TW202242095A - 安全免疫隱形細胞 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關於安全之免疫隱形植入式細胞及其預防、治療或治癒疾病的用途。
Description
本發明係有關哺乳動物細胞領域，以及這類細胞作為植入用之供體細胞的用途。
序列表之引用併入序列表
本發明係與一電子形式之序列表一起提交。序列表之全部內容特此以引用之方式併入。
目前正在研究可通用植入的組織及/或細胞，以期獲得顯著的益處，諸如在供體/受體免疫學特徵不匹配或有自體免疫疾病（第1型糖尿病(T1D)）的情況下降低移植排斥風險。
為了限制移植排斥風險，自體移植是一種選擇，通過從患者身上提取幹細胞、進行擴增、分化再移植回同一患者體內。然而，此過程在技術上非常困難且費用昂貴。
組織不匹配排斥是通過第I類HLA（人類白血球抗原）肽複合物及隨後基於T細胞的組織破壞所介導的。耗盡第I類HLA肽複合物可免除大多數細胞的組織匹配要求。
現存在有6種第I類HLA肽複合物：高度多型性的第I類HLA肽複合物HLA-A、HLA-B及HLA-C，以及較低多型性的第I類HLA肽複合物HLA-E、-F及-G。
可以經由以下兩種途徑之一來耗盡第I類HLA肽複合物：
1) 藉由直接去除所有六個高度多型性第I類HLA的等位基因，或
2) 藉由消除β2微球蛋白(B2M)之蛋白質。B2M是所有HLA-I複合物轉移到細胞表面所必要的。B2M蛋白的缺乏會使細胞表面失去了所有第I類HLA肽複合物。
儘管缺乏泛第I類HLA的細胞被保護免受不匹配排斥，但因為缺少第I類HLA-E複合物，其容易受到自然殺手細胞排斥（NK細胞）的影響。當存在於細胞表面時，第I類HLA-E複合物會向NK細胞傳遞抑制信號。在沒有HLA-E複合物的情況下，此抑制信號的喪失導致NK細胞裂解缺失HLA的細胞。
解決NK裂解問題的嘗試係依賴於與HLA-E蛋白融合之B2M蛋白的工程化變體的表現(WO19032675)。一種方法（Gornalusse等人，Nature Biotechnology 2017）是在融合蛋白中預先建立一呈信號肽/B2M/HLA-E三聚體形式之信號肽（HLA第I類前導肽序列），以增加該複合物的穩定性及膜表現。大多數重要的研發計劃係使用包含有融合（或「預結合」）HLA-G衍生的信號肽作為HLA第I類前導肽之融合構築體。
在生成缺失HLA的細胞（也稱為「通用供體」細胞）時的一個公認問題是，這些細胞對於病毒感染或腫瘤轉化的免疫監視變得靜默。但仍有一相關風險，即在病毒感染或惡性反分化後，該等細胞不再受常規免疫監視的影響，且這引發了安全隱患。
仍然需要改進的安全通用供體細胞。
Gornalusse G.等人(Nature Biotechnology 2017)公開了表現HLA-E的多功能幹細胞。
WO2012145384公開了缺失B2M微球蛋白的細胞。
US8586358B2公開了HLA單倍型同型合子的HLA同源型細胞。
US20040225112A1公開了編碼單鏈人類HLA-E蛋白質的基因，以防止NK細胞介導的細胞毒性。
Deuse等人(Nature Biotechnology, 2019)公開了敲除B2M及CIITA並加入CD47。
WO19032675公開了一種經分離的基因修飾T細胞，其包括編碼一包括有B2M蛋白與HLA-E及/或HLA-G蛋白之融合蛋白的序列。
WO18005556據稱公開了包括有MHC-E分子的細胞。
Young等人Cancer Gen. Therapy (2000), 7:240-246公開了使用單純皰疹病毒–胸腺嘧啶激酶(HSV-TK)基因之更昔洛韋(ganciclovir)介導的細胞殺傷。
在一態樣中本發明提供一種包括有B2M/HLA-E基因（諸如B2M/HLA-E*0101及B2M/HLA-E*0103基因）之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞不包括其他可表現的B2M基因。於一實施例中，所述哺乳動物細胞在不同的已知位置具有至少4個HSV-TK基因的敲入，其中至少一個或至少兩個為TK-sr39基因。
在另一態樣中本發明提供一種哺乳動物細胞，其具有B2M/HLA-E基因（諸如B2M/HLA-E*0101及B2M/HLA-E*0103基因二者）敲入另外之缺乏B2M及HLA-II的細胞內，例如缺乏CIITA的細胞。
在另一態樣中本發明提供一種包括有B2M/HLA-E基因之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞不包括其他可表現的B2M基因，且其缺失CIITA，並在不同的已知位置具有4個HSV-TK基因的敲入，且其中所述4個HSV-TK基因之至少一個或至少兩個為TK-sr39基因。
在另一態樣中本發明提供一種包括有B2M/HLA-E*0101及B2M/HLA-E*0103基因之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞不包括其他可表現的B2M基因，且其缺失CIITA，並在不同的已知位置具有4個HSV-TK基因的敲入，且其中所述4個HSV-TK基因之至少一個或至少兩個為TK-sr39基因。
在一態樣中本發明提供一種製造植入式哺乳動物細胞之方法，其包括以下步驟：
● 提供一哺乳動物細胞，
● 敲入至少一B2M/HLA-E融合基因（諸如B2M/HLA-E*0101基因及/或B2M/HLA-E*0103基因）至所述哺乳動物細胞內，
● 使所述哺乳動物細胞的原生B2M基因失活，
● 在不同的已知位置敲入4個HSV-TK基因且其中所述4個HSV-TK基因之至少一個或至少兩個為TK-sr39基因。
藉此獲得所述植入式哺乳動物細胞。
在另一態樣中本發明提供一種製造植入式哺乳動物細胞之方法，包括以下步驟：
● 提供一哺乳動物細胞，
● 敲入至少一B2M/HLA-E融合基因（諸如B2M/HLA-E*0101基因及/或B2M/HLA-E*0103基因）至所述哺乳動物細胞內，
● 使所述哺乳動物細胞的原生B2M基因失活，
● 在不同的已知位置敲入4個HSV-TK基因且其中所述4個HSV-TK基因之至少一個或至少兩個為TK-sr39基因。
● 使所述哺乳動物細胞分化，
藉此獲得所述植入式哺乳動物細胞。
在一態樣中，所述4個HSV-TK基因包括2個TK-sr39基因複本及2個野生型HSV-TK基因複本。
在一態樣中，所述哺乳動物細胞為人類細胞。
在一進一步態樣中，所述哺乳動物細胞為幹細胞。
在一態樣中，所述幹細胞為胚胎幹細胞。在另一態樣中，所述幹細胞為多功能幹細胞。在又另一態樣中，所述幹細胞係處於已分化階段。在另一態樣中，所述幹細胞為經誘發的多功能幹細胞(iPSC)。
在又一態樣中本發明係提供根據本發明之哺乳動物細胞之用於預防、治療或治癒慢性或急性疾病的用途。換言之，本發明係提供一種根據本發明之使用於預防、治療或治癒慢性或急性疾病的哺乳動物細胞，或供使用於預防、治療或治癒慢性或急性疾病的哺乳動物細胞。
於一實施例中，此慢性疾病係包括或選自由以下所組成之群組：糖尿病、第1型糖尿病、第2型糖尿病、乾性黃斑部病變、色素性視網膜炎、神經系統疾病、帕金森氏病、心臟病、慢性心臟衰竭、組織纖維化、硬化、聽力損失、角膜失明、中風及慢性腎臟病。
於一實施例中，該急性疾病係包括細菌性肺部感染，諸如呼吸器獲得性細菌性肺炎及醫院獲得性細菌性肺炎。
本發明提供了經改良通用供體細胞。相較於先前技術之通用供體細胞，本發明之細胞對於患者更有通用性也更安全。
定義幹細胞：
如本文所用，術語「幹細胞」應理解為具有分化潛能和增殖能力(特別是自我更新能力)但保持分化潛能的未分化細胞。術語「幹細胞」包含了亞群，根據分化潛能諸如為多功能幹細胞(PSC)、多潛能幹細胞、單能幹細胞及類似物。
多功能幹細胞，亦稱為多功能細胞，或多功能SC，或PSC：
如本文所用，這些術語是指能夠在體外培養並且具有分化為屬於三個胚層(外胚層、中胚層、內胚層)的任何細胞譜系之能力的幹細胞。PSC可以從受精卵、複製胚胎、生殖幹細胞、組織中的幹細胞、體細胞及類似細胞誘導。PSC的實例包括胚胎幹細胞(ESC)、經誘發的多功能幹細胞(iPSC)、胚胎生殖細胞(EG細胞)及類似細胞。從間充質幹細胞(MSC)獲得的Muse細胞(多譜系分化壓力忍受細胞)和從生殖細胞(例如睾丸)產生的生殖幹細胞(GS細胞)，也涵蓋於PSC術語中。因此，本發明中使用的多功能幹細胞可以是由囊胚製備的胚胎幹細胞，如在WO 03/055992和WO 2007/042225中所述者，或者是可商購的細胞或細胞株。ES細胞株也可以衍生自單一卵裂球，而不會破壞子宮內胚胎，也不會影響臨床結果(Chung等人(2006)和Klimanskaya等人(2006))。
經誘發的多功能幹細胞、iPS、iPSC：
如本文所用，術語「經誘發的多功能幹細胞」(也稱為iPS細胞或iPSC)是指可經由通常稱為重新程式化的過程直接從成體細胞產生的PSC種類。藉由引入特定的富潛能性-相關基因集之產物，可以將成體細胞轉化為PSC。胚胎幹細胞也可以衍生自孤雌單倍體(parthenotes)，如WO 2003/046141中所述。另外，可以從單一卵裂球或經由培養獲得的內部細胞團產生胚胎幹細胞，而不會破壞胚胎。胚胎幹細胞可由特定的體制獲得，也可商購獲得。較佳地，本發明的方法和產物基於hPSC，即衍生自iPSC或胚胎幹細胞(包括孤雌單倍體)的幹細胞。
內分泌前驅細胞的特徵在於表現標記物NGN3、NeuroD及NKX2.2。
NGN3+/NKX2.2+雙陽性細胞係為共表現NGN3及NKX2.2這兩種標記物的細胞。
如本文所用之「NeuroD」係為鹼性螺旋-環-螺旋(bHLH)轉錄因子之NeuroD家族的一員。如本文所用之「NGN3」係為鹼性螺旋-環-螺旋轉錄因子之神經元素(neurogenin)家族的一員。如本文所用之「NKX2.2」及「NKX6.1」係為NKX轉錄因子家族的成員。
如本文所用之「INS+」係為一種產生胰島素的細胞。
如本文所用之術語「分化」或「細胞分化」、「分化的」係指細胞的分化。細胞分化為細胞從一種細胞類型轉變為另一種細胞類型的過程，通常是從不太特化的類型（諸如幹細胞）轉變為更特化的類型（諸如組織特異性細胞，例如心肌細胞）。術語「已分化的」或「未分化的」係指細胞在細胞分化過程中的分化階段。
等位基因：
如本文所用之術語「等位基因」係指一指定基因的變異體。例如，HLA-E 0101及HLA-E 0103為HLA-E基因的變異體，也稱為等位基因或同種型。
B2M:
如本文所用之術語「B2M」係指貝他2微球蛋白，即β2微球蛋白。術語「B2M基因」係指代編碼B2M蛋白質的基因。B2M蛋白質是所有第I類HLA蛋白的次單位。B2M蛋白是第I類HLA蛋白易位到細胞表面所必需的。在人類中，B2M基因位於第15號染色體上。
缺失B2M的細胞：
如本文所用之術語「缺失B2M的細胞」意指一種不包括B2M蛋白的細胞。例如，細胞因為其不具有可表現的B2M基因而為「缺失B2M的」，例如因為所有B2M基因不活化或因為會導致不能表現B2M蛋白的任何修飾。例如，該B2M基因可能完全不存在於細胞中，或其可能在功能上有缺陷，例如失活或損壞，使其不被表現或不編碼功能性的B2M蛋白。在缺失B2M的細胞中，沒有HLA第I類蛋白存在於細胞表面上。
於細胞包括有B2M/HLA基因融合體的上下文中，所述細胞為「另外之缺乏B2M的細胞」，措詞「另外之缺乏B2M的細胞」意指除了所述B2M/HLA基因融合體之外，該細胞不包括能夠表現B2M蛋白的基因，換言之，該細胞中能夠表現B2M蛋白的唯一基因是所述B2M/HLA基因融合體。
B2M/HLA-E基因或蛋白質：
如本文所用之術語「B2M/HLA-E基因」係等同於「B2M/HLA-E融合基因」，其表示編碼了包括有B2M部分及HLA-E部分之蛋白質的基因融合構築體，其等同於「B2M/HLA-E融合蛋白」。如本文所用，除非另有說明，否則術語「B2M/HLA-E基因」及「B2M/HLA-E融合基因」係指其任何功能變化形式，其中該基因具有表現相應的融合蛋白的能力，且其中所表現的B2M/HLA-E融合蛋白具有易位到細胞表面。
B2M/HLA-E*0101蛋白：
如本文所用之術語「B2M/HLA-E*0101蛋白」意指包括有「B2M」部分及「HLA-E」部分之融合蛋白，其中該HLA-E部分為0101同種型，亦稱為0101等位基因，即包括有一個B2M功能性肽與一個HLA-E 0101功能性肽之融合蛋白。
B2M/HLA-E*0101基因：
如本文所用之術語「B2M/HLA-E*0101基因」係指編碼B2M/HLA-E*0101蛋白之基因融合構築體。
HLA/MHC：
術語「HLA」係代表人類白血球抗原。如本文所用，HLA係指眾所周知之負責調節哺乳動物免疫系統的HLA系統。「HLA基因」係編碼「HLA蛋白」，亦稱為「MHC蛋白」。「MHC」係代表「主要組織相容性複合體」。
功能性「HLA蛋白」（或「MHC蛋白」）係易位至細胞表面並於需要時誘導免疫反應。在人類中，HLA基因位於第6號染色體上。
第I類HLA蛋白為異二聚體，且包括高度多型性的HLA-A、HLA-B及HLA-C蛋白，以及較低多型性的HLA-E、HLA-F及HLA-G蛋白。第I類HLA蛋白通常存在於人類所有有核細胞的表面。
第I類HLA蛋白的作用是將小肽（本文所稱的「內源性肽」）從細胞內部呈現在細胞外表面。在細胞感染的情況下，第I類HLA肽會將來自入侵病原體（如病毒）的小肽呈現在細胞外表面，這被識別為「非自身的」（或「外來的」或「抗原」），並通過免疫系統破壞細胞而誘發免疫反應。在沒有細胞感染的情況下，第I類HLA肽會在細胞外表面呈現一內源性小肽，例如來自HLA-E（HLA-E片段），這小肽會被識別為「自身的」（或「自身抗原」），不會誘發免疫反應。
第II類HLA蛋白為異二聚體，且包括HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ及HLA-DR。第II類HLA蛋白通常存在於專業的抗原表現細胞。
第II類HLA蛋白的作用是將主要衍生自外源的抗原呈現在細胞表面，並啟動一抗原特異性免疫反應（經由CD4(+) T淋巴細胞）。
在人類細胞的上下文中，術語「HLA」係指在人類中已知的HLA基因。在非人類哺乳動物細胞的上下文中，術語「HLA」係指在所述細胞中已知之對應HLA的基因，其在一些物種中可能以不同方式命名，例如「MHC」(「主要組織相容性複合體」)基因。例如，在豬中，HLA-E基因被命名為SLA6。
