CN105143441A

CN105143441A - 用带有活性因子的细胞空壳作为淋巴细胞体外培养增效剂的制备及其应用方法

Info

Publication number: CN105143441A
Application number: CN201480017697.1A
Authority: CN
Inventors: 张明杰
Original assignee: Shenzhen Hank Biological Engineering Co ltd
Current assignee: SHENZHEN HANK BIOLOG ENGINEERING CO LTD
Priority date: 2014-01-13
Filing date: 2014-01-13
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2034-01-13
Also published as: US9796960B2; CN105143441B; WO2015103793A1; US20170037371A1

Abstract

提供了一种用带有活性因子的细胞空壳作为淋巴细胞体外培养增效剂的制备及其应用方法。制备细胞空壳的方法包括：将细胞进行洗涤处理，获得经过洗涤的细胞；将经过洗涤的细胞进行裂解处理，获得细胞空壳，其中该细胞表面带有能够促进淋巴细胞增殖分化的细胞因子。

Description

用带有活性因子的细胞空壳作为淋巴细胞体外培养增效剂

的制备及其应用方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体而言，涉及用带有活性因子的细胞空壳作为淋巴细胞体外增效剂的制备及其应用方法。更具体地说是涉及用带有活性因子的细胞空壳作为淋巴细胞体外培养增效剂的制备方法及其在扩增活化淋巴细胞中的应用方法。背景技术

淋巴细胞在体外的增殖和分化受多种因素的调节，最常见的调节剂主要是可溶性细胞因子、各种天然细胞和基因重组工程细胞。在细胞的体外培养中，用表达某种细胞因子的基因重组工程细胞作为伺养细胞（Feeder Cells) 或抗原呈递细胞（APC) 对淋巴细胞的调解功能往往比用游离的细胞因子更强，表明固相化细胞因子的优势。所以，目前常用表达细胞因子的基因重组工程细胞作为伺养细胞或 APC来促进淋巴细胞的增殖及分化。不管是伺养细胞还是 APC都属于辅助细胞，为了不影响淋巴细胞在体外的增殖和分化，需要对伺养细胞和 APC进行处理，使其失去增殖活性。目前常用的方法有伽玛射线照射、 UV照射、电休克等物理方法和丝裂霉素化学处理等。但仍存在无法大量制备、设备昂贵、操作不安全、灭活程度不好掌握、可能会有残存的活细胞或彻底损坏细胞等缺陷。此外，不管是物理的还是化学的处理方法，都是造成核酸的交联或破坏，虽然其不能再在细胞增殖中起作用，但还在细胞内，作为遗传物质，即使是其碎片，也可能有被整合到其它细胞基因中的可能性，因此对制得的细胞进入临床应用将是一大障碍。

因此，如何获得既有效又安全的淋巴细胞体外增效剂仍是生物学的一大难题。发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决了相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种制备细胞空壳的方法。

本发明是基于发明人的以下发现而完成的：发明人发现，用伺养细胞刺激淋巴细胞的扩增及活化，淋巴细胞与伺养细胞的直接接触是必需的，而伺养细胞内的可溶性成分并不重要。比如，用来刺激 NK细胞（自然杀伤细胞）扩增活化的 K562-mIL15-41BB伺养细胞内表达了大量的 GFP (绿荧光蛋白质），在较暗的光线下，肉眼就可以看出其发绿光。每次用伽马射线处理前收集培养的 K562-mIL15-41BB伺养细胞时，把细胞沉淀到离心管底部后，细胞的绿色就更显著。在伽马射线处理后用 PBS洗涤细胞的过程中，每洗涤一次，细胞的绿色就会丢失不少。这表明，伽马射线处理已经造成了细胞膜的损伤，虽然至今还没有人对这个现象做过系统的分析，但很明显的是其包浆内的细胞成分已经有很大的丢失。因此，发现了伺养细胞中真正有效的成分是细胞膜，除去细胞内其它成分应该不但不影响其功能，反而会使用其扩增活化的淋巴细胞在临床应用上更安全。也就是说，除去伺养细胞或 APC内部的所有成分，仅仅保留完整的空细胞膜（即细胞空壳， Ghost Cell) ，也同样具有伺养细胞或 APC的功能。

因而，在本发明的一个方面，本发明提供了一种制备细胞空壳的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将细胞进行洗涤处理，以便获得经过洗涤的细胞；将所述经过洗涤的细胞进行裂解处理，以便获得细胞空壳，其中，所述细胞的表面具有能够促进淋巴细胞增殖分化的细胞因子。发明人发现，利用本发明的该方法能够快速有效地制备获得所述细胞空壳，且该方法操作简单、容易控制，易于实现大规模生产。

需要说明的是，所述细胞的表面具有能够促进淋巴细胞增殖的细胞因子，可以是所述细胞本身能够在其表面表达所述细胞因子，也可以是通过基因工程方法（例如瞬时转染或稳定表达）将所述细胞因子表达在所述细胞表面，还可以是在细胞表面吸附或交联所述细胞因子。另外，所述细胞可以为原代细胞（例如外周血单核细胞），也可以为传代细胞（例如 K562细胞）。

