CN1436843A

CN1436843A - 脐血造血干细胞的制作方法

Info

Publication number: CN1436843A
Application number: CN02103676A
Authority: CN
Inventors: 刘颉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-02-08
Filing date: 2002-02-08
Publication date: 2003-08-20

Abstract

脐血造血干细胞的制作方法，按如下步序进行：(1)采集脐血，将出生的胎儿的脐血采到脐血采集袋内；(2)加入红细胞沉淀剂；(3)离心分离1，将脐血采集袋中脐血中的红细胞分离；(4)移出红细胞，将红细胞输送到红细胞收集袋内；(5)离心分离2，将白细胞包括造血干细胞与血浆再一次分离；(6)移出血浆，将被分离的血浆输入到血浆收集袋内，脐血收集袋内剩余的脐血为含富集白细胞的脐血；(7)加入冷冻剂，将脐血收集袋中的富集白细胞脐血中加入冷冻剂；(8)包装；(9)降温；(10)入库保存。用本发明方法制作的造血干细胞可长期存放，以便于随时取用，大大地方便了治疗，及时解除病人痛苦，适用于制作在脐血库中长期存放的造血干细胞。

Description

脐血造血干细胞的制作方法

技术领域

本发明方法涉及一种血液制品的制作方法，特别是一种脐血造血干细胞的制作方法。

背景技术

造血干细胞是能够产生血细胞(红细胞、白细胞、血小板)和免疫活性细胞的一类特殊细胞。红细胞负责运输氧气，白细胞抵抗入侵的病原微生物，血小板有凝血作用，免疫活性细胞构成人体的免疫防御体系。当病人的造血干细胞受到损害或恶变时，将正常的造血干细胞移植到病人体内取代异常的造血干细胞，使之重建正常造血和免疫功能，这是目前治疗恶性及非恶性血液病、某些遗传性病和恶性肿瘤的最有效的方法。对上述的病症的一般的治疗方法是采用骨髓移植法，骨髓移植的最大障碍是找到一个组织配型基因完全相同的供者，另外骨髓采集需要使用麻醉剂，会给供者造成不适，骨髓移植准备工作耗费时间，影响病人及时治疗。胎儿脐血中含有大量造血细胞，以脐血作为造血干细胞移植的新来源，是20世纪末医学领域取得的重要成果之一。目前，脐血造干细胞移植已成功治愈了白血病，严重免疫缺陷症和某些遗传性疾病等。由于脐血来源广泛对供者无任何痛若，取血方法简便，和可以血库形式长期保存，便于查询取用及时方便的优点，展望未来，脐血可能取代骨髓成为造血干细胞主要来源，特别是对儿童病患者。

本发明内容

本发明的目的是提供一种脐血造血干细胞的制作方法，以此方法制作的造血干细胞可长期存放于脐血库，以便于病人随时配组、治疗取用，大大地方便了治疗，及时救治病人。此外，本发明的实施还会具有显著的社会和经济效益。

本发明的目的是按如下技术方案实现的。脐血造血干细胞的制作方法，其特征是：它按如下步序进行：

(1)采集脐血，将出生的胎儿的脐血采到脐血采集袋内；

(2)加入红细胞沉淀剂，将红细胞沉淀剂加入到脐血采集袋中；

(3)离心分离1，用离心方法将脐血采集袋中脐血中的红细胞分离；

(4)移出红细胞，将脐血采集袋中被分离的红细胞输送到红细胞收集袋内；

(5)离心分离2，用离心方法将脐血收集袋中的血浆与白细胞包括造血干细胞再一次分离；

(6)移出血浆，将脐血采集袋中被分离的血浆输入到血浆收集袋内，脐血收集袋内剩余的为含干细胞的白细胞；

(7)加入冷冻剂，将脐血收集袋中的包括干细胞的白细胞中加入冷冻剂；

(8)包装，将含干细胞的白细胞包装；

(9)降温，将包装的含干细胞的白细胞降温；

(10)入库保存，入库在液氮中保存。

所述步序(2)采用的沉淀剂为6％羟乙基淀粉，按与脐血比例1∶3-5加入。所述步序(7)中冷冻剂为二甲亚砜，与等容积的右旋糖酐40混合预冷后以1∶4比例加入经预冷的含造血干细胞的白细胞中。所述步序(9)的降温是将包装有含造血干细胞的白细胞的金属保存盒放在降温仪内，开始降温速度为8-10℃/分，开始冻结温度为-3℃，停止冻结温度为-10--15℃，冻结后降温速度为2℃/分，终止降温温度为-50℃。所述步序(3)的操作是：将脐血采集袋的带有接驳头的一端朝下放在离心机中，所述步序(4)的操作是将脐血采集袋带有接驳头的一端朝下，用II型连接管从接驳头引出，经I型连接管引到红细胞袋中。所述步序(5)的操作是将脐血采集袋的带有接驳头的一端朝上安放在离心机中；所述步序(6)的操作是将脐血采集袋带有接驳头的一端朝上，用II型连接管从接驳头处将血浆引出至血浆袋中。所述的I型连接管包括尖插头、连管体、支管，尖插头的尾部与连管体的单端口相连，连管体的另一端具有至少二个端口，分别经支管与红细胞袋及血浆袋相连。所述II型连接管包括尖插头、连管体、支管、分支管、隔膜管，尖插头的尾部与连管体的单端口相连，连管体的另一端具有若干端口，各端口经支管与下一级连管体相连，在一支管的端头上具有隔膜管，另一支管的端头与下一级连管体的单端口相连。

本发明方法采用逐步分离的方法将采集到的脐血经离心分离将脐血中的血红细胞首先分离取出，然后再将血浆分离取出，将含有造血干细胞的白细胞加冷冻剂进行包装、冷冻，放入脐血库保存，以备随时取用。为了防止在各操作、传递中产生差错，在每一步序操作之前必须进行核查该脐血采集袋，红细胞收集袋、以及用于抽取红细胞成份的注射器上的标记(条码号)是否一致，同样在其它操作如加入冷冻剂操作时也应核对该脐血采集袋、冷冻袋、冷冻保存盒上的标记是否一致。

由于上述操作特别是红细胞、血浆的移出，抽样检测，加入沉淀剂、冷冻剂等操作，使用常规的取血方法和注射分离器械已不能确保在操作过程中不发生污染，达不到生物制品GMP的要求。此外，常规器械在操作中易混乱、工作效率低，计量不易准确。采用本发明提供的制作方法和脐血收集袋、I和II型连接管及其血浆袋、红细胞袋，能避免上述普通器械的缺点，达到不会发生污染、不会发生血样混乱，且计量准确、工作效率显著提高的目的。

综上所述，本发明由于采用胎儿的脐血为原料，加以处理，制成造血干细胞，可将其低温长期存放在脐血血库中，以随时根据病人要求取出使用，避免了采用骨髓移植时的不易寻找捐赠人和即时移植的种种不便，使病人得到及时治疗。此外，由于脐血造血干细胞的生产制作在中国尚处于初创阶段，本发明填补了这方面的空白，本发明的实施还将会改变中国长期以来造血干细胞来源缺乏的局面，也会具有显著的社会效益和经济效益。

附图说明

图1为本发明的制作流程示意图，

图2、3、4、5为红细胞、血浆移出和添加操作示意图。

实施例

通过本实施例来具体说明本发明脐血造血干细胞的制作方法。脐血存在于胎盘和与胎儿连接的脐带血管内，在胎儿出生的时候采集，脐血为造血干细胞的原材料。按图1所示步序进行制作：

(1)采集脐血，将胎儿脐血采集到脐血采集袋1内；如图2，该脐血采集袋1一端带有接驳头12另端具有悬挂口13和悬挂孔13A用于悬挂，脐血采集袋1内装脐血11，经筛选脐血质量应达规定标准，本实施例中，脐血应达到无病原体感染，未携带遗传病基因，低凝血，和细胞具有良好的存活能力，检测是否达标。

(2)加入红细胞沉淀剂，连接脐血采集袋1和II型连接管2，将红细胞沉淀剂通过II型连接管的隔膜管23A或24加入到脐血采集袋内，本实施例采用6％羟乙基淀粉与脐血比例为1∶5，将该沉淀剂注入到脐血采集袋1内，充分混匀。

(3)离心1；用离心方法将脐血采集袋1中脐血11中的红细胞14分离，本实施例中采用离心机，将脐血采集袋带接驳头12的一端朝下放入低温离心机，离心后，红细胞14沉淀在采集袋的带接驳头12的一端。

(4)移出红细胞，如图3，将脐血采集袋1中被分离的红细胞14输送到红细胞收集袋4内。先将脐血采集袋1从离心机取出，采集袋1的接驳头12朝下，将与脐血采集袋1相连的I型连接管的红细胞收集袋4放在较低的位置，使红细胞14从脐血收集袋1的底部缓慢流入红细胞收集袋4中。

