CN102224237B - 使用β-丙内酯(BLP)进行最终灭活的细菌菌影(BG)生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细菌菌影制备物，其中使用β-丙内酯进行细菌的最终灭活。

Description

使用β-丙内酯(BLP)进行最终灭活的细菌菌影(BG)生产方法

本发明涉及细菌菌影(Bacterial Ghost)制备物，其中使用β-丙内酯进行细菌的最终灭活。 

革兰氏阴性菌的空的细菌细胞被膜(即所谓的细菌菌影(BG))是通过基因的受控异源表达制备的，所述基因将细菌(特别是革兰氏阴性菌)部分裂解(EP-A-0 291 021、EP-A-0 516 655)。例如，裂解基因可以是编码多肽的噬菌体PhiX174基因E，所述多肽被插入到革兰氏阴性菌的细胞被膜复合物中并导致形成跨过内膜和外膜的跨膜通道结构。该通道结构的内径在大约20-400nm的范围内(特别是40-200nm)或500-1,000nm，这取决于所用的裂解条件。细胞质成分通过该通道结构被释放，从而获得具有完整形状的空的细胞被膜复合物，即所谓的细菌菌影。 

虽然产生不含细胞质成分的BG的裂解方法是非常有效的，但是，有一定数量的细胞(通常在10⁴个细胞中有至少1个)仍然是完整的。细菌裂解基因(例如噬菌体PhiX174基因E)和核酸酶基因(以产生不含核酸的细菌菌影)的受调节的共表达引起杀灭过程效率的协同性升高，从而引起BG制备物中活体细菌细胞的大量减少，如WO 03/006630所揭示。 

在WO 91/13155和WO 93/01791中揭示了细菌菌影作为死疫苗或佐剂的用途以及在其细胞被膜结构中携带异源蛋白的重组细菌菌影的制备。细菌菌影还适合作为活性化合物的载体或靶向介质，如WO 00/53163所描述。 

为了使细菌菌影作为死疫苗的用途更加安全，特别是应用于人类医药，需要提供不含活体细菌细胞的BG制备物。因此，本发明要解决的技术问题是提供不含活体细菌细胞的BG制备物。 

令人惊奇地发现：当杀菌剂被用作BG生产过程的最终步骤时，几乎所有的潜在未被杀灭的细菌都被灭活，其中所述杀菌剂是β-丙内酯(BPL)。更加令人惊奇的是，在β-丙内酯处理之后，细菌菌影制备物保持完整性。 

β-丙内酯的化学式是C₃H₄O₂，其分子量为72.06g/mol。β-丙内酯是无色液体，在水中高度可溶，其降解产物是由于自身破坏而产生的无害化合物。β-丙内酯作为杀菌剂被用于疫苗、组织移植物、外科手术工具和血浆、水、牛奶和营养液的酶，并用作封闭空间内的水汽相消毒剂。其杀菌作用被用于对抗植物细菌、致病性真菌和病毒。 

因此，本发明的第一个方面涉及几乎不含活体细菌细胞的细菌菌影的制备物，包括以β-丙内酯处理所述细菌菌影。优选地，菌影制备物中任何残余活体细菌细胞的数目被降低至少10³倍、更优选降低10⁴倍、更优选降低10⁵倍，最优选降低10⁶倍或更多。 

在以上描述的方法中，优选以0.01％-1％(v/v)的终浓度，更优选以0.025-0.5％(v/v)的终浓度加入β-丙内酯。可以在一个或多个步骤中向制备物中加入β-丙内酯，例如在两个连续步骤中加入，其中两部分优选为等量的，其中在大约15-45分钟(例如大约30分钟)之后加入第二部分的β-丙内酯。优选作为液体加入β-丙内酯。作为水汽或喷雾或其它形式加入也是可以的。 