根据本发明的实施例，所述洗涤处理进一步包括：将所述细胞悬浮于等渗溶液中，以便获得细胞悬液；将所述细胞悬液进行离心处理，以便获得所述经过洗涤的细胞。

根据本发明的实施例，在将所述细胞悬浮于等渗溶液中之前，将所述等渗溶液预冷至 4 摄氏度。

根据本发明的实施例，所述等渗溶液为 pH为 7.4的等渗磷酸盐缓冲液（PBS)。

根据本发明的实施例，所述裂解处理进一步包括：按照预定体积比例将所述经过洗涤的细胞悬浮于低渗溶液中，将所得到的细胞悬液静置 2小时，以便获得细胞裂解液；将所述细胞裂解液进行离心处理，以便获得所述细胞空壳。

根据本发明的实施例，所述预定体积比例为 1 : 40。由此，有利于提高细胞裂解的效率。根据本发明的实施例，在将所述经过洗涤的细胞悬浮于低渗溶液中之前，预先将所述低渗溶液预冷至 4摄氏度。

根据本发明的实施例，所述低渗溶液为低渗 Tris盐酸缓冲液。由此，有利于提高细胞裂解的效率。

根据本发明的实施例，能够促进淋巴细胞增殖的细胞因子为选自 IL-4、 IL-7、 IL-15、

IL-2K CD19、 CD64、 CD86和 4-1BBL的至少一种。

在本发明的一个实施例中，通过以下步骤制备细胞空壳：一）细胞空壳制备试剂： 1 ) 等渗 PBS: 0.15 mol/L氯化钠， pH7.4; 2)低渗 Tris盐酸缓冲液： 10 mmol/L， pH7.4。二）操作步骤： 1 ) 细胞的收集及洗涤：将细胞悬浮于约 3倍量预泠的 pH7.4等渗 PBS, 4摄氏度 600 x g (1500转）离心 10分钟，除去上清，重复洗涤 1-3次。 2)裂解和细胞膜的洗涤：向洗净的细胞，约按 1 : 40的比例加入预泠的 10 mmol/L低渗 Tris盐酸缓冲液，边加边缓慢搅拌，置 4摄氏度冰箱中约 2小时，使之完全裂解；然后于 4摄氏度 12000 x g (9000转) 离心 10分钟，使细胞膜沉淀。重复洗涤、离心 3-5次，最后获得细胞空壳。 3 )约按 2 X 10⁷/ml 细胞空壳的浓度分装， -80摄氏度冰箱冷藏；或冰冻干燥， 4摄氏度冰箱冷冻保存备用。

在本发明的另一方面，本发明提供了一种细胞空壳。根据本发明的实施例，所述细胞空壳是通过前面所述的方法制备的。发明人惊奇地发现，本发明的完整的空细胞膜（即细胞空壳）能够发挥伺养细胞及 APC的功能。与游离的细胞因子相比，表达某种特定细胞因子的完整的空细胞膜的伺养或抗原呈递功能更强。完整的空细胞膜具有和现有的伺养细胞及 APC同等的伺养及抗原呈递功能；而且，由于去除了细胞内的核酸及其它可能的有毒有害的成分，故其同时具有和游离的细胞因子等同的安全性，也能够像普通的多肽或蛋白质那样被做成不同的剂型而有利于制备、储存、运输、及使用。

在本发明的再一方面，本发明提供了一种培养淋巴细胞的方法，其特征在于，包括：将所述淋巴细胞与培养液混合，以便得到淋巴细胞悬浮液；将所述淋巴细胞悬浮液加入到培养容器中，并向所述培养容器中加入前面所述的细胞空壳；以及将所述培养容器在饱和湿度、温度为 37摄氏度以及二氧化碳浓度为 5.0体积％的培养箱中进行培养。由此，能够实现淋巴细胞大规模体外扩增，可以在短时间内获得大量淋巴细胞，且扩增获得的淋巴细胞仍具有较强的免疫功能。另外，向培养容器中加入的细胞空壳，能够发挥良好的伺养及抗原呈递功能，且由于去除了细胞内的核酸及其他可能的有毒有害成分，其同时具有和游离细胞因子等同的安全性。

根据本发明的实施例，所述淋巴细胞包括 NK细胞、 CTL细胞、和 Treg细胞。

需要说明的是，用于 NK细胞培养的细胞空壳应带有但不限于 IL-15、 IL-2K CD19、 CD64、 CD86和 4-1BBL等细胞因子中的任何一个或其有机组合；用于 CTL细胞培养的细胞空壳应带有但不限于 IL-4、 IL-7、 4-1BBL等细胞因子中的任何一个或其有机组合、以及赋予 CTL特异性的抗原（包括蛋白质、多肽、多糖等）；用于 Treg细胞培养的细胞空壳应带有但不限于 CD64、 CD86、 4-1BBL等细胞因子中的任何一个或其有机组合。

根据本发明的实施例，所述悬浮液中含有 40毫升液体培养基以及 5 X 10⁶个淋巴细胞，所述细胞空壳与所述淋巴细胞的比例为 1 : 1。由此，有利于淋巴细胞的增殖与生长。

本发明通过提出了一个简单有效的用带有活性因子的空壳细胞（即本发明的细胞空壳) 发挥伺养细胞或 APC功能的方法，解决了通过用伺养细胞作为淋巴细胞培养增效剂方法获得的淋巴细胞进入临床应用的多个障碍；同时，发明人发现，利用本发明的制备细胞空壳的方法能够快速有效地制备获得所述细胞空壳，且该方法操作简单、容易控制，易于实现大规模生产；从而获得了更安全、更有效、更低成本的生物临床试剂；克服了以往用伽玛照射、 UV照射、电转、及有丝分裂抑制剂等处理制备伺养细胞或 APC的诸多不足之处。以往的伺养细胞或 APC处理方法大都是在围绕着实际上并不需要的成分动脑筋。而且，不管是物理的还是化学的处理方法，都是造成核酸的交联破坏或细胞膜的损伤；虽然其不能再在细胞增殖中起作用，但核酸还在细胞内，作为遗传物质，即使是其碎片，也可能有被整合到其它细胞基因中的可能性。

