富集
CN108165531A (zh) * 2017-12-23 2018-06-15 淮北智淮科技有限公司 一种造血干细胞用的脐带血单核细胞培养方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20160208215A1 (en) 2016-07-21
EP3039122B1 (en) 2019-07-17
EP3039122A1 (en) 2016-07-06
CN105683361B (zh) 2021-04-02
US20200002670A1 (en) 2020-01-02
DK3039122T3 (da) 2019-09-30
JP2016528908A (ja) 2016-09-23
JP6636427B2 (ja) 2020-01-29
WO2015028614A1 (en) 2015-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105683361A (zh) 使用小分子从人多能干细胞产生内分泌祖细胞
JP7490035B2 (ja) 多能性幹細胞の膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）および内分泌細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化
CN103952372B (zh) 人胚胎干细胞的分化
CN102159703B (zh) 多能干细胞的分化
CN101952415B (zh) 人胚胎干细胞的分化
JP6469047B2 (ja) ヒト胚性幹細胞の分化
CN101878298B (zh) 人胚胎干细胞的分化
KR102058901B1 (ko) 인간 배아 줄기 세포의 분화
KR102025158B1 (ko) 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 계통으로의 분화
CN103052393B (zh) 用胰腺内分泌前体细胞治疗糖尿病
CN102171330B (zh) 多能干细胞的分化
CN107058389A (zh) 多能干细胞
CN104903440A (zh) 使用小分子从多能干细胞产生胰内胚层
CN105176919A (zh) 人胚胎干细胞的分化
Southard et al. Generation and selection of pluripotent stem cells for robust differentiation to insulin-secreting cells capable of reversing diabetes in rodents
Bose et al. In vitro differentiation of pluripotent stem cells into functional β islets under 2D and 3D culture conditions and in vivo preclinical validation of 3D islets
CN113728090B (zh) 从干细胞衍生的定形内胚层生成胰腺内胚层
WO2014129628A1 (ja) 多能性幹細胞から膵ランゲルハンス島を製造する方法
ES2746232T3 (es) Generación de células progenitoras endocrinas a partir de células madre pluripotentes humanas mediante el uso de moléculas pequeñas
Jaramillo Recapitulating pancreatic development in inducing in-vitro human embryonic stem cell differentiation

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant