CN106689117A

CN106689117A - 拟缺香茶菜酮在制备细胞冻存液的应用和方法

Info

Publication number: CN106689117A
Application number: CN201710001138.7A
Authority: CN
Inventors: 刘文友
Original assignee: Zhengzhou Han Technology Co Ltd
Current assignee: Zhengzhou Han Technology Co Ltd
Priority date: 2017-01-03
Filing date: 2017-01-03
Publication date: 2017-05-24

Abstract

本发明提出一种拟缺香茶菜酮在制备细胞冻存液的应用和方法，其可降低适用于免疫细胞长期保存，并能够在复苏后保持其细胞特性。本发明人惊奇的发现，拟缺香茶菜酮可以显著减少DMSO的使用量，该冻存液能够有效用于保存细胞，尤其是免疫细胞，并且冻存时间长（冻存时间可达几年甚至更长），细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，活性好，细胞回收率高，尤其适用于大规模免疫细胞的冷冻保存。

Description

拟缺香茶菜酮在制备细胞冻存液的应用和方法

技术领域

本发明涉及一种拟缺香茶菜酮在制备细胞冻存液的应用和方法，属于生物领域，特别是细胞培养领域。

背景技术

拟缺香茶菜 Isodon excisoides (Sun ex C. H. Hu) C. Y. Wu et H. W. Li别名野紫苏，为唇形科（Labiatae）香茶菜属 Rabdosia (Bl.) Hassk.植物，产于湖北、四川、云南。其味辛、苦，性平，具祛风活血、解毒消肿功效，主要用于治疗感冒头痛、风湿痹痛、跌打瘀肿、骨折、外伤出血、毒蛇咬伤。关于该植物化学成分研究报道较少。李火云等对拟缺香茶菜 Isodon excisoides 全草的化学成分进行研究，分离得到 24 个化合物，其中化合物1鉴定为：

(E)-5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-(4-hydroxyphenyl) pent-1-en-3-one，该化合物为新化合物，命名为拟缺香茶菜酮。其分子结构为：

。

本发明发现拟缺香茶菜酮在制备细胞冻存液的应用和方法，其适用于免疫细胞长期保存，并能够在复苏后保持其细胞特性。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种拟缺香茶菜酮在制备细胞冻存液的应用和方法，其可降低适用于免疫细胞长期保存，并能够在复苏后保持其细胞特性。

拟缺香茶菜酮为：

(E)-5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-(4-hydroxyphenyl) pent-1-en-3-one，其分子结构为：

。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种细胞冻存液。根据本发明实施例，该细胞冻存液冻存的细胞种类不受特别的限制，只要冻存液能用于长期保存细胞即可。

作为本发明的一个技术方案，该冻存液包括0.5体积%的DMSO，0.005-0.008体积%的拟缺香茶菜酮；DMSO是二甲基亚砜，用途广泛。用作乙炔、芳烃、二氧化硫及其他气体的溶剂以及腈纶纤维纺丝溶剂。是一种即溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂。对皮肤有极强的渗透性，有助于药物向人体渗透。也可作为农药的添加剂。也是一种十分重要的化学试剂。

DMSO也是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。

但研究表明，DMSO存在一定的毒性作用，与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，具有血管毒性和肝肾毒性。及余量培养基。因此，从安全角度考虑，应该尽量降低其使用量。

本发明人惊奇的发现，拟缺香茶菜酮可以显著减少DMSO的使用量，该冻存液能够有效用于保存细胞，尤其是免疫细胞，并且冻存时间长（冻存时间可达几年甚至更长），细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，活性好，细胞回收率高，尤其适用于大规模免疫细胞的冷冻保存。

本发明的有益之处在于：

本发明公开了一种拟缺香茶菜酮在制备细胞冻存液的应用和方法，其可降低DMSO的用量，降低毒性，增加安全性，而且不需要使用血浆，无传染源，适用于免疫细胞长期保存，并能够在复苏后保持其细胞特性。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