在本发明的又一方面，本发明还提供了一种扩增活化淋巴细胞的方法，其特征在于，包括： 1 )从人外周血中分离单核细胞； 2)将步骤 1 ) 中所分离的单核细胞与 40ml淋巴细胞完全培养液混合，以便获得淋巴细胞悬浮液，其中，所述淋巴细胞完全培养液为含有 200 IU/ml IL-2、 1-10体积％自体血浆和 80U/ml庆大霉素的 RPMI1640完全培养液，所述 40 ml 淋巴细胞悬浮液中含有 5 X 10⁶个所述单核细胞； 3 )将步骤 2) 中所得到的所述淋巴细胞悬浮液加入到 T175培养瓶中，并向所述 T175培养瓶中加入 5 X 10⁶个前面所述的细胞空壳，并置于培养箱中，在饱和湿度、 37°C以及 5.0体积％C0₂的条件下进行培养； 4) 在所述培养的第四天，补加 40ml淋巴细胞完全培养液； 5 ) 在所述培养的第七天，将所述 T175培养瓶中的细胞转移到培养袋中，补加所述淋巴细胞完全培养液至 400ml，并添加 8 X 10⁷个前面所述的细胞空壳； 6)在所述培养的第十天，将培养物传代至两个培养袋中，其中，每个培养袋中含有 640ml所述淋巴细胞完全培养液；以及 7) 在所述培养的第十二天，收集培养产物，以便获得淋巴细胞，其中，所述淋巴细胞包括 NK细胞、 CTL细胞和 Treg细胞。发明人惊喜地发现，利用本发明的该方法，能够快速有效地扩增淋巴细胞。另外，培养过程中加入前面所述的细胞空壳，能够有效刺激淋巴细胞的增殖，且由于去除了细胞内的核酸和其他可能的有毒有害成分，不存在 DNA、有害成分残留等问题，扩增获得的细胞能够用于临床治疗。

本发明证实了用带有活性因子的细胞空壳上的细胞因子的活性更强。和纳米颗粒制备的制剂相比，用细胞空壳作为伺养细胞或 APC则更好。一方面是因为纳米颗粒是无机物，对培养的细胞或机体难免会有一定的不相容性；另一方面，用传代的癌细胞系制备细胞空壳时，细胞上与该癌症相关的抗原则更有利于诱导出对该种癌症更有效的杀伤性 T淋巴细胞 (CTL)。本发明以 NK细胞体外培养增效剂为例对 CTL及 Treg的制备作了说明，同时对其应用作了详细介绍。

为了更清楚地说明本发明的重大意义，本发明实施例中以用伽玛射线照射法制备伺养细胞的方法为对照。具体方法：把伺养细胞按 l X 10⁷/ml的浓度悬浮于 pH7.4等渗 PBS, 用 1万拉得的剂量照射，然后用 pH7.4等渗 PBS洗涤 3次，悬浮于细胞培养液中，调整细胞浓度为 2 X 10⁷/ml， -80摄氏度低温保存备用。

为了更清楚地说明本发明的优势，本发明实施例中同时也提供了伺养细胞及细胞空壳中 DNA及 R A的检测方法，作为实施例中的对比之用。具体是：提取总 DNA，用二苯胺反应定量；用异硫氰酸胍结合氯仿 -酚法提取总 R A，用地衣酚反应定量。在本发明中测试过的所有细胞空壳，都未测出 DNA或 R A。表明按我们的方法处理，可以完全除去细胞中的核酸；在后面的实施例中不再一一详述。

发明人发现，可用带有活性因子的细胞空壳有效地刺激淋巴细胞的体外扩增活化，获得的淋巴细胞具有良好的参与免疫反应的能力。本发明的实施例中所述的淋巴细胞来自于外周单核细胞（PBMC ) , 并以扩增活化其中的 NK细胞的方法作为实施例，本领域技术人员可以理解，使用相应细胞空壳（伺养细胞）或 APC 按类似的方法就可以扩增活化 CTL 及 Treg。具体方法步骤： 1 ) 自体血浆制备：抽取抗凝外周血 50ml， 700G, 20min室温离心；吸取血浆，置于水浴锅中 56°C， 30min; 然后 4°C静置 15min; 最后 4°C， 900G, 离心 30min, 取自体血浆 4°C保存备用。 2 ) 取血浆后的细胞层加入 D-PBS混匀，用淋巴细胞分离液 800G， 20min分离 PBMC; 3 ) 选 T175培养瓶 1个，向分离出的 PBMC加入 40ml淋巴细胞完全培养液（含有约 200 IU/ml IL-2、自体血浆 1-10体积％、庆大霉素 80U/ml的 RPMI 1640 )制成细胞悬液 (约 5 X 10⁶个淋巴细胞)，加入到 T175培养瓶；同时加入 2x l0⁷伺养细胞或空细胞膜，置于饱和湿度、 37°C、 5.0体积％ C0₂培养箱中培养； 4 ) 在所述培养的大约第四天，补加约 40 ml淋巴细胞完全培养液； 5 )在所述培养的第七天左右，将所述 T175 培养瓶中的细胞转移到培养袋中，补加所述淋巴细胞完全培养液至约 400ml，并添加约 8 X 10⁷个前面所述的细胞空壳； 6 ) 在所述培养的第十天左右，将培养物传代至两个培养袋中，其中，每个培养袋中含有约 640ml所述淋巴细胞完全培养液；以及 7 ) 在所述培养的第十二天左右，收集培养产物，以便获得 NK细胞。或者若需更大量的 NK细胞，就补加培养液到 1280毫升 /袋； 8 ) 在所述培养的第十二天左右，转到两个培养袋，加淋巴细胞完全培养液至各约 850毫升 /袋； 9 )在所述培养的第十六天左右，从两个培养袋每袋取约 500 毫升共约 1000毫升细胞悬液，收集细胞，回输给病人。同时补加新鲜淋巴细胞完全培养液约 150毫升 /袋； 10 ) 在所述培养的第十八天左右，剩下约 1000毫升细胞悬液，收集细胞，回输给病人。本领域技术人员可以理解，可以根据需要的 NK细胞的数量，将 NK细胞进行不同时间的培养。

