ES2937168T3 - La inducción controlada de progenitoras pancreáticas humanas produce células de tipo beta funcionales - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para la diferenciación dirigida simple, rápida, eficaz y segura de células madre embrionarias en células pancreáticas tipo beta que secretan insulina en respuesta a los niveles de glucosa. Las células son terapias de trasplante útiles para individuos diabéticos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

La inducción controlada de progenitoras pancreáticas humanas produce células de tipo beta funcionales

Referencia cruzada a solicitud relacionada

La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N.° 62/151.832, presentada el 23 de abril de 2015.

Antecedentes

La diferenciación dirigida de células madre pluripotentes humanas en células de tipo beta productoras de insulina funcionales es muy prometedora para la terapia de reemplazo celular para pacientes que padecen diabetes. Este enfoque también ofrece la oportunidad única de estudiar aspectos inaccesibles de otro modo del desarrollo y la función de las células beta humanas in vitro.

La diabetes mellitus tipo 1 y 2 (T1D, T2D) son enfermedades caracterizadas por la destrucción autoinmune o disfunción progresiva y la subsiguiente pérdida de células beta pancreáticas productoras de insulina, respectivamente. Los tratamientos actuales para ambos tipos de pacientes con diabetes consisten en regular los niveles de glucosa en sangre mediante inyecciones de insulina exógena. Si bien este enfoque proporciona un tratamiento razonable de las enfermedades, los riesgos no deseados y las complicaciones a largo plazo persisten debido a la incapacidad de mantener estrictamente los niveles de glucosa dentro de un intervalo fisiológico normal. Las complicaciones incluyen episodios potencialmente mortales de hipoglucemia, así como complicaciones de larga duración de la hiperglucemia que dan como resultado micro y macroangiopatías que conducen a patologías cardiovasculares e insuficiencia renal, así como neuropatía. Por tanto, existe la necesidad de tratamientos distintos que proporcionen un control superior del metabolismo de la glucosa para minimizar, o idealmente eliminar las complicaciones de larga duración.

Un enfoque existente para tratar la diabetes es el trasplante de preparaciones de islotes de cadáveres humanos en pacientes. Este procedimiento típicamente da como resultado un mejor control glucémico, puede hacer que los pacientes sean independientes de la insulina durante períodos prolongados y mejora la calidad de vida en general (Shapiro et al, 2000; Barton et al, 2012; Posselt et al, 2010). Sin embargo, la grave escasez de donantes de órganos de cadáveres, el requisito de inmunosupresión de por vida y la variabilidad entre las preparaciones de islotes dificulta el uso del trasplante de islotes como un tratamiento fácilmente disponible para las personas con diabetes. En consecuencia, numerosos esfuerzos de investigación se han centrado en identificar fuentes alternativas abundantes de células productoras de insulina sensibles a la glucosa sustitutas (Hebrok, 2012; Efrat y Russ, 2012; Nostro y Keller, 2012; Tuduri y Kieffer, 2011; Bouwens et al, 2013; Zhou y Melton, 2008; Pagliuca y Melton, 2013). Uno de los enfoques más atractivos es la diferenciación dirigida en células productoras de insulina a partir de células madre embrionarias humanas pluripotentes (hESC) (D'Amour et al, 2005; Nostro et al, 2011; Guo et al, 2013b; Van Hoof et al, 2011; Mfopou et al., 2010; Chen et al, 2009; Xu et al, 2011; Shim et al, 2014) y más recientemente, células madre pluripotentes inducidas (Maehr et al, 2009; Shang et al, 2014; Hua et al, 2013).

El conocimiento integral de los eventos de señalización y los patrones de expresión del factor de transcripción temporal (TF) durante la organogénesis del páncreas de roedores (Pan y Wright, 2011; Seymour y Sander, 2011; Hebrok, 2003; Murtaugh y Melton, 2003) han acelerado la identificación de condiciones de cultivo que permitan la generación de tipos de células pancreáticas a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC). Las etapas tempranas del desarrollo, incluyendo el endodermo definitivo, las células de tipo tubos intestinales y las progenitoras pancreáticas pueden inducirse de manera eficiente in vitro. Las transiciones posteriores hacia células que expresan hormonas in vitro son menos eficientes, sin embargo, y con frecuencia conducen a la formación de una población mixta de diferentes células progenitoras pancreáticos y endocrinas polihormonales (Guo et al, 2013a; Nostro et al, 2011; D'Amour et al, 2006). Dichas células polihormonales expresan insulina entre otras hormonas, pero carecen de expresión de factores clave de transcripción de células beta y no secretan insulina in vitro en respuesta a una exposición a glucosa - la función distintiva de las auténticas células beta (Guo et al, 2013a; Nostro et al, 2011; D'Amour et al, 2006). No obstante, el trasplante de dichos cultivos heterogéneos en ratones sustitutos da como resultado la formación de células de tipo beta sensibles a la glucosa después de varios meses in vivo (Rezania et al, 2012; Kron et al., 2008; Szot et al., 2014).

Experimentos de clasificación sofisticados identificaron células progenitoras que expresan homeosecuencia 1 TF pancreática y duodenal (PDX1, también conocida como IPF1) y la proteína homeosecuencia NKX6.1 como la fuente de estas células de tipo beta funcionales (Kelly et al, 2011). Si bien se han identificado células polihormonales en el páncreas fetal humano, lo que sugiere que pueden reflejar aspectos del proceso normal de diferenciación embrionaria (Riedel et al, 2011; De Krijger et al, 1992), cada vez más pruebas indican que las células polihormonales derivadas de hESC dan lugar preferentemente a células de tipo alfa positivas para una sola hormona (Rezania et al, 2011). Por tanto, para replicar completamente el desarrollo de células beta humanas in vitro, es imperativo comprender mejor y recapitular con precisión la secuencia de señales embrionarias necesarias para la especificación adecuada de los precursores de células beta, en lugar de precursores de células alfa.

Durante la organogénesis pancreática normal in vivo, las células beta funcionales se generan a través de un proceso de especificación por etapas que comienza con las progenitoras pancreáticas, identificadas por la expresión de PDX1 (Herrera et al, 2002). Si bien las células PDX1+ pueden dar lugar a todos los linajes pancreáticos (Herrera et al, 2002), la posterior inducción de NKX6.1 en estas células restringe su potencial de diferenciación solo a las células endocrinas y ductales (Schaffer et al, 2010). A continuación, se inicia la diferenciación endocrina en las progenitoras PDX1+/NKX6.1+ mediante la expresión de corta duración de la neurogenina 3 TF de hélice bucle hélice básica (NEUROG3, también conocida como NGN3) (Gu et al, 2002). De forma interesante, se ha demostrado que el momento de la expresión de NEUROG3 es crucial para promover la formación de diversos tipos de células de islotes endocrinos (Johansson et al, 2007). Por ejemplo, la inducción precoz de la diferenciación endocrina mediante la expresión forzada de NEUROG3 en ratones da como resultado predominantemente la generación de células alfa (Johansson et al, 2007). Kumar, S. et al. (Int. J. Mol. Sci. 15 (2014), pág. 23418-47) revisa los desarrollos en la diferenciación de células beta de células madre pluripotentes inducida por moléculas pequeñas y grandes. El documento US 2010/112691 A1 describe métodos para producir cultivos de suspensión de agregados de ESC indiferenciadas o diferenciadas que utilizan vías de señalización de ErbB, tales como la diferenciación de hESC en células de endodermo PDX1+/NKX6.1+. El documento US 2013/164787 A1 describe la generación de células de endodermo de intestino anterior PDX1+ a partir de células madre pluripotentes (inducidas) o hESC y la posterior diferenciación en células progenitoras pancreáticas y secretoras de hormonas PDX1+/NKX6.1+.

Por todas las razones anteriores, sigue existiendo una necesidad en la técnica de materiales y métodos que proporcionen la diferenciación dirigida de células madre pluripotentes (por ejemplo, células madre pluripotentes humanas) en células de tipo beta productoras de insulina funcionales para el tratamiento de la diabetes.

Sumario

Las terapias celulares que utilizan células beta productoras de insulina funcionales producidas a partir de células madre humanas son muy prometedoras para el tratamiento de la diabetes. En el presente documento se divulgan datos que establecen que los protocolos actuales de diferenciación pancreática inducen una diferenciación endocrina precoz, lo que conduce a la formación de células endocrinas polihormonales no deseadas. La divulgación proporciona además un protocolo simplificado de diferenciación basado en cultivo en suspensión que permite la especificación temporal correcta de progenitores pancreáticas y endocrinas en células de tipo beta sensibles a la glucosa in vitro. Este enfoque proporciona un suministro rápido y reproducible de células de tipo beta humanas funcionales y permite investigaciones detalladas sobre el desarrollo del páncreas humano y la biología de las células beta. Las características destacadas de la tecnología divulgada en el presente documento incluyen la exclusión de los inhibidores de BMP comúnmente utilizados durante la diferenciación de células madre embrionarias humanas a células progenitoras pancreáticas que previene la inducción endocrina precoz. La exposición secuencial de las células del intestino anterior al ácido retinoico seguida de un tratamiento combinado con EGF/KGF establece poblaciones progenitoras de PDX1+ y PDX1+/NKX6.1+ altamente puras, respectivamente. La inducción temporal precisa de la diferenciación endocrina en progenitoras PDX1+/NKX6.1+, pero no en progenitoras PDX1+/NKX6.1-, da como resultado la generación de células de tipo beta funcionales in vitro. Las células de tipo beta producidas mediante los métodos divulgados exhiben características clave de auténticas células beta humanas, permanecen funcionales después de un trasplante a corto plazo y reducen los niveles de glucosa en sangre en ratones diabéticos.