細胞基因型：
「基因A
-/-細胞」係指基因A的兩個複本都不具有功能的細胞，例如被刪除或以其他方式破壞。「基因A
+/-細胞」係指一種其中基因A的一個複本是有功能的而第二個複本不具功能的細胞，例如被刪除或以其他方式破壞。「基因A
+細胞」是指該細胞僅包括基因A的一個複本，且所述基因A的一個複本是有功能的。
細胞表面表現型：
如本文所用之詞句「HLA-A/B/C
-/-細胞之細胞表面表現型」係指不具有HLA-A、HLA-B及HLA-C蛋白之細胞表面。
如本文所用之詞句「HLA-E*0101
+HLA-E*0103
+細胞之細胞表面表現型」係指包括有從每一個HLA-E等位基因的一個複本表現之HLA-E*0101蛋白及HLA-E*0103蛋白的細胞表面。
CIITA / 缺失CIITA的：
術語「CIITA」係代表「第II類主要組織相容性複合體，轉活化因子」。如本文所用之術語「CIITA」係指代「CIITA基因」或「CIITA蛋白」，即由CIITA基因編碼之蛋白。CIITA蛋白為涉及全部第II類HLA肽之轉錄之轉錄因子。在人類基因體中，CIITA蛋白位於第16號染色體上。
如本文所用之術語「缺失CIITA的」意指「不具有功能性CIITA基因」。「缺失CIITA的細胞」意指一種不表現功能性CIITA蛋白的細胞。例如，細胞因為其不具有可表現的CIITA基因而為「缺失CIITA的」，例如因為所有CIITA基因不活化或因為會導致不能表現CIITA蛋白的任何修飾。在缺失CIITA的細胞中，沒有HLA第II類蛋白存在於細胞表面上。
在人類細胞的上下文中，術語「CIITA」係指在人類中已知的CIITA基因。在非人類哺乳動物細胞的上下文中，術語「CIITA」係指在所述細胞中已知之對應CIITA的基因，其在一些物種中可能以不同方式命名。
不同的已知位置：
如本文所用之詞句「在已知的(多個)位置」係指「在一靶定基因座」。該詞句係指基因修飾，諸如在基因體的特定靶定基因座(位置)中插入、刪去或破壞，相對於基因體中隨機位置的隨機基因修飾而言。尤其在敲入方面，詞句「在不同的已知位置」的表達係指，感興趣的基因不是插入在基因體中的隨機位置，而是插入到預先確定且特別靶定的基因座上。這樣做的好處是確保所插入基因的表現程度一致，例如，靶定安全港基因座。
如本文所用之詞句「在不同位置」係指「在基因體上之不同基因座」。該詞句指的是(例如)一個以上的核酸序列插入，其中所述二或多個核酸序列未插入在基因體上的相同基因座，即，在基因體上的一個相同位置。相反地，所述二或多個核酸序列被插入到基因體上的不同基因座。例如，若插入在相同的染色體上，則該二或多個序列在插入後會彼此相隔若干核苷酸。詞句「不同位置」可包含位於一對染色體之兩條染色體上的相同基因座。
EF1a mini、EF1a、UbC、PGK、CMV及CAG啟動子：
EF1a啟動子係代表人類延長因子1α啟動子，UbC啟動子係代表人類泛素C啟動子，PGK啟動子係代表小鼠磷酸甘油酯激酶1啟動子，CMV啟動子係代表巨細胞病毒迅早期啟動子，CAG（或CAGG）啟動子係代表與CMV早期增強子偶聯之雞β-肌動蛋白啟動子。這些啟動子為可用以驅動異位基因表現的持續性啟動子。
UCO及UCOE：
UCOE係代表泛素性染色質開放元件。UCO元件可防止啟動子的靜默。UCO元件可放置在啟動子的上游。
可表現之B2M基因：
如本文所用之措詞「可表現之B2M基因」意指可藉由細胞轉錄機制而轉錄為B2M mRNA的基因且所述mRNA可藉由細胞轉譯機制而轉譯為B2M蛋白的基因。於細胞包括有B2M/HLA基因融合體的上下文中，措詞「不包括其它可表現之B2M基因」意指除了所述B2M/HLA基因融合體之外，該細胞不包括能夠被轉錄及被轉譯成B2M蛋白的基因，換言之，該細胞中能夠表現B2M蛋白的唯一基因是所述B2M/HLA基因融合體。
與其它基因有關的是，措詞「可表現之基因」也意指可藉由細胞機制被轉錄及被轉譯成所述基因所編碼之蛋白的基因。
如本文所用之與基因相關的術語「表現」意指「轉錄成mRNA且轉譯成所述基因所編碼之蛋白」。
GCV：如本文所用之GCV為更昔洛韋的縮寫。
HLA-E雜合：
包括有至少兩種不同HLA-E基因之等位基因的細胞（諸如包括有一個HLA-E*0101基因及一個HLA*0103基因的細胞）之HLA-E是雜合的。
缺失HLA-II的：
如本文所用之術語「缺失HLA-II的細胞」意指在細胞表面上不包括HLA-II蛋白的細胞。在細胞表面上不存在HLA-II蛋白可能是由於該細胞中不存在任何可表現之HLA-II基因所引起，例如，因為所有HLA-II基因的不活化。在細胞表面上不存在HLA-II蛋白可能是由於該細胞缺失CIITA所引起。
HSV-TK基因及TK-sr39：
如本文所用之術語「HSV-TK」係代表單純皰疹病毒(HSV)胸腺嘧啶激酶(TK)，並指代一種自殺轉換系統。如本文所用之術語「HSV-TK基因」係指代一種編碼具有磷酸化諸如更昔洛韋(GCV)及阿昔洛韋(acyclovir, ACV)之TK酶的基因。所述「HSV-TK」酶（亦稱為TK酶）之胺基酸序列，以及所述「HSV-TK」酶之核苷酸序列可為野生型序列或其變異體。
為了觸發HSV-TK
+細胞自殺，例如將更昔洛韋(GCV)提供給HSV-TK
+細胞或寄存有這類細胞的生物體，TK酶將GCV磷酸化而抑制DNA聚合酶，並觸發HSV-TK
+細胞死亡。
術語「野生型TK」(wt TK)係指野生型HSV-TK酶或編碼野生型HSV-TK酶的基因。SEQ ID NO: 9為一個編碼野生型HSV-TK酶的可能基因序列。
術語「TK-sr39基因」係指編碼TK-sr39酶的HSV-TK基因。術語「TK-sr39酶」係指一種包括有相較於野生型HSV-TK之胺基酸序列突變I159、F160、L161、F168及M169的變異TK酶。於參照下，野生型TK胺基酸序列包括L159、I160、F161、A168及L169胺基酸。
TK-sr39亦為Black等人於Cancer Research 61, 3022–3026, 4月1日, 2001中描述。
敲入及敲除：
如本文所用之術語「敲入」係指將一基因插入基因體中。利用敲入技術將基因插入到基因體上的一靶定位置中，這表示該基因被插入到特定的基因座，在該基因體中預先定義好的特定位置上進行敲入，這與其他基因工程方法中的隨機基因插入相反。
如本文所用之術語「敲除」係指通過破壞基因體中的基因而造成的刪除或失活。為了實現對感興趣的指定基因之刪除或破壞，敲除技術通常需要在基因體上特定靶向位置進行基因修飾。
在本領域中有好幾種相當明確的敲入及敲除技術。
Kpb及Mbp：如本文中所用，根據遺傳學及生物技術領域的常識，「Kbp」為「千個鹼基對」的縮寫，意指1,000個鹼基對，而「Mbp」為「百萬個鹼基對」的縮寫，意指1,000,000個鹼基對。
哺乳動物細胞：
如本文所用之術語「哺乳動物細胞」係指一種源自哺乳動物活生物體的細胞，諸如哺乳動物類動物細胞或人類細胞。哺乳動物細胞可處於未分化階段，例如處於多潛能或多能性階段，或處於分化階段，諸如完全成熟階段，或處於分化的中間階段。
如本文所用之用以指代基因或蛋白質的術語係意欲在人類細胞的上下文中指代所述人類基因或蛋白質，且在非人類哺乳動物細胞的上下文中指代對應的基因或蛋白質，尤其是與人類細胞中對應的基因或蛋白質相比下可能在特定哺乳動物物種中以不同方式命名的基因或蛋白質。
匹配HLA類型：
如本文所用之術語「匹配HLA」或「匹配HLA類型」係指在供體細胞與和宿主生物體之間有足夠相似性的HLA同種型，不會誘發免疫系統對供體細胞的排斥。在哺乳動物中，HLA蛋白是個體所特有的。宿主生物體的免疫系統會將供體細胞（例如移植細胞或移植器官中的細胞）細胞外表面上的「不匹配」HLA蛋白識別為「非自身」（或「入侵者」），並誘發免疫反應及對供體細胞的排斥。若供體細胞的HLA蛋白與宿主生物體的HLA蛋白為相同或足夠相似的同種型，即HLA類型與宿主生物體相匹配，則免疫系統會將供體細胞識別為「自身」，不會誘發供體細胞的排斥反應。
原生的：
如本文所用之與細胞中的基因、基因序列或基因座相關的術語「原生的」分別意指該細胞之內源性基因、細胞內源性基因的序列、或細胞內源性基因的基因座。
多型性：
如本文所用之術語「多型性」係指在一指定細胞內存在有不同的同型指定基因。HLA系統中的多型性使得免疫反應更有效且適應性更佳。
預結合的HLA-I前導肽：
若存在「預結合的HLA第I類前導肽」，該融合構築體可變成預結合的HLA第I類前導/B2M/HLA-E融合構築體之三聚融合構築體。例如，「預結合的HLA第I類前導肽」可能是諸如包括在B2M/HLA-E融合構築體中的VMAPRTLIL序列。
蛋白、肽:
除非另有說明，否則術語「蛋白」及「肽」係指其功能變化形式。
安全港：
如本文所用之術語「安全港位點」或「安全港基因座」或「安全港基因體港位點」係指基因體上之一個持續表現的位置，其不會因為表觀遺傳靜默化或轉錄活性的向下調控而靜默。AAVS1及hROSA16是人類基因體中的安全港位點。「AAVS1」係代表腺相關病毒整合位點1，並位於人類第19號染色體上。「hROSA26」係代表「Gt(ROSA)26S的人類形式」或「ROSA26的人類形式」，並位於人類第3號染色體上。CLYBL及CCR5是其他可能的安全港位點，「CLYBL」係代表「類β型檸檬酸鹽裂解」，並位於人類第13號染色體上，「CCR5」係代表「C-C趨化介素第5型」，並位於人類第5號染色體上。
可通用植入細胞、可植入細胞、植入式細胞或通用供體細胞：
如本文所用之術語「可通用植入細胞」或「通用植入式細胞」或「通用細胞」或「通用供體細胞」或「可植入式細胞」或「免疫安全細胞」或「隱形細胞」或「免疫隱形細胞」或「植入式細胞」係皆指代可以移植到宿主生物體中而不會被識別為非自身細胞且因而不會被宿主生物體的免疫系統排斥之細胞。該細胞通常源自於與宿主生物體不同的供體生物體。本發明之目的為提供可安全地植入各種患者體內而不會被排斥的細胞。
植入式哺乳動物細胞以及哺乳動物細胞：
在本發明方法、方法請求項及方法實施例的上下文中，術語「哺乳動物細胞」係指一種在完成本發明的基因修飾之前的細胞，術語「植入式哺乳動物細胞」係指一種包括有本發明的基因修飾的細胞。
野生型及變異體：
如本文中所用之術語「野生型」在特別指基因或蛋白時，其意指所述基因或蛋白的核苷酸或胺基酸序列是在自然條件下在個體間普遍存在的序列，且不同於其非典型變體。如本文中所用之術語「變異體」在特別指基因或蛋白時，其意指所述基因或蛋白的核苷酸或胺基酸序列與自然條件下在個體間普遍存在的序列相比，該序列帶有修飾，諸如加入、刪除或替換該序列的一或多個部分。
本發明在另一態樣中係提供一種包括有至少一個B2M/HLA-E基因（可以B2M/HLA-E融合基因互換命名）之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞不包括其他可表現的B2M基因並在不同的已知位置具有至少4個HSV-TK基因的敲入，且其中至少一個編碼TK-sr39酶。
於一實施例中，所述哺乳動物細胞係包括B2M/HLA-E基因。於一實施例中，所述哺乳動物細胞包括一種類型的B2M/HLA-E等位基因，即在B2M/HLA-E融合體中之一HLA-E變異體。於一實施例中，在B2M/HLA-E融合體中之HLA-E變異體為HLA-E*0101等位基因或HLA-E*0103等位基因。
於一實施例中，所述哺乳動物細胞係包括兩種不同的B2M/HLA-E等位基因，及所述細胞對於B2M/HLA-E為異型合子。於一實施例中，該B2M/HLA-E融合體中之HLA-E變異體為HLA-E*0101等位基因及HLA-E*0103等位基因。
本發明在一態樣中係提供一種包括有B2M/HLA-E*0101或B2M/HLA-E*0103融合基因之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞不包括其他可表現的B2M基因。本發明在一態樣中係提供一種包括有B2M/HLA-E*0101及B2M/HLA-E*0103基因之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞不包括其他可表現的B2M基因。
於本發明中，該
B2M/HLA-E*0101基因（可以B2M/HLA-E*0101融合基因互換命名）係編碼B2M/HLA-E*0101蛋白（可以B2M/HLA-E*0101融合蛋白互換命名）。
於一實施例中，該B2M/HLA-E*0101蛋白包括B2M蛋白、HLA-E*0101蛋白以及於該B2M蛋白與HLA-E*0101蛋白之間的連接子。於一實施例中，該B2M部分係位於該B2M/HLA-E*0101融合蛋白的N端，而HLA-E部分係位於C端。
於一實施例中，該B2M/HLA-E*0101蛋白亦包括信號肽。
於一實施例中，該B2M/HLA-E*0101蛋白包括信號肽、B2M蛋白、HLA-E*0101蛋白以及該B2M蛋白與HLA-E*0101蛋白之間的連接子。於一實施例中，該信號肽係位於該B2M/HLA-E*0101融合蛋白的N端，隨後為B2M蛋白及一連接子，而該HLA-E蛋白係位於C端。
於一實施例中，該位於B2M蛋白與HLA-E*0101蛋白之間的連接子為(G4S)4連接子。
於本發明中，該
B2M/HLA-E*0103基因（可以B2M/HLA-E*0103融合基因互換命名）係編碼B2M/HLA-E*0103蛋白（可以B2M/HLA-E*0103融合蛋白互換命名）。如本文所用之術語「B2M/HLA-E*0103」係意欲指β2微球蛋白(B2M)與HLA-E*0103之間的融合。
於一實施例中，該B2M/HLA-E*0103蛋白包括B2M蛋白、HLA-E*0103蛋白以及於該B2M蛋白與HLA-E*0103肽之間的連接子。於一實施例中，該B2M部分係位於該B2M/HLA-E*0103融合蛋白的N端，而HLA-E部分係位於C端。
於一實施例中，該B2M/HLA-E*0103蛋白亦包括信號肽。
於一實施例中，該B2M/HLA-E*0103蛋白包括信號肽、B2M蛋白、HLA-E*0103蛋白以及該B2M蛋白與HLA-E*0103蛋白之間的連接子。於一實施例中，該信號肽係位於該B2M/HLA-E*0103融合蛋白的N端，隨後為B2M蛋白及一連接子，而該HLA-E蛋白係位於C端。