本发明的优选方面在于将细菌菌影灭活10-60分钟，更优选为15-45分钟，更优选为25-35分钟。 

此外，根据本发明，优选在15-55℃，更优选在26-50℃，更优选在35-45℃，更优选在36-44℃，最优选在38-43℃加入β-丙内酯。 

本发明的细菌菌影制备物可以通过包括以下步骤的方法制备： 

(a)提供包含编码能够在细菌细胞被膜中形成通道结构的裂解蛋白的基因的细菌细胞； 

(b)可选地在裂解基因不表达的条件下培养细菌细胞； 

(c)将细菌细胞置于裂解基因被表达且细菌细胞的细胞质成分被释放的条件；和 

(d)获得所产生的细菌菌影。 

编码裂解蛋白的基因的优选例子为噬菌体PhiX174基因E。 

特别优选地，用于以上描述的制备细菌菌影的方法的细菌细胞另外编码能够水解细菌细胞中的细胞质成分的酶，如WO 03/006630所描述。相应的制备细菌菌影的方法包括以下的额外步骤： 

(a)可选地在所述酶基因不表达的条件下培养细菌细胞； 

(b)将细菌细胞置于其中所述酶基因被表达且细菌细胞的细胞质成分被降解的条件。 

编码水解酶的基因优选为核酸酶基因，特别是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)核酸酶基因(WO 03/006630)。 

在特别优选的实施方式中，所述裂解基因和酶基因与可调控的表达控制序列可操作地连接。更优选地，裂解基因和酶基因每个均与单独的可调控的表达控制序列可操作地连接并处于一个或几个载体中。因此，可以分开启动这两种基因的表达，例如在培养程序的不同时间启动。 

优选地，在同时抑制所述裂解基因和酶基因的条件下培养细胞。然后，诱导酶的表达，例如，当酶基因处于化学可调控的启动子(例如lac启动子或其衍生物)控制下时，通过加入诱导剂(例如IPTG)诱导酶的表达。 

更优选地，酶以这样的形式表达：至少是部分无活性的，并且可以在后续阶段通过向培养物中加入辅基而被激活。 

然后，在随后的例如20分钟乃至1.5小时之后，特别优选在大约45分钟之后，诱导裂解基因的表达，例如，当裂解基因与温度调节性启动子(例如λPR或PL启动子与经修饰的操纵子序列和温度敏感型c1857抑制子的联合(WO 98/078740))可操作地连接时，通过将温度转变为例如42-44℃来诱导裂解基因的表达。然后，大约30分钟乃至2小时(例如大约90分钟)之后，通过加入其功能所需要的辅基(例如金属离子，例如Mg²⁺和/或Ca²⁺)将酶激活。当在化学物质可诱导的启动子/操纵子系统中克隆时，还可以通过化学物质(例如阿拉伯糖) 诱导裂解蛋白E的表达。 

在这种情况下，特别有利的是β-丙内酯介导的非-E裂解细菌的灭活在限制性和允许性温度均是有效的。 

在进一步优选的实施方式中，在诱导裂解之后并且在激活水解酶(如果适用)之后，并且在纯化细菌菌影制备物之前或之后加入β-丙内酯，其中优选在纯化之前加入β-丙内酯。纯化之后加入β-丙内酯需要另外的纯化步骤，例如，在使用之前进一步修饰和/或冻干细菌菌影。 

对于大规模生产菌影制备物，优选为在收集(例如从发酵罐收集)之后通过离心、正切过滤、冻干、喷雾干燥或其它方法将菌影浓缩。在浓缩之后，可以以上文指明的用量和条件加入β-丙内酯。 

本发明还涉及包含如上所述的经β-丙内酯处理的细菌菌影制备物和药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂的组合物。所述组合物适合作为疫苗或佐剂，例如免疫刺激性化合物，其可以单独使用或与(需要针对该免疫原产生免疫反应的免疫原)一起使用。组合物适合用于人类医药和兽用医药。此外，不含任何活体细菌细胞的细菌菌影可用作治疗和诊断剂的载体，所述治疗和诊断剂例如是：多肽(例如抗体、细胞因子、干扰素、趋化因子)、酶和非免疫原性或免疫原性多肽或肽、核酸和低分子量的活性物质(例如，肽、激素、抗生素、抗肿瘤试剂、类固醇、免疫调节剂)，如WO 2005/011713所揭示的，其中可以将细菌菌影封闭，例如在WO 01/54672或WO 2005/011713中所描述。 