做法是，在无菌操作台内，将血液分离用I型连接管3的尖插头31与II型连接管的隔膜管24相连，按照离心时脐血采集袋1朝向的位置，将脐血采集袋1悬挂在墙的勾子上。将连在I型连接管3上的红细胞(收集)袋4放在电子秤6上(图3)。离心后红细胞14沉淀下来，通过重力和使用止血钳33控制红细胞14从脐血袋1到红细胞袋4的流速。当红细胞量达到电脑指示的量时，停止红细胞移出，热合与红细胞袋4相连的支管32，分离红细胞袋4。

(5)离心2，用离心方法将白细胞包括造血干细胞与脐血收集袋中剩余的血浆再一次分离，用离心机进行分离，将脐血采集袋放入低温离心机，在离心运行后，大于99％的白细胞包括造血干细胞与血浆分离。第二次离心时，将脐血采集袋1的接驳头12一端朝上(图4)，离心后，保持上述位置。

(6)移出血浆，将脐血采集袋1从离心机中取出，将脐血采集袋接驳头12一端的悬挂孔13A悬挂在分浆器(未示出)上，通过分浆器上夹板对脐血采集袋1的压力，和使用止血钳33控制血浆15从脐血采集袋1到血浆袋5的流速，当含有红细胞沉淀液的血浆15的移出量达到电脑指示的量时，夹紧与血浆袋5相连的支管32上的夹子33，使脐血采集袋1内剩余的为包括造血干细胞的白细胞16，即富集白细胞。

(7)加入冷冻剂，将脐血采集袋1中的富集白细胞脐血中加入冷冻剂。本实施例采用的冷冻剂为2.5ml的二甲亚砜(Dimethyl sulphoxide)，将其与等容积的右旋糖酐40(Dextran40)混合后，以混合液按1∶4的比例通过连接管快速加入到脐血收集袋1内的富集白细胞脐血中，加入之前混合液和富集白细胞均需预冷。其操作为：血浆移出后，将冷冻袋7通过II型连接管2与脐血袋1相连(图5)。从II型连接管的扭断式隔膜管24处注入5ml冷冻剂后，将含有冷冻剂的浓缩白细胞16从脐血采集袋1转入冷冻袋7，热合与II型连接管2相连的支管22后，使冷冻袋7分离。

(8)将冷冻袋7放入FEP塑料保护袋内，真空密合后，装入冷冻保存盒内。

(9)降温；将冷冻保存盒降温，放在液氮保存系统的降温仪的液氮气相层内进行降温，开始降温速度为10℃/分，开始冻结温度为-3℃，停止冻结温度为-10℃，冻结后降温速度为2℃/分，终止降温速度为-50℃，

(10)入库液氮保存；在液氮保存系统内自动将冷冻保存盒从液氮气相层转入到液氮的液相层保存，温度为-196℃。

如图2，该II型连接管2包括尖插头21、连管体21A、支管22，分支管23、隔膜管24，尖插头21的尾部与连管体21A的单端口相连，连管体21A的下端具有若干端口，本实施例为2个端口，右端经支管22与下一级连管体21B相连，连管体21B可再下分为多级隔膜管23A。左端支管22的下端头为连管体21B，下端可与分支管23、下一级连管体21C的单端口相连以便形成多级连管分支，多级分支的末端为隔膜管24，用于插入该尖插头或注射器来抽取或添加之用。如图3，I型连接管3包括尖插头31、连管体31B、支管32，尖插头31的尾部与连管体31B的单端口相连，连管体31B另一端具有二个端口，分别经支管32与红细胞袋4及血浆袋5相连。当使用时，如图3，II型连接管2的尖插头21插入采血袋1的接驳头12中，I型连接管3的尖插头31插入II型连接管2的隔膜管24中，将红细胞经II型连接管2和I型连接管3的支管32引入到红细胞袋4中，或如图4引入到血浆袋5中。引出重量由电子秤6显示。由于I、II型连接管均可具有多个、多级支管，可同时连接多个血浆袋或和红细胞袋，使血液分离简化、准确、高效、不致污染。