於一實施例中，該位於B2M蛋白與HLA-E*0103蛋白之間的連接子為(G4S)4連接子。
於一較佳實施例中，該B2M/HLA-E*0101融合蛋白及/或該B2M/HLA-E*0103融合蛋白係保留了在易位到細胞表面之前進一步結合內源性肽的能力。這是由於所述融合蛋白中沒有預結合的HLA第I類前導肽序列(諸如VMAPRTLIL)作為所述融合蛋白的一部分而實現的。於一實施例中，該B2M/HLA-E*0101融合蛋白及/或該B2M/HLA-E*0103融合蛋白不包括預結合的HLA第I類前導肽序列。
於一實施例中，該B2M/HLA-E*0101融合蛋白之HLA-E*0101部分係包括胺基酸序列[SEQ ID NO :01]：
GSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPDRRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHSL。
於一實施例中，該B2M/HLA-E*0101融合蛋白或該B2M/HLA-E*0103融合蛋白之B2M部分係包括胺基酸序列[SEQ ID NO :02]：
IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM。
於一實施例中，該B2M/HLA-E*0103融合蛋白之HLA-E*0103部分係包括胺基酸序列[SEQ ID NO :03]：
GSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPD
GRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHSL。
於一實施例中，該包括有(G4S)4連接子及信號肽之B2M/HLA-E*0101融合蛋白係包括胺基酸序列[SEQ ID NO :04]：
MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPDRRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHSL。
於一實施例中，該包括有(G4S)4連接子及信號肽之B2M/HLA-E*0103融合蛋白係包括胺基酸序列[SEQ ID NO :05]：
MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPD
GRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHSL。
於一實施例中，該編碼B2M/HLA-E*0101融合蛋白且帶有(G4S)4連接子及信號肽之B2M/HLA-E*0101基因係包括核酸序列SEQ ID NO 06：
ATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGGGTGGTGGCGGTTCTGGTGGTGGCGGTAGTGGCGGCGGAGGAAGCGGTGGTGGCGGTTCCGGTTCCCACTCCTTGAAGTATTTCCACACTTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCTCTGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGCGCTTCGACAACGACGCCGCGAGTCCGAGGATGGTGCCGCGGGCGCCGTGGATGGAGCAGGAGGGGTCAGAGTATTGGGACCGGGAGACACGGAGCGCCAGGGACACCGCACAGATTTTCCGAGTGAACCTGCGGACGCTGCGCGGCTACTACAATCAGAGCGAGGCCGGTTCTCACACCCTGCAGTGGATGCATGGCTGCGAGCTGGGGCCCGACAGGCGCTTCCTCCGCGGGTATGAACAGTTCGCCTACGACGGCAAGGATTATCTCACCCTGAATGAGGACCTGCGCTCCTGGACCGCGGTGGACACGGCGGCTCAGATCTCCGAGCAAAAGTCAAATGATGCCTCTGAGGCGGAGCACCAGAGAGCCTACCTGGAAGACACATGCGTGGAGTGGCTCCACAAATACCTGGAGAAGGGGAAGGAGACGCTGCTTCACCTGGAGCCCCCAAAGACACACGTGACTCACCACCCCATCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCAGGATGGGGAGGGCCATACCCAGGACACGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAGGAGCAGAGATACACGTGCCATGTGCAGCATGAGGGGCTACCCGAGCCCGTCACCCTGAGATGGAAGCCGGCTTCCCAGCCCACCATCCCCATCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCTCCTTGGATCTGTGGTCTCTGGAGCTGTGGTTGCTGCTGTGATATGGAGGAAGAAGAGCTCAGGTGGGAAAGGAGGGAGCTACTCTAAGGCTGAGTGGAGCGACAGTGCCCAGGGGTCTGAGTCTCACAGCTTG。
於一實施例中，該編碼B2M/HLA-E*0103融合蛋白且帶有(G4S)4連接子及信號肽之B2M/HLA-E*0103基因係包括核酸序列SEQ ID NO 07：
ATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGGGTGGTGGCGGTTCTGGTGGTGGCGGTAGTGGCGGCGGAGGAAGCGGTGGTGGCGGTTCCGGTTCCCACTCCTTGAAGTATTTCCACACTTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCTCTGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGCGCTTCGACAACGACGCCGCGAGTCCGAGGATGGTGCCGCGGGCGCCGTGGATGGAGCAGGAGGGGTCAGAGTATTGGGACCGGGAGACACGGAGCGCCAGGGACACCGCACAGATTTTCCGAGTGAACCTGCGGACGCTGCGCGGCTACTACAATCAGAGCGAGGCCGGTTCTCACACCCTGCAGTGGATGCATGGCTGCGAGCTGGGGCCCGACGGGCGCTTCCTCCGCGGGTATGAACAGTTCGCCTACGACGGCAAGGATTATCTCACCCTGAATGAGGACCTGCGCTCCTGGACCGCGGTGGACACGGCGGCTCAGATCTCCGAGCAAAAGTCAAATGATGCCTCTGAGGCGGAGCACCAGAGAGCCTACCTGGAAGACACATGCGTGGAGTGGCTCCACAAATACCTGGAGAAGGGGAAGGAGACGCTGCTTCACCTGGAGCCCCCAAAGACACACGTGACTCACCACCCCATCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCAGGATGGGGAGGGCCATACCCAGGACACGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAGGAGCAGAGATACACGTGCCATGTGCAGCATGAGGGGCTACCCGAGCCCGTCACCCTGAGATGGAAGCCGGCTTCCCAGCCCACCATCCCCATCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCTCCTTGGATCTGTGGTCTCTGGAGCTGTGGTTGCTGCTGTGATATGGAGGAAGAAGAGCTCAGGTGGGAAAGGAGGGAGCTACTCTAAGGCTGAGTGGAGCGACAGTGCCCAGGGGTCTGAGTCTCACAGCTTG。
在另一態樣中本發明提供一種皆具有B2M/HLA-E*0101及B2M/HLA-E*0103基因敲入另外之缺乏B2M的細胞內的哺乳動物細胞。
於一實施例中，在人類細胞的情況下該B2M/HLA-E係插入在第5號染色體上之原生B2M基因的基因座。於一實施例中，該B2M/HLA*0101的一個複本及B2M/HLA*0103基因的一個複本係插入在該細胞之原生B2M基因的兩個複本中之每一者的基因座上，藉此使原本的B2M基因失活。一實例係顯示於圖1中。
於一實施例中，該B2M/HLA基因不包括編碼預結合的HLA第I類前導肽之序列，且該B2M/HLA蛋白不包括預結合的HLA第I類前導肽。
驚訝地發現到，將不包括編碼了預結合之HLA第I類前導肽之序列的B2M/HLA-E*0101及B2M/HLA-E*0103基因融合構築體用於缺失B2M的細胞中，會產生HLA-A/B/C
-/-HLA-E*0101
+HLA-E*0103
+細胞的細胞表面表現型且此細胞的HLA-E密度高且強健，有最大的內源性肽結合多樣性，對於NK細胞介導之非感染性靶細胞裂解的保護最佳，且增強NK細胞對感染病毒或其他病原體之靶哺乳動物細胞的識別及最佳消除能力。
本發明可有利地允許A)在供體細胞表面持續性地增加HLA-E蛋白的密度，以抑制NK細胞介導之缺失B2M的細胞的排斥，B)經由原生的內源性肽結合來保留HLA-E的正常免疫監視功能（導致耐受能力略有降低），C)通過包含多種HLA-E同種型，最大程度地提高與HLA蛋白結合的潛在內源性肽的多樣性，以及D)減輕病毒感染或惡性反分化後細胞不再受常規免疫監視的風險。
為了提供增加的HLA-E密度並達成優勢A)，通過非原生啟動子在細胞中插入兩個而不是一個B2M/HLA-E基因的等位基因。為了達成優勢B)，發明人使用了編碼B2M/HLA-E融合蛋白的B2M/HLA-E基因，該基因沒有預先工程化的，即預結合的HLA第I類前導肽，轉而利用原生的內源性肽加工及加載機制。為了達成優勢C)，利用了兩種主要的HLA-E等位基因，即HLA-E*0101及HLA-E*0103。這兩種編碼的HLA-E*0101及HLA-E*0103的蛋白加載及呈現不同的內源性肽子集，從而增加了HLA蛋白在正常情況下適當地加載耐受性內源性肽的可能性，又增加了在病毒感染期間加載活化內源性肽的可能性。為了達成優勢D)，發明人已引入了4個複本的HSV-TK基因作為穩健的開關，如果需要的話，可以迅速殺死細胞。幾種修飾的組合物在感染條件下顯著改善細胞保留及免疫監視的潛力。
有利的是，正常的內源性肽加載（通過不使用預結合的肽）和多種HLA-E同種型的結合係可擴大細胞對病毒及/或細菌感染的免疫監視，同時保留最大程度的耐受性表現型。在感染期間，來自病毒或細菌病原體的幾種肽可取代HLA-E的正常內源性肽。當HLA-E呈現病原體衍生的肽時，它會刺激受感染細胞的NK裂解；與帶有預結合肽的HLA-E會向NK細胞表明「健康狀態」的情況相反，其不會刺激NK裂解且藉此提供了耐受功能。這是用本發明實現的一個重要安全特徵。
於一實施例中，本發明之哺乳動物細胞係缺失HLA-II。於一實施例中，該哺乳動物細胞係缺失CIITA。
任何可用的相關基因編輯技術(CRISPR、TALEN、ZFN、自返核酸內切酶、腺病毒重組等)可用於修飾細胞，使得B2M的兩個等位基因被敲除，同時B2M/HLA-E*0101及B2M/HLA-E*0103基因的一或多個複本被敲除。
B2M/HLA-E基因（諸如B2M/HLA-E*0101及B2M/HLA-E*0103基因）的敲入可直接在原生B2M基因座上、在其它基因座上（諸如安全港基因座、諸如AAVS1安全港基因座）或其任意組合上完成。任何可用的啟動子均可用於這些敲入基因，例如選自由EF1a mini、EF1a、UbC、PGK、CMV及CAG所組成之群中的啟動子。根據本發明，所期望的HLA-E密度的增加係通過由持續活性啟動子所控制的雙等位基因HLA-E敲入而獲得。在原生細胞中，內源性HLA-E啟動子係由啟動子INFγ反應元件所控制。
同樣地該等HSV-TK可在所要位置敲入，及在靶定的基因座。可使用任何可用的相關基因編輯技術。
本發明之細胞係包括在不同的已知位置之至少4個HSV-TK基因，其中所述4個HSV-TK基因之至少一個為TK-sr39基因。在一實施例中，所述4個HSV-TK基因中的至少兩個為TK-sr39基因。在一實施例中，所述4個HSV-TK基因中的兩個為TK-sr39基因而另兩個為野生型HSV-TK基因。
於本發明中，HSV-TK基因係作為可誘導的「自殺開關」系統來控制經工程化之哺乳動物細胞（例如在宿主生物體中）的存活。自殺開關的概念牽涉到基因體導入一個基因，該基因使細胞對外源性分子敏感，可以在需要的時候施用。HSV-TK基因編碼一種胸腺嘧啶激酶，可將常用的小分子抗病毒藥物更昔洛韋轉化為HSV-TK表現細胞內的有毒物質。這類自殺基因的問題是，理論上它們可以通過自發性基因體刪除或啟動子靜默的方式失活或消除，導致「自殺開關」失去了預期的控制。
於本發明之一實施例中，HSV-TK自殺基因係位於基因體的安全港基因座中。於本發明之一實施例中，該HSV-TK的表現係受一個帶有上游UCO元件之啟動子驅動。於本發明之一實施例中，該HSV-TK自殺基因的表現係受一個帶有上游UCO元件之UbC啟動子驅動。
於本發明之一實施例中，該HSV-TK自殺基因的4個複本係插入細胞的基因體中。
於本發明之一實施例中，4個HSV-TK基因，即HSV-TK基因的4個複本，係在不同位置敲入，即在基因體上有一點分隔之位置處，諸如提供一個安全的系統，不至於因基因重排或刪除而惡化。於一實施例中，該4個HSV-TK基因係敲入相同的染色體且彼此相隔至少10Kbp，諸如至少100 Kbp、至少1 Mbp或至少20 Mbp。於另一實施例中，該4個HSV-TK基因係敲入4個不同染色體上之位置處。於另一實施例中，該4個HSV-TK基因係敲入3個不同染色體上之位置處。於另一實施例中，該4個HSV-TK基因係敲入2個不同染色體上之位置處，諸如在二倍體細胞中之第3號染色體上的同一位置有兩個HSV-TK複本，在第19號染色體上的同一位置有兩個HSV-TK複本。於本發明之另一實施例中，2個HSV-TK基因係在安全的基因體港位點處敲入。於另一實施例中，係敲入一個HSV-TK基因以破壞及消除B2M等位基因。於另一實施例中，係敲入一個HSV-TK基因以消除CIITA等位基因。