本发明为了更好地论证用带有活性因子的细胞空壳制备的 NK细胞比用其它现有方法制备的 NK细胞具有更强的杀伤肿瘤细胞的功能，提供了细胞毒性检验方法，具体方法步骤： 1 ) 测定前一天复苏一管效应细胞，比如 NK细胞，在 RPMI 1640完全培养液（含 10%胎牛血清， 80U/ml庆大霉素的 RPMI 1640培养液）中培养； 2) 每次测定时使用一种细胞系作为靶细胞。需要 6x l0⁵个效应细胞细胞禾 B3x l0⁵个靶细胞； 3 ) 用 RPMI 1640完全培养液稀释 Calcein-AM，配制 CAM液； 4)把 10⁶靶细胞悬浮于 1 mL CAM液。 37 °C培养 1小时，适时晃动。然后用 RPMI 1640完全培养液洗涤 2次，每次 1200 rpm离心 5 min。计数，调整浓度为 l x l0⁵/ mL; 5 ) 把效应细胞稀释为 l x l0⁶/ mL，在 U形底 96孔细胞培养板上设 3孔，每孔加靶细胞 200uL，对应效靶比例（E:T) 10: 1； 6) 向最大释放孔加100uL 2% Triton X-100，其余孔加 lOOuL完全培养液。

7)把效应细胞做 5次倍比稀释，最后一个稀释度的效靶比例（E:T)为 0.3125: 1 ; 8 )每孔加 100 靶细胞， 100g离心 l min，引导细胞接触。 37 °C 5% C0₂浮箱培养 4小时； 9) 用 100 加样器轻轻吸打细胞，以悬浮释放的 calcein; 100g 离心 5min，以沉淀细胞。轻轻吸取上清液 100 μ , 转移至一个新培养板，防止产生泡沫。如果有泡沫形成，就用针刺破； 10) 用荧光读板仪（激发光 485 nm，发射光 530 nm) 读板； 11 ) 计算特异性细胞毒性百分比。 [(试验组 -自然释放组 )/ (最大释放组- 自然释放组)] X 100. 附图说明

图 1显示了根据本发明的实施例 1，用 RPMI 8866-空壳和 RPMI 8866-伽玛刺激 PBMC 中 NK细胞的体外扩增效果对比图；

图 2显示了根据本发明的实施例 1， PBMC中的 NK细胞经 RPMI8866-伽玛及 RPMI8866- 空壳刺激扩增后，对 K562靶细胞的杀伤率对比图；

图 3显示了根据本发明的实施例 2，用 HFWT-伽玛和 HFWT-空壳刺激 PBMC中 NK细胞的体外扩增效果对比图；

图 4显示了根据本发明的实施例 2， PBMC中的 NK细胞经 HFWT-伽玛和 HFWT-空壳刺激扩增后，对 K562细胞的杀伤率对比图；

图 5显示了根据本发明的实施例 3，用 EBV-CLC-伽玛和 EBV-CLC-空壳刺激 PBMC中 NK细胞的体外扩增效果图；

图 6显示了根据本发明的实施例 3， PBMC中的 NK细胞经 EBV-CLC-伽玛和 EBV-CLC- 空壳刺激扩增后，对 K562细胞的杀伤率对比图；

图 7显示了根据本发明的实施例 4，用 K15-41BBL-伽玛和 K15-41BBL-空壳刺激 PBMC 中 NK细胞的体外扩增效果图；

图 8 显示了根据本发明的一个实施例， PBMC 中的 NK细胞经 K15-41BBL-伽玛和 K15-41BBL-空壳刺激扩增后，对 K562细胞的杀伤率对比图；

图 9显示了根据本发明的实施例 5，用 K21-41BBL-伽玛和 K21-41BBL-空壳刺激 PBMC 中 NK细胞的体外扩增效果图；图 10 显示了根据本发明的实施例 5， PBMC 中的 NK细胞经 K21-41BBL-伽玛和 K21-41BBL-空壳刺激扩增后，对 K562细胞的杀伤率对比图；

