ES2746232T3 - Generación de células progenitoras endocrinas a partir de células madre pluripotentes humanas mediante el uso de moléculas pequeñas - Google Patents

Abstract

Un método para obtener células progenitoras endocrinas dobles positivas a NGN3/NKX2.2, en donde una población de células que comprende células del endodermo pancreático se expone simultáneamente en un medio basal, a: a) un inhibidor del receptor TGF-ß tipo I, b) un antagonista de BMP, en donde el antagonista de BMP es nogina, c) un activador de adenilato ciclasa, y d) nicotinamida.

Description

DESCRIPCIÓN

Generación de células progenitoras endocrinas a partir de células madre pluripotentes humanas mediante el uso de moléculas pequeñas

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos para generar células progenitoras endocrinas a partir de células madre pluripotentes humanas, tales como células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas. Antecedentes de la invención

El trasplante de células beta proporciona potencialmente la cura final para la diabetes tipo I. Sin embargo, la limitada disponibilidad de las células beta donantes limita el uso de este tratamiento como una terapia clínica.

Las células madre pluripotentes (PS) pueden proliferar infinitamente y diferenciarse en muchos tipos celulares; por lo tanto, las células PS son una fuente prometedora de células beta. Sin embargo, antes de que las células PS puedan usarse para tratar la diabetes, necesitan diferenciarse de manera eficiente y reproducible en células beta pancreáticas. Durante el desarrollo embrionario de vertebrado, una célula pluripotente da lugar a las tres capas germinales; ectodermo, mesodermo y endodermo.

La inducción del endodermo definitivo (DE) es la primera etapa hacia la formación de los tejidos derivados del endodermo, tales como tejido pancreático. La generación del endodermo pancreático (PE) a partir de células DE es necesaria para la generación de células beta productoras de insulina. Las células de PE con potencial de convertirse en progenitores endocrinos (EP) se caracterizan por la coexpresión de dos factores de transcripción importantes, PDX1 y NKX6.1.

Paso a paso in vitro se han establecido protocolos de diferenciación para generar células pancreáticas a partir de células PS.

Estos protocolos generalmente mimetizan los eventos principales del desarrollo pancreático, que incluye varias etapas tales como la formación del DE, el intestino primitivo, el intestino posterior, PE, EP y finalmente las células beta pancreáticas completamente diferenciadas.

Un protocolo para obtener células pancreáticas (similares) a partir de células madre embrionarias humanas (hES) y células madre pluripotentes inducidas (iPS) se ejemplifica por los protocolos descritos en varios artículos científicos (Aoi y otros 2008; D'Amour y otros 2006; Jiang y otros 2007; Kroon y otros 2008; Takahashi y otros 2007; Takahashi & Yamanaka 2006; y Wernig y otros 2007)).

Hasta la fecha, se ha logrado una eficiente diferenciación DE de las células hES mediante el tratamiento con activina A y Wnt. Las células DE pueden diferenciarse adicionalmente en células de PE mediante el uso de ácido retinoico (RA) (Cai y otros. 2010; D'Amour y otros. 2006) e inhibición de BMP (Kunisada y otros 2012; Schulz y otros2012; Zhang y otros (2009).

Después de la generación de células PE la siguiente etapa en la vía de generar células beta pancreáticas es generar células EP que expresan los marcadores NGN3 y NKX2.2.

Nostro y otros (2012) y Kunisada y otros (2011) describen métodos para diferenciar de PE a EP.

Sin embargo, existe una necesidad de un método más eficiente para diferenciar de PE a EP.

Breve descripción de la invención

La presente invención proporciona métodos mejorados para diferenciar endodermo pancreático (PE) en células progenitoras endocrinas (EP) mediante la combinación de características de protocolos conocidos lo que aumenta de esta manera el porcentaje de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2. Mediante la adición de moléculas pequeñas al método mencionado anteriormente dicho porcentaje puede aumentarse adicionalmente. Ciertas combinaciones de moléculas pequeñas permiten un aumento ventajoso adicional en el porcentaje de dobles positivos a NGN3/NKX2.2.

La presente descripción se refiere además a células EP obtenibles por los métodos de la presente invención.

La presente descripción se refiere además al uso médico de dichas células entre otros en el tratamiento de la diabetes tipo I.

La presente invención toma un enfoque alternativo para mejorar la eficiencia de la diferenciación de células PE humanas hacia células beta completamente diferenciadas, al proporcionar un método para aumentar el porcentaje de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2, una marca distintiva de las células EP comprometidas a un destino de célula endocrina.

En una modalidad la invención proporciona una población precursora de células beta pancreáticas mejorada, es decir, células EP con porcentaje aumentado de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2.

En otra modalidad la presente invención proporciona una población de células EP más homogénea, que es importante para el desarrollo posterior de estas células hacia células beta pancreáticas completamente diferenciadas.

En otra modalidad, la presente invención proporciona, además, una población EP más sincronizada para llegar a la siguiente etapa de diferenciación, específicamente las células beta completamente diferenciadas sensibles a glucosa.

En un aspecto la presente invención proporciona un método para obtener células progenitoras endocrinas dobles positivas a NGN3/NKX2.2 en donde una población de células que comprende células del endodermo pancreático se expone a un inhibidor del receptor TGF-p tipo I y un antagonista de BMP y un activador de adenilato ciclasa y nicotinamida en medio basal.

En un aspecto la presente invención proporciona un método para obtener células progenitoras endocrinas dobles positivas a NGN3/NKX2.2 en donde una población de células que comprende células del endodermo pancreático se expone a gefitinib, inhibidor de JNK VIII y DAPT.

La invención puede resolver, además, otros problemas que resultarán evidentes a partir de la descripción de las modalidades ilustrativas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el efecto ventajoso de un método de la presente invención en la inducción de ARNm de NGN3. La Figura 2 muestra el efecto ventajoso de un método de la presente invención en la generación de células progenitoras endocrinas dobles positivas a NGN3/NKX2.2.