此外，本发明涉及β-丙内酯在制备细菌菌影制备物中的用途，其中细菌菌影制备物特别是药物制备物。 

应该注意：上文中本说明书引用的所有专利和非专利文献均通过引用并入本文。 

附图说明

图1具有自质粒pGLNlc表达E-SNUC的福氏志贺菌(Shigellaflexneri)2a BG的BG生产过程的流程图。 

图2质粒pGLysivb的构建。 

图3福氏志贺菌2a(pGLNlc)的代表性发酵图像，以显示BG生产过程中的时间点A-M。 

图4经过BPL处理(42℃，BPL终浓度为0.05％)和未经BPL处理的大肠杆菌NM522(pBBR1MCS5，无E裂解)和大肠杆菌BG NM522(pGlysivb，E-裂解质粒)的比较。 

图4A未处理的相对于经BPL处理的大肠杆菌NM522(骨架质粒pBBR1MCS5，无E裂解)。 

图4B未处理的相对于经BPL处理的大肠杆菌BGNM522(pGlysivb，E-裂解质粒)。 

图5温度研究，以确定在不同的温度下BPL活性的效应。 

图6在20升发酵罐规模生产并在42℃以终浓度为0.05％的BPL处理30分钟的大肠杆菌NM522BG和大肠杆菌NM522的比较。 

图6a经BPL处理的大肠杆菌BGNM522(pGlysivb，E-裂解质粒)。 

图6b经BPL处理的大肠杆菌NM522(骨架质粒pBBR1MCS5，无E裂解)。 

图7在42℃以终浓度为0.025％的BPL处理30分钟将在20升发酵罐规模中通过E-裂解和核酸酶组合(E-SNUC)生产的大肠杆菌NM522BG灭活。 

图8通过使用0.05％的BPL进行30分钟的最终灭活而生产的福氏志贺菌2a BG(E-SNUC)的一致性研究。 

图9福氏志贺菌2a的BG生产过程中样品的实时PCR数据的一致性：福氏志贺菌2a(pGLNlc)的5个发酵的平均值+/-从相应的5个发酵进行的5个实时PCR的SD。d.1.＝检测极限＝0.02ng DNA/ml。 

图10使用经0.05％BPL灭活的福氏志贺菌2a(骨架质粒pBBR1MCS5)进行的发酵(作为对照)。 

图10A ATCC 700930(pBBR1MCS5)运行1。 

图10B ATCC 700930(pBBR1MCS5)运行2。 

实施例 

1.细菌菌影(BG)的制备：使用E-裂解和核酸酶组合处理，然后以β-丙内酯(BPL)处理作为最终灭活步骤(显示于图1) 

以质粒pGlysivb(编码裂解基因E，其构建如图2所描述)或pGLNlc(同时编码裂解基因E和金黄色葡萄球菌核酸酶基因SNUC；WO03/006630)转化革兰氏阴性菌(例如大肠杆菌，或本研究中的福氏志贺菌2a)。质粒pGlysivb和pGLNlc在突变的热敏感性λ启动子(λPRmut)的控制下通过从35℃温度上调至42-44℃而严格调控裂解基因E的表达；SNUC的表达依赖于通过加入IPTG对上游lac启动子的诱导。作为蛋白E表达的结果，在细菌的内膜和外膜之间形成了E特异性的通道结构，从而导致细胞质成分(包括染色体和质粒DNA)在所述条件下被排出至培养基中，在E裂解过程中，所有的细菌中至少有99.9％被转化为BG。为了确保BG不含核酸，激活了第二个系统，在pGLNlc的情况下，利用SNUC的DNA和RNA降解能力。在细菌的指数生长期内，核酸酶在诱导基因E表达之前-30分钟进行表达，在E裂解完成之后，通过加入氯化镁和氯化钙被激活。为了将所有潜在的未杀灭的细菌完全灭活，作为BP生产过程的最后一步，分两次向发酵液中加入BPL。在42℃-44℃以BPL孵育30分钟之后，通过离心或切向过滤收集BG，在无菌水中彻底洗涤并冻干。 

在生产过程中，在固定的时间点(在图3中标记为A-M)取出培养液的样品以确定光密度、集落形成单位(CFU)，通过显微镜检测BG表观以及用于通过实时PCR分析DNA含量。发酵参数(如pH、气流、pO₂、搅拌和温度)由发酵程序自动记录。在一致性研究的整个过程中将所有的参数保持在窄范围(Narrow window)。 