患者的安全是細胞治療中一個非常重要的參數。
插入4個TK自殺基因複本也有利於提高對患者的安全性。驚訝地發現到，具有4個TK自殺基因複本的細胞對於更昔洛韋治療的敏感性明顯高於具有2個複本的細胞，使得用少量更昔洛韋就可能實現細胞死亡。
由於對更昔洛韋的反應增加，插入2個TK-sr39自殺基因變異體複本進一步有利增加對患者的安全性。
與隨機整合到細胞基因體中相比，將TK自殺基因放置在已知的位置有利於提高對患者的安全性。與隨機整合相比，靶向整合減少了重要基因或重要基因表現調控被破壞的風險。其也減少了自殺基因隨機整合到次佳表現活性區域的風險，藉此確保最佳的TK表現程度。
與插入在相同的插入基因座相比，將TK自殺基因放置在不同的位置會限制所有TK自殺基因複本同時也靜默或向下調控的風險，而進一步提高患者的安全性。
將TK自殺基因放置於安全港基因座會有利於提高對患者的安全性。安全港基因座是基因體中持續表現的區域。這種方式減少了自殺基因被非自願靜默或向下調控的風險，藉此增加自殺TK蛋白始終處於最佳表現程度的機會，且隨後在需要投予更昔洛韋給藥時控制細胞死亡。
其結果是，根據本發明將4個TK自殺基因複本放置於已知的不同位置（諸如安全港基因座）可為接受細胞治療的患者提供顯著改善的安全性。
於一實施例中，至少2個HSV-TK基因被敲入一個安全港位點中，諸如AAVS1基因座或hROSA26基因座或CLYBL基因座。於一實施例中，2個HSV-TK基因的複本被敲入一個安全港位點中，諸如AAVS1基因座或hROSA26基因座或CLYBL基因座，且2個HSV-TK基因被敲入CIITA基因座中。
於另一實施例中，2個HSV-TK基因被敲入安全港位點中，且2個HSV-TK基因被敲入另一個安全港位點中，並敲除CIITA基因座。於一更特定的實施例中，2個HSV-TK基因被敲入AAVS1基因座中，且2個HSV-TK基因被敲入CLYBL基因座中，並敲除CIITA基因。
於一實施例中，2或至少2個HSV-TK基因被敲入B2M基因座（即每個B2M基因座有至少一個HSV-TK基因），且2或至少2個HSV-TK基因被敲入CIITA基因座（即每個CIITA基因座有至少一個HSV-TK基因）。
在另一實施例中，至少2個TK-sr39基因複本係插入安全港位點。在另一實施例中，至少2個野生型HSV-TK基因複本係插入該CIITA基因座內。在另一實施例中，一個TK-sr39基因複本係插入AAVS1安全港位點，且一個TK-sr39基因複本係插入CLYBL安全港位點。在另一實施例中，2個TK-sr39基因複本係插入該AAVS安全港位點內，而2個野生型HSV-TK基因複本係插入該CIITA基因座內。於一實施例中，2或至少2個TK-sr39基因被敲入B2M基因座（即每個B2M基因座有至少一個TK-sr39基因），且2或至少2個TK-sr39基因被敲入CIITA基因座（即每個CIITA基因座有至少一個TK-sr39基因）。
於一實施例中，係將B2M/HLA-E基因敲入該B2M基因的每個基因座內，藉此使細胞的原生B2M基因失活。
於一實施例中，係將B2M/HLA-E*0101基因或B2M/HLA-E*0103基因敲入該B2M基因的基因座內，藉此使細胞的原生B2M基因失活。於一實施例中，係將B2M/HLA-E*0101基因敲入該B2M基因的一個複本的基因座內，且將B2M/HLA-E*0103基因敲入該B2M基因的另一個複本的基因座內，藉此使細胞的原生B2M基因失活。於一實施例中，係將2個HSV-TK基因敲入該AAVS1基因的基因座內，且將2個HSV-TK基因敲入該CIITA基因的基因座內，藉此使細胞的原生CIITA基因失活。細胞的原生CIITA基因失活會導致HLA-II蛋白耗盡。
於一實施例中，係將一個B2M/HLA-E*0101基因敲入B2M基因的一個複本的基因座中，將一個B2M/HLA-E*0103基因敲入B2M基因的另一個複本的基因座中，將HSV-TK基因的2個複本敲入諸如AAVS1之安全港基因座，且將2個HSV-TK基因敲入CIITA基因的基因座中。
於一實施例中，係將一個B2M/HLA-E*0101基因敲入B2M基因的一個複本的基因座中，將一個B2M/HLA-E*0103基因敲入B2M基因的另一個複本的基因座中，將HSV-TK基因的2個複本敲入AAVS1基因的基因座中，將2個HSV-TK基因敲入CLYBL基因座中，並將該CIITA基因敲除，即CIITA基因的兩個複本皆敲除。
於一實施例中，2或至少2個B2M/HLA-E融合基因被敲入B2M基因座（即每個B2M基因座有至少一個所述融合基因），2或至少2個HSV-TK基因亦被敲入B2M基因座（即每個B2M基因座有至少一個所述TK基因），且2或至少2個HSV-TK基因被敲入CIITA基因座（即每個CIITA基因座有至少一個所述TK基因）。
該4個HSV-TK基因係較佳地表現到當暴露於更昔洛韋下時其每一者可單獨殺死所述哺乳動物細胞之程度。
於一實施例中，該野生型HSV-TK蛋白包括胺基酸序列SEQ ID NO: 08：
MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALTLIFDRHPIAALLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQCGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRSMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN。
於一實施例中，該編碼野生型HSV-TK蛋白之HSV-TK基因係包括核酸序列SEQ ID NO 09：
ATGGCTTCTTACCCTGGACACCAGCATGCTTCTGCCTTTGACCAGGCTGCCAGATCCAGGGGCCACTCCAACAGGAGAACTGCCCTAAGACCCAGAAGACAGCAGGAAGCCACTGAGGTGAGGCCTGAGCAGAAGATGCCAACCCTGCTGAGGGTGTACATTGATGGACCTCATGGCATGGGCAAGACCACCACCACTCAACTGCTGGTGGCACTGGGCTCCAGGGATGACATTGTGTATGTGCCTGAGCCAATGACCTACTGGAGAGTGCTAGGAGCCTCTGAGACCATTGCCAACATCTACACCACCCAGCACAGGCTGGACCAGGGAGAAATCTCTGCTGGAGATGCTGCTGTGGTGATGACCTCTGCCCAGATCACAATGGGAATGCCCTATGCTGTGACTGATGCTGTTCTGGCTCCTCACATTGGAGGAGAGGCTGGCTCTTCTCATGCCCCTCCACCTGCCCTGACCCTGATCTTTGACAGACACCCCATTGCAGCCCTGCTGTGCTACCCAGCAGCAAGGTACCTCATGGGCTCCATGACCCCACAGGCTGTGCTGGCTTTTGTGGCCCTGATCCCTCCAACCCTCCCTGGCACCAACATTGTTCTGGGAGCACTGCCTGAAGACAGACACATTGACAGGCTGGCAAAGAGGCAGAGACCTGGAGAGAGACTGGACCTGGCCATGCTGGCTGCAATCAGAAGGGTGTATGGACTGCTGGCAAACACTGTGAGATACCTCCAGTGTGGAGGCTCTTGGAGAGAGGACTGGGGACAGCTCTCTGGAACAGCAGTGCCCCCTCAAGGAGCTGAGCCCCAGTCCAATGCTGGTCCAAGACCCCACATTGGGGACACCCTGTTCACCCTGTTCAGAGCCCCTGAGCTGCTGGCTCCCAATGGAGACCTGTACAATGTGTTTGCCTGGGCTCTGGATGTTCTAGCCAAGAGGCTGAGGTCCATGCATGTGTTCATCCTGGACTATGACCAGTCCCCTGCTGGATGCAGAGATGCTCTGCTGCAACTAACCTCTGGCATGGTGCAGACCCATGTGACCACCCCTGGCAGCATCCCCACCATCTGTGACCTAGCCAGAACCTTTGCCAGGGAGATGGGAGAGGCCAAC。
於一實施例中，TK-sr39酶包括胺基酸序列SEQ ID NO: 10：
MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALTIFLDRHPIAFMLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQCGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRSMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN。
在另一態樣中本發明提供一種製造植入式哺乳動物細胞之方法，其包括本文所揭露之步驟。
在合理的情況下，該等步驟的順序可能不同。例如，基因修飾步驟及細胞分化步驟可以以不同順序發生，B2M/HLA-E基因的敲入可以在B2M基因失活之前發生，分化步驟可以在B2M/HLA-E基因及/或B2M基因失活之前發生。
在製造本發明之植入式哺乳動物細胞之方法的上下文中，「提供一哺乳動物細胞」的步驟意指「在活體外提供一哺乳動物細胞」的步驟。換言之，「提供一哺乳動物細胞」的步驟意指「培養哺乳動物細胞」的步驟。
在製造本發明之植入式哺乳動物細胞之方法的上下文中，所有的步驟皆在活體外進行。換言之，製造本發明之植入式哺乳動物細胞之方法為一種在活體外的方法。在一態樣中本發明提供一種製造植入式哺乳動物細胞之方法，其包括以下步驟：
● 提供一哺乳動物細胞，
● 敲入至少一B2M/HLA-E融合基因（諸如B2M/HLA-E*0101基因及/或B2M/HLA-E*0103基因）至所述哺乳動物細胞內，
● 使所述哺乳動物細胞的原生B2M基因失活，
● 在所述哺乳動物細胞之不同的已知位置敲入至少4個HSV-TK基因，其中所述4個HSV-TK基因之至少一個為TK-sr39基因，
● 視情況使所述哺乳動物細胞分化，
藉此獲得所述植入式哺乳動物細胞。
在另一態樣中本發明提供一種製造植入式哺乳動物細胞之方法，包括以下步驟：
● 提供一哺乳動物細胞，
● 敲入至少一B2M/HLA-E融合基因（諸如B2M/HLA-E*0101基因及/或B2M/HLA-E*0103基因）至所述哺乳動物細胞內，
● 使所述哺乳動物細胞的原生B2M基因失活，
● 在不同的已知位置敲入至少4個HSV-TK基因且其中所述4個HSV-TK基因之至少一個為TK-sr39基因，
● 使所述哺乳動物細胞的原生HLA-II基因或原生CIITA基因失活，
● 視情況使所述哺乳動物細胞分化，
藉此獲得所述植入式哺乳動物細胞。
在另一態樣中本發明提供一種製造植入式哺乳動物細胞之方法，包括以下步驟：
● 提供缺失B2M及CIITA的哺乳動物細胞，
● 敲入B2M/HLA-E融合基因（諸如B2M/HLA-E*0101基因及/或B2M/HLA-E*0103基因）至所述缺失B2M及CIITA的哺乳動物細胞內，
● 在不同的已知位置處敲入4個HSV-TK基因，其中所述4個HSV-TK基因之至少一個為TK-sr39基因，
藉此獲得所述植入式哺乳動物細胞。
在另一態樣中本發明提供一種製造植入式哺乳動物細胞之方法，包括以下步驟：
● 提供一哺乳動物細胞，
● 敲入一個B2M/HLA-E*0101基因及/或一個B2M/HLA-E*0103基因至所述哺乳動物細胞的B2M基因內，
● 在所述哺乳動物細胞之基因體中之不同的已知位置處敲入4個HSV-TK基因，其中所述4個HSV-TK基因之至少一個為TK-sr39基因，
● 視情況使所述哺乳動物細胞分化，
藉此獲得所述植入式哺乳動物細胞，且其缺失B2M，並表現B2M/HLA-E*0101蛋白及/或B2M/HLA-E*0103蛋白及HSV-TK蛋白。
在另一態樣中本發明提供一種製造植入式哺乳動物細胞之方法，包括以下步驟：
a) 提供缺失B2M及CIITA的哺乳動物細胞，
b) 敲入B2M/HLA-E*0101及B2M/HLA-E*0103二者至所述缺失B2M及CIITA的哺乳動物細胞內，
c) 在不同的已知位置處敲入4個HSV-TK基因，其中所述4個HSV-TK基因之至少一個為TK-sr39基因，
藉此獲得所述植入式哺乳動物細胞。
可設想到根據本發明方法進行基因修飾的哺乳動物細胞可能處於不同的分化階段，並可根據需要進一步分化。如，在幹細胞、多功能細胞或處於早期分化階段的細胞之情況下，此細胞可以在植入之前分化到更高級的分化階段、更成熟的細胞類型。本發明的方法也可以應用於在植入之前不需要進一步分化的功能細胞類型。
在又另一實施例中，本發明係提供根據本發明之哺乳動物細胞之用於預防、治療或治癒疾病（諸如慢性疾病或急性疾病）的用途。設想到本發明之哺乳動物細胞及本發明之方法可能在治療各種慢性疾病方面是有用的。也設想到它們在預防慢性疾病以及其他疾病方面可能是有用的。
於一實施例中，所述疾病係包括或選自由以下所組成之群組：糖尿病、第1型糖尿病、第2型糖尿病、乾性黃斑部病變、色素性視網膜炎、神經系統疾病、帕金森氏病、心臟病、慢性心臟衰竭、組織纖維化、硬化、聽力損失、角膜失明、中風及慢性腎臟病。
於一實施例中，該哺乳動物細胞為動物細胞。於另一實施例中，該哺乳動物細胞為人類細胞。
於一實施例中，該哺乳動物細胞為未分化細胞。於一實施例中，該哺乳動物細胞為幹細胞，諸如人類幹細胞、多功能細胞，諸如多功能人類細胞或iPS細胞（經誘發的多功能幹細胞），諸如人類iPS細胞。
於一實施例中，本發明之哺乳動物細胞為未分化細胞，諸如幹細胞、多功能細胞或iPS細胞，其係進一步分化成功能性細胞類型。
於另一實施例中，該哺乳動物細胞為已分化細胞。