La Figura 3 muestra los efectos individuales y los efectos ventajosos de combinar las moléculas pequeñas de la presente invención.

La Figura 4 muestra los efectos individuales y los efectos ventajosos de combinar varias moléculas pequeñas de la presente invención.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a métodos para generar células progenitoras endocrinas (EP) a partir de células madre pluripotentes, tales como células madre embrionarias (ES) y células madre pluripotentes inducidas de origen humano.

Las células madre son células no diferenciadas definidas por su capacidad al nivel de célula única tanto de autorrenovarse como de diferenciarse para producir células de la progenie, que incluyen progenitores autorrenovables, progenitores no renovables y células diferenciadas de manera terminal. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de diversos linajes celulares de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como también para dar lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante.

Las células madre se clasifican por su potencial de desarrollo como: (1) totipotente, que significa ser capaz de dar lugar a todos los tipos de células embrionarias y extraembrionarias; (2) pluripotentes, que significa ser capaces de dar lugar a todos los tipos de células embrionarias; (3) multipotentes, que significa ser capaz de dar lugar a un subconjunto de linajes celulares, pero todos dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC) pueden producir la progenie que incluye HSC (autorrenovables), progenitores restringidos a las células de la sangre y todos los tipos y elementos celulares (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre); (4) oligopotentes, que significa ser capaz de dar lugar a un subconjunto más restringido de linajes celulares que las células madre multipotentes; y (5) unipotente, que significa ser capaz de dar lugar a un linaje de células único (por ejemplo, células madre espermatogénicas).

Las células pancreáticas maduras o diferenciadas no proliferan y sí secretan altos niveles de hormonas endocrinas pancreáticas o enzimas digestivas. Por ejemplo, las células beta completamente diferenciadas secretan insulina a altos niveles en respuesta a la glucosa. Los cambios en la interacción celular y la maduración se producen a medida que las células pierden marcadores de células no diferenciadas o ganan marcadores de células diferenciadas. La pérdida o ganancia de un marcador único puede indicar que una célula "maduró o se diferenció completamente”. La presente invención toma un enfoque alternativo para mejorar la eficiencia de la diferenciación de células PE humanas hacia células beta completamente diferenciadas, al proporcionar un método para mejorar el porcentaje de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2, que son marcadores para una población de células Ep , una de las etapas celulares necesarias para llegar a una célula beta pancreática que produce insulina.

Además, la presente invención proporciona una población de células EP más homogénea y sincronizada, que es importante para el desarrollo posterior de estas células hacia la célula beta que produce insulina.

La presente invención puede resolver, además, otros problemas que resultarán evidentes a partir de la descripción de las modalidades ilustrativas.

Como se usa en la presente descripción, "células productoras de insulina" se refiere a células que producen y almacenan o secretan cantidades detectables de insulina en respuesta a glucosa. Las "células productoras de insulina" pueden ser células individuales o colecciones de células.

Como se usa en la presente descripción el término “células beta” se refiere a células que residen dentro de grupos de células pequeñas denominados islotes de Langerhans en el páncreas. Las células beta responden a niveles altos de glucosa en sangre mediante la secreción de la hormona peptídica insulina, que actúa sobre otros tejidos para promover la captación de glucosa de la sangre, por ejemplo en el hígado donde promueve el almacenamiento de energía por síntesis de glucógeno.

Como se usa en la presente descripción, "diferenciar" o "diferenciación" se refiere a un proceso donde las células progresan de un estado no diferenciado a un estado diferenciado, de un estado inmaduro a un estado menos inmaduro o de un estado inmaduro a un estado maduro. Por ejemplo, las células pancreáticas embrionarias tempranas no diferenciadas son capaces de proliferar y expresar marcadores característicos, como PDX1, NKX6.1 y PTF1a.

El término "factor de diferenciación" se refiere a un compuesto añadido a las células precursoras pancreáticas o ES para mejorar su diferenciación a células EP. Los factores de diferenciación también pueden conducir una diferenciación adicional a células beta maduras.

Los factores de diferenciación ilustrativos incluyen factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento de queratinocitos, exendina-4, factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento similar a insulina 1, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, péptido similar a glucagón 1, indolactama V, IDE1&2 y ácido retinoico.

En algunos aspectos la diferenciación de las células comprende cultivar las células en un medio que comprende uno o más factores de diferenciación.

En una modalidad, la invención se refiere a un método para proporcionar función endocrina pancreática a un mamífero deficiente en su producción de al menos una hormona pancreática, el método que comprende las etapas de implantar células obtenidas por cualquiera de los métodos de la invención en una cantidad suficiente para producir una cantidad medible de dicha al menos una hormona pancreática en dicho mamífero.

En una modalidad, una población de células EP preparada de acuerdo con los métodos de la presente invención puede usarse en el tratamiento de la diabetes, por ejemplo, mediante la implantación en un paciente que necesita tal tratamiento.

Como se usa en la presente descripción, el término "células madre pluripotentes humanas (hPS)” se refiere a células que pueden derivarse de cualquier fuente y que son capaces, en condiciones apropiadas, de producir progenie humana de diferentes tipos de células que son derivadas de las 3 capas germinales (endodermo, mesodermo, y ectodermo). Las células hPS pueden tener la capacidad de formar un teratoma en ratones SCID de 8-12 semanas de edad y/o la capacidad para formar células identificables de las tres capas germinales en cultivo de tejidos.

Los diversos métodos y otras modalidades descritas en la presente descripción pueden requerir o utilizar células hPS a partir de una variedad de fuentes.

Adicional o alternativamente, las células hPS adecuadas pueden obtenerse a partir de líneas celulares establecidas y/o células madre pluripotentes humanas inducidas (hiPS).

Como se usa en la presente descripción, el término “células hiPS” se refiere a células madre pluripotentes humanas inducidas. Se concibe además que cualquier célula madre pluripotente humana a su vez puede usarse en la presente invención, que incluye células adultas diferenciadas que se reprograman a células pluripotentes por ejemplo, el tratamiento de células de adultos con determinados factores de transcripción, tales como OCT4, SOX2, NANOG, y LIN28.