为了探究在收集BG之前通过加入BPL进行最终的细菌灭活对于生产过程是否是关键性的，在加入BPL之前，在时间点K，从发酵液中取出3升培养物。通过分两次加入0.025％的BPL(时间点K和L)，以终浓度为0.05％的BPL处理容器中的培养液。推荐分两次加入BPL是为了避免可能引起的污染(例如，在容器盖下面形成液滴)以及为 了实现良好的灭活性能。为了进一步分析细菌的存活，在时间点M通过离心(8,000rpm，15分钟)收集3升BG+BPL处理过的材料(共6瓶，每瓶含有400ml BG悬浮液)。 

离心后，弃上清，以无菌水彻底洗涤BG沉淀物。在第一个洗涤步骤中，将每个BG沉淀物重悬于400ml的无菌去离子水，离心之后将沉淀物储存于-20℃过夜。后续的洗涤步骤是为了将材料缩减至40ml的最终体积(在4×400ml无菌去离子水中进行洗涤步骤2，在2×400ml无菌去离子水中进行洗涤步骤3，在1×400ml无菌去离子水中进行洗涤步骤4)。或者，也可以在程序的这个阶段进行BPL处理。 

加入40ml无菌去离子水将最终的沉淀物重悬并分装在2个冷冻干燥瓶中，将剩余的样品(～5ml)转移至第3个冷冻干燥瓶。冷冻干燥之后，检测材料的无菌性。每个无菌测试进行一式三份。将大约10mg BG制备物装入标记的无菌eppendorf管。向每个管中加入1.5mlLBv-培养基并将冻干的材料重悬。将1ml悬浮液倒入空的皮氏培养皿并加入20ml LBv琼脂(恰当地冷却至手温)。当琼脂变成固体之后，将平板在28℃孵育24小时。将100μl BG悬浮液用于在LBv琼脂平板上铺板并在28℃孵育24小时。将200μl菌影悬浮液在LBv琼脂平板上铺板并在28℃孵育24小时。将100μl菌影悬浮液用于接种5ml LBv并在28℃孵育24小时。在后一培养基的富集孵育之后，将100μl和200μl在LBv琼脂上铺板并在28℃孵育24小时。将剩余的BG悬浮液储存于4℃。使用WASP系统(Don Whitley Scientific，Ltd.设备)进行所有的无菌测试平板的铺板和计数。 

对于实时PCR，在发酵过程中的时间点B-M取出培养液的样品。使用Biorad IQ Icycler，根据标准化条件进行所有的实时PCR运行，扩增裂解/SNUC质粒pGLNlc的庆大霉素抗性盒的片断。在每次实时PCR运行中进行单独的标准曲线以将pGLNlc定量，显示出至少为0.998的相关系数。 

2.经过BPL处理(42℃，BPL终浓度为0.05％)和未经BPL处理的大肠杆菌NM522(pBBR1MCS5，无E裂解)和大肠杆菌BG NM522 (pGlysivb，E-裂解质粒)的比较 

结果： 

在42℃经0.05％的BPL处理的大肠杆菌NM522(pBBR1MCS5)的数据显示(图4A)：在小规模实验中获得了～5log的存活率下降；而在42℃经过0.05％的BPL处理的大肠杆菌BG NM522(pGlysivb)(图4B)没有存活的细菌。在42℃的温度以浓度为0.05％的BPL反应30分钟足以将E裂解的细菌安全灭活；没有检测到活体细胞计数。以相同数量的BPL在相同的参数下处理大肠杆菌细菌不会导致完全灭活。 

3.温度研究，以确定在不同的温度下BPL活性的效应 

BPL的灭菌活性及其在水中的自我破坏是温度依赖性的。为了证明在生产BG的条件下细菌灭活的温度模式，以大约1×10³/ml的起始CFU使用0.05％的BPL在4个不同的温度(16℃、28℃、36℃和42℃)进行了研究，以比较大肠杆菌NM522pGlysivb的灭活速率。 

结果： 

可以证明：相比于较低温度(在36℃为30分钟)，在42℃进行的BG生产具有较快的BPL灭活速率(15分钟)；在30分钟内，在28℃CFU降低大约1.5log，在16℃仅有轻微的降低(小于0.5log)。确定了温度依赖性的反应速率(图5) 