Desarrollando las observaciones anteriores, los protocolos actuales de diferenciación de progenitoras pancreáticas promueven el compromiso endocrino precoz, dando como resultado en última instancia la generación de células polihormonales no funcionales. La omisión de los inhibidores de BMP de uso común durante la especificación pancreática previene la formación endocrina precoz, mientras que el tratamiento con ácido retinoico seguido de EGF/KGF combinados genera de manera eficiente tanto poblaciones PDX1+ como las subsiguientes de progenitoras pancreáticas PDX1+/NKX6.1+, respectivamente. La activación temporal precisa de la diferenciación endocrina en las progenitoras PDX1+/NKX6.1+ produce células de tipo beta sensibles a la glucosa in vitro que exhiben características clave de auténticas células beta humanas, permanecen funcionales después de un trasplante a corto plazo y reducen los niveles de glucosa en sangre en ratones diabéticos. Por tanto, el sistema simplificado y escalable de los inventores recapitula con precisión las etapas clave del desarrollo del páncreas humano y proporciona un suministro rápido y reproducible de células de tipo beta humanas funcionales.

En un aspecto, la divulgación proporciona un método de generación de una célula progenitora PDX1+ poniendo en contacto una célula madre embrionaria con una cantidad eficaz de un compuesto de ácido retinoico solo, induciendo así la formación de una célula progenitora PDX1+. En algunas realizaciones, la célula madre embrionaria es una célula madre embrionaria humana. La célula madre embrionaria se pone en contacto con un compuesto de ácido retinoico in vitro. Las realizaciones anteriores comprenden además no poner en contacto la célula madre embrionaria con un inhibidor de proteína morfogénica ósea (BMP) antes de la expresión de NKX6.1 por la célula.

En algunas realizaciones de este aspecto de la divulgación, el método comprende además poner en contacto la célula con cantidades eficaces de factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento de queratinocitos, induciendo así la formación de una célula progenitora PDX1+/NKX6.1+. En algunas de estas realizaciones, la célula expresa NKX6.1 antes de que la célula entre en contacto con al menos uno de factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento de queratinocitos (K). En algunas de estas realizaciones, la célula expresa NKX6.1 antes de ponerse en contacto con el factor de crecimiento epidérmico y el factor de crecimiento de queratinocitos.

En otras realizaciones más, el método comprende además inducir a la célula progenitora PDX1+/NKX6.1+ a expresar NEUROG3, lo que da como resultado la producción de una célula de tipo beta INS+/NKX6.1+, en donde la expresión de NEUROG3 se induce poniendo en contacto la célula progenitora PDX1+/NKX6.1+ con una cantidad eficaz de un inhibidor de proteína morfogénica ósea, un inhibidor de TGFp/ALK, o un inhibidor de Sonic Hedgehog. Se contemplan realizaciones en donde la célula progenitora PDX1+/NKX6.1+ se pone en contacto con una cantidad eficaz de proteína morfogénica ósea y una cantidad eficaz de un inhibidor de TGFp/ALK. En algunas realizaciones, la célula progenitora PDX1+/NKX6.1+ se pone en contacto con una cantidad eficaz de proteína morfogénica ósea y una cantidad eficaz de un inhibidor de Sonic Hedgehog. En algunas realizaciones, el inhibidor de la proteína morfogénica ósea es nogina o el inhibidor de Sonic Hedgehog es ciclopamina.

Este aspecto de la divulgación comprende además métodos en donde la expresión de NEUROG3 se induce mediante la exposición de la célula progenitora PDX1+/NKX6.1+ a cantidades eficaces de una proteína de unión a TATA, un inhibidor de cinasa de tipo receptor de activina, nogina y factor de crecimiento de queratinocitos, o K. En algunas realizaciones, la expresión de NEUROG3 comienza antes de que se detecte la expresión de NKX2.2. En algunas realizaciones, no más del 5 % de las células generadas son células polihormonales. En algunas realizaciones, la célula de tipo beta INS+/NKX6.1+ es sensible a los niveles de glucosa. En algunas de estas realizaciones, la célula de tipo beta INS+/NKX6.1+ secreta un nivel aumentado de insulina en respuesta a un nivel aumentado de glucosa.

Se proporcionan algunas realizaciones de los métodos de acuerdo con la divulgación en donde la célula de tipo beta INS+/NKX6.1+ no expresa un nivel detectable del marcador Ki67.

Un aspecto no reivindicado de la divulgación es un método para generar una célula de tipo beta INS+/NKX6.1+ que se aviene mejor al trasplante de la célula de tipo beta INS+/NKX6.1+ en un ser humano. En algunas realizaciones, el ser humano es diabético.

Otras características y ventajas de la divulgación se comprenderán mejor con referencia a la siguiente descripción detallada, incluyendo el dibujo y los ejemplos.

Breve descripción del dibujo

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Figura 1. La diferenciación pancreática de hESC usando un sistema de cultivo a gran escala da como resultado dos subconjuntos distintos de células productoras de insulina. A: Esquema que resume el método de diferenciación empleado. R = ácido retinoico, C = ciclopamina, N = nogina, E = factor de crecimiento epidérmico, K = factor de crecimiento de queratinocitos, T = TBP y A = inhibidor de ALK. B: Micrografía de agrupaciones de células MEL1INS-GFP después de 17 días de diferenciación que demuestra una fuerte expresión de GFP (expresión de GFP en blanco). Barra de escala = 200 pm. C: Análisis por citometría de flujo en el día 20 de la diferenciación que muestra el 41,5 % de todas las células que expresan GFP bajo el control del promotor de insulina endógeno. D: Cuantificación por citometría de flujo del porcentaje promedio de células GFP+ dentro de cultivos diferenciados después de 19-24 días. n=7. Los valores son promedio ± desviación estándar (SD). E: El análisis por citometría de flujo del péptido C específico humano intracelular (C-PEP) y la insulina (INS) muestra porcentajes comparables de células positivas para C-PEP e INS. F: Tinción de inmunofluorescencia para C-PEP y glucagón (GCG), y cuantificación por citometría de flujo de poblaciones GCG+/C-PEP+ (ventana roja), GCG-/C-PEP+ (ventana negra) en los días 13 y 19 de diferenciación. G: Tinción de inmunofluorescencia para C-PEP y NKX6.1, y cuantificación por citometría de flujo de poblaciones NKX6.1+/INS+ (ventana verde) y NKX6.1-/INS+ (ventana roja) en los días 13 y 19. Los recuadros de inmunofluorescencia muestran dos fenotipos distintos para las células C-PEP+ (NKX6.1+ y NKX6.1-). Solo se detecta una población positiva doble INS/NKX6.1 robusta en el día 19. H: Microscopía electrónica de transmisión de agrupaciones del día 20. Las células contienen vesículas secretoras con núcleos densos en electrones rodeados por halos escasos en electrones (recuadro verde), similar a auténticas vesículas de células beta, así como otros gránulos similares a los que se encuentran en las células pancreáticas no beta (recuadros rojos). Figura 2. Definición de las actividades temporales de factores de señalización individuales para generar de manera eficiente poblaciones de progenitoras de páncreas PDX1+ y PDX1+/NKX6.1+ mientras se previene la inducción precoz de la diferenciación endocrina. A-C: Expresión del marcador progenitor pancreático el día 9,5 después del tratamiento con factores de diferenciación convencionales solos o en diferentes combinaciones. Los tratamientos consistieron en combinaciones de ciclopamina (C), nogina (N) y ácido retinoico (R) durante los días 6-8, seguidos de la subdivisión de cada condición en tres grupos de tratamiento durante el día 9-9,5. Grupo 1) continuación del tratamiento de los días 6-8; Grupo 2) tratamiento con EGF y KGF (EK); Grupo 3) tratamiento con EGF, KGF y nogina (EKN). La condición seleccionada para estudios posteriores, '10', está marcada con un recuadro verde. Los datos mostrados son representativos de los resultados obtenidos en dos experimentos independientes. A: Tabla que detalla 18 condiciones de cultivo diferentes que se evaluaron. B: Cuantificación de células que expresan proteínas PDX1 (ventana naranja) y NKX6.1 (ventana azul) en condiciones individuales después de 9,5 días de diferenciación. C: Expresión de la proteína NKX6.1 y NEUROG3 evaluada mediante tinción de preparación completa de agrupaciones diferenciadas a los 9,5 días. Cabe destacar la expresión robusta de NEUROG3 en todas las agrupaciones expuestas a N (condiciones 3, 6, 9 y 12-18).

Figura 3. Recapitulación de la organogénesis del páncreas humano para generar progenitoras endocrinas. A: Esquema que resume una estrategia de diferenciación simplificada para la generación por etapas controlada de tipos de células progenitoras pancreáticas. B: El análisis por citometría de flujo de evolución temporal ilustra la generación eficiente de poblaciones de progenitoras PDX1+ (ventana naranja) y progenitoras PDX1+/NKX6.1+ (ventana azul). Se muestran los datos de uno de tres experimentos independientes con resultados similares. C: Análisis por inmunofluorescencia de secciones de agrupaciones diferenciadas en los puntos de tiempo indicados teñidos para NKX2.2 (verde) y NEUROG3 (rojo) humanas. Los recuadros muestran células positivas dobles para NEUOG3/NKX2.2. Se muestran los datos de uno de tres experimentos independientes con resultados similares.