Como se usa en la presente descripción, una “población de células EP” es una población de precursores de células beta pancreáticas en la que al menos 5 % de la población de células son dobles positivos a NGN3/NKX2.2.

Como se usa en la presente descripción, el término "PDX1" se refiere a un factor de transcripción del homeodominio implicado en el desarrollo del páncreas. "NGN3" como se usa en la presente descripción, es un miembro de la familia de neurogenina de los factores básicos de transcripción de bucle-hélice-bucle. "NKX2.2" y "NKX6.1" como se usa en la presente descripción son miembros de la familia del factor de transcripción NKX. "Islet-1" o "Isl-1", como se usa en la presente descripción, es un miembro de la familia de LIM/homeodominio de factores de transcripción y se expresa en el páncreas en desarrollo. "MafA" como se usa en la presente descripción es un factor de transcripción expresado en el páncreas, y controla la expresión de genes implicados en la biosíntesis y secreción de insulina. En una modalidad, la presente invención proporciona un método alternativo y más eficiente en comparación con el conocido en la técnica para diferenciar células PE a células EP, lo que produce de esta manera una población EP más homogénea.

Una población EP homogénea es un punto de partida conveniente para la diferenciación adicional en células beta completamente diferenciadas.

En una modalidad, las células PE se tratan de tal manera que el porcentaje de dobles positivos a NGN3/NKX2.2 en la población resultante es mayor que el que se logra mediante el uso de protocolos conocidos para diferenciar una población de células PE a población de células EP.

En una modalidad mediante el uso del método de la presente descripción se observa una regulación al alza de 600 veces del ARNm de NGN3 en comparación con el tratamiento con medios basales.

En una modalidad, los métodos conocidos para diferenciar PE a células EP se usan para mejorar el porcentaje de dobles positivos a NGN3/NKX2.2 en la población de células EP resultante.

En una modalidad, los métodos conocidos para diferenciar PE a células EP se usan para mejorar sinérgicamente el porcentaje de dobles positivos a NGN3/NKX2.2 en la población de células EP resultante.

En una modalidad, los elementos de los métodos conocidos para diferenciar PE a células EP se usan para mejorar sinérgicamente el porcentaje de dobles positivos a NGN3/NKX2.2 en la población de células EP resultante.

En una modalidad, el método de acuerdo con el ejemplo de referencia 2 produce una población de células progenitoras endocrinas que son al menos 8 % del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2.

En una modalidad, el método de acuerdo con el ejemplo de referencia 2 produce una población de células progenitoras endocrinas que son al menos 9 % del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2.

En una modalidad, el método de acuerdo con el ejemplo de referencia 2 produce una población de células progenitoras endocrinas que son al menos 10 % del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2.

En una modalidad, el método de acuerdo con el ejemplo de referencia 2 produce una población de células progenitoras endocrinas que son al menos 15 % del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2.

En una modalidad, el método de acuerdo con la presente invención produce una población de células progenitoras endocrinas que son de 15-100 % del efecto doble positivo a NGN3/ⁿ K^x 2.2.

En una modalidad las moléculas pequeñas se usan para aumentar el porcentaje de dobles positivas a NGN3/NKX2.2 en un proceso de diferenciación PE a EP.

En una modalidad las moléculas pequeñas se usan en combinación para aumentar el porcentaje de dobles positivas a NGN3/NKX2.2 en un proceso de diferenciación PE a EP.

En una modalidad las moléculas pequeñas se usan en combinación para aumentar sinérgicamente el porcentaje de dobles positivas a NGN3/NKX2.2 en un proceso de diferenciación PE a EP.

En las modalidades a continuación se enumeran una cantidad de moléculas pequeñas y concentraciones que son útiles para promover la diferenciación de PE a EP.

En una modalidad, la molécula pequeña encontrada como útil para promover la diferenciación de PE a EP es gefitinib. En una modalidad, el gefitinib se usa en una concentración de 0,1-100 pM. En una modalidad, el gefitinib se usa en una concentración de 1-10 pM. En una modalidad, el gefitinib se usa en una concentración de 5 pM.

En una modalidad, la molécula pequeña encontrada como útil para promover la diferenciación de PE a EP es inhibidor de JNK VIII. En una modalidad, el inhibidor de JNK VIII se usa a una concentración de 0,1-100 pM. En una modalidad, el inhibidor de JNK VIII se usa en una concentración de 1-10 pM. En una modalidad, el inhibidor de JNK VIII se usa en una concentración de 10 pM.

En una modalidad, la molécula pequeña encontrada como útil para promover la diferenciación de PE a EP es el inhibidor de DNA-PK V. En una modalidad, el inhibidor de DNA-PK V se usa en una concentración de 0,1-100 pM. En una modalidad, el inhibidor de DNA-PK V se usa a una concentración de 1-10 pM. En una modalidad, el inhibidor de DNA-PK V se usa a una concentración de 5 pM.

En una modalidad, la molécula pequeña encontrada como útil para promover la diferenciación de PE a EP es DAPT. En una modalidad, el DAPT se usa en una concentración de 0,1-100 pM.

En una modalidad, el DAPT se usa en una concentración de 1-10 pM. En una modalidad, el DAPT se usa en una concentración de 2,5 pM.

En una modalidad, las moléculas pequeñas encontradas como útiles para promover la diferenciación de PE a EP es una combinación de gefitinib e inhibidor de JNK VIII. En una modalidad, el inhibidor de JNK VIII y gefitinib se usan en una concentración de 0,1-100 pM. En una modalidad, el inhibidor de JNK VIII y gefitinib se usan en una concentración de 1-10 pM. En una modalidad, el inhibidor de JNK VIII y gefitinib se usan en una concentración de 5 y 10 pM, respectivamente.