图 11 显示了根据本发明的实施例 6，用 TK21-41BBL-伽玛和 TK21-41BBL-空壳刺激 PBMC中 NK细胞的体外扩增效果图；

图 12 显示了根据本发明的实施例 6， PBMC 中的 NK细胞经 TK21-41 BBL-伽玛和

TK21-41BBL-空壳刺激扩增后，对 K562细胞的杀伤率对比图；

图 13显示了根据本发明的实施例 7，用新鲜液体及冻干两种剂型的 PK21-41BBL-空壳和 K21-41BBL-空壳刺激 PBMC中 NK细胞的体外扩增效果图；

图 14显示了根据本发明的实施例 7， PBMC中的 NK细胞经新鲜液体及冻干两种剂型的 K21-41BBL-空壳和 PK21-41BBL-空壳刺激扩增后，对 K562细胞的杀伤率对比图；图 15 显示了根据本发明的实施例 8，用 PBMC-空壳 CIL21-41BBL 和 PBMC-空壳 aIL21-41BBL刺激 PBMC中 NK细胞的体外扩增效果图；

图 16显示了根据本发明的实施例 8， PBMC中的 NK细胞经 PBMC-空壳 CIL21-41BBL 和 PBMC-空壳 aIL21-41BBL刺激扩增后，对 K562细胞的杀伤率对比图。发明详细描述

本发明提供了用带有活性因子的细胞空壳作为淋巴细胞体外培养增效剂的制备及其应用方法。下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例 1

1、制备 RPMI 8866细胞空壳

按照以下步骤，采用传代细胞系 RPMI 8866制备细胞空壳，其中， RPMI 8866是人 B 淋巴母细胞系。具体如下：

将 RPMI8866细胞悬浮于 3倍量预冷至 4摄氏度、的 pH为 7.4的等渗 PBS中，于 4 摄氏度、 1500转 /分钟下离心 10分钟，除去上清，重复洗涤 1-3次，得到经过洗涤的 RPMI 8866细胞；然后将经过洗涤的 RPMI 8866细胞按体积比为 1 : 40的比例加入预冷至 4摄氏度、浓度为 10 mmol/L的低渗 Tris盐酸缓冲液中，边加边缓慢搅拌，接着，将得到的混合液于 4摄氏度的冰箱中静置 2小时，使细胞完全裂解；随后，于 4摄氏度、 9000转 /分钟下离心 10分钟，使细胞空壳沉淀，进一步重复洗涤、离心 3-5次，即得 RPMI8866细胞空壳，即 RPMI 8866-空壳。然后，按 2 X 10⁷个细胞空壳 /ml的浓度分装，于零下 80摄氏度冰箱冷藏；或经冰冻干燥后，于 4摄氏度冰箱冷冻保存。

2、制备 RPMI 8866-伽玛伺养细胞

按照以下步骤，采用伽玛射线照射法制备伺养细胞：

把 RPMI 8866细胞按 1 X 10⁷个 /ml的浓度悬浮于 pH为 7.4的等渗 PBS中，得到的细胞悬浮液经剂量为 1万拉得的伽玛射线照射后，用 pH为 7.4的等渗 PBS洗涤 3次，即得伺养细胞，即 RPMI8866-伽玛，然后以 2 X 10⁷个伺养细胞 /ml的浓度悬浮于 RPMI 1640完全培养液（胎牛血清 10%、庆大霉素 80U/ml) 中，于零下 80摄氏度冷藏保存。

3、用 RPMI 8866-空壳及 RPMI 8866-伽玛伺养细胞扩增 PBMC中的 NK细胞利用 RPMI 8866-空壳或 RPMI 8866-伽玛刺激 PBMC中 NK细胞扩增，共对 3个正常人的外周血单核细胞进行了测试，具体如下：

1 ) 自体血浆制备：抽取抗凝外周血 50ml， 700G, 20min室温离心；吸取血浆，置于水浴锅中 56°C， 30min; 然后 4°C静置 15min; 最后 4°C， 900G, 离心 30min，取自体血浆 4°C保存备用。

2)取血浆后的细胞层加入 D-PBS混匀，用淋巴细胞分离液 800G， 20min分离 PBMC); 3 ) 选 T175培养瓶 1个，向分离出的 PBMC加入 40ml淋巴细胞完全培养液（含有约

200 IU/ml IL-2、自体血浆 1-10%、庆大霉素 80U/ml)制成细胞悬液 (约 5 X 10⁶个淋巴细胞)，加入到 T175培养瓶；同时加入 2 X 10⁷伺养细胞或空细胞膜，置于饱和湿度、37°C、5.0% C0₂ +立关翁由 +立关.

4) 在所述培养的大约第四天，补加约 40 ml淋巴细胞完全培养液；

5 ) 在所述培养的第七天左右，将所述 T175培养瓶中的细胞转移到培养袋中，补加所述淋巴细胞完全培养液至约 400ml，并添加约 8 X 10⁷个前面所得到的细胞空壳；

6)在所述培养的第十天左右，将培养物传代至两个培养袋中，其中，每个培养袋中含有约 640ml所述淋巴细胞完全培养液；以及

7)在所述培养的第十二天左右，收集培养产物，测试用不同方法对 PBMC中 NK细胞的扩增活化效果。其中，根据所需细胞的数量，可以对 PBMC中 NK细胞进行不同时间的培养，例如可连续培养 18天或 20天等。

4、用 RPMI 8866-伽玛及 RPMI 8866-空壳对 PBMC中 NK细胞的体外扩增效果比较

RPMI 8866-伽玛及 RPMI 8866-空壳对 PBMC中 NK细胞的体外扩增效果见图 1。由图 1 的结果可知，培养 10天时，两者的平均扩增率均为 40倍左右，表明本发明的细胞空壳对 NK细胞的扩增效果与伺养细胞相当。