Figura 4. La generación eficiente de células progenitoras pancreáticas PDX1+/NKX6.1+ antes de la inducción endocrina da como resultado células de tipo beta. A: Esquema que resume una estrategia de diferenciación simplificada para la generación por etapas controlada de tipos de células progenitoras pancreáticas y endocrinas posteriores. GF= factores de crecimiento. B: Micrografías de agrupaciones diferenciadas en el día 19 bajo microscopía óptica (imagen de la izquierda) o microscopía de fluorescencia que muestran una expresión prominente de GFP (imagen de la derecha; expresión de GFP mostrada en blanco). C: Cuantificación del porcentaje de células positivas para péptido C humano en el día 19-21. Los valores son promedio ± SD. n=7 experimentos independientes. D: Tinciones de inmunofluorescencia de agrupaciones diferenciadas en el día 20 para insulina (INS), PDX1, NKX6.1, NKX2.2 y glucagón (GCG). Se muestra uno de cuatro experimentos con resultados similares. E: Gráficos representativos de citometría de flujo que representan la coexpresión de marcadores pancreáticos PDX1, NKX6.1, NKX2.2, ISL1, NEUROD1, PA^x 6, Cromogranina A (CHGA) y GCG con péptido C humano en los puntos de tiempo indicados. Las ventanas negras marcan el porcentaje de células totales positivas para el marcador indicado en el eje 'Y'. Las ventanas verdes marcan el porcentaje de células de tipo beta positivas dobles. La ventana roja marca el porcentaje de células bihormonales INS+/GCG+. F: Cuantificación por citometría de flujo de células de tipo beta positivas para péptido C que coexpresan marcadores en 'D'. Un alto porcentaje de células de tipo beta coexpresan todos los genes que normalmente se encuentran en las células beta, pero no la hormona GCG. Los valores son promedio ± SD. n=4 para PDX1, n=19 para NKX6.1, n= 4 para NKX2.2, n= 9 para ISL1, n=9 para NEUROD1, n = 5 para PAX6, n=6 para CHGA y n=5 para GCG. El análisis se realizó en los días 15-21 de diferenciación.

Figura 5. Las células de tipo beta exhiben características clave de auténticas células beta humanas y son sensibles a la glucosa. A-D: Análisis por PCR cuantitativa de transcritos de genes seleccionados en células de tipo beta GFP+ clasificadas (barras verdes), poblaciones GFP-(barras azules) y preparaciones de islotes humanos (barras negras). Resultados mostrados en relación con el control endógeno GAPDH. RQ = cuantificación relativa. Los valores son promedio ± SD. n = 4 experimentos independientes para poblaciones de células derivadas de hESC en los días 19-20 y n = 3 para islotes humanos. E: Contenido de insulina, péptido C humano y proinsulina en relación con el ADN en células de tipo beta en el día 19. Los datos presentados son promedio ± error estándar (n= 3 experimentos independientes, duplicados técnicos). F: Imágenes de microscopía electrónica de transmisión de células de tipo beta en el día 20. Se muestra uno de tres experimentos con resultados similares. Barra de escala = 500 nm. Los recuadros representan vesículas secretoras similares a gránulos presentes en auténticas células beta humanas. G: Secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) de islotes humanos y células de tipo beta en los días 19-20. El eje "Y" indica la relación entre la insulina secretada en condiciones de glucosa baja y la secretada en condiciones de glucosa alta. Los valores son promedio ± desviación estándar (SD) (n = 3 para islotes humanos y n = 10 para células de tipo beta).

Figura 6. Las células de tipo beta siguen siendo sensibles a la glucosa después de un trasplante a corto plazo. A: Niveles de péptido c humano circulante medidos en sueros de ratones 7-10 días después del trasplante con 4000 islotes humanos o 5,0*106 células diferenciadas directamente (que contienen aproximadamente 1,15*106 células de tipo beta). Los sueros en ayunas y de exposición se recogieron después de un ayuno nocturno y 1 hora después de exposición a glucosa intraperitoneal, respectivamente. La línea discontinua separa los datos sin procesar de las mediciones del péptido c sérico normalizadas al número de células beta presentes en cada injerto de islotes humanos (4000 islotes humanos trasplantados, cada uno con alrededor de 1000 células, aproximadamente el 50 % de las cuales son células beta, por lo tanto 2,0x106 células beta presentes en el total de injertos). n = 5 para islotes humanos y n = 12 para injertos derivados de hES. B: Tinción con hematoxilina y eosina del injerto del día 14. k= riñón, g= injerto. Se muestran datos representativos de uno de tres ratones. C: Tinción de inmunofluorescencia de injertos de hES diferenciadas 2 semanas después del trasplante para péptido C humano, glucagón (GCG), somatostatina (SST), PDX1, NKX6.1 y NKX2.2. Se muestran datos representativos de uno de tres ratones. D: Niveles de glucosa en sangre (BG) de ratones tratados con estreptozotocina para extirpar células beta endógenas (STZ) seguido de trasplante (Tx) de agrupaciones que contienen células de tipo beta ya sea en el día 0 o en el día 4, como se indica (n=8, dos experimentos de diferenciación independientes). Los valores son promedio ± desviación estándar. La significación estadística se calculó usando la prueba de la t bilateral. p= *<0,05, ***<0,01 y ***<0,001. Control (CTRL) = 6-9 animales.

Figura 7. Los protocolos publicados dan como resultado una diferenciación endocrina precoz mediante la activación de NEUROG3. A-C: Análisis de marcadores progenitores pancreáticos clave en agrupaciones diferenciadas como se resume en la figura 1A. R = ácido retinoico, C = ciclopamina, N = nogina, E = factor de crecimiento epidérmico, K = factor de crecimiento de queratinocitos, T = TBP y A = inhibidor de ALK. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos independientes. A: la expresión de proteínas PDX1, INS, GCG, NEUROG3 y NKX6.1 se evaluó mediante tinción de preparación completa de agrupaciones diferenciadas en los puntos de tiempo indicados. Cabe destacar la expresión precoz del marcador endocrino NEUROG3 en ausencia de la proteína NKX6.1 en los días 6-9. B y C: Cuantificación por citometría de flujo de células PDX1 (ventana naranja), PDX1+/NKX6.1+ (ventana azul), INS+/NKX6.1+ (ventana verde) e INS+/NKX6.1-(ventana roja) en los puntos de tiempo indicados. D: Análisis por qPCR de transcritos de NGN3 y NKX2.2 en el día 8 de diferenciación empleando tratamiento con RCN (ácido retinoico (R), ciclopamina (C), y nogina (N)) o R con dos concentraciones diferentes de vitamina C (Vit. C) durante 3 días o sin tratamiento. Los datos se muestran como el promedio ± error estándar, relativo a RCN y normalizado a GAPDH. (n= tres experimentos independientes, duplicados técnicos).

Figura 8. La inducción de la expresión de NEUROG3 en progenitoras pancreáticos PDX1+ da como resultado células productoras de insulina que carecen de expresión de NKX6.1. A: Esquema que resume la estrategia de diferenciación empleada. R = ácido retinoico, N = nogina y A = inhibidor de ALK. B y C: Análisis por citometría de flujo de la expresión de péptido c humano (C-PEP), glucagón (GCG) y NKX6.1 en los puntos de tiempo de diferenciación indicados. Se muestran datos representativos de 3 a 4 experimentos independientes con resultados similares. B: La diferenciación endocrina de progenitoras pancreáticas PDX1+ da como resultado la generación predominante de células polihormonales productoras de insulina y glucagón en el día 13. C: Las células productoras de insulina carecen de expresión del factor crítico de transcripción de células beta NKX6.1 en los días 13 y 21. Se genera una pequeña población de células progenitoras NKX6.1+/INS- mediante el tratamiento inductor de NEUROG3 con a N.

Figura 9. Las células de tipo beta derivadas de hESC son posmitóticas. A: La proliferación de poblaciones de células de tipo beta péptido C+ y células negativas para péptido C en los días 18-20 se determinó mediante tinción conjunta con el marcador de proliferación Ki67. B: Tinción de inmunofluorescencia de agrupaciones diferenciados el día 20 para el marcador de proliferación Ki67 e insulina humana (INS). Se muestran datos representativos de uno de tres experimentos con resultados similares.

Figura 10. Procesamiento eficiente de insulina en células de tipo beta derivadas de hESC. A: Análisis por transferencia de Western del procesamiento de proinsulina a insulina en células de tipo beta en los puntos de tiempo indicados. Se muestra una preparación de islotes humanos a modo de comparación. Avanzando de izquierda a derecha, se proporcionan paneles de transferencia de Western de lo siguiente: se muestran i) dos preparaciones de islotes humanos, ii) células hES9.3 muestreadas los días 17, 19 y 21, iii) células hES9.6 muestreadas los días 17, 19 y 21, y iv) células hES9.10 muestreadas los días 17 y 19 La transferencia de Western se recortó para conservar espacio, lo que permitió mostrar los niveles de tubulina (como una proteína de mayor peso molecular, la tubulina superó a la proinsulina y la insulina en el gel sometido a transferencia de Western). B: Cuantificación del procesamiento de proinsulina en la figura 5E y el panel A. n = 3 para cada punto de tiempo de células de tipo beta y n = 4 para islotes humanos.