En una modalidad la concentración de gefitinib es aproximadamente dos veces mayor que la del inhibidor de JNK VIII.

En una modalidad, se añaden una o más moléculas pequeñas además del inhibidor de JNK VIII y gefitinib.

En una modalidad, DAPT se usa junto con gefitinib y el inhibidor de JNK VIII en cualquiera de las concentraciones de DAPT mencionadas anteriormente tal como 2,5 pM.

En una modalidad, el inhibidor de DNA-PK V se usa junto con gefitinib y el inhibidor de JNK VIII en cualquiera de las concentraciones de inhibidor de DNA-PK mencionadas anteriormente tal como 5 pM.

En una modalidad, gefitinib, el inhibidor de JNK VIII y el inhibidor de DNA-PK V se usan en combinación a una concentración individual de 0,1-100 pM. En una modalidad, gefitinib, el inhibidor de JNK VIII y el inhibidor de DNA-PK V se usan en combinación a una concentración individual de 1-10 pM.

En una modalidad se usa gefitinib 1-100 pM, 1-100 pM de inhibidor JNK VIII, 0,5-50 pM de DAPT y 1-100 pM de inhibidor de DNA-PK V. En una modalidad se usa en combinación gefitinib 1-10 pM, 5-20 pM de inhibidor JNK VIII, 1-10 pM de DAPT y 1-10 pM de inhibidor de DNA-PK V. En una modalidad se usan en combinación gefitinib 5 pM, 10 pM de inhibidor Jn K VIII, 5 pM de inhibidor de DNA-PK V.

En una modalidad, DAPT, inhibidor de DNA-PK V, gefitinib y el inhibidor de JNK VIII se usan en combinación en cualquiera de las concentraciones mencionadas anteriormente para los compuestos respectivos.

En una modalidad, gefitinib, el inhibidor de JNK VIII, DAPT y el inhibidor de DNA-PK V se usan en combinación a una concentración individual de 0,1-100 pM. En una modalidad, gefitinib, el inhibidor de JNK VIII, DAPT y el inhibidor de DNA-PK V se usan en combinación a una concentración individual de 1-10 pM. En una modalidad gefitinib 5 pM, 10 pM de inhibidor JNK VIII, 2,5 pM de DAPT y 5 pM de inhibidor de DNA-PK V se usan en combinación.

En una modalidad uno o más de los siguientes compuestos se usa para diferenciar PE a EP; Rockout, BPIQ-I, PD174265, inhibidor de p38 III, PD169316, DMBI, inhibidor de Syk, PD98059, inhibidor de DNA-PK V, inhibidor de TGF-p RI III, L-685,458, compuesto E. En una modalidad se usa Rockout a una concentración de 5-10 pM. En una modalidad, el inhibidor de p38 III se usa a una concentración de 5-10 pM. En una modalidad, PD169316 se usa a una concentración de 1-5 pM.

En una modalidad, DMBI se usa a una concentración de 1-50 pM. En una modalidad, DMBI se usa a una concentración de 10 pM.

En una modalidad, el inhibidor de Syk se usa a una concentración de 1-50 pM. En una modalidad, el inhibidor de Syk se usa a una concentración de 1 pM.

En una modalidad, BPIQ-I se usa a una concentración de 0,1-100 pM.

En una modalidad, BPIQ-I se usa a una concentración de 1-50 pM. En una modalidad, BPIQ-I se usa a una concentración de 10 pM.

En una modalidad, PD174265 se usa a una concentración de 0,1-100 pM. En una modalidad, PD174265 se usa a una concentración de 1-50 pM. En una modalidad, PD174265 se usa a una concentración de 10 pM. En una modalidad, PD174265 se usa a una concentración de 1 pM.

En una modalidad, el inhibidor de DNA-PK V se usa a una concentración de 0,1-100 pM. En una modalidad, el inhibidor de DNA-PK V se usa a una concentración de 1-10 pM. En una modalidad, el inhibidor de DNA-PK V se usa a una concentración de 5 pM.

En una modalidad el inhibidor de TGF-p RI III se usa a una concentración de 0,1-100 pM.

En una modalidad el inhibidor de TGF-p RI III se usa a una concentración de 1-10 pM. En una modalidad el inhibidor de TGF-p RI III se usa a una concentración de 5 pM.

En una modalidad L6 se usa a una concentración de 0,1-100 pM. En una modalidad L6 se usa a una concentración de 1-10 pM. En una modalidad L6 se usa a una concentración de 5 pM.

En una modalidad, el Compuesto E se usa a una concentración de 50 nM - 5 pM. En una modalidad, el Compuesto E se usa a una concentración de 100 nM - 1 pM. En una modalidad, el Compuesto E se usa a una concentración de 500 nM.

En una modalidad, las células EP que se pueden obtener por el método de acuerdo con la invención son células productoras de insulina, opcionalmente junto con células diferenciadas hacia células productoras de glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático, y/o ghrelina.

En una modalidad, la población celular que comprende las células EP se obtiene a partir de una población de células somáticas. En algunos aspectos, la población de células somáticas se ha inducido para desdiferenciarse en una célula madre tipo embrionaria (es decir, pluripotente). Tales células desdiferenciadas se denominan, además, células madre pluripotentes inducidas (iPS).

En una modalidad, la población celular que comprende las células EP se obtiene a su vez a partir de células madre embrionarias.

En una modalidad, la población celular que comprende las células EP se obtiene a su vez a partir de células hiPS. En una modalidad, la diferenciación tiene lugar en cuerpos embrionarios y/o en cultivos celulares en monocapa o una combinación de estos.

Los ejemplos de referencia del efecto de usar dichas moléculas pequeñas para aumentar la cantidad de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2 se muestran en los ejemplos del presente documento y las Figuras 3 y 4.

En una modalidad las células que se someten a diferenciación hacia células progenitoras endocrinas dobles positivas a NGN3/NKX2.2 se tratan con dichas moléculas pequeñas.