於一實施例中，該哺乳動物細胞為衍生自本發明之幹細胞、多功能細胞或iPS細胞之人類已分化細胞。
於本發明特定實施例中，該哺乳動物細胞為選自下表之分化細胞。
根據以下清單提到的出版物中所述的分化方法，所述分化細胞可衍生自本發明之幹細胞、多功能細胞或iPS細胞：
● 如通過WO2017/144695中所述方法可獲得之β細胞、INS+及NKX6.1+雙陽性細胞、C-肽+及NKX6.1+雙陽性細胞、胰島素分泌細胞、體外衍生的類β細胞、胰臟內分泌細胞或內分泌細胞；
● 如通過專利申請案WO2015028614中所述方法可獲得之內分泌前驅細胞或NGN3+/NKX2.2+雙陽性細胞；
● 如通過Nolbrant S.等人, Nat. Protoc. 2017 九月, 12(9):1962-1979; Kirkeby A.等人, Cell Rep. 2012 六月28日, 1(6):703-14; Aktinson-Dell R.等人, Adv Exp Med Biol. 2019, 1175:383-405; Ni P.等人, Mol Ther Methods Clin Dev. 2019 四月8日, 13:414-430中所述方法可獲得之神經細胞，諸如神經元、中間神經元細胞、寡樹突膠細胞、星狀膠細胞、多巴胺神經細胞；
● 如通過Chen B. Stem Cell Res Ther. 2019 五月21日, 10(1):142; Sun X.等人, Front Cell Neurosci. 2019 九月3日, 13:394; Dougherty J.A.等人, Front Physiol. 2018 Dec 14, 9:1794; Candelario K.M.等人, J Comp Neurol. 2019 十一月19日; Yang R.等人, Front Immunol. 2019 十月16日, 10:2346中所述方法可獲得之外泌體細胞（諸如ESCs (胚胎幹細胞)或NSCs (神經元幹細胞)），或衍生自ESC或NSC之外泌體細胞；
● 如通過Ackermann M.等人, Nat Commun. 2018 十一月30日;9(1):5088; Good ML.等人 J Vis Exp. 2019 十月24日(152); Zhu H.等人 Methods Mol Biol. 2019, 2048:107-119; Kitadani J.等人, Sci Rep. 2018 三月15日;8(1):4569中所述方法可獲得之免疫細胞，諸如T細胞、NK細胞、巨噬細胞、樹突細胞。
● 如通過Li Z.等人 Cell Death Dis. 2019 十月10日, 10(10):763中所述方法可獲得之肝細胞；
● 如通過Coll M. Cell Stem Cell. 2018 七月5日, 23(1):101-113中所述方法可獲得之星狀細胞；
● 如通過Miyake T. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2019 Sep 1, 105(1):193-205中所述方法可獲得之纖維母細胞、角質細胞或毛細胞；
● 如通過Jeong M.等人, Cell Death Dis. 2018 九月11日;9(9):922中所述方法可獲得之內耳細胞；
● 如通過Negoro R.等人 Stem Cell Reports, 2018 十二月11日, 11(6):1539-1550; Lees EA等人 J Vis Exp. 2019 五月12日, (147)中所述方法可獲得之腸細胞或類器官細胞；
● 如通過Vanslambrouck JM等人 J Am Soc Nephrol. 2019 十月, 30(10):1811-1823中所述方法可獲得之類腎細胞或另一種腎相關細胞；
● 如通過Huang CY等人 J Mol Cell Cardiol. 2019 十月23日, 138:1-11中所述方法可獲得之心肌細胞
● 如通過Ben M’Barek K等人 Biomaterials. 2019 十一月6日:119603中所述方法可獲得之視網膜細胞、視網膜色素上皮細胞；
● 如通過Chen KH等人 Am J Transl Res. 2019 九月15日;11(9):6232-6248)中所述方法可獲得之間質幹細胞。
於本發明方法之一實施例中，在應用分化步驟的情況下，該哺乳動物細胞是未分化的細胞，諸如幹細胞、多功能細胞或iPS細胞，並分化成選自以上列表的細胞。
於本發明方法之一實施例中，該植入式哺乳動物細胞為選自以上列表的已分化細胞。
本發明之非限制性實施例包含：
1. 包括有至少一B2M/HLA-E基因之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞不包括其他可表現的B2M基因。
2. 根據實施例1之包括有B2M/HLA-E*0101基因及B2M/HLA-E*0103基因的哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞不包括其他可表現的B2M基因。
3. 根據實施例1之包括有B2M/HLA-E*0101基因及B2M/HLA-E*0103基因的哺乳動物細胞。
4. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述細胞在不同的已知位置具有4個或至少4個HSV-TK基因的敲入，其中所述4個HSV-TK基因之至少一個為TK-sr39基因。
5. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述B2M/HLA-E*0101基因及/或B2M/HLA-E*0103基因已被敲入所述哺乳動物細胞之原生B2M序列中。
6. 一種包括有B2M/HLA-E*0101及B2M/HLA-E*0103之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞不包括其他可表現的B2M基因。
7. 一種具有B2M/HLA-E*0101及B2M/HLA-E*0103皆敲入另外之缺乏β2微球蛋白(B2M)的細胞內之哺乳動物細胞。
8. 根據實施例6-7中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述B2M/HLA-E*0101及B2M/HLA-E*0103係已直接敲入用來製造所述B2M之細胞的原生B2M序列。
9. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞具有HLA-A/B/C
-/-HLA-E
+細胞表面表現型，諸如HLA-A/B/C
-/-HLA-E*0103
+及/或HLA-A/B/C
-/-HLA-E*0101
+細胞表面表現型。
10. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞具有HLA-A/B/C
-/-HLA-E
+細胞表面表現型並包括在不同的已知位置之4個HSV-TK基因的敲入。
11. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞具有HLA-A/B/C
-/-HLA-E*0101
+及HLA-E*0103
+細胞表面表現型。
12. 一種包括有B2M/HLA-E*0101基因及B2M/HLA-E*0103基因之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞不包括其他可表現的B2M基因，且其缺失CIITA，並在不同的已知位置具有4個HSV-TK基因的敲入，其中所述4個HSV-TK基因之至少一個為TK-sr39基因。
13. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞為一種可通用植入式細胞。
14. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞為幹細胞或多功能細胞。
15. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞其中所述哺乳動物細胞係選自由以下所組成之群組：神經元、心肌細胞、視網膜細胞、視網膜色素上皮細胞及β細胞。
16. 根據實施例15之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞為β細胞或其前驅物。
17. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞係選自由間質幹細胞、胚胎幹細胞及神經幹細胞所組成之群。
18. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述B2M/HLA-E基因，諸如B2M/HLA-E*0101及/或B2M/HLA-E*0103基因，其各自包含一啟動子，或敲入受到功能性啟動子控制之基因座內，或在一啟動子旁。
19. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中係利用（即在受控制下）原生B2M啟動子於原生B2M基因座上敲入所述B2M/HLA-E基因。
20. 根據實施例1-19中之任一例之哺乳動物細胞，其中係利用（即在受控制下）非原生B2M啟動子於原生B2M基因座上敲入所述B2M/HLA-E*0101基因及/或B2M/HLA-E*0103基因。
21. 根據實施例1-19中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述B2M/HLA-E*0101及/或B2M/HLA-E*0103基因係敲入原生B2M基因座以外的基因座上，並利用一替代性啟動子。
22. 根據實施例1-21中之任一例之哺乳動物細胞，其中所要HLA-E密度係經由雙等位基因的敲入而生成。
23. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中未使用HLA-G信號序列肽的優先加載。
24. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中該B2M/HLA-E基因不包括預結合的HLA-I前導肽。
25. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述B2M/HLA-E*0101基因係編碼B2M/HLA-E*0101蛋白的胺基酸序列SEQ ID NO:4或其具有共1-10個取代、刪除或添加之變異體。
26. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述B2M/HLA-E*0103基因係編碼B2M/HLA-E*0103蛋白的胺基酸序列SEQ ID NO:5或其具有共1-10個取代、刪除或添加之變異體。
27. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞係缺失HLA-II，諸如缺失CIITA。
28. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其包括在不同的已知位置處敲入的4個或至少4個HSV-TK基因。
29. 根據實施例28之哺乳動物細胞，其中所述4個HSV-TK基因係敲入在相隔至少10 Kbp，諸如至少100 Kbp、至少1 Mbp或至少20 Mbp之位置處。
30. 根據實施例28-29中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述4個HSV-TK基因係敲入4個不同染色體上之位置處。
31. 根據實施例28-29中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述4個HSV-TK基因係敲入3個不同染色體上之位置處。
32. 根據實施例28-29中之任一例之哺乳動物細胞，其中所述4個HSV-TK基因係敲入2個不同染色體上之位置處。
33. 根據實施例28之哺乳動物細胞，其中所述4個HSV-TK基因係較佳地表現到當暴露於更昔洛韋下時其每一者可單獨殺死所述哺乳動物細胞之程度。
34. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中2個或至少2個HSV-TK基因係在安全基因體港位點敲入。
35. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中係敲入1個HSV-TK基因以消除B2M等位基因。
36. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，其中係敲入1個HSV-TK基因以消除CIITA等位基因。
37. 根據實施例4-36中之任一例之哺乳動物細胞，其中4個HSV-TK基因係敲入安全港位點，諸如AAVs1、hROSA、AAVS1、CLYBL或其任意組合。
38. 根據前述實施例中之任一例之哺乳動物細胞，該哺乳動物細胞不是自然殺手(NK)細胞。
39. 一種製造植入式哺乳動物細胞之方法，包括以下步驟：
● 提供一哺乳動物細胞，
● 敲入至少一B2M/HLA-E融合基因至所述哺乳動物細胞內，
● 使所述哺乳動物細胞的原生B2M基因失活，
● 視情況使所述哺乳動物細胞分化，
藉此獲得所述植入式哺乳動物細胞。
40. 製造植入式哺乳動物細胞之方法，包括以下步驟：
● 提供一哺乳動物細胞，
● 敲入至少一B2M/HLA-E融合基因至所述哺乳動物細胞內，
● 使所述哺乳動物細胞的原生B2M基因失活，
● 使所述哺乳動物細胞分化，
藉此獲得所述植入式哺乳動物細胞。
41. 製造植入式哺乳動物細胞之方法，包括以下步驟：
a) 提供一哺乳動物細胞，
b) 敲入B2M/HLA-E基因至所述哺乳動物細胞之B2M基因座內，
藉此獲得所述植入式哺乳動物細胞。
42. 製造植入式哺乳動物細胞之方法，包括以下步驟：
a) 提供缺失B2M的未分化哺乳動物細胞，
b) 敲入B2M/HLA-E基因至所述缺失B2M的未分化哺乳動物細胞內，以及
c) 使所述未分化的細胞分化為功能性已分化細胞，
藉此獲得所述植入式哺乳動物細胞。
43. 製造植入式哺乳動物細胞之方法，包括以下步驟：