Figura 11. Ilustración comparativa esquemática de protocolos de diferenciación dirigida a células pancreáticas (por ejemplo, células beta de los islotes) conocidos en la técnica y divulgados en el presente documento. Se proporciona una ilustración que compara los protocolos de diferenciación dirigida para provocar la diferenciación de células madre embrionarias humanas (hES) a células pancreáticas tales como células beta de los islotes. Los protocolos convencionales avanzan a partir de hES a través del intestino anterior hasta la columna en el centro de la figura, pasando por PDX1 a NGN3 y, a continuación, a INSGCG. La metodología divulgada en el presente documento avanza desde hES pasando por el intestino anterior, PDX1, PDX1/NKX6.1, NGN3 y, a continuación, a INS NKX6.1.

Descripción detallada

Dado que se ha demostrado que las células polihormonales derivadas de hESC dan lugar a células alfa (Rezania et al, 2011), se esperaba que la generación in vitro de células endocrinas polihormonales fuera resultado de la asignación prematura al destino endocrino. Para abordar este asunto, se realizó un análisis por etapas detallado de la generación de progenitoras pancreáticas y la inducción endocrina. La mayoría de los protocolos actuales establecen de manera eficiente las progenitoras de PDX1+ mediante el uso de ácido retinoico en combinación con moléculas para inhibir las vías de señalización de la proteína morfogénica ósea (BMP) y la Sonic Hedgehog (SHH), mientras se añade simultáneamente el factor de crecimiento de fibroblastos 10 o el factor de crecimiento de queratinocitos (KGF, también conocido como FGF7) (Rezania et al, 2012; Hua et al, 2013; Guo et al, 2013b; Nostro y Keller, 2012; Mfopou et al, 2010). En el presente documento se divulga la necesidad de controlar temporalmente la introducción de agentes inductores en la vía de diferenciación dirigida de células madre embrionarias a células pancreáticas de tipo beta funcionales. Por ejemplo, el uso temprano o indiscriminado de inhibidores de BMP para especificar células pancreáticas promueve la inducción precoz de la diferenciación endocrina en progenitoras pancreáticas PDX1+, lo que da como resultado la formación de células polihormonales. Los inhibidores de BMP tienen un papel en la diferenciación dirigida de células ES a células de tipo beta, pero solo si los inhibidores se introducen más adelante en el proceso, es decir, después de que las células hayan comenzado a expresar NKX6.1. Se han identificado condiciones de cultivo simplificadas que replican el desarrollo endocrino fetal y permiten la generación precisa y eficiente de poblaciones de progenitoras PDX1+ y PDX1+/NKX6.1+ sin activación precoz del marcador endocrino NEUROG3. La inducción posterior de la diferenciación endocrina en células progenitoras PDX1+/NKX6.1+ correctamente especificadas da como resultado la formación de células de tipo beta que expresan insulina y responden a la glucosa in vitro dentro, o en menos de, tres semanas. El estudio de los inventores, por lo tanto, detalla un protocolo simplificado de diferenciación dirigida que recapitula estrechamente los aspectos clave del desarrollo endocrino humano y da como resultado la formación de un gran número de células de tipo beta sensibles a la glucosa en condiciones de cultivo celular.

En el presente documento, se divulga un protocolo de diferenciación simplificado que replica las etapas clave de la organogénesis del páncreas embrionario para la generación definida de tipos de células endocrinas y progenitoras pancreáticas humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESC) que da como resultado la formación de células de tipo beta sensibles a la glucosa in vitro. En la figura 11 se proporciona un esquema directo que compara el protocolo divulgado en el presente documento con los protocolos convencionales. Las células de tipo beta derivadas de hESC exhiben características clave de las células beta humanas de cadáver in vitro e in vivo, en particular, su capacidad para responder a los aumentos fisiológicos de las concentraciones de glucosa mediante la secreción de insulina. El análisis de la expresión génica de las células de tipo beta indica la presencia de factores esenciales para la función de las células beta, la biosíntesis adecuada de insulina madura, el metabolismo de la glucosa y la secreción de insulina a niveles comparables a los islotes humanos. Además, las células de tipo beta muestran características ultraestructurales de auténticas células beta humanas, tales como vesículas secretoras apropiadas. Por tanto, elementos críticos necesarios para la generación y procesamiento, empaquetamiento y almacenamiento adecuados de insulina en su forma madura bioactiva están presentes en estas células derivadas de hESC. Por último, las células de tipo beta permanecieron funcionales después del trasplante a corto plazo y redujeron los niveles de glucosa en sangre en un modelo murino de diabetes, confirmando además el correcto estado de diferenciación de las células.

En fechas recientes, otros dos grupos notificaron la derivación de células de tipo beta sensibles a la glucosa a partir de células hESC que comparten muchas características de las células de tipo beta descritas en el presente documento (Rezania et al, 2014; Pagliuca et al, 2014). Ambos de estos estudios, sin embargo, se centraron en optimizar las etapas posteriores de la diferenciación directa, mientras empleaban partes de protocolos publicados, en concreto, la adición de RCN, para establecer poblaciones de progenitoras pancreáticas. Los datos divulgados en el presente documento demuestran que la generación de progenitoras pancreáticas usando este método también da como resultado la generación indeseable de células endocrinas polihormonales inmaduras que carecen de expresión del factor de transcripción de células beta crítico NKX6.1. De hecho, ambos estudios publicados señalan poblaciones apreciables de células positivas para péptido C/insulina que carecen de expresión de NKX6.1. Se demuestra que las células polihormonales resultan de la inducción endocrina precoz en progenitoras pancreáticas PDX1+ (que carecen de expresión NKX6.1), que se puede evitar omitiendo los inhibidores de BMP durante la etapa de especificación del páncreas. Además, el análisis detallado de los inventores de los efectos de los factores de RCN individuales en la expresión de marcadores pancreáticos clave reveló que el ácido retinoico solo es suficiente para inducir la generación competente de más del 98 % de progenitoras pancreáticas PDX1+. La exposición posterior a EGF y KGF da como resultado la activación rápida y eficaz de NKX6.1 en estas células, generando células progenitoras PDX1+/NKX6.1+ con la capacidad de dar lugar a células de tipo beta in vitro. Estas condiciones de diferenciación simplificadas permiten la generación eficiente de poblaciones progenitoras pancreáticas humanas y endocrinas más restringidas a partir de células madre pluripotentes sin la formación no deseada de células polihormonales. Este protocolo de diferenciación simplificado se parece más a los aspectos clave del desarrollo temprano del páncreas humano y, como tal, representa una mejora sobre los protocolos publicados.

Los estudios en roedores han demostrado un papel importante para la señalización de Notch en la diferenciación endocrina de células progenitoras in vivo. Si bien inicialmente se requiere para la generación de células progenitoras competentes, es necesaria una reducción posterior de la señalización de Notch para la inducción de la expresión de NEUROG3 que inicia la diferenciación endocrina (Shih et al, 2012). En el contexto de la diferenciación in vitro, estudios previos han demostrado que la inhibición directa de la señalización de Notch por inhibidores de gamma secretasa o el uso de inhibidores de BMP y TGFp/ALK da como resultado una mayor expresión de insulina en etapas posteriores (Mfopou et al, 2010; Nostro et al, 2011; Pagliuca et al, 2014; Rezania et al, 2014). Se emplea la inhibición de BMP y cinasa de tipo receptor de activina (ALK) durante una ventana de 5 días para inducir la expresión de NEUROG3 específicamente en progenitoras PDX1+/NKX6.1+, lo que dio como resultado la generación eficiente de células de tipo beta INS+/NKX6.1+, mientras que solo se observaron unas pocas células polihormonales (alrededor del 3 %, que es menos del 5 %). Probablemente, estas células no deseadas se originaron a partir del pequeño porcentaje de progenitoras pancreáticas PDX1 presentes en el momento de la inducción endocrina. En contraste con la formación de progenitoras PDX1+ y PDX1+/NKX6.1+ que se produce rápidamente (36-48 horas después de la adición de factor(es) inductor(es)) y uniformemente en la mayoría de las células, la diferenciación endocrina se produce durante un período prolongado y se limita a un pequeño subconjunto de células totales. Esto podría ser un reflejo de la situación observada durante el desarrollo normal del páncreas humano, donde solo unas pocas células progenitoras inician el programa de diferenciación endocrina en un momento dado (Jennings et al, 2013). Si bien la inducción generalizada simultánea de la diferenciación endocrina en la mayoría de la población de progenitoras PDX1+/NKX6.1+ reduciría en gran medida el tiempo de diferenciación y aumentaría el rendimiento de células tipo beta, los resultados de los inventores apuntan a una regulación de la expresión de NEUROG3 que requiere un ajuste sutil, pero temporalmente preciso, que parece más complejo que solo la inhibición de Notch. Como el protocolo de diferenciación de los inventores permite un control estricto de la expresión de NEUROG3, podría usarse en estudios futuros para identificar nuevos reguladores de la expresión del gen NEUROG3 e, idealmente, para lograr una activación uniforme de NEUROG3 durante la diferenciación directa in vitro.

Si bien las preparaciones de islotes de cadáver son ampliamente aceptadas como el modelo de referencia para estudiar las células beta humanas, varios problemas asociados con su uso permanecen. Por ejemplo, su rendimiento y utilidad dependen de una serie de factores de confusión: variación genética, edad y estilo de vida del donante, tiempo de aislamiento, pureza de los islotes y condiciones de envío. Al eliminar las restricciones de disponibilidad y reproducibilidad, se espera que las células de tipo beta derivadas de hESC proporcionen una importante herramienta terapéutica y para acelerar la comprensión de la biología de las células beta humanas. En conjunto, el protocolo rápido y simplificado de los inventores proporciona un control temporal preciso sobre la generación de tipos de células endocrinas y progenitoras pancreáticas posteriores y da como resultado el establecimiento de células de tipo beta humanas que exhiben sensibilidad a la glucosa in vitro e in vivo. El enfoque de diferenciación directa basado en suspensión de los inventores es escalable, y la capacidad de los inventores para producir grandes cantidades de células de tipo beta acelerará aún más los esfuerzos para brindar de manera eficiente una terapia celular segura y efectiva a los pacientes que padecen diabetes. Además, a través de la producción y el mantenimiento de diferentes poblaciones de células de desarrollo, el enfoque de los inventores se puede usar para investigaciones más detalladas sobre el desarrollo del páncreas humano y la función de las células beta humanas que antes eran imposibles debido al material donante limitado, tales como exámenes de detección de fármacos a gran escala y estudios de función génica en todo el genoma.

Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones de la divulgación.

EJEMPLO 1

Materiales y métodos

Cultivo celular

Se mantuvieron células indicadoras MEL1 INSGFP/W indiferenciadas de referencia (Micallef et al, 2012) en capas alimentadoras de fibroblastos de embrión de ratón (Millipore) en medios hESC como se describió (Guo et al, 2013b). Las diferenciaciones basadas en suspensión se llevaron a cabo de la siguiente manera. En resumen, los cultivos confluentes se disociaron en una suspensión de células individuales mediante incubación con TrypLE (Gibco). Se contaron las células y cada pocillo de placas de baja adherencia de 6 pocillos se sembró con 5,5 x 106 células en 5,5 ml de medio hES complementado con 10 ng/ml de Activina A (R&D Systems) y 10 ng/ml de Heregulina B1 (Peprotech). Las placas se colocaron en un agitador orbital a 100 rpm para inducir la formación de esferas, como se describió (Schulz et al, 2012). Para inducir la diferenciación definitiva del endodermo, los agregados se recogieron 24 horas después en un tubo falcon de 50 ml, se dejaron sedimentar por gravedad, se lavaron una vez con PBS y se resuspendieron en medio d1 (RPMI (Gibco) que contenía FBS al 0,2 %, ITS a 1:5000 (Gibco), 100 ng/ml de activina A y 50 ng/ml de WNT3a (R&D Systems)). Las agrupaciones de 3 pocillos se combinaron en 2 pocillos en este punto y se distribuyeron en placas nuevas de baja adherencia en 5,5 ml de medio d1. A partir de entonces, los medios se cambiaron diariamente, retirando 4,5 ml de medio (al final del día 1) o 5,5 ml de medio los días siguientes y volviendo a añadir 5,5 ml de medio fresco hasta el día 9. Después del día 9, solo se retiraron y añadieron diariamente 5 ml de medio.

Se ha descrito la diferenciación empleando protocolos publicados (Schulz et al, 2012; Rezania et al, 2012). Los medios en el protocolo de diferenciación simplificado de los inventores consisten en, d2: RPMI que contiene FBS al 0,2 %, ITS a 1:2000 y 100 ng/ml de activina A; d3: RPMI que contiene FBS al 0,2 %, ITS a 1:1000, TGFbi IV 2,5 pM (CalBioChem) y 25 ng/ml de KGF (R&D Systems); d4-5: RPMI que contiene FBS al 0,4 %, ITS a n1:1000 y 25 ng/ml de KGF. d6-7: DMEM (Gibco) con glucosa 25 mM que contiene B27 a 1:100 (Gibco), TTNBP 3 nM (Sigma); d8: DMEM con glucosa 25 mM que contiene B27 a 1:100, TTNBP 3 nM y 50 ng/ml de E^g F (R&D Systems); d9: DMEM con glucosa 25 mM que contiene B27 a 1:100, 50 ng/ml de EGF y 50 ng/ml de KGF. d10-14: DMEM con glucosa 25 mM que contiene B27 a 1:100, LDN-193189500 nM (Stemgent), proteína de unión a TATA 30 nM (TBP; Millipore), Alki II 1000 nM (Axxora) y 25 ng/ml de KGF; d15-21: DMEM con glucosa 2,8 mM que contiene Glutamax a 1:100 (Gibco) y NEAA a 1:100 (Gibco). Los islotes humanos procedían de Prodo Laboratories o del Centro de Producción de Células e Islotes de la UCSF.

Ratones

Los ratones NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) se obtuvieron de Jackson Laboratories. Los ratones usados en este estudio se mantuvieron de acuerdo con los protocolos aprobados por la Universidad de California, Comité de San Francisco sobre el Centro de Recursos de Animales de Laboratorio. Para injertos de cápsula renal, aproximadamente 5,0 * 106 Células diferenciadas hESC en esferas y 4000 equivalentes de islotes humanos se trasplantaron como se describió (Russ y Efrat, 2011; Szot et al., 2007). Para la secreción de insulina inducida por glucosa, los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche y se recogió el suero antes y después de la administración intraperitoneal de 3 g/kg de solución de D-glucosa. Para la inducción de la diabetes, a los ratones se les administraron 35 mg/kg de estreptozotocina mediante inyección intraperitoneal durante 5 días. Los riñones portadores del injerto se extirparon para análisis de inmunofluorescencia. No se empleó ningún método estadístico para determinar el tamaño de la muestra, los ratones no se aleatorizaron y el análisis no se enmascaró.

Clasificación de células y análisis por citometría de flujo

En resumen, las esferas se recogieron y se dejaron sedimentar por gravedad. Las agrupaciones se lavaron una vez en PBS y se disociaron mediante un pipeteo suave después de 12-15 minutos de incubación en Accumax (Innovative Cell Technologies). Para la clasificación, la suspensión celular se filtró y se resuspendió en tampón FACS que consistía en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (centro de cultivo celular de la UCSF) que contenía EDTA 2 mM (Ambion) y BSA al 1 % (Sigma). Las células muertas se excluyeron mediante tinción con dAp I (Sigma). La clasificación de células se realizó en un FACS Aria II (BD Bioscience). Para el análisis basado en flujo, las células disociadas se fijaron con paraformaldehído al 4 % (Electron Microscopy Science) durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados en PBS. Las muestras se almacenaron a 4 °C o se tiñeron inmediatamente con anticuerpos conjugados directamente. El análisis de datos se realizó con el software FlowJo. Los anticuerpos contra glucagón de ratón y contra péptido C humano de ratón fueron conjugados internamente por el Núcleo de Anticuerpos de la UCSF y/o con kits de etiquetado de anticuerpos (Molecular Probes) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Anticuerpos conjugados directamente disponibles en el mercado, es decir, los anticuerpos humanos PAX6-Alexa647, Islote-1-PE, NKX6.1-Alexa647, NKX6.1-PE, Cromogranina A-PE, NeuroD1-Alexa647, PDX1-PE y Ki67-Alexa647, eran de BD Bioscience.

Análisis microscópico electrónico

Las esferas se fijaron añadiendo una solución de cacodilato de sodio 0,1 M a 37 °C (Sigma) que contenía paraformaldehído al 2 % (Electron Microscopy Science) y glutaraldehído al 2,5 % (Electron Microscopy Science), CaCl23mM (Sigma), pH final 7,4. A continuación, las esferas se transfirieron a 4 °C durante aproximadamente 18 horas, seguido de un procesamiento y análisis estándar por parte del Laboratorio de Microscopía Electrónica/Núcleo de Microscopía del Centro de Diabetes.

Análisis por inmunofluorescencia

Las esferas se fijaron durante 15-30 minutos a temperatura ambiente con paraformaldehído al 4 %, seguido de múltiples lavados en PBS. La tinción de preparación completa se realizó en suspensión, bloqueando primero durante la noche a 4 °C en un tampón de bloqueo que consiste en bloque CAS (Invitrogen) con TritonX al 0,2 % (Fisher). Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 °C en tampón de bloqueo, seguido de lavados en PBS que contenía Tween-20 al 0,1 % (PBS-T, Sigma) e incubación en anticuerpos secundarios apropiados diluidos en PBS-T durante la noche a 4 °C. El día siguiente, las agrupaciones se lavaron en PBS-T seguido de PBS y se montaron con Vectashield (Vector) sobre portaobjetos de vidrio. Para el seccionamiento de agrupaciones, las esferas se incluyeron en agar al 2 % (Sigma), seguido de deshidratación, inclusión en parafina y seccionamiento. Las secciones cortadas se rehidrataron y se trataron con una solución de recuperación de antígenos (Biogenex) antes de la incubación con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C en tampón de bloqueo. Al día siguiente, las secciones se lavaron 3 veces en p BS-T y se incubaron con anticuerpos secundarios apropiados durante 30-40 minutos a temperatura ambiente en PBS-T. Los anticuerpos secundarios conjugados con Alexa apropiados se adquirieron de JAX o Molecular Probes y se usaron a diluciones de 1:500. Los portaobjetos se lavaron en PBS-T y PBS antes de montarlos en Vectashield. Los núcleos se visualizaron con DAPI. Las imágenes se adquirieron usando un microscopio Leica SP5 o un Zeiss ApoTome. Los anticuerpos primarios se emplearon de la siguiente manera:

continuación

Análisis por qPCR

El ARN total se aisló con TRIZOL (Sigma) o el kit micro/mini RNAeasy (Qiagen) y se transcribió inversamente usando el kit iScript cDNA (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis por qPCR se realizó en un sistema de PCR en tiempo real rápida ABI 7900 HT (Applied Biosystems) y un sistema en tiempo real CFX Connect (Biorad) usando protocolos estándar. Los cebadores fueron Taqman Probes (Applied Biosystems) y/o como se publicó anteriormente (Liu et al, 2014). Los valores de p se calcularon usando una prueba de la t de Student bilateral.