En una modalidad, el método de acuerdo con el ejemplo de referencia 2, con la adición de dichas moléculas pequeñas, produce una población de células progenitoras endocrinas que son de 150-400 % del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2.

En una modalidad, el método de acuerdo con el ejemplo de referencia 2, con la adición de dichas moléculas pequeñas, produce una población de células progenitoras endocrinas que son de 150-300 % del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2.

En una modalidad, el método de acuerdo con el ejemplo de referencia 2, con la adición de dichas moléculas pequeñas, produce una población de células progenitoras endocrinas que son de 150-300 % del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2.

En una modalidad, el método de acuerdo con el ejemplo de referencia 2, con la adición de dichas moléculas pequeñas, produce una población de células progenitoras endocrinas que son al menos 150 % del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2.

En una modalidad, el método de acuerdo con el ejemplo de referencia 2, con la adición de dichas moléculas pequeñas, produce una población de células progenitoras endocrinas que son al menos 200 % del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2.

En una modalidad, el método de acuerdo con el ejemplo de referencia 2, con la adición de dichas moléculas pequeñas, produce una población de células progenitoras endocrinas que son al menos 300 % del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2.

En una modalidad, el método de acuerdo con el ejemplo de referencia 2, con la adición de dichas moléculas pequeñas, produce una población de células progenitoras endocrinas que son hasta 400 % del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2.

En una modalidad, el método de acuerdo con el ejemplo de referencia 2, con la adición de dichas moléculas pequeñas, la presente descripción produce una población de células progenitoras endocrinas que son hasta 400 % del efecto doble positivo a n Gn3/NKX2.2.

En una modalidad las células que se someten a diferenciación hacia células progenitoras endocrinas dobles positivas a NGN3/NKX2.2 se exponen a un inhibidor del receptor TGF-p tipo I, un antagonista de BMP, un activador de adenilato ciclasa y nicotinamida en medio basal antes de tratarse con dichas moléculas pequeñas.

En una modalidad el inhibidor del receptor TGF-p tipo I es SB431542 y el antagonista de BMP es nogina.

En una modalidad el activador de adenilato ciclasa es forskolina.

Modalidades adicionales de la invención:

Modalidad 1: Un método para obtener células progenitoras endocrinas dobles positivas a NGN3/NKX2.2 en donde una población de células que comprende células endodérmicas pancreáticas se expone a

un inhibidor del receptor TGF-p tipo I, y

un antagonista de BMP, y

un activador de adenilato ciclasa, y

nicotinamida

en medio basal.

Modalidad 2: Un método de acuerdo con la modalidad 1 en donde el inhibidor del receptor TGF-p tipo I es SB431542 y el antagonista de BMP es nogina.

Modalidad 3: Un método de acuerdo con las modalidades 1 o 2 en donde el activador de adenilato ciclasa es forskolina.

Modalidad 4: Un método de acuerdo con las modalidades 1-3 en donde el medio basal es RPMI1640.

Modalidad 5: El método de acuerdo con las modalidades 1-4 en donde las células progenitoras endocrinas se exponen además al inhibidor de DNA-PK V, gefitinib, inhibidor de JNK VIII o DAPT o cualquier combinación de dichas moléculas.

Modalidad 6: El método de acuerdo con las modalidades 1-4 en donde se combinan gefitinib, el inhibidor de JNK VIII y el inhibidor de DNA-PK V.

Modalidad 7: El método de acuerdo con las modalidades 1-4 en donde se combinan gefitinib, inhibidor de JNK VIII y DAPT.

Modalidad 8: El método de acuerdo con las modalidades 1-4 en donde se combinan gefitinib, el inhibidor de JNK VIII y el inhibidor de DNA-PK V.

Modalidad 9: El método de acuerdo con las modalidades 1-4 en donde se usa gefitinib 1-100 pM, el inhibidor de JNK VIII 1-100 pM, DAPT 0,5-50 pM y el inhibidor de DNA-PK V 1-100 pM.

Modalidad 10: El método de acuerdo con la modalidad 9 en donde se usa gefitinib 1-10 pM, el inhibidor de JNK VIII 5-20 pM, DAPT 1-10 pM y el inhibidor de DNA-PK V 1-10 pM.

Modalidad 11: Las células obtenidas de acuerdo con el método de las modalidades 1-8.

Modalidad 12: Las células obtenidas de acuerdo con las modalidades 1-8 para usar en medicina.

Modalidad 13: Las células obtenidas de acuerdo con las modalidades 1-8 para usar en el tratamiento de la diabetes. Modalidad 14: Uso de la célula obtenida de acuerdo con los métodos de las modalidades 1-8 para el tratamiento de la diabetes.

Modalidad 15: Un método para obtener células progenitoras endocrinas dobles positivas a NGN3/NKX2.2 en donde una población de células que comprende células endodérmicas pancreáticas se expone a gefitinib, inhibidor de JNK VIII y DAPT.

Sorprendentemente, en relación con la diferenciación de PE a células EP, puede lograrse un efecto ventajoso mediante la combinación de etapas de dos protocolos publicados conocidos por diferenciar células de células PE a células EP. También se ha demostrado sorprendentemente que determinadas moléculas pequeñas y combinaciones de estas pueden impulsar además la diferenciación de PE a Ep y así aumentar el rendimiento de las células EP (que conduce a un porcentaje mayor de EP en la población de células preparada mediante el uso de los métodos de la presente invención).