4.在20升的发酵罐规模生产并在42℃经过终浓度为0.05％的BPL处理30分钟而生产的大肠杆菌NM522BG和大肠杆菌NM522的比较 

为了确定在与用于由大肠杆菌BG NM522(pGlysivb)生产的BG的完全灭活(图6A)所用的条件相同的发酵条件下BPL对大肠杆菌NM522(pBBR1MCS5)的灭活效应，使用经骨架质粒pBBR1MCS5(无裂解，无核酸酶)转化的大肠杆菌NM522进行了对照发酵(图6B)。按照如BG生产所描述的时间点和发酵条件(实施例1，图3)测定BPL的杀灭速率以及细菌样品的DNA浓度。 

结果： 

经过0.05％的BPL在42℃处理的大肠杆菌NM522(骨架质粒pBBR1MCS5)的发酵数据(图6B)显示：获得了～3log的存活率的下降；而由经过0.05％的BPL在42℃处理的NM522(pGlysivb)生产的大肠杆菌BG(图6A)则完全灭活，在BG生产过程结束时没有可以检测到的活体CFU。(图6A)对于20升规模的发酵罐中的大肠杆菌NM522BG(pGlysivb)，可以通过在42℃以0.05％的BPL处理30分钟达到BG生产过程的最终的且安全的灭活步骤。(图6B)对于20升规模的发酵罐中的大肠杆菌NM522(骨架质粒pBBR1MCS5)，通过在42℃以0.05％的BPL处理30分钟无法达到大肠杆菌的最终灭活。细菌存活率的下降为～3log。 

5.在42℃以终浓度为0.025％的BPL处理30分钟将20升发酵罐规模中通过E裂解和核酸酶的组合(E-SNUC)生产的大肠杆菌NM522BG灭活 

结果： 

在不含DNA的BG(E-SNUC BG)大肠杆菌NM522(编码裂解基因E的pGlysivb，编码金黄色葡萄球菌核酸酶基因SNUC的pSNUCIQ3)的生产过程中，用于通过BPL实现完全灭活的浓度被确定为0.025％以下(图7)。对于20升规模的发酵罐中的不含DNA的大肠杆菌NM522BG(pGlysivb，pSNUCIQ3)的生产过程，可以通过在42℃以0.025％的BPL处理30分钟达到最终的且安全的灭活(图7)。 

6.通过使用0.05％的BPL进行30分钟的最终灭活而生产的福氏志贺菌2a BG(E-SNUC)的一致性研究 

一致性研究总结了来自5个发酵运行的数据，发酵均在如图3所示的BG生产过程的简要描述中所叙述的参数下进行(见实施例)。为了显示发酵的一致性，图8显示了在指示取样点的平均CFU值+/-SD(C＝诱导裂解，E＝SNUC的激活，K＝第1次加入BPL，L＝第2次加入BPL，M＝收集)。如上针对生产过程所述(实施例1，图3)，在发酵过程的时间点B-M取出样品来进行实时PCR检测，以确定BG样品中残余的DNA。为了显示实时PCR数据的一致性，图9显示了在指示 取样点收集的培养物的DNA平均纳克数/ml+/-SD(C＝诱导裂解，E ＝SNUC的激活，K＝第1次加入BPL，M＝收集)。 

结果： 

福氏志贺菌2a BG生产过程的一致性研究显示：对于整个生产工艺中所测的所有时间点，一致性具有良好相关性(图9)。按照BG生产的简要描述中的叙述进行了无菌测试(实施例1，图3)。在两个时间点收集用于无菌测试的材料：一个为时间点K，在加入BPL之前；一个为时间点M，在BG生产工艺结束时。发现测试的所有BG样品都是无菌的。进行了实时PCR，显示生产工艺中DNA含量的减少。样品显示出良好的一致性，在时间点M获取的样品的最终材料达到了DNA的检测极限(＝0.02ng DNA/ml培养物)。 

7.使用经0.05％BPL灭活的福氏志贺菌2a(pBBR1MCS5)进行的发酵，作为对照。 

为了确定在与BG生产相同的发酵条件下BPL对福氏志贺菌2a细菌的灭活效应，使用经过骨架质粒pBBR1MCS5(无裂解，无核酸酶)转化的福氏志贺菌2a进行了两个对照发酵。按照如BG生产所描述的时间点和发酵条件(实施例1，图3)测定BPL的杀灭速率以及细菌样品的DNA浓度。 