Análisis de contenido

Los análisis de insulina, péptido C humano y proinsulina se realizaron midiendo una alícuota de agrupaciones lisadas con etanol ácido con kits ELISA disponibles en el mercado (Insulina Cat. 80-INSMR-CH10, péptido C humano cat. 80-CPTHU-CH01 y proinsulina Cat. 80-PINHUT-CH01; todo de Alpco). El ADN total se cuantificó mediante el ensayo PicoGreen (Invitrogen) y se normalizó al porcentaje de células positivas para péptido C en cada muestra.

Transferencia de Western para Proinsulina/Insulina:

Los lisados celulares se resolvieron en geles SDS-PAGE con gradiente de acrilamida al 4-12 % (NuPAGE, Invitrogen) normalizados a ADN celular (Quant-iT dsDNA, Molecular Probes). A continuación, las muestras se electrotransfirieron a membranas de nitrocelulosa y se sometieron a inmunotransferencia con antiinsulina de cobaya, que reconoce tanto la proinsulina como la insulina, como se describió previamente (Haataja et al, 2013). Se usó inmunotransferencia con antitubulina como control de carga confirmatorio. Se usaron anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Jackson ImmunoResearch) para la detección de quimioluminiscencia mejorada (Millipore). El análisis se realizó cuatro veces con islotes humanos aislados usados como control positivo.

Secreción de insulina estimulada por glucosa

Se transfirieron islotes humanos o esferas derivadas de hES a tubos y se lavaron dos veces con tampón bicarbonato de Krebs-Ringer (KRB) que contenía glucosa 2,8 mM. Las muestras se incubaron durante una hora en KRB que contenía glucosa 2,8 mM para permitir el equilibrado de las células. Se retiró el tampón 2,8 mM y se reemplazó con KRB fresco que contenía glucosa 2,8 mM durante una hora seguido de incubación durante otra hora en KRB que contenía glucosa 16,7 mM. Después del período de incubación, los tampones se recogieron para el análisis ELISA específico del péptido C humano usando un kit disponible en el mercado (Alpco).

EJEMPLO 2

La diferenciación pancreática de hESC usando un sistema de cultivo a gran escala da como resultado dos subconjuntos distintos de células productoras de insulina.

Para generar células pancreáticas de tipo beta a partir de PSC humana, se estableció un sistema de cultivo en suspensión tridimensional escalable basado en métodos notificados previamente (Schulz et al, 2012; Rezania et al, 2012) (figura 1A). Para monitorizar la generación de células productoras de insulina vivas y facilitar su aislamiento, se empleó la línea celular indicadora INSGFP/W de referencia recientemente publicada (Micallef et al, 2012) en la que la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) está bajo el control del promotor de insulina endógeno. Usando este protocolo de diferenciación, la expresión de la GFP indicadora se observó fácilmente en el día 13 y aumentó a partir de entonces, lo que dio como resultado un promedio del 37±8 % de células positivas para GFP entre los días 19-24 (figura 1B-D). La validez de GFP como un sustituto preciso de la insulina se verificó mediante tinción con un anticuerpo específico de insulina, que reveló un porcentaje aún mayor de células productoras de insulina (hasta un 60 %), probablemente debido a la acumulación tardía del marcador de fluorescencia (figura IE). Se obtuvieron resultados similares con un anticuerpo específico para el péptido C humano, excluyendo la reactividad de los anticuerpos debido a la captación de insulina a partir de medios de cultivo (figura IE). La tinción conjunta para péptido C humano y glucagón (GCG), una hormona normalmente producida por las células alfa, mostró que el 4,3 % y el 13,2 % de todas las células exhibieron un fenotipo polihormonal en el día 13 y el día 19, respectivamente (figura IF). La tinción conjunta para el péptido C y NKX6.1 en el día 20 indicó la presencia de algunas células de tipo beta positivas dobles (figura 1G). El análisis por citometría de flujo cuantitativo reveló que la proporción de células de tipo beta doblemente positivas para INSULINA y NKX6.1 aumentó de menos del 2,5 % en el día 13 a aproximadamente el 12 % de células en el día 19 de las células totales (figura 1G). El análisis ultraestructural de cultivos diferenciados mostró células que contenían vesículas secretoras con un núcleo denso en electrones rodeado por un halo escaso en electrones (figura 1H), una morfología que recuerda a las vesículas de insulina que se encuentran en las células beta humanas. La mayoría de las células, sin embargo, exhibió una mezcla de gránulos secretores que normalmente se encuentran en las células no beta de las preparaciones de páncreas humano (figura 1H). Por tanto, experimentos de diferenciación que emplean protocolos publicados (Schulz et al, 2012; Rezania et al, 2012) dan como resultado la generación eficiente de dos poblaciones distintas de células productoras de insulina: células INS+ que no coexpresan el TF NKX6.1 crítico y se manifiestan como células polihormonales, y células de tipo beta INS+/NKX6.1 que se asemejan más a las células beta humanas. Perceptiblemente, las células de tipo beta INS+/NKX6.1+ están ausentes de los cultivos en puntos de tiempo tempranos, pero aparecen y aumentan en número en etapas posteriores de diferenciación, lo que indica que se derivan de un tipo de célula progenitora distinta.

EJEMPLO 3

Definición de las actividades temporales de factores de señalización individuales para generar de manera eficiente poblaciones de progenitoras de páncreas PDX1+ y PDX1 /NKX6.1+ mientras se previene la inducción precoz de la diferenciación endocrina.

Para caracterizar el tipo de progenitores presentes en la diferenciación de cultivos en el punto de inducción endocrina, se realizó un análisis detallado de la evolución temporal para la expresión de los marcadores pancreáticos PDX1, NKX6.1, NEUROG3, GCG e INS (figura 7). La alta expresión del marcador progenitor PDX1 se indujo y se mantuvo de manera eficiente a partir de un día después de la adición combinada de ácido retinoico (R), el inhibidor de SHH ciclopamina (C) y el inhibidor de BMP nogina (N) a los medios de cultivo (denominados RCN, Día 6, figuras 7A y B). El tratamiento posterior con factor de crecimiento epidérmico (EGF), KGF y N (EKN) dio como resultado la sólida generación de células positivas dobles PDX1+/NKX6.1+ que alcanzaron el 67 % de la población total en el día 11 (figuras 7A y B). El análisis por inmunofluorescencia reveló que el cóctel RCN de factores ampliamente usado para generar endodermo pancreático también induce la expresión precoz de NEUROG3 en progenitoras pancreáticas PDX1+. De hecho, la expresión de NEUROG3 se puede detectar ya en el día 6, cuando la proteína NKX6.1 está ausente de todas las células (figuras 7A y B). Por consiguiente, las células que expresan insulina que se detectan por primera vez 4 días después de la inducción de NEUROG3 (a partir del día 10), no coexpresan NKX6.1 y son en su mayoría polihormonales (figuras 1F y G, y figura 7C). En cambio, las células de tipo beta positivas dobles para INS/NKX6.1 pueden detectarse fácilmente solo en puntos de tiempo posteriores (día 19, figura 1G), lo que indica que estas células se diferencian de las células progenitoras positivas dobles para PDX1/NKX6.1. Por tanto, se esperaba que la generación robusta de células progenitoras PDX1+/NKX6.1+ antes de la inducción de NEUROG3 permitiera la generación eficiente de células de tipo beta in vitro. Para determinar cuáles de los factores usados entre los días 6-8 en el protocolo original (R, C y N) fueron responsables de la inducción de PDX1, NKX6.1 y NEUROG3, se incubaron esferas con cada uno de los factores solos o en diferentes combinaciones durante los días 6-8 (figura 2A). Los medios basales con B27 pero sin ningún factor adicional sirvieron como condición de control. Al final del día 8, cada una de estas seis condiciones se subdividió adicionalmente en tres grupos de tratamiento diferentes: la composición de los medios permaneció igual que durante los días 6-8 (grupo 1), o se cambió a EK (grupo 2) o a EKN (grupo 3), lo que dio como resultado 18 condiciones experimentales individuales (figura 2A). Las esferas cultivadas en cada condición se analizaron el día 9,5 mediante citometría de flujo para cuantificar la expresión de PDX1 y NKX6.1, y mediante análisis por inmunofluorescencia convencional para la expresión de NKX6.1 y NEUROG3. Como se muestra en la figura 2B, esferas dentro del grupo 1 que habían estado expuestas al ácido retinoico durante los días 6-8, ya sea solo o en combinación con otros factores (condiciones 4, 5 y 6), exhibieron una generación altamente eficiente de progenitoras positivas para PDX1 (>88 %), mientras que la adición de C o N solos (condiciones 2 y 3) no dio como resultado una generación mejorada de células PDX1+ sobre los medios basales solos. NKX6.1 se indujo solo débilmente en todas las condiciones del grupo 1, con la excepción de RC (condición 5), que produjo un 45 % de células doblemente positivas para PDX1/NKX6.1. La expresión de NKX6.1 también se indujo fuertemente cuando las células se expusieron a ácido retinoico solo o en combinación con otros factores, seguido del tratamiento con EK (grupo 2) o EKN (grupo 3) (figuras 2B y C, condiciones 10-12 y 16-18). La diferenciación endocrina, marcada por la expresión NEUROG3, se notó solo cuando las esferas habían sido expuestas a N, ya sea entre los días 5-9,5 (figura 2C, condiciones 3, 6, 9 y 12) o comenzando al final del día 8 (figura 2C, grupo 3, condiciones 13-18). Se detectaron muy pocas células NEUROG3+ en todas las demás condiciones (figura 2C, condiciones 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 y 11). El análisis por qPCR en el día 8 de NEUROG3 y sus transcritos de ARNm de NKX2.2 diana aguas abajo reveló niveles significativamente más bajos de estos marcadores endocrinos con tratamiento R en comparación con la condición RCN comúnmente empleada (figura 7D). Perceptiblemente, la adición de vitamina C, que demostró recientemente reducir la diferenciación endocrina en hESC (Rezania et al, 2014), no redujo significativamente los transcritos de NGN3 o NKX2.2 en nuestro sistema de cultivo en suspensión durante el tratamiento con RCN o R (figura 7D). En conjunto, estos resultados indican que el tratamiento con R seguido de EK conduce a una generación altamente eficiente de progenitoras PDX1+/NKX6.1+ (90 %) y que la formación de auténticas precursoras endocrinas positivos para NEUROG3 se induce mediante tratamiento con N (figura 2 A-C, condición 10, ventanas verdes). Por tanto, al definir las actividades temporales de los factores de señalización individuales solos y en combinación, se pueden inducir patrones de expresión del factor de transcripción característicos de diferentes tipos de células progenitoras pancreáticas embrionarias humanas (progenitoras PDX1+ y PDX1+/NKX6.1+) sin una inducción precoz de la diferenciación endocrina.