5、用 RPMI 8866-伽玛及 RPMI 8866-空壳从 PBMC中扩增活化的 NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒功能比较。以上述体外扩增获得的 NK细胞为效应细胞，以 K562白血病细胞（K562细胞）为靶细胞，采用 Calcein-AM荧光扫描测定法测定 PBMC 中的 NK细胞经 RPMI8866-伽玛及 RPMI8866-空壳刺激扩增后，对 K562细胞的杀伤作用。具体步骤如下：

用 RPMI1640完全培养液（含 10%胎牛血清、 80U/ml庆大霉素的 RPMI 1640 ) 稀释荧光染料 Calcein-AM，配制成 CAM液，将把 1 X 10⁶个靶细胞悬浮于 1 mL上述 CAM液中，置于饱和湿度、 37摄氏度、 5体积％二氧化碳条件下培养 1小时，培养过程中适时晃动，然后用 NKEM培养液洗涤 2次，每次 1200 rpm离心 5 min。计数，调整浓度靶细胞浓度为 1 X 10⁵/mL。将效应细胞稀释至细胞浓度为 1 X 10⁶个 /mL。

在 U形底 96孔细胞培养板上设 3孔，每孔加靶细胞 200 uL，对应效靶比例（E:T) 10: 1，向其中的 1孔加 lOOuL 2% Triton X-100以完全裂解靶细胞作为最大释放阳性对照，向其余 2孔加 lOOuL RPMI 1640完全培养液，作为自然释放阴性对照。

将效应细胞做 5次倍比稀释，最后一个稀释度的效靶比例（E:T) 为 0.3125:1。

根据所测不同浓度效应细胞总样品数目，在 96孔板上设定所需的待测样品孔数，每孔力口 100 靶细胞， 100g离心 l min，引导细胞接触，然后置于饱和湿度、 37摄氏度、 5体积％〔0₂浮箱中培养 4小时，接着，用 100 加样器轻轻吸打细胞，以悬浮释放的 calcein 荧光染料，然后 100g离心 5min，以沉淀细胞，轻轻吸取上清液 100 μΐ, 转移至一个新培养板，用荧光读板仪（激发光 485 nm，发射光 530 nm) 读板。按照公式杀伤率= [(试验组- 自然释放组) /(最大释放组-自然释放组)] X 100，计算 PBMC中的 NK细胞经 RPMI 8866-伽玛及 RPMI 8866-空壳刺激扩增后对 K562细胞的杀伤率。结果将图 2。

由图 2的结果可知， PBMC中的 NK细胞经 RPMI8866-伽玛及 RPMI8866-空壳刺激扩增后，均对 K562细胞具有较强的毒性。

实施例 2

用传代细胞系 HFWT 细胞（HFWT 是 Wilms肿瘤细胞系）分别制备 HFWT-伽玛和 HFWT-空壳，并进行 NK细胞扩增和细胞毒性实验，制备方法及实验方法同实施例 1。

HFWT-伽玛伺养细胞和 HFWT-空壳对 PBMC中 NK细胞的体外扩增效果见图 3。由图

3的结果可知，培养 12天时，两者的平均扩增率均为 100倍左右，表明本发明的细胞空壳刺激 NK细胞的扩增效果与伺养细胞相当。

PBMC中的 NK细胞经 HFWT-伽玛和 HFWT-空壳刺激扩增后对 K562细胞的杀伤作用结果见图 4。由图 4的结果可知， PBMC中的 NK细胞经 HFWT-伽玛和 HFWT-空壳刺激扩增后，均对 K562细胞具有较强的毒性。

实施例 3

用 EBV-CLC细胞分别制备 EBV-CLC-伽玛伺养细胞和 EBV-CLC-空壳，并进行 NK细胞扩增和细胞毒性实验，制备方法及实验方法同实施例 1。其中， EBV-CLC是将人 B淋巴细胞经 EBV转化形成的 B淋巴母细胞系。

EBV-CLC-伽玛和 EBV-CLC-空壳对 PBMC中 NK细胞的体外扩增效果见图 5。由图 5 的结果可知，培养 12天时，两者的平均扩增率均为 150倍左右，表明本发明的细胞空壳刺激 NK细胞的扩增效果与伺养细胞相当。

PBMC中的 NK细胞经 EBV-CLC-伽玛和 EBV-CLC-空壳刺激扩增后对 K562细胞的杀伤作用结果将图 6。由图 6的结果可知， PBMC中的 NK细胞经 EBV-CLC-伽玛和 EBV-CLC- 空壳刺激扩增后，均对 K562细胞具有较强的毒性。

实施例 4

用基因重组细胞系 K15-41BBL细胞分别制备 K15-41BBL-伽玛伺养细胞和 K15-41BBL- 空壳，并进行 NK细胞扩增和细胞毒性实验，制备方法及实验方法同实施例 1，区别在于进行 NK细胞扩增时，于培养 20天时，检测 NK细胞扩增效果。其中， K15-41BBL是将人 IL-15及 4-1BBL表达在 K562细胞表面而制备的细胞系。

K15-41BBL-伽玛伺养细胞和 K15-41BBL-空壳对 PBMC中 NK细胞的体外扩增效果见图 7。由图 7的结果可知，培养 20天时，两者的平均扩增率均为 2500倍左右，无显著差别。