a) 提供缺失B2M的哺乳動物細胞，
b) 敲入B2M/HLA-E基因（諸如B2M/HLA-E*0101基因及/或B2M/HLA-E*0103基因）至所述缺失B2M的哺乳動物細胞內，
藉此獲得所述植入式哺乳動物細胞。
44. 根據實施例39-43中之任一例之方法，其更包括以下步驟：在不同的已知位置敲入至少4個HSV-TK基因，其中所述4個HSV-TK基因之至少一個為TK-sr39基因。
45. 根據實施例39-44中之任一例之方法，其中至少2個HSV-TK基因被敲入安全港基因座。
46. 根據實施例39-45中之任一例之方法，其中4個HSV-TK基因被敲入安全港基因座。
47. 根據實施例39-46中之任一例之方法，其更包括以下步驟：使所述哺乳動物細胞的原生HLA-II基因或原生CIITA基因失活。
48. 根據實施例39-47中之任一例之方法，其中所述B2M/HLA-E基因（諸如B2M/HLA-E*0101及/或B2M/HLA-E*0103基因）係已直接敲入用來製造所述缺失B2M的細胞之細胞原生B2M序列。
49. 根據實施例39-48中之任一例之方法，其中所述B2M/HLA-E基因係包括一個B2M/HLA-E*0101基因及一個B2M/HLA-E*0103基因。
50. 根據實施例39-49中之任一例之方法，其中所述哺乳動物細胞為細胞表面表現型HLA-A/B/C
-/-HLA-E*0101
+HLA-E*0103
+之細胞。
51. 根據實施例39-50中之任一例之方法，其中所述哺乳動物細胞為幹細胞。
52. 根據實施例39-51中之任一例之方法，其中所述哺乳動物細胞或所述可植入哺乳動物細胞係選自由以下所組成之群組：神經元、心肌細胞、視網膜細胞、視網膜色素上皮細胞、間質幹細胞及β細胞。
53. 根據實施例39-52中之任一例之方法，包括以下步驟：
● 提供一哺乳動物幹細胞或多功能細胞，
● 敲入至少一B2M/HLA-E*0101基因及一B2M/HLA-E*0103基因至所述哺乳動物細胞中，
● 使所述哺乳動物細胞的原生B2M基因失活，
● 在不同的已知位置處敲入至少4個HSV-TK基因，其中所述4個HSV-TK基因之至少一個為TK-sr39基因，
● 使所述哺乳動物細胞分化，
藉此獲得所述植入式哺乳動物細胞。
54. 根據實施例39-53中之任一例之方法，其中，在分化步驟中，所述哺乳動物細胞係分化為β細胞、INS+及NKX6.1+雙陽性細胞或C-肽+/NKX6.1+雙陽性細胞、胰島素分泌細胞、體外衍生的類β細胞、胰臟內分泌細胞或內分泌細胞、內分泌前驅細胞或NGN3+/NKX2.2+雙陽性細胞、神經細胞（諸如神經元、中間神經元細胞、寡樹突膠細胞、星狀膠細胞、多巴胺神經細胞）、外泌體細胞（諸如ESCs或NSCs）、或衍生自ESC或NSC之外泌體細胞、免疫細胞（諸如T細胞、NK細胞、巨噬細胞、樹突細胞）、肝細胞、星狀細胞、纖維母細胞、角質細胞或毛細胞、內耳細胞、腸細胞或類器官細胞、類腎細胞或另一種腎相關細胞、皮質神經前驅細胞、心肌細胞、視網膜細胞、視網膜色素上皮細胞、間質幹細胞。
55. 根據實施例39-54中之任一例之方法，其中所述植入式哺乳動物細胞係選自β細胞、INS+及NKX6.1+雙陽性細胞或C-肽+/NKX6.1+雙陽性細胞、胰島素分泌細胞、體外衍生的類β細胞、胰臟內分泌細胞或內分泌細胞、內分泌前驅細胞或NGN3+/NKX2.2+雙陽性細胞、神經細胞（諸如神經元、中間神經元細胞、寡樹突膠細胞、星狀膠細胞、多巴胺神經細胞）、外泌體細胞（諸如ESCs或NSCs）、或衍生自ESC或NSC之外泌體細胞、免疫細胞（諸如T細胞、NK細胞、巨噬細胞、樹突細胞）、肝細胞、星狀細胞、纖維母細胞、角質細胞或毛細胞、內耳細胞、腸細胞或類器官細胞、類腎細胞或另一種腎相關細胞、皮質神經前驅細胞、心肌細胞、視網膜細胞、視網膜色素上皮細胞、間質幹細胞。
56. 根據實施例39-55中之任一例之方法，其中敲入的B2M/HLA-E基因（諸如B2M/HLA-E*0101基因及/或B2M/HLA-E*0103基因）係各包含一個啟動子，或其中所述B2M/HLA-E基因敲入一個啟動子旁，或敲入受到功能性啟動子控制之基因座內。
57. 根據實施例39-56中之任一例之方法，其中係利用原生B2M啟動子於原生B2M基因座上敲入所述B2M/HLA-E*0101基因及B2M/HLA-E*0103基因。
58. 根據實施例39-57中之任一例之方法，其中係利用一替代性非原生B2M啟動子於原生B2M基因座上敲入所述B2M/HLA-E*0101基因及B2M/HLA-E*0103基因。
59. 根據實施例39-58中之任一例之方法，其中B2M/HLA-E*0101基因及B2M/HLA-E*0103基因的敲入都在原生B2M基因座以外的基因座上，並利用一替代性啟動子或受一替代性啟動子控制。
60. 根據實施例39-59中之任一例之方法，其中所述B2M/HLA-E*0101基因係編碼B2M/HLA-E*0101蛋白的胺基酸序列SEQ ID NO:4或其共具有1-10個取代、刪除或添加之變異體。
61. 根據實施例39-60中之任一例之方法，其中所述B2M/HLA-E*0103基因係編碼B2M/HLA-E*0103蛋白的胺基酸序列SEQ ID NO:5或其共具有1-10個取代、刪除或添加之變異體。
62. 根據實施例39-61中之任一例之方法，其中所要HLA-E密度係經由雙等位基因的敲入而生成。
63. 根據實施例39-62中之任一例之方法，其中未使用HLA-G信號序列肽的優選加載。
64. 根據實施例39-63中之任一例之方法，其中所述哺乳動物細胞係缺失CIITA的。
65. 根據實施例39-64中之任一例之方法，其包括使該功能性HLA-II蛋白的表現失活之步驟。
66. 根據實施例65之方法，其包括使該CIITA基因失活之步驟。
67. 根據實施例41-66中之任一例之方法，其進一步包括以下步驟：c)在不同的已知位置處敲入4個HSV-TK基因。
68. 根據實施例44-67中之任一例之方法，其中所述4個HSV-TK基因係敲入在相隔至少10 Kbp，諸如至少100 Kbp、至少1 Mbp或至少20 Mbp之位置處。
69. 根據實施例44-68中之任一例之方法，其中所述4個HSV-TK基因係敲入4個不同染色體上之位置處。
70. 根據實施例44-69中之任一例之方法，其中所述4個HSV-TK基因係敲入2個不同染色體上之位置處。
71. 根據實施例44-70中之任一例之方法，其中僅由所述4個HSV-TK基因中之一者進行表現之HSV-TK蛋白在暴露於更昔洛韋下時係足以殺死所述哺乳動物細胞之程度。
72. 根據實施例44-71中之任一例之方法，其中2個或至少2個HSV-TK基因係敲入安全的基因體港位點。
73. 根據實施例44-72中之任一例之方法，其中一個HSV-TK基因係敲入以消除B2M等位基因。
74. 根據實施例44-73中之任一例之方法，其中一個HSV-TK基因係敲入以消除CIITA等位基因。
75. 根據實施例39-74中之任一例之方法，其中所述敲入及/或基因失活係使用選自鋅指核酸酶(ZFNs)、CRISPR、TALEN或腺病毒重組而構築。
76. 根據實施例39-75中之任一例之方法，其中所述缺失B2M的哺乳動物細胞為一種幹細胞，其已藉由敲除兩個原生B2M等位基因進行修飾。
77. 根據實施例1-38及89-95中之任一例之用於預防、治療或治癒慢性疾病或供使用於製備用於預防、治療或治癒慢性疾病之藥物的哺乳動物細胞。
78. 根據實施例77之哺乳動物細胞，其中所述慢性疾病係選自由以下所組成之群組：糖尿病、第1型糖尿病、第2型糖尿病、乾性黃斑部病變、色素性視網膜炎、神經系統疾病、帕金森氏病、心臟病、慢性心臟衰竭、組織纖維化、硬化、聽力損失、角膜失明、中風及慢性腎臟病。
79. 根據實施例1-38或77-78中之任一例之哺乳動物細胞，其中一個HSV-TK基因係經敲入以消除B2M等位基因，而另一HSV-TK基因係經敲入以消除CIITA等位基因。
80. 製造植入式哺乳動物細胞之方法，包括以下步驟：
● 提供缺失B2M及缺失CIITA的哺乳動物細胞，
● 敲入B2M/HLA-E融合基因（諸如B2M/HLA-E*0101基因及B2M/HLA-E*0103基因中之一或二者）至所述缺失B2M及CIITA的哺乳動物細胞內，
● 在不同的已知位置處敲入4個HSV-TK基因，其中所述4個HSV-TK基因之至少一個為TK-sr39基因，
藉此獲得所述植入式哺乳動物細胞。
81. 根據實施例80之方法，其中所述植入式哺乳動物細胞具有HLA-A/B/C-/- HLA-E細胞表面表現型。
82. 根據實施例80-81之方法，其中所述植入式哺乳動物細胞具有HLA-A/B/C-/- HLA-E*0101+ HLA-E*0103+細胞之細胞表面表現型。
83. 根據實施例80-82中之任一例之方法，其中所述哺乳動物細胞為幹細胞、多功能細胞或iPS細胞。
84. 根據實施例80-83中之任一例之方法，其中所述哺乳動物細胞係選自由以下所組成之群組：神經元、心肌細胞、視網膜細胞、視網膜色素上皮細胞、間質幹細胞及β細胞。
85. 根據實施例80-84中之任一例之方法，其包括使所述哺乳動物細胞分化之步驟。
86. 根據實施例85之方法，其中，在分化步驟中，所述哺乳動物細胞係分化為β細胞、INS+及NKX6.1+雙陽性細胞或C-肽+/NKX6.1+雙陽性細胞、胰島素分泌細胞、體外衍生的類β細胞、胰臟內分泌細胞或內分泌細胞、內分泌前驅細胞或NGN3+/NKX2.2+雙陽性細胞、神經細胞（諸如神經元、中間神經元細胞、寡樹突膠細胞、星狀膠細胞、多巴胺神經細胞）、外泌體細胞、免疫細胞（諸如T細胞、NK細胞、巨噬細胞、樹突細胞）、肝細胞、星狀細胞、纖維母細胞、角質細胞或毛細胞、內耳細胞、腸細胞或類器官細胞、類腎細胞或另一種腎相關細胞、皮質神經前驅細胞、心肌細胞、視網膜細胞、視網膜色素上皮細胞、間質幹細胞。
87. 根據實施例80-84中之任一例之方法，其中所述4個HSV-TK基因係敲入4個不同染色體上之位置處。
88. 根據實施例80-85中之任一例之方法，其中2個HSV-TK基因係敲入安全的基因體港位點。
89. 一種包括有一或兩個B2M/HLA-E基因複本之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞不包括其他可表現的B2M基因，且在不同的已知位置具有4個HSV-TK基因的敲入，且其中所述4個HSV-TK基因之至少一個為TK-sr39基因。
90. 根據實施例89之哺乳動物細胞或根據實施例80-88中之任一例之方法，其中所述4個HSV-TK基因中的至少兩個為TK-sr39基因。
91. 根據實施例89之哺乳動物細胞或根據實施例39-76及80-88中之任一例之方法，其中所述4個HSV-TK基因中的兩個為TK-sr39基因而另兩個為野生型HSV-TK基因。
92. 根據實施例90-91中之任一例之哺乳動物細胞或根據實施例39-76及80-88中之任一例之方法，其中2個TK-sr39基因複本係插入安全港位點。
93. 根據實施例90-92中之任一例之哺乳動物細胞或根據實施例39-76及80-88中之任一例之方法，其中至少2個HSV-TK基因複本為野生型TK基因且插入該CIITA基因座內。
94. 根據實施例91-93中之任一例之哺乳動物細胞或根據實施例39-76及80-88中之任一例之方法，其中2個TK-sr39基因複本係插入該AAVS安全港位點內，而2個野生型TK基因複本係插入該CIITA基因座內。
95. 根據實施例89-94中之任一例之哺乳動物細胞或根據實施例39-76及80-88中之任一例之方法，其中該哺乳動物細胞係缺失CIITA。
96. 根據實施例1-38及89-95中之任一例之哺乳動物細胞或根據實施例39-76及80-88中之任一例之方法，其中2或至少2個B2M/HLA-E融合基因被敲入B2M基因座，2或至少2個HSV-TK基因亦被敲入B2M基因座，且2或至少2個HSV-TK基因被敲入CIITA基因座。
97. 根據實施例1-38及89-95中之任一例之哺乳動物細胞或根據實施例39-76及80-88中之任一例之方法，2或至少2個B2M/HLA-E融合基因被敲入B2M基因座，2或至少2個TK-sr39基因亦被敲入B2M基因座，且2或至少2個HSV-TK基因被敲入CIITA基因座。
在一實施例中，本發明係有關一種包括有2或至少2個B2M/HLA-E融合基因、不包括其他可表現的B2M基因且在不同的已知位置具有至少4個HSV-TK基因的敲入之哺乳動物細胞，其中所述4個HSV-TK基因之至少一個為TK-sr39基因，其中所述2或至少2個B2M/HLA-E融合基因被敲入B2M基因座，2或至少2個所述HSV-TK基因亦被敲入B2M基因座，且2或至少2個所述HSV-TK基因被敲入CIITA基因座。
在一實施例中，本發明係有關一種包括有2或至少2個B2M/HLA-E融合基因、不包括其他可表現的B2M基因且在不同的已知位置具有至少4個TK-sr39基因的敲入之哺乳動物細胞，其中所述2或至少2個B2M/HLA-E融合基因被敲入B2M基因座，2或至少2個所述TK-sr39基因亦被敲入B2M基因座，且2或至少2個所述TK-sr39基因被敲入CIITA基因座。
實例實例1 - 使用包括有野生型HSV-TK基因之細胞的更昔洛韋測定法
將未分化的親本hESC（人胚胎幹細胞）細胞株（顯示在圖3中名為「WT」的那列上）、具有2個野生型HSV-TK基因複本的hESC細胞株（顯示在圖3中名為「2xHSV-TK」的那列上）、以及具有4個野生型HSV-TK基因複本的hESC細胞株（顯示在圖3中名為「4xHSV-TK」的那列上）分別塗盤在hFN（人類纖維蛋白塗層）上。以60.000細胞/孔將細胞播種於24孔形式的培養皿中，並在DEF-CS培養基中培養過夜。接著將細胞培養在含有5個不同濃度之更昔洛韋(GCV)的DEF-CS培養基中培養7天：0、1、12.5、25、50或100 
M的GCV。每天更換含有更昔洛韋的DEF-CS培養基。當細胞達到90%的匯合度時，將細胞以1:2的比例在含有更昔洛韋之DEF-CS中繼代。培養7天後，將細胞用DAPI染色並拍下圖像。結果影像係顯示於圖3。