EJEMPLO 4

Recapitulación de la organogénesis del páncreas humano para generar progenitoras endocrinas

Este protocolo de diferenciación mejorado y simplificado proporciona la base para la posterior formación eficiente de células productoras de insulina en suspensión (figura 3A). La diferenciación endocrina en células doble positivas para PDX1/NKX6.1 fue inducida por la exposición a un cóctel de factores que consiste en TBP (T), inhibidor de ALK (A), N y K, (TANK) que previamente se ha demostrado que activan la expresión de NEUROG3 mientras mantienen una alta expresión de PDX1 y NKX6.1 (Rezania et al, 2012; Nostro et al, 2011) (figuras 3A y B). Mientras que la proteína NEUROG3 era indetectable antes del tratamiento con TANK (figura 3C, día 9), las células que presentaban acumulación nuclear de proteína NEUROG3 aparecieron tan pronto como un día después del tratamiento con TANK (figura 3C, día 10). Por tanto, la expresión del factor proendocrino NEUROG3 se induce rápidamente a través del tratamiento con TANK una vez que se especifican las progenitores PDX1+/NKX6.1+ (figura 3b , día 9). En contraste con la generación casi uniforme de poblaciones progenitoras PDX1+ y PDX1+/NKX6.1+ después de la estimulación apropiada, la diferenciación endocrina parece estar confinada a una población más pequeña de células. Esta observación puede explicarse por la semivida muy corta de la proteína NEUROG3 (Roark et al, 2012), que solo permite la detección transitoria de este marcador en células que experimentan diferenciación endocrina. Las células NEUROG3+, sin embargo, continuaron estando presentes cuando las agrupaciones se expusieron al cóctel de diferenciación endocrina durante 5 días (figura 3C, día 14), lo que indica que las células endocrinas se generaron durante este período. Para caracterizar aún más a las progenitoras presentes en los cultivos de los inventores al inicio de la diferenciación endocrina, se analizó la expresión de NKX2.2, una diana aguas abajo de NEUROG3. Recientemente se notificó que NKX2.2 tiene patrones de expresión distintos durante la organogénesis pancreática en ratón y ser humano (Jennings et al, 2013). Si bien NKX2.2 es fácilmente detectable en células progenitoras pancreáticas de ratón antes de la expresión de NEUROG3, la proteína NKX2.2 solo se observa después del compromiso endocrino durante el desarrollo del páncreas humano. Análogamente, se detectó la expresión de la proteína NKX2.2 solo después de que se inicia la diferenciación endocrina en el día 10, pero no antes en las progenitores PDX1+ o PDX1+/NKX6.1+ (figura 3C). Cabe destacar que, algunas células NKX2.2+ en el día 10 coexpresan NEUROG3, y se encuentran números crecientes de células NKX2.2+/NEUROG3- en puntos de tiempo posteriores (figura 3C). Estos datos indican que NKX2.2 podría servir como marcador de linaje para células humanas que han sufrido una diferenciación endocrina inducida por la expresión transitoria de NEUROG3. Resumiendo, se ha establecido una nueva estrategia de diferenciación que recapitula fielmente la organogénesis del páncreas humano y permite el control preciso sobre la generación de progenitoras PDX1+ y PDX1+/NKX6.1+.

EJEMPLO 5

La generación eficiente de células progenitoras pancreáticas PDX1+/NKX6.1+ antes de la inducción endocrina da como resultado células de tipo beta sensibles a la glucosa.

Para probar la expectativa de que la activación precoz de la expresión de NEUROG3 da como resultado células polihormonales inmaduras y no células de tipo beta positivas dobles para INS/NKX6.1, se inició la diferenciación endocrina en el día 7 en progenitoras pancreáticas PDX1+ al exponer las células a los inductores de NEUROG3 ALKi y nogina (figura 8A). Mientras que algunas células positivas para una sola hormona estaban presentes el día 13, muchas células endocrinas fueron doblemente positivas para el péptido C y el glucagón (figura 8B). En apoyo adicional de la expectativa de los inventores, prácticamente todas las células positivas para péptido C carecían de expresión de NKX6.1 (figura 8C). Para probar si las células progenitoras PDX1+/ n Kx 6.1+ correctamente especificadas se diferencian hacia células de tipo beta positivas dobles para INS/NKX6.1, se transfirieron esferas diferenciadas usando el nuevo método de los inventores a un medio basal sin factores de crecimiento adicionales y se monitorizó el establecimiento de células de tipo beta (figura 4A). El porcentaje de células GFP+ aumentó del día 13 al día 19, alcanzando un promedio del 23±6 % de células positivas para péptido C humano en los días 19-21, probablemente reflejando la generación continua de células productoras de insulina durante aproximadamente 4 días después de la eliminación de los factores inductores de NEUROG3 (figuras 4B, C). El análisis por inmunofluorescencia de las células productoras de insulina reveló la coexpresión y la localización nuclear de los TF críticos para la función de las células beta (PDX1, NKX6.1 y NKX2.2), pero muy pocas células polihormonales (figura 4D). El análisis por citometría de flujo de agrupaciones diferenciadas mostró un alto porcentaje de células totales (ventanas negras) y células de tipo beta positivas para péptido C (ventanas verdes) teñidas conjuntamente para PDX1, NKX6.1, NXK2.2, ISL1, PAX6, NeuroD1 y Cromogranina A (CHGA) (figura 4E). Estos marcadores normalmente se encuentran tanto en las progenitoras pancreáticas como en las células beta maduras. La cuantificación de la tinción conjunta de células de tipo beta péptido C+ para PDX1, NKX6.1, NKX2.2, ISL1, NEUROD1, PAX6 y Cromogranina A mostró un 84±7 %, 75±20 %, 92±5 %, 86±5 %, 95±4 %, 93±5 % y 93±4 % de células positivas dobles, respectivamente (figura 4F). Perceptiblemente, solo el 3,2 % de todas las células diferenciadas coexpresaron el péptido C y la hormona glucagón (figura 4E, ventana roja). Una característica distintiva importante de las células beta humanas maduras es su capacidad proliferativa restringida. Mientras que el 9,1 ± 3,7 % de las células negativas para el péptido C proliferaban activamente, solo el 0,5 ± 0,6 % de las células de tipo beta positivas para péptido C se tiñen conjuntamente para el marcador de proliferación Ki67, indicando su estado de diferenciación terminal (figuras 9A y B). Por tanto, la estrategia de diferenciación optimizada de los inventores da como resultado la generación predominante de células beta productoras de insulina postmitóticas que coexpresan marcadores críticos de células beta.