PBMC 中的 NK细胞经 K15-41BBL-伽玛伺养细胞和 K15-41BBL-空壳刺激扩增后对 K562细胞的杀伤作用结果将图 8。由图 8的结果可知， PBMC中的 NK细胞经 K15-41BBL- 伽玛伺养细胞和 K15-41BBL-空壳刺激扩增后，均对 K562细胞具有表较强的毒性。

实施例 5

用基因重组细胞系 K21-41BBL细胞分别制备 K21-41BBL-伽玛伺养细胞和 K21-41BBL- 空壳，并进行 NK细胞扩增和细胞毒性实验，制备方法及实验方法同实施例 1，区别在于进行 NK细胞扩增时，于培养 20天时，检测 NK细胞扩增效果。其中， K21-41BBL是将人 IL-2K IL-15、 CD86、 CD64、 CD19及 4-1BBL等分子表达在 K562细胞表面而制备的细胞系。

K21-41BBL-伽玛伺养细胞和 K21-41BBL-空壳对 PBMC中 NK细胞的体外扩增效果见图 9。由图 9的结果可知，培养 20天时，两者的平均扩增率均为 4万倍左右，无显著差别。

PBMC 中的 NK细胞经 K21-41BBL-伽玛伺养细胞和 K21-41BBL-空壳刺激扩增后对 K562细胞的杀伤作用结果将图 10。由图 10的结果可知， PBMC中的 NK细胞经 K21-41BBL- 伽玛伺养细胞和 K21-41BBL-空壳刺激扩增后，均对 K562细胞具有较强的毒性。

实施例 6

用 TK21-41BBL细胞分别制备 TK21-41BBL-伽玛伺养细胞和 TK21-41BBL-空壳，并进行 NK细胞扩增和细胞毒性实验，制备方法及实验方法同实施例 1，区别在于进行 NK细胞扩增时，于培养 20天时，检测 NK细胞扩增效果。其中， TK21-41BBL是用编码 IL-21、IL-15、 CD86、 CD64、 CD19、及 4-1BBL蛋白质的基因瞬时转染 K562白血病细胞而制备的细胞系。

TK21-41BBL-伽玛伺养细胞和 TK21-41 BBL-空壳对 PBMC中 NK细胞的体外扩增效果见图 11。由图 11的结果可知，培养 20天时，两者的平均扩增率均为 2万倍左右，无显著差别。

PBMC中的 NK细胞经 TK21-41BBL-伽玛伺养细胞和 TK21-41BBL-空壳刺激扩增后对 K562 细胞的杀伤作用结果将图 12。由图 12 的结果可知， PBMC 中的 NK 细胞经 TK21-41 BBL-伽玛和 TK21-41BBL-空壳刺激扩增后，均对 K562细胞具有较强的毒性。

实施例 7

1、制备细胞空壳

采用 K562细胞细，按照实施例 1 中制备细胞空壳的方法制备细胞空壳，获得 K562- 空壳，然后在 K562-空壳上用戊二醛法交联 IL-21、 IL-15、 CD86、 CD64、 CD19及 4-1BBL 的 PK21-41BBL, 获得 PK21-41BBL-空壳。

2、 NK细胞扩增

利用新鲜液体（直接制备获得，未经保存）及冻干（制备获得后，经冷冻干燥并置于 4摄氏度冰箱保存）两种剂型的 PK21-41BBL-空壳和实施例 6中所得 K21-41BBL-空壳，刺激 PBMC 中的 NK细胞扩增，实验方法同实施例 1，于培养的 20 天，检测两种剂型的 K21-41BBL-空壳和 PK21-41 BBL-空壳对 PBMC中的 NK细胞的体外扩增效果。结果见图 13。由图 13 的结果可知，两种剂型的 K21-41BBL-空壳及 PK21-41 BBL-空壳对 PBMC中 NK细胞的体外扩增效果无显著差别，扩增 20天时，平均扩增率均约 4万倍左右。

3、细胞毒性实验

以 K562细胞为靶细胞，分别以利用新鲜液体（直接制备获得，未经保存）及冻干（制备获得后，经冷冻干燥并置于 4 摄氏度冰箱保存）两种剂型的 K21-41BBL-空壳和 PK21-41BBL-空壳刺激 PBMC中 NK细胞扩增后获得的 NK细胞为效应细胞，进行细胞毒性实验，具体实验方法同实施例 1。结果见图 14。由图 14的结果可知， PBMC中的 NK细胞经新鲜液体及冻干两种剂型的 PK21-41BBL-空壳及 K21-41BBL-空壳刺激扩增后，对 K562细胞均具有很强的细胞毒性。

实施例 8

1、制备 PBMC 细胞空壳、交联了细胞因子的 PBMC 细胞空壳及吸附了细胞因子的

PBMC细胞空壳

采用 PBMC细胞，按照实施例 1中的方法，分别制备 PBMC-空壳，然后通过戊二醛法在 PBMC-空壳上交联 IL-21、 IL-15、 CD86、 CD64、 CD19禾卩 4-lBBL, 获得 PBMC-空壳另夕卜，将 PBMC-空壳和 IL-21、 IL-15、 CD86、 CD64、 CD19和 4-1BB等可溶性细胞因子混合在一起，使细胞因子吸附在 PBMC-空壳上，获得 PBMC-空壳 aIL21-41BBL。