分离获得脐带血单个核细胞，将单个核细胞细胞接种到加有20ml培养基的培养瓶中，培养基配比为：18ml OpTmizer™ CTS™ T-cell expansion SFM培养基+2ml自体血浆（Autologous plasma）+终浓度1000IU/ml Pepro Tech IL-2+终浓度0.01KE/ml沙培林（OK432），37℃，5%CO₂无菌培养，记为第0天。每日观察细胞，并进行适当传代扩增，培养基配比为培养基配比为：OpTmizer™ CTS™ T-cell expansion SFM培养基+10%自体血浆（Autologous plasma）+终浓度1000IU/ml Pepro Tech IL-2，诱导扩增得到免疫细胞。

免疫细胞的冻存和复苏方法：

将上述体外诱导扩增第10天获得的免疫细胞分别采用冻存液进行冻存，冻存液的成份如下：

该冻存液包括0.5体积%的DMSO， 0.008体积%的拟缺香茶菜酮；以及余量培养基。

冻存液剩余体积的均为1640培养基。

按照以下步骤冻存免疫细胞：将冷冻保存液与细胞混匀后，速移入冻存管，并放入冻存盒中，-80℃程序降温过夜，次日转入液氮内。其中，每10⁷个免疫细胞采用1.5ml冻存液。

冷冻保存免疫细胞30d，然后进行复苏。

检测冻存前后细胞的存活率，以及复苏后细胞回收率。具体地，冻存前以及冻存并复苏后的细胞存活率计算方法为：【活细胞数/（活细胞数＋死细胞数）】×100%。复苏后细胞回收率的计算方法为：（复苏后活细胞数/冻存时活细胞数）×100%。

利用流式细胞仪检测免疫细胞细胞表面标志CD3-CD56+和CD3+CD4+的表达情况。

实施例2：

其他条件如实施例1，但是冻存液的成份如下：

该冻存液包括0.8体积%的DMSO，0.005体积%的拟缺香茶菜酮；以及余量培养基。

实施例3：

其他条件如实施例1，但是冻存液的成份如下：

该冻存液包括0.6体积%的DMSO，0.006体积%的拟缺香茶菜酮；以及余量培养基。

实施例4：

其他条件如实施例1，但是冻存液的成份如下：

该冻存液包括0.7体积%的DMSO，0.008体积%的拟缺香茶菜酮；以及余量培养基。

实施例5：

其他条件如实施例1，但是冻存液的成份如下：

该冻存液包括0.9体积%的DMSO， 0.008体积%的拟缺香茶菜酮；以及余量培养基。

实施例6：

各组冻存液的细胞回收率为：

	细胞回收率（%）
		实施例1	63.8
实施例2	65.1
		实施例3	95.6
实施例4	61.8
		实施例5	62.3

实施例1-5冻存后，细胞表面标志表达情况与冻存前相比均无显著差别。

实施例7：

对比实验：

D1：5体积% DMSO；

D2：10体积%DMSO；

D3：1积% DMSO；

对比实验各组冻存液的细胞回收率为：

	细胞回收率（%）
		D1	62.9
D2	77.0
		D3	35.6

可见，DMSO对免疫细胞具有较好的保护作用，如想达到较好的回收率，DMSO的浓度必须为10体积%或者更高。

实施例8：

本发明人发现，实施例3的配比相对于其他实施例具有显著的更高的细胞回收率，为了验证其可重复性，进行了5次重复实验，结果如下：

	细胞回收率（%）
		1	95.3
2	96.1
		3	95.5
4	95.1
		5	96.2

结果表明，实施例3的配比确实具有显著的更好的冻存效果，具有很好的重复性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包括于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于，包括：

0.5体积%的DMSO；

0.005-0.008体积%的拟缺香茶菜酮；

以及余量培养基。

2.权利要求1所述的冻存液，其特征在于：

其包括0.6体积%的DMSO；

0.006体积%的拟缺香茶菜酮；

以及余量培养基。

3.权利要求1或2所述的冻存液用于冻存细胞的应用。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述细胞是免疫细胞。

5.权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述细胞是单核细胞。

6.拟缺香茶菜酮在制备细胞冻存液上的应用。