Para caracterizar aún más la expresión génica en células de tipo beta en los días 19-20, se aprovechó el marcador vivo de GFP para comparar poblaciones de células de tipo beta GFP+ y GFP- clasificadas con islotes humanos purificados. Las células de tipo beta derivadas de hESC mostraron altos niveles de transcritos del gen de la insulina, comparables a las preparaciones de islotes de cadáver, mientras que las poblaciones negativas para GFP exhiben solo niveles insignificantes de la hormona (figura 5A). También se detectaron niveles de transcrito para otras dos hormonas (GCG y SST) en células GFP+, probablemente debido a la contaminación por la pequeña cantidad de células polihormonales que también expresan el indicador GFP (figuras 5A y 4D y E). De acuerdo con el análisis por inmunofluorescencia (figura 4D), los transcritos para los TF PDX1, NKX6.1 y NKX2.2 que normalmente se encuentran tanto en las células progenitoras como en las células beta maduras se expresaron a niveles comparables en células negativas para GFP, positivas para GFP y de los islotes (figura 5B). Los transcritos para factores de transcripción de células beta humanas maduras mAfA y MAFB se expresaron de manera robusta en islotes humanos y se enriquecieron en células de tipo beta en comparación con las poblaciones GFP-. Los niveles de transcrito de MAFB en células de tipo beta fueron similares a los islotes humanos; los niveles de expresión de MAFA fueron ligeramente inferiores (figura 5B). Otros genes importantes para la funcionalidad de las células beta humanas, incluyendo los componentes del canal KATP, Canal de rectificación interna de potasio, Subfamilia J, Miembro 11 (KIR6.2 también conocido como KCJN11) y casete de unión a ATP, Subfamilia C, Miembro 8 (SUR1 también conocido como ABCC8), la enzima del metabolismo de la glucosa Glucocinasa (GCK, también conocida como HK4) y la Prohormona Convertasa 1/3 (PC1/3) necesaria para la biosíntesis de insulina, se enriquecieron en células de tipo beta positivas para GFP a niveles similares o superiores a los encontrados en los islotes humanos (figura 5C). En cambio, Los niveles de ARNm para el marcador progenitor SOX9 se redujeron en células de tipo beta en comparación con progenitoras GFP-(figura 5D). La expresión algo más alta de SOX9 en los islotes humanos es probablemente el resultado de la contaminación con células ductales positivas para Sox9. Por tanto, el análisis de expresión génica de los inventores indicó que las células de tipo beta derivadas de hESC poseen la maquinaria molecular necesaria para la función de las células beta, incluyendo la biosíntesis de insulina y el metabolismo de la glucosa. Investigaciones posteriores revelaron que las células de tipo beta del día 19 contienen 2,5 ± 1,2 ug, 0,32 ± 0,12 ug y 310 ± 143 ng de insulina, péptido c humano y proinsulina por |jg de ADN, respectivamente (figura 5E). Estos valores son comparables a aproximadamente 2,8 ug de insulina, aproximadamente 0,55 ug de péptido c y aproximadamente 150 ng de proinsulina por jg de ADN para islotes humanos, como se publicó recientemente (Rezania et al, 2014). El análisis por transferencia de Western para la proinsulina y la insulina madura confirmó aún más el procesamiento eficiente de la proteína insulina en células de tipo beta derivadas de hESC, alcanzando el 59±2 % del grado de procesamiento observado en islotes humanos purificados (figuras 10A y B). El análisis ultraestructural de agrupaciones de células diferenciadas por microscopía electrónica de transmisión reveló que muchas células contenían vesículas secretoras que exhibían núcleos densos en electrones o estructuras de tipo varilla, similares a lo que se observa en las células beta humanas (figura 5F). Para investigar más a fondo las propiedades funcionales de células de tipo beta diferenciadas in vitro, se realizaron ensayos de secreción de insulina estimulada por glucosa, en los que se midió la liberación de péptido C humano, un subproducto de la biosíntesis de insulina endógena secretada en una proporción equimolar a la insulina. Las células de tipo beta derivadas de hESC analizadas en los días 19-21 respondieron a un aumento en la concentración de glucosa de 2,8 mM a 16,7 mM secretando 1,8 ± 0,9 veces más péptido C, una respuesta similar al aumento de 1,9 ± 0,6 veces detectado con islotes humanos (figura 5G). Por tanto, las células de tipo beta generadas por la estrategia de diferenciación optimizada de los inventores expresan genes críticos de células beta, sintetizan altos niveles de insulina madura, presentan características ultraestructurales de auténticas células beta y secretan insulina endógena en respuesta a cambios en las concentraciones fisiológicas de glucosa.

EJEMPLO 6

Las células de tipo beta derivadas de hESC siguen siendo sensibles a la glucosa después de un trasplante a corto plazo.

Para determinar si las células de tipo beta derivadas de hESC pueden mantener su sensibilidad a la glucosa in vivo, se trasplantaron aproximadamente 5 millones de células debajo de la cápsula renal de ratones inmunodeficientes (esferas de los días 19-21 que consistían en progenitoras y células de tipo beta). Ratones trasplantados con 4000 islotes humanos sirvieron como controles. De siete a 10 días después de la cirugía, los niveles de péptido C humano se midieron en ratones en ayunas durante la noche, antes y después de la administración de un bolo de glucosa. Como se esperaba, los ratones que recibieron injertos de islotes humanos exhibieron bajos niveles de secreción de insulina en ayunas, seguidos de un marcado aumento de la insulina circulante después de la exposición a glucosa (promedio de 221 ± 116 pM, figura 6A). Al igual que los ratones portadores de islotes humanos, los ratones en ayunas trasplantados con células de tipo beta derivadas de hESC tenían niveles bajos de péptido C circulante. Tras la administración de glucosa, las concentraciones de péptido C en el suero de estos ratones también aumentaron, aunque a niveles más bajos que en ratones trasplantados con islotes humanos (promedio de 40 ± 28 pM, figura 6A). Este número más bajo podría explicarse en parte por los diferentes números de células trasplantadas en los grupos de células de tipo beta e islotes humanos. De hecho, cada islote humano contiene en promedio 1000 células, de las cuales el 50% son células beta (Cabrera et al, 2006). Por tanto, 4000 islotes humanos contienen aproximadamente 2,0 x 106 auténticas células beta. Debido a que las esferas diferenciadas de hESC contienen en promedio un 23 % de células de tipo beta, solo se trasplantaron alrededor de 1,15 * 106 células de tipo beta por ratón. La normalización basada en el número de células beta indica que las células de tipo beta derivadas de hESC secretaron 70 ± 48 pM de péptido c humano por 2,0 x 106 células, lo que representa aproximadamente 1/3 de la insulina secretada por cada célula beta de cadáver humana (figura 6A). La tinción con hematoxilina y eosina, junto con el análisis por inmunofluorescencia de los injertos de hESC a las 2 semanas después del trasplante, demostraron estructuras de tipo islotes prominentes positivas para el péptido C humano (figuras 6B y C). Las células de tipo beta también mantuvieron la coexpresión de los TF de células beta clave PDX1, NKX6.1 y NKX2.2, y solo unas pocas células coexpresaron otras hormonas, tales como glucagón y somatostatina (figura 6C). Para investigar más a fondo las propiedades funcionales de las células de tipo beta derivadas de hES in vivo, se trasplantaron agrupaciones debajo de la cápsula renal de ratones que se volvieron diabéticos mediante el tratamiento con la toxina de las células beta, estreptozotocina. Los ratones que recibieron injertos exhibieron niveles de glucosa en sangre (BG) significativamente reducidos en todos los puntos de tiempo analizados en comparación con los animales de control (figura 6D). Si bien los niveles de BG se redujeron significativamente en los ratones portadores de injertos, estos continuaron exhibiendo valores de glucosa en sangre hiperglucémicos a lo largo del tiempo. Esto probablemente se deba a la cantidad limitada de células de tipo beta que se pueden trasplantar debajo de la cápsula renal en un ratón. Se ha demostrado previamente que se requieren 4000 islotes humanos para establecer la euglucemia de larga duración en ratones diabéticos. El trasplante de un número menor de islotes humanos (1500 islotes) reduce los niveles de glucosa en sangre solo durante los 7 días posteriores al trasplante, después de lo cual regresa la hiperglucemia (Fiaschi-Taesch et al, 2010). El procedimiento quirúrgico de los inventores permite el trasplante de aproximadamente 1,15 * 106 células de tipo beta, sustancialmente menos que las aproximadamente 2,0x106 células beta presentes en los 4.000 islotes humanos que se descubrió previamente que eran necesarios para la reversión de larga duración de la diabetes. Por lo tanto, la reducción observada en los niveles de BG, pero la falta de reversión completa de la diabetes en ratones portadores de trasplantes derivados de hES, no es inesperada dada esta limitación técnica. En conjunto, los datos in vivo demuestran que las células de tipo beta derivadas de hESC mantienen su fenotipo diferenciado y siguen siendo sensibles a la glucosa después de un período de injerto corto in vivo y resalta su valor terapéutico potencial.

Las referencias enumeradas a continuación se citaron en toda la divulgación:

Referencias

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Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un método de generación de una célula progenitora PDX1+ al poner en contacto una célula madre embrionaria con una cantidad eficaz de un compuesto de ácido retinoico y no poner en contacto la célula madre embrionaria con un inhibidor de proteína morfogénica ósea (BMP) antes de la expresión de NKX6.1 por la célula, induciendo así la formación de una célula progenitora PDX1+, en donde la célula madre embrionaria se pone en contacto con una cantidad eficaz de compuesto de ácido retinoico solo para inducir la formación de una célula progenitora PDX1+.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula madre embrionaria es una célula madre embrionaria humana.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además poner en contacto la célula con cantidades eficaces de factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento de queratinocitos, induciendo así la formación de una célula progenitora PDX1+/NKX6.1+.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la célula expresa NKX6.1 antes de que la célula entre en contacto con al menos uno de factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento de queratinocitos.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende además inducir a la célula progenitora PDX1+/NKX6.1+ para que exprese NEUROG3, lo que da como resultado la producción de una célula de tipo beta INS+/NKX6.1+, en donde la expresión de NEUROG3 se induce poniendo en contacto la célula progenitora PDX1+/NKX6.1+ con una cantidad eficaz de un inhibidor de proteína morfogénica ósea, un inhibidor de TGFp/ALK, un inhibidor de Sonic Hedgehog, o con cantidades eficaces de una proteína de unión a TATA, un inhibidor de cinasa de tipo receptor de activina, nogina y factor de crecimiento de queratinocitos.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la célula progenitora PDX1+/NKX6.1+ se pone en contacto con una cantidad eficaz de proteína morfogénica ósea y una cantidad eficaz de un inhibidor de TGFp/ALK.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la expresión de NEUROG3 comienza antes de que se detecte la expresión de NKX2.2.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde no más del 5 % de las células generadas son células polihormonales.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la célula de tipo beta INS+/NKX6.1+ es sensible a los niveles de glucosa.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la célula de tipo beta INS+/NKX6.1+ secreta un nivel aumentado de insulina en respuesta a un nivel aumentado de glucosa.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la célula de tipo beta INS+/NKX6.1+ no expresa un nivel detectable del marcador Ki67.