2、 NK细胞扩增

以上述获得的 PBMC-空壳 cIL21-41BBL、 PBMC-空壳 aIL21-41BBL刺激异体 PBMC (即制备细胞空壳和伺养细胞所采用的 PBMC和用于扩增的 PBMC来自不同的人）中的 NK细胞扩增，实验方法同实施例 1，于培养的 20天，检测 PBMC-空壳 cIL21-41BBL、PBMC- 空壳 aIL21-41BBL对 PBMC中的 NK细胞的体外扩增效果。结果见图 15。由图 15的结果可知， PBMC-空壳 CIL21-41BBL和 PBMC-空壳 aIL21-41BBL对 PBMC中的 NK细胞的体外扩增效果无显著差异，培养 20天时，平均扩增率均约为 4万倍左右。

3、细胞毒性实验

以 K562细胞为靶细胞，分别以 PBMC中的 NK细胞经 PBMC-空壳 CIL21-41BBL和 PBMC-空壳 aIL21-41BBL刺激扩增后，获得的 NK细胞为效应细胞，进行细胞毒性实验，具体实验方法同实施例 1。实验结果见图 16。由图 16 的结果可知，经 PBMC-空壳 CIL21-41BBL和 PBMC-空壳 aIL21-41BBL刺激扩增的 NK细胞，对 K562细胞均具有很强的细胞毒性。在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、 "一些实施例"、 "示例"、 "具体示例"、或 "一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

权利要求书

1、一种制备细胞空壳的方法，其特征在于，包括：

将细胞进行洗涤处理，以便获得经过洗涤的细胞；

将所述经过洗涤的细胞进行裂解处理，以便获得细胞空壳；

其中，所述细胞的表面具有能够促进淋巴细胞增殖分化的细胞因子。
2、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述洗涤处理进一步包括：

将所述细胞悬浮于等渗溶液中，以便获得细胞悬液；

将所述细胞悬液进行离心处理，以便获得所述经过洗涤的细胞。
3、根据权利要求 2所述的方法，其特征在于，在将所述细胞悬浮于等渗溶液中之前，预先将所述等渗溶液预冷至 4摄氏度。

4、根据权利要求 3所述的方法，其特征在于，所述等渗溶液为 pH为 7.4的等渗磷酸盐缓冲液。
5、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述裂解处理进一步包括：

按照预定体积比例将所述经过洗涤的细胞悬浮于低渗溶液中，将所得到的细胞悬液静置 2小时，以便获得细胞裂解物；

将所述细胞裂解物进行离心处理，以便获得所述细胞空壳。
6、根据权利要求 5所述的方法，其特征在于，所述预定体积比例为 1 : 40。
7、根据权利要求 5所述的方法，其特征在于，在将所述经过洗涤的细胞悬浮于低渗溶液中之前，预先将所述低渗溶液预冷至 4摄氏度。
8、根据权利要求 7所述的方法，其特征在于，所述低渗溶液为低渗 Tris盐酸缓冲液。
9、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述能够促进淋巴细胞增殖活化的细胞因子为选自 IL-4、 IL-7、 IL-15、 IL-21、 CD19、 CD64、 CD86和 4-1BBL中的至少一种。
10、一种细胞空壳，其特征在于，所述细胞空壳是通过权利要求 1-9任一项所述的方法制备的。
11、一种培养淋巴细胞的方法，其特征在于，包括：

将所述淋巴细胞与液体培养基混合，以便得到淋巴细胞悬浮液；

将所述淋巴细胞悬浮液加入到培养容器中，并向所述培养容器中加入权利要求 10所述的细胞空壳；以及

将所述培养容器在饱和湿度、温度为 37摄氏度以及二氧化碳浓度为 5.0体积％的培养箱中进行培养。
12、根据权利要求 11所述的方法，其特征在于，所述淋巴细胞包括 NK细胞、 CTL细胞和 Treg细胞。 13、根据权利要求 12所述的方法，其特征在于，所述淋巴细胞悬浮液中含有 40毫升液体培养基以及 5 X 10<sup>6</sup>个所述淋巴细胞，所述细胞空壳与所述淋巴细胞的比例为 1 : 1。
14、一种扩增活化淋巴细胞的方法，

其特征在于，包括：

( 1 ) 从人外周血中分离单核细胞；

(2) 将步骤（1 ) 中所分离的单核细胞与 40ml淋巴细胞培养液混合，以便获得淋巴细胞悬浮液，其中，所述淋巴细胞培养液为含有 200 IU/ml IL-2、 1体积％自体血浆和 80U/ml 庆大霉素的 PMI1640完全培养液，所述 40 ml淋巴细胞悬浮液中含有 5 X 10⁶个所述单核细胞；

(3 ) 将步骤（2) 中所得到的所述淋巴细胞悬浮液加入到 T175 培养瓶中，并向所述

T175培养瓶中加入 5 X 10⁶个权利要求 10所述的细胞空壳，并置于培养箱中，在饱和湿度、 37°C以及 5.0体积％ C0₂的条件下进行培养；

(4) 在所述培养的第四天，补加 40ml RPMI 1640完全培养液；

(5 ) 在所述培养的第七天，将所述 T175培养瓶中的细胞转移到培养袋中，补加所述完全培养液至 400ml，并添加 8 X 10⁷个权利要求 10所述的细胞空壳；

(6)在所述培养的第十天，将培养物传代至两个培养袋中，其中，每个培养袋中含有 640ml所述完全培养液；以及

(7) 在所述培养的第十二天，收集培养产物，以便获得淋巴细胞，

其中，所述淋巴细胞包括 NK细胞、 CTL细胞和 Treg细胞。