EJEMPLOS

Lista de abreviaturas

DAPT: Difluorofenilacetil)-alanil-fenilglicina-t-butil-éster

DMBI: (Z)-3-[4-(Dimetilamino)bencilidenil]indolin-2-ona

CompE: Compuesto E

DE: Endodermo definitivo

DEF-CS: Sistema de cultivo DEF

DNA-Pki: Inhibidor de DNA-PK V

EP: Progenitor endocrino

hBS: Tronco derivado de blastocisto humano

hES: Tronco embrionario humano

hESC: Célula madre embrionaria humana

hiPS: Tronco Pluripotente humano inducido

HSC: Célula madre hematopoyética

iPS: Tronco Pluripotente inducido

iPSC: Célula Madre Pluripotente inducida

KOSR: Reemplazo de suero KnockOut™

PE: Endodermo pancreático

PEST: Penicilina Estreptomicina

SC: Célula madre

Rockout: Inhibidor de quinasa Rho III

Ejemplo de Referencia 1: Preparación de la población de células PE

Las células hES (DEF-hES SA121) o las células iPS (DEF-ChiPS2) se cultivaron en medio DEF (Cellectis) suplementado con 30 ng/ml de bFGF (Peprotech #100-18B) y 10 ng/ml de nogina (Peprotech #120-10C). El medio DEF o el medio/sistema DEF-CS es un medio de cultivo equilibrado definido para el establecimiento y propagación de las células madre pluripotentes humanas, medio/sistema DEF-CS.

Las células hES se diferenciaron en DE en matraces T75 mediante el uso del siguiente protocolo: Los cultivos confluentes se lavaron una vez en RPMI1640 (Gibco #61870) y se trataron con CHIR99021 3 pM (Axon#1386) en RPMI1640, PEST al 0,1 % (Gibco #15140). Después de 24 horas las células se lavaron con Rp Mi1640, PEST al 0,1 % y se trataron con 100 ng/ml de Activina A (Peprotech #120-14E) en RPMI1640, PEST al 0,1 %. 24 horas más tarde, se añadió 2 % de B27 (Invitrogen #17504-044) al medio de Activina A durante 2 días con cambio diario de medio. Las células se mantuvieron a 37°C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada durante la diferenciación. Las células DE se tripsinizaron mediante el uso de Tryple Select (Invitrogen #12563-029) y se sembraron nuevamente como células únicas en RPMI1640 suplementado con 100 ng/ml de Activina A , B27 al 2 % y PEST al 0,1 % en múltiples placas ópticas de 96 pocillos a 200 K/cm2 (Corning#3340).

Se permitió que las células DE se adhirieran y diferenciaran en células PE mediante el uso del siguiente protocolo: Los cultivos D^e se lavaron una vez y se trataron con LDN-19318950 nM (Stemgent#04-0074) en RPMI 1640, PEST al 0,1 %, KOSR al 12 % (Gibco # 10828). Después de cuatro días las células se lavaron con RPMI1640 y se diferenciaron durante siete días con AM580 1 pM (Enzo#BML-GR104), inhibidor de JNK II 10 pM (Calbiochem#420119), LDN-193189 50 nM y bFGF 64 ng/ml en RPMI1640, PEST al 0,1 %, KOSR al 12 %. Las células se mantuvieron a 37°C y 5% de CO² en una incubadora humidificada durante la diferenciación con cambio diario del medio.

Ejemplo de Referencia 2: Diferenciación de PE a EP mediante el uso de un protocolo de combinación Las células PE obtenidas de acuerdo con el ejemplo de referencia 1 se diferenciaron durante tres días con SB43115426 |jM (Sigma núm. S4317), nogina 50 ng/ml (Peprotech #120-10c), forskolina 10 j M (Sigma #F6886) y nicotinamida 10 mM (Calbiochem #481907) en RPMI1640 PEST al 0,1 % y B27 al 2 %. Las células se mantuvieron a 37°C y 5% de CO² en una incubadora humidificada durante la diferenciación con cambio diario del medio.

Ejemplo de Referencia 3: Comparación del método de acuerdo con el ejemplo de referencia 2 con protocolos conocidos

El método de acuerdo con el ejemplo de referencia 2 se comparó con los métodos descritos en Kunisada y otros (2011) (protocolo K) y Nostro y otros (2012) (protocolo N), respectivamente.

Protocolo K

Las células PE obtenidas de acuerdo con el ejemplo de referencia 1 se diferenciaron durante tres días con forskolina 10 j M (Sigma #F6886) y nicotinamida 10 mM (Calbiochem #481907) en RPMI1640, PEST al 0,1 % y B27 al 2 %. Las células se mantuvieron a 37°C y 5% de CO² en una incubadora humidificada durante la diferenciación con cambio diario del medio.

Protocolo N

Las células PE obtenidas de acuerdo con el ejemplo de referencia 1 se diferenciaron durante tres días con SB43115426 ^j M (Sigma núm. S4317), nogina 50 ng/ml (Peprotech #120-10c) en RPMI1640, PEST al 0,1 % y B27 al 2 %. Las células se mantuvieron a 37°C y 5% de CO² en una incubadora humidificada durante la diferenciación con cambio diario del medio.

Los resultados se obtuvieron de la siguiente manera:

Los niveles relativos de expresión génica para el marcador progenitor endocrino NGN3 en respuesta a 3 días de diferenciación EP de acuerdo con el protocolo K y el protocolo N y el protocolo combinado K&N (ejemplo de referencia 2). La expresión génica se muestra en relación con la presente en cultivos diferenciados en el medio basal, que se estableció en 1.

Las células se cultivaron en el día 4 EP y el ARN total se extrajo mediante el uso del kit RNeasy Plus Mini (Qiagen#74134) y las concentraciones de ARN se midieron con el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific). El ARN se transcribió de manera inversa en ADNc mediante el uso del kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada experimento usó una cantidad fija de ARN (500 ng) para la síntesis de ADNc. La mezcla de reacción se incubó durante 5 minutos a 25 °C, 30 min a 42 °C y 5 min a 85 °C.

Las reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativas en tiempo real (qPCR) se corrieron por duplicado mediante el uso de 1/100 del ADNc por reacción, los ensayos de expresión génica Taqman (conjuntos de cebadores inventariados contra NGN3 o el gen constitutivo GAPDH) y la mezcla maestra de PCR universal rápida Taqman en reacciones de 10 jl. Se realizó qPCR en un sistema de qPCR Mx3005P (Agilent) mediante el uso de un programa de dos etapas rápidas: Desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 minutos seguido por 40 ciclos a 95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 20 segundos. Los datos primarios se exportaron del programa MxPro y se analizaron mediante el uso de Microsoft Excel y GraphPad Prism. La cuantificación relativa de la expresión génica se realizó mediante el uso del método del ciclo umbral comparativo (DDCt) (Schmittgen y Livak, 2008) mediante el uso de GAPDH como referencia interna.