结果： 

对于福氏志贺菌2a(骨架质粒pBBR1MCS5)的两个发酵，以0.05％的BPL灭活均引起了活体细胞计数(CFU)下降4log(图10A、B)，这表明与E-裂解或E-SNUC裂解组合不同，终浓度为0.05％的BPL单独不足以在30分钟内杀灭所有细菌。 

对照发酵的实时数据显示没有DNA的下降。 

Claims (26)

1.一种生产细菌菌影制备物的方法，包括以下步骤：

（a）生产细菌菌影制备物；和

（b）然后在其中所述菌影制备物中任意残余的活体细菌细胞的数目被降低的条件下以β-丙内酯处理所述细菌菌影制备物，其中以终浓度为0.01-1％（v/v）的β-丙内酯处理细菌菌影，并且其中在26-50℃加入β-丙内酯。

2.权利要求1的方法，其中所述菌影制备物中的任意残余的活体细菌细胞的数目降低至少10³倍。

3.权利要求1或2的方法，其中所述菌影制备物中的任意残余的活体细菌细胞的数目降低至少10⁴倍。

4.权利要求1或2的方法，其中所述菌影制备物中的任意残余的活体细菌细胞的数目降低至少10⁵倍。

5.权利要求1或2的方法，其中所述菌影制备物中的任意残余的活体细菌细胞的数目降低至少10⁶倍。

6.权利要求1或2的方法，其中以终浓度为0.025-0.5%（v/v）的β-丙内酯处理细菌菌影。

7.权利要求1或2的方法，其中在两个连续步骤中加入β-丙内酯。

8.权利要求1或2的方法，其中在35-45℃加入β-丙内酯。

9.权利要求1或2的方法，其中在38-43℃加入β-丙内酯。

10.权利要求1或2的方法，其中采用β-丙内酯将细菌菌影灭活10-60分钟。

11.权利要求1或2的方法，其中采用β-丙内酯将细菌菌影灭活15-45分钟。

12.权利要求1或2的方法，其中采用β-丙内酯将细菌菌影灭活25-35分钟。

13.权利要求1或2的方法，其中通过以下步骤获得所述细菌菌影制备物：

（a）提供包含编码能够在细菌细胞被膜复合物中形成通道结构的裂解蛋白的基因的细菌细胞；

（b）可选地在其中编码所述裂解蛋白的基因不表达的条件下培养细菌细胞；

（c）将细菌细胞置于其中编码所述裂解蛋白的基因被表达且细菌细胞的细胞质成分被释放的条件；和

（d）获得所产生的细菌菌影。

14.权利要求13的方法，其中编码所述裂解蛋白的基因是噬菌体phiX174基因E。

15.权利要求13的方法，其中所述细菌细胞另外表达编码能够水解细菌细胞中的细胞质成分的酶的基因，所述方法包括以下步骤：

(a)可选地在其中编码所述酶的基因不表达的条件下培养细菌细胞；

(b)将细菌细胞置于编码该酶的基因被表达且细菌细胞的细胞质成分被降解的条件。

16.权利要求15的方法，其中编码所述酶的基因是核酸酶基因。

17.权利要求15的方法，其中编码所述酶的基因是金黄色葡萄球菌核酸酶基因。

18.权利要求15的方法，其中编码所述裂解蛋白的基因和编码所述酶的基因与可调控的表达控制序列可操作地连接。

19.权利要求18的方法，其中编码所述裂解蛋白的基因和编码所述酶的基因每个均与单独的可调控的表达控制序列可操作地连接并处于一个或几个载体中。

20.权利要求19的方法，其中在不同时间诱导所述裂解蛋白的表达和所述酶的表达。

21.一种药物组合物，其包含经β-丙内酯处理的细菌菌影制备物和药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。

22.权利要求21的组合物，其为疫苗。

23.权利要求21的组合物，其为佐剂。

24.权利要求21－23任一项的组合物，用于人类医药。

25.权利要求21－23任一项的组合物，用于兽用医药。

26.经β-丙内酯处理的细菌菌影制备物在制备药物制备物中的用途。

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