在基因體中不同位點上具有4個野生型HSV-TK複本的細胞係比在基因體中不同位點上只有2個野生型HSV-TK複本的細胞對更昔洛韋更為敏感。細胞在具有4個HSV-TK複本時，對所有的細胞皆可實現細胞死亡，即在以12.5 µM或更高的GCV之更昔洛韋治療下沒有細胞存活。細胞在僅有2個HSV-TK複本時，無法對所有的細胞實現細胞死亡，在更昔洛韋治療下仍有細胞存活。
實例2 - 使用包括有TK-sr39基因之細胞的更昔洛韋測定法
將未分化的親本hESC（人胚胎幹細胞）細胞株以及具有2個TK-sr39基因複本的hESC細胞株塗盤在hFN（人類纖維蛋白塗層）上。以60.000細胞/孔將細胞播種於24孔形式的培養皿中，並在DEF-CS培養基中培養過夜。接著將細胞培養在含有12個不同濃度之更昔洛韋(GCV)的DEF-CS培養基中培養6天：0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.15、0.3、0.6、1.3、2.5或5 M的GCV。每天更換含有更昔洛韋的DEF-CS培養基。培養7天後，將細胞用DAPI染色並拍下圖像。具有2個TK-sr39基因複本之hESC細胞株的結果影像係顯示於圖4。
圖4所示之數據教示了對於具有2個TK-sr39基因複本之hESC細胞株，實現全部細胞死亡的GCV最低劑量在0.04及0.08 µM更昔洛韋之間。
在不同次嘗試此測定法時，更昔洛韋滴定從12.5 µM開始至0.125 µM，並在7天後導致全部細胞死亡。
與包括有4個野生型HSV-TK複本（根據實例1）的細胞相比，由包括有2個TK-sr39複本（1個複本在AAVS1且1個複本在CLYBL）的細胞所獲得的結果為包括有2個TK-sr39複本的細胞之更昔洛韋敏感性提高了100倍。在具有2個TK-sr39基因複本之hESC細胞株中，以0,08 µM GCV可實現全部細胞死亡。在具有4個野生型HSV-TK基因複本之hESC細胞株中，以12,5 µM GCV可實現全部細胞死亡。
實例3 – 具有野生型HSV-TK基因之免疫安全細胞生成實驗方案
以總量500 ng之針對AAVS1的TALEN
®mRNA對（ThermoFisher
®，正向靶序列：CTGTCCCCTCCACCCCAC (SEQ ID NO 11)，反向靶序列：TTCTGTCACCAATCCTGT (SEQ ID NO 12)）以及500 ng之含有300 bp同源臂(與AAVS1中的TALEN
®剪切位置、HSV-TK卡匣及隨後的mCherry選擇卡匣相接)的供體質粒，將人類胚胎幹細胞(SA121)進行電穿孔。將細胞培養一週，並使用FACS細胞分選儀對mCherry陽性細胞進行批量分選。將細胞再培養一週，之後以總量500 ng之針對CLYBL的TALEN
®mRNA對（ThermoFisher
®，正向靶序列：CTCAAGTAGGTCTCTTTC (SEQ ID NO 13)，反向靶序列：GAAAGTCTTCTCCTCCAA (SEQ ID NO 14)）以及500 ng之含有300 bp同源臂(與CLYBL中的TALEN
®剪切位置、HSV-TK卡匣及隨後的eGFP選擇卡匣相接)的供體質粒。將細胞培養一週，並使用FACS細胞分選儀對mCherry/eGFP雙陽性細胞進行批量分選。將細胞再培養一週，之後以100 ng Cre重組酶mRNA進行電穿孔以切除選擇卡匣。使用FACS細胞分選儀將mCherry/eGFP雙陰性細胞單細胞分選到96孔盤中，並培養2至4週。使用PCR篩選細胞殖株的靶向雙等位基因整合。
以總量200 ng之針對B2M的TALEN
®mRNA對（ThermoFisher
®，正向靶序列：TCTCGCTCCGTGGCCTT (SEQ ID NO 15)，反向靶序列：AGCCTCCAGGCCAGAAAG (SEQ ID NO 16)），及200 ng之含有300 bp同源臂(與B2M中的TALEN
®剪切位置、B2M-HLAIE0101融合卡匣及隨後的mCherry選擇卡匣相接)的供體質粒，及200 ng之含有300 bp同源臂(與B2M中的TALEN
®剪切位置、B2M-HLAIE0103融合卡匣及隨後的eGFP選擇卡匣相接)的供體質粒，將含有來自上述實驗方案之4個HSV-TK複本的殖株進行電穿孔。將細胞培養一週，並使用FACS細胞分選儀對mCherry/eGFP雙陽性細胞進行批量分選。將細胞再培養一週，之後以100 ng Cre重組酶mRNA進行電穿孔以切除選擇卡匣。使用FACS細胞分選儀將mCherry/eGFP雙陰性細胞單細胞分選到96孔盤中，並培養2至4週。使用PCR篩選細胞殖株的靶向單等位基因整合。
所有的電穿孔係根據製造商的說明使用10uL Neon轉染套組 (ThermoFisher
®#MPK1025，脈衝電壓1100V，脈衝幅寬20，脈衝編號2，4e5細胞)。
細胞係根據製造商的說明(Takara
®#Y30017)在DEF-CS中培養。
實例4 – 具有TK-sr39基因之免疫安全細胞生成實驗方案
以總量500 ng之針對AAVS1的TALEN
®mRNA對（ThermoFisher
®，正向靶序列：
CTGTCCCCTCCACCCCAC(SEQ ID NO 17)，反向靶序列：
TTCTGTCACCAATCCTGT(SEQ ID NO 18)）以及500 ng之含有300 bp同源臂(與AAVS1中的TALEN
®剪切位置、TK-sr39卡匣及隨後的mCherry選擇卡匣相接)的供體質粒，將人類胚胎幹細胞(SA121)進行電穿孔。將細胞培養一週，並使用FACS細胞分選儀對mCherry陽性細胞進行批量分選。將細胞再培養一週，之後以總量500 ng之針對CLYBL的TALEN
®mRNA對（ThermoFisher
®，正向靶序列：CTCAAGTAGGTCTCTTTC (SEQ ID NO 19)，反向靶序列：GAAAGTCTTCTCCTCCAA (SEQ ID NO 20)）以及500 ng之含有300 bp同源臂(與CLYBL中的TALEN
®剪切位置、TK-sr39卡匣及隨後的eGFP選擇卡匣相接)的供體質粒。將細胞培養一週，並使用FACS細胞分選儀對mCherry/eGFP雙陽性細胞進行批量分選。將細胞再培養一週，之後以100 ng Cre重組酶mRNA進行電穿孔以切除選擇卡匣。使用FACS細胞分選儀將mCherry/eGFP雙陰性細胞單細胞分選到96孔盤中，並培養2至4週。使用PCR篩選細胞殖株的靶向雙等位基因整合。
以總量200 ng之針對B2M的TALEN
®mRNA對（ThermoFisher
®，正向靶序列：TCTCGCTCCGTGGCCTT (SEQ ID NO 21)，反向靶序列：AGCCTCCAGGCCAGAAAG (SEQ ID NO 22)），及200 ng之含有300 bp同源臂(與B2M中的TALEN
®剪切位置、B2M-HLAIE0101融合卡匣及隨後的mCherry選擇卡匣相接)的供體質粒，及200 ng之含有300 bp同源臂(與B2M中的TALEN
®剪切位置、B2M-HLAIE0103融合卡匣及隨後的eGFP選擇卡匣相接)的供體質粒，將含有來自上述實驗方案之2個TK-sr39 HSV-TK複本的殖株進行電穿孔。將細胞培養一週，並使用FACS細胞分選儀對mCherry/eGFP雙陽性細胞進行批量分選。將細胞再培養一週，之後以100 ng Cre重組酶mRNA進行電穿孔以切除選擇卡匣。使用FACS細胞分選儀將mCherry/eGFP雙陰性細胞單細胞分選到96孔盤中，並培養2至4週。使用PCR篩選細胞殖株的靶向單等位基因整合。
所有的電穿孔係根據製造商的說明使用10uL Neon轉染套組 (ThermoFisher
®#MPK1025，脈衝電壓1100V，脈衝幅寬20，脈衝編號2，4e5細胞)。
細胞係根據製造商的說明(Takara
®#Y30017)在DEF-CS中培養。
無
[圖1]是根據本發明之B2M/HLA-E*0101及B2M/HLA-E*0103基因構築體及其在人類第15號染色體上的B2M基因座中的敲入實施例示意圖。所示基因構築體包括啟動子、編碼信號肽的核酸序列、編碼B2M的核酸序列、編碼(G4S)4連接子的核酸序列、以及用於該等基因構築體之一者之編碼HLA-E*0101的核酸序列、或用於另一基因構築體之編碼HLA-E*0103的核酸序列。箭頭
表示驅動該基因構築體表現的啟動子。
[圖2]是根據本發明之安全港基因座中敲入2個HSV-TK基因的實施例示意圖，諸如在第19號染色體上之港基因座AAVS1 (PPP1R12C)，在第3號染色體上的hROSA26，在第5號染色體上的CCR5或在第13號染色體上的CLYBL。所示的基因構築體包括一個啟動子及一個編碼HSV-TK蛋白的核酸序列。箭頭
表示驅動該基因構築體表現的啟動子。
[圖3]係顯示暴露於不同濃度的更昔洛韋(GCV)後之帶有野生型HSV-TK之細胞的細胞培養物圖片。
[圖4]係顯示暴露於不同濃度的更昔洛韋(GCV)後之帶有TK-sr39之細胞的細胞培養物圖片。
<![CDATA[<110> 丹麥商諾佛．儂迪克股份有限公司（Novo Nordisk A/S）]]>
<![CDATA[<120> 安全免疫隱形細胞]]>
<![CDATA[<130> 200094WO01]]>
<![CDATA[<140> TW 110147425]]>
<![CDATA[<141> 2021-12-17]]>
<![CDATA[<150> EP 20215272.4]]>
<![CDATA[<151> 2020-12-18]]>
<![CDATA[<160> 22 ]]>
<![CDATA[<170> PatentIn版本3.5]]>
<![CDATA[<210> 1]]>
<![CDATA[<211> 337]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 智人]]>
<![CDATA[<400> 1]]>
Gly Ser His Ser Leu Lys Tyr Phe His Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Asn Asp Ala Ala Ser Pro Arg Met Val Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Met Glu Gln Glu Gly Ser Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr
50 55 60
Arg Ser Ala Arg Asp Thr Ala Gln Ile Phe Arg Val Asn Leu Arg Thr
65 70 75 80
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln
85 90 95
Trp Met His Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Arg Arg Phe Leu Arg Gly
100 105 110
Tyr Glu Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Glu
115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Val Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Glu
130 135 140
Gln Lys Ser Asn Asp Ala Ser Glu Ala Glu His Gln Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Asp Thr Cys Val Glu Trp Leu His Lys Tyr Leu Glu Lys Gly Lys
165 170 175
Glu Thr Leu Leu His Leu Glu Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His
180 185 190
Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Gln Asp Gly Glu Gly His
210 215 220
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Val Thr Leu
260 265 270
Arg Trp Lys Pro Ala Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile
275 280 285
Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ser Val Val Ser Gly Ala Val Val Ala
290 295 300
Ala Val Ile Trp Arg Lys Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr
305 310 315 320
Ser Lys Ala Glu Trp Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Glu Ser His Ser
325 330 335
Leu
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<![CDATA[<211> 99]]>
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<![CDATA[<213> 智人]]>
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50 55 60
Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys
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50 55 60
Arg Ser Ala Arg Asp Thr Ala Gln Ile Phe Arg Val Asn Leu Arg Thr
65 70 75 80