Los resultados en la forma de expresión relativa de NGN3 se muestran en la tabla 1 a continuación y en la figura 1. Los resultados muestran que cuando se combinan dos protocolos individuales (protocolo K y protocolo N) para producir células progenitoras endocrinas, podemos mejorar sinérgicamente el nivel de expresión de ARNm de NGN3 en la población de células EP.

Tabla 1: Expresión relativa de NGN3

Después de tres días de diferenciación EP, en el día 4 EP, los medios se aspiraron seguido por la fijación de las células a temperatura ambiente durante 30 min con paraformaldehído al 4 % (VWR, 97.131.000). Las células se lavaron con PBS y se permeabilizaron con 0,5 % de Triton X-100 (Sigma, 9002-93-1) durante 10 min, se lavaron y se bloquearon en amortiguador de TNB al 0,5 % (Perkin Elmer) durante 30 min a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios, anti-NGN3 de oveja (R&D systems #AF3444) y anti-NKX2.2 de conejo (Sigma #HPA003468) se diluyeron 1:1000 y 1:500, respectivamente, en 0,1 % de Triton X-100 en PBS y se añadieron a cada pocillo para incubación durante toda la noche a 4 °C. Las células se lavaron tres veces con PBS. DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, Applichem, A4099.0010) y los anticuerpos secundarios, Alexa Fluor 488 de burro anti-cabra y Alexa Fluor 594 de burro anti-conejo (ambos Invitrogen) se diluyeron 1:1000 en 0,1 % de Triton X-100 en PBS y se añadieron a cada pocillo durante 45 min. Las células se lavaron cinco veces y se dejaron en 200 pl de PBS para la obtención de las imágenes.

La obtención de imágenes se realizó mediante el uso del Analizador InCell 2000 (GE Healthcare). Se capturaron 4 campos por pocillo con objetivo de 10x. El número total de células basado en el conteo por tinción con DAPI y el número de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2 se determinó mediante el uso de InCell Developer Toolbox 1.8 (GE Healthcare). La fracción de las células dobles positivas a NGN3/NKX2.2 se cuantificaron mediante el uso del programa InCell developer toolbox (GE Healthcare) y se normalizaron con respecto al protocolo combinado K&N (ejemplo de referencia 2) en cada placa y se calculó el % del efecto (% del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2 = ((S-S ^neg)/(| S^pos-S^neg |))*100). En donde S es el % de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2 para una combinación de compuestos dada, S^neg y S^pos son el % de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2 para el control negativo y el protocolo combinado K&N, respectivamente).

Los resultados en la forma de % del efecto de células dobles positivas a NGN3 / NKX2.2 se muestran a continuación en la tabla 2 y en la figura 2.

Tabla 2: % del efecto de células dobles positivas a NGN3 / NKX2.2

Los resultados muestran que cuando se combinan dos protocolos individuales (protocolo K y protocolo N) para producir células progenitoras endocrinas, podemos mejorar sinérgicamente el nivel de células dobles positivas a NGN3 / NKX2.2 en la población de células EP.

Ejemplo de Referencia 4: Diferenciación EP inducida por moléculas pequeñas

La capacidad de determinadas moléculas para inducir y aumentar la diferenciación de PE a EP se probó en las siguientes condiciones:

Se preparó una población de células EP de acuerdo con los ejemplos de referencia 1 y 2. Sin embargo, además de los reactivos usados en el ejemplo de referencia 2 las moléculas pequeñas enumeradas en la tabla 3 se añadieron durante tres días a las concentraciones especificadas en la tabla 3 a continuación en las concentraciones como se muestra.

Después de tres días de diferenciación EP, los medios se aspiraron seguido por la fijación de las células a temperatura ambiente durante 30 min con paraformaldehído al 4 % (VWR, 97.131.000). Las células se lavaron con PBS y se permeabilizaron con 0,5 % de Triton X-100 (Sigma, 9002-93-1) durante 10 min, se lavaron y se bloquearon en amortiguador de TNB al 0,5 % (Perkin Elmer) durante 30 min a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios, anti-NGN3 de oveja (R&D systems #AF3444) y anti-NKX2.2 de conejo (Sigma #HPA003468) se diluyeron 1:1000 y 1:500, respectivamente, en 0,1 % de Triton X-100 en PBS y se añadieron a cada pocillo para incubación durante toda la noche a 4 °C. Las células se lavaron tres veces con PBS. DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, Applichem, A4099.0010) y los anticuerpos secundarios, Alexa Fluor 488 de burro anti-cabra y Alexa Fluor 594 de burro anti­ conejo (ambos Invitrogen) se diluyeron 1:1000 en 0,1 % de Triton X-100 en PBS y se añadieron a cada pocillo durante 45 min. Las células se lavaron cinco veces y se dejaron en 200 |jl de PBS para la obtención de las imágenes.

La obtención de imágenes se realizó mediante el uso del Analizador InCell 2000 (GE Healthcare). Se capturaron 4 campos por pocillo con objetivo de 10x. El número total de células basado en el conteo por tinción con DAPI y el número de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2 se determinó mediante el uso de InCell Developer Toolbox 1.8 (GE Healthcare). La fracción de las células dobles positivas a NGN3/NKX2.2 se cuantificaron mediante el uso del programa InCell developer toolbox (GE Healthcare) y se normalizaron con respecto al protocolo combinado K&N en cada placa y se calculó el % del efecto (% del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2 = ((S-S^neg)/(| S^pos-S^{n e g} |))*100). En donde S es el % de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2 para una combinación de compuestos dada, S^neg y S^pos son el % de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2 para el control negativo y el protocolo combinado K&N, respectivamente). Los valores por encima del 150 % del efecto se categorizaron como aciertos.