在上述加工过程中，各步序操作时均有检测，以免发生差错，如在步序(1)后留样检测传染病、血型，如在步序(4)移出红细胞后，将移出的红细胞进行组织配型检测。做法是将移出的红细胞成份分装在数个冷冻小管内，用于组织配型检测以备今后应用。在步序(6)，移出血浆后，要对富集白细胞进行检测，包括检测细胞数量，细胞成活率、细胞集落培养等，可按常规做法办理。在步序(8)之后，进行检测步序(81)，先将冷冻袋内含冷冻剂的细胞液返回到步序(7)的脐血袋1内，再送回冷冻袋，接着进行检测步序(82)，将血浆袋内的血浆返回脐血袋，再将血浆送到血浆袋，目的是检测干细胞在处理过程时经过的所有途径是否受到病原菌污染，以保证干细胞的质量。又如在步序(8)富集白细胞转入冷冻袋之前也需进行细胞成活率检测，以保证质量。管理上的措施是防止同时处理二份以上脐血时发生混乱，导致恶性事故发生，一般在各主要步序均经核查，要有第二者进行核查脐血采集袋、红细胞收集袋、及用于抽取红细胞成份的注射器上的条码号是否一致。核查红细胞收集袋、用于抽取红细胞成份的注射器及储存试管上的条码是否一致，以免出错。在步序(8)要由第二者进行核查该脐血袋、冷冻袋、冷冻保存盒上的条码是否一致。在各个步序中均设有登记表，按要求登记以方便管理避免出错。此外，本发明方法的各步序均可采用电脑控制，特别是重量配比，各操作参数控制、各种试管、注射器等配套识别，以及试验取得的数据存储，则可大大节省一些烦琐的核查登记工作。

Claims

1、脐血造血干细胞的制作方法，其特征是：它按如下步序进行：

(1)采集脐血，将出生的胎儿的脐血采到脐血采集袋内；

(5)离心分离2，用离心方法将脐血采集袋中的血浆与白细胞包括造血干细胞再一次分离；

(6)移出血浆，将脐血采集袋中被分离的血浆输入到血浆收集袋内，脐血采集袋内剩余的为含造血干细胞的白细胞；

(7)加入冷冻剂，将脐血采集袋中的含造血干细胞的白细胞中加入冷冻剂；

(8)包装，将加入冷冻剂的含造血干细胞的白细胞包装；

(9)降温，将加入冷冻剂的含造血干细胞的白细胞降温；

(10)入库保存，入库在液氮中保存。

2、根据权利要求1所述的脐血造血干细胞的制作方法，其特征是：所述步序(2)采用的沉淀剂为6％羟乙基淀粉，按与脐血比例1∶3-5加入。

3、根据权利要求1所述脐血造血干细胞的制作方法，其特征是：所述步序(7)中冷冻剂为二甲亚砜，与等容积的右旋糖酐40混合预冷后以1∶4比例加入经预冷的含造血干细胞的白细胞中。

4、根据权利要求1所述脐血造血干细胞的制作方法，其特征是：所述步序(9)的降温是将包装有含造血干细胞的白细胞的金属保存盒放在降温仪内，开始降温速度为8-10℃/分，开始冻结温度为-3℃，停止冻结温度为-10--15℃，冻结后降温速度为2℃/分，终止降温温度为-50℃。

5、根据权利要求1所述脐血造血干细胞的制作方法，其特征是：所述步序(3)的操作是：将脐血采集袋的带有接驳头的一端朝下放在离心机中，所述步序(4)的操作是将脐血采集袋带有接驳头的一端朝下，用II型连接管从接驳头引出，经I型连接管引到红细胞袋中。

6、根据权利要求1所述脐血造血干细胞的制作方法，其特征是：所述步序(5)的操作是将脐血采集袋的带有接驳头的一端朝上安放在离心机中；所述步序(6)的操作是将脐血采集袋带有接驳头的一端朝上，用II型连接管从接驳头处将血浆引出至血浆袋中。

7、根据权利要求5所述的方法中使用的连接管，其特征是：所述的I型连接管包括尖插头、连管体、支管，尖插头的尾部与连管体的单端口相连，连管体的另一端具有至少二个端口，分别经支管与红细胞袋及血浆袋相连。

8、根据权利要求5或6所述的方法中使用的连接管，其特征是：所述II型连接管包括尖插头、连管体、支管、分支管、隔膜管，尖插头的尾部与连管体的单端口相连，连管体的另一端具有若干端口，各端口经支管与下一级连管体相连，在一支管的端头上具有隔膜管，另一支管的端头与下一级连管体的单端口相连。

9、根据权利要求1所述的脐血造血干细胞的制作方法，其特征是：在步序(4)移出红细胞后，将移出的红细胞进行组织配型检测，做法是将移出的红细胞分装在数个储存试管内进行组织配型检测。

10、根据权利要求1所述的脐血造血干细胞的制作方法，其特征是：在步序(8)之后的检测(81)为先将冷冻袋内含冷冻剂的细胞液返回到步序(7)的脐血袋内，再送回冷冻袋，接着进行检测(82)为将血浆袋内的血浆返回到脐血袋，再将血浆送到血浆袋。