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln
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Trp Met His Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly
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Tyr Glu Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Glu
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Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Val Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Glu
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Gln Lys Ser Asn Asp Ala Ser Glu Ala Glu His Gln Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Asp Thr Cys Val Glu Trp Leu His Lys Tyr Leu Glu Lys Gly Lys
165 170 175
Glu Thr Leu Leu His Leu Glu Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His
180 185 190
Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe
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Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Gln Asp Gly Glu Gly His
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Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
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Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg
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Arg Trp Lys Pro Ala Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile
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Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ser Val Val Ser Gly Ala Val Val Ala
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Ala Val Ile Trp Arg Lys Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr
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Ser Lys Ala Glu Trp Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Glu Ser His Ser
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Leu
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Leu
130 135 140
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145 150 155 160
Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp
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275 280 285
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aagaatggag agagaattga aaaagtggag cattcagact tgtctttcag caaggactgg 240
tctttctatc tcttgtacta cactgaattc acccccactg aaaaagatga gtatgcctgc 300
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tcccactcct tgaagtattt ccacacttcc gtgtcccggc ccggccgcgg ggagccccgc 480
ttcatctctg tgggctacgt ggacgacacc cagttcgtgc gcttcgacaa cgacgccgcg 540
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cgggagacac ggagcgccag ggacaccgca cagattttcc gagtgaacct gcggacgctg 660
cgcggctact acaatcagag cgaggccggt tctcacaccc tgcagtggat gcatggctgc 720
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gattatctca ccctgaatga ggacctgcgc tcctggaccg cggtggacac ggcggctcag 840
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gagggccata cccaggacac ggagctcgtg gagaccaggc ctgcagggga tggaaccttc 1140
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cagcatgagg ggctacccga gcccgtcacc ctgagatgga agccggcttc ccagcccacc 1260
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Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly
225 230 235 240
Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Cys Gly Gly Ser Trp Arg
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Ser Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys
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tccatgaccc cacaggctgt gctggctttt gtggccctga tccctccaac cctccctggc 600
accaacattg ttctgggagc actgcctgaa gacagacaca ttgacaggct ggcaaagagg 660
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ctgctggcaa acactgtgag atacctccag tgtggaggct cttggagaga ggactgggga 780
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Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu
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Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Cys Gly Gly Ser Trp Arg
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Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu
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Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln Thr His Val
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Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe
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ttctgtcacc aatcctgt 18
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<![CDATA[<223> 反向靶序列]]>
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Claims (15)
- 一種包括有B2M/HLA-E融合基因之哺乳動物細胞，其不包括其他可表現的B2M基因且在不同的已知位置具有至少4個HSV-TK基因的敲入，其中所述4個HSV-TK基因之至少一個為TK-sr39基因。
- 如請求項1所述之哺乳動物細胞，其中所述4個HSV-TK基因之至少兩個為TK-sr39基因。
- 如請求項1至2中之任一項所述之哺乳動物細胞，其中所述細胞在不同的已知位置處包括4個HSV-TK基因，所述4個HSV-TK基因中的兩個為TK-sr39基因而另兩個為野生型HSV-TK基因。
- 如請求項1至2中之任一項所述之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞為幹細胞。
- 如請求項1至2中之任一項所述之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞係選自由以下所組成之群組：神經細胞、神經元、中間神經元細胞、寡樹突膠細胞、星狀膠細胞、多巴胺神經細胞、外泌體細胞、心肌細胞、視網膜細胞、視網膜色素上皮細胞、間質幹細胞、β細胞、INS+及NKX6.1+雙陽性細胞、C-肽+及NKX6.1+雙陽性細胞、胰島素分泌細胞、體外衍生的類β細胞、胰臟內分泌細胞、內分泌細胞、免疫細胞、T細胞、NK細胞、巨噬細胞、樹突細胞、肝細胞、星狀細胞、纖維母細胞、角質細胞、毛細胞、內耳細胞、腸細胞或類器官細胞、皮質神經前驅細胞、類腎細胞及腎相關細胞。
- 如請求項1至2中之任一項所述之哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞係缺失HLA-II，例如缺失CIITA。
- 如請求項1至2中之任一項所述之哺乳動物細胞，其中至少2個HSV-TK基因係於安全基因體港位點敲入。
- 如請求項1至2中之任一項所述之哺乳動物細胞，其中所述HSV-TK基因中的至少兩個係於一安全港位點敲入且所述HSV-TK基因中的至少兩個係經敲入以消除CIITA等位基因。
- 一種製造植入式哺乳動物細胞之方法，包括以下步驟： ● 提供一哺乳動物細胞， ● 敲入至少一B2M/HLA-E融合基因至所述哺乳動物細胞， ● 使所述哺乳動物細胞的原生B2M基因失活， ● 在不同的已知位置處敲入至少4個HSV-TK基因，其中所述4個HSV-TK基因之至少一個為TK-sr39基因， ● 視情況使所述哺乳動物細胞分化， 藉此獲得所述植入式哺乳動物細胞。
- 如請求項9所述之方法，其中所述哺乳動物細胞係選自由以下所組成之群組：幹細胞、多功能細胞或iPS細胞、內分泌前驅細胞及NGN3+/NKX2.2+雙陽性細胞。
- 如請求項9所述之方法，其中所述植入式哺乳動物細胞係選自由以下所組成之群組：神經細胞、神經元、中間神經元細胞、寡樹突膠細胞、星狀膠細胞、多巴胺神經細胞、外泌體細胞、心肌細胞、視網膜細胞、視網膜色素上皮細胞、間質幹細胞、β細胞、INS+及NKX6.1+雙陽性細胞、C-肽+及NKX6.1+雙陽性細胞、胰島素分泌細胞、體外衍生的類β細胞、胰臟內分泌細胞、內分泌細胞、免疫細胞、T細胞、NK細胞、巨噬細胞、樹突細胞、肝細胞、星狀細胞、纖維母細胞、角質細胞、毛細胞、內耳細胞、腸細胞或類器官細胞、皮質神經前驅細胞、類腎細胞及腎相關細胞。
- 如請求項9至11中之任一項所述之方法，其中所述4個HSV-TK基因的敲入係位於2個不同染色體上。
- 如請求項9至11中之任一項所述之方法，其中至少2個HSV-TK基因係於安全基因體港位點敲入。
- 一種如請求項1至7中之任一項所述之哺乳動物細胞，其係用於預防、治療或治癒慢性疾病及/或急性疾病。
- 如請求項14所述之哺乳動物細胞，其中所述慢性疾病係選自由以下所組成之群組：糖尿病、第1型糖尿病、第2型糖尿病、乾性黃斑部病變、色素性視網膜炎、神經系統疾病、帕金森氏病、心臟病、慢性心臟衰竭、組織纖維化、硬化、聽力損失、角膜失明、中風、慢性腎臟病、及/或所述急性疾病係選自細菌性肺部感染。
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