Se ha descubierto que una cantidad de moléculas pequeñas promueven la diferenciación de células PE en células EP. Las moléculas se enumeran en la Tabla 3 a continuación.

Además, la eficiencia de este protocolo combinado, medida como células dobles positivas a NGN3/NKX2.2, puede mejorarse incluso más mediante la adición de inhibidores pequeños que se dirigen a secretasa gamma, JNK, Rho quinasa, P38MAPK, SYK, DNA-PK, PI3K, PDGFR, FGFR o EGFR.

Los resultados se muestran en la tabla 4 a continuación y en la figura 3.

Tabla 4: % del efecto de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2

Ejemplo de Referencia 5: Diferenciación PE a EP inducida por una combinación de moléculas pequeñas

La capacidad de ciertas moléculas de la Tabla 3 y combinaciones de estas para inducir y aumentar la diferenciación de PE a EP se probaron en las siguientes condiciones.

Se preparó una población de células EP de acuerdo con el ejemplo de referencia 2. Sin embargo, además de los reactivos usados en el ejemplo de referencia 2, se añadieron ciertas moléculas pequeñas enumeradas en la tabla 3 ya sea solas o en combinación durante los tres días de diferenciación EP.

Después de tres días de diferenciación EP, los medios se aspiraron seguido por la fijación de las células a temperatura ambiente durante 30 min con paraformaldehído al 4 % (VWR, 97.131.000). Las células se lavaron con PBS y se permeabilizaron con 0,5 % de Triton X-100 (Sigma, 9002-93-1) durante 10 min, se lavaron y se bloquearon en amortiguador de TNB al 0,5 % (Perkin Elmer) durante 30 min a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios, anti-NGN3 de oveja (R&D systems #AF3444) y anti-NKX2.2 de conejo (Sigma #HPA003468) se diluyeron 1:1000 y 1:500, respectivamente, en 0,1 % de Triton X-100 en PBS y se añadieron a cada pocillo para incubación durante toda la noche a 4 °C. Las células se lavaron tres veces con PBS. DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, Applichem, A4099.0010) y los anticuerpos secundarios, Alexa Fluor 488 de burro anti-cabra y Alexa Fluor 594 de burro anti­ conejo (ambos Invitrogen) se diluyeron 1:1000 en 0,1 % de Triton X-100 en PBS y se añadieron a cada pocillo durante 45 min. Las células se lavaron cinco veces y se dejaron en 200 pl de PBS para la obtención de las imágenes.

La obtención de imágenes se realizó mediante el uso del Analizador InCell 2000 (GE Healthcare). Se capturaron 4 campos por pocillo con objetivo de 10x. El número total de células basado en el conteo por tinción con DAPI y el número de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2 se determinó mediante el uso de InCell Developer Toolbox 1.8 (GE Healthcare). La fracción de las células dobles positivas a NGN3/NKX2.2 se cuantificaron mediante el uso del programa InCell developer toolbox (GE Healthcare) y se normalizaron con respecto al protocolo combinado K&N en cada placa y se calculó el % del efecto (% del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2 = ((S-S^neg)/(| S^pos-S^{n e g} |))*100). En donde S es el % de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2 para una combinación de compuestos dada, S^neg y S^pos son el % de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2 para el control negativo y el protocolo combinado K&N, respectivamente.

Los resultados en la forma de % del efecto de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2 se muestran a continuación en la tabla 5 y en la figura 4. Los resultados muestran que la eficiencia de diferenciación del protocolo en el ejemplo de referencia 2 y 4 aumenta cuando se añade DAPT junto con el inhibidor de JNK VIII o Gefitinib o el inhibidor de JNK VIII más Gefitinib.

Tabla 5: % del efecto de células dobles positivas a NGN3/NKX2.2.

Si bien determinadas características de la invención se han ilustrado y descrito en la presente descripción, muchas modificaciones, sustituciones, cambios y equivalentes serán evidentes para un experto en la técnica. Por lo tanto, debe entenderse que las reivindicaciones anexas pretenden cubrir todas esas modificaciones y cambios siempre que caigan dentro del verdadero espíritu de la invención.

Referencias

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Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método para obtener células progenitoras endocrinas dobles positivas a NGN3/NKX2.2, en donde una población de células que comprende células del endodermo pancreático se expone simultáneamente en un medio basal, a:

a) un inhibidor del receptor TGF-p tipo I,

b) un antagonista de BMP, en donde el antagonista de BMP es nogina,

c) un activador de adenilato ciclasa, y

d) nicotinamida.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el inhibidor del receptor TGF-p tipo I es SB431542.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el activador de adenilato ciclasa es forskolina.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichas células progenitoras endocrinas son al menos 8 % del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichas células progenitoras endocrinas son al menos 10 % del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichas células progenitoras endocrinas son al menos 10-100 % del efecto doble positivo a NGN3/NKX2.2.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el medio basal es RPMI1640.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde las células progenitoras endocrinas se exponen además al inhibidor de DNA-PK V, gefitinib, inhibidor de JNK VIII o DAPT o cualquier combinación de dichas moléculas.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde se combinan gefitinib, inhibidor de JNK VIII e inhibidor de DNA-PK V.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde se combinan gefitinib, inhibidor de JNK VIII y DAPT.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde se combinan gefitinib, inhibidor de JNK VIII, DAPT e inhibidor de DNA-PK V.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde se usa 1-100 pM de gefitinib, 1­ 100 pM de inhibidor de JNK VIII, 0,5-50 pM de DAPT y 1-100 pM de inhibidor de DNA-PK V.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-12, en donde se usa 1-10 pM de gefitinib, 5-20 pM de inhibidor de JNK VIII, 1-10 pM de DAPT y 1-10 pM de inhibidor de DNA-PK V.