CN103436550B - 一种菌影载体的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种菌影载体，所述菌影载体包含锚定基因E’、巴氏杆菌OmpH基因、裂解盒（pBV220-E从阻遏蛋白到终止子的全部序列）和质粒载体pET28a。所述菌影载体中的裂解盒（ci857-E-T1T2）独立存在于pET28a的非多克隆位点区，与pET28a原有的表达系统形成两个独立的表达系统，且方向相反，便于在pET28a的多克隆位点区插入目的蛋白基因，蛋白表达时不会影响目的蛋白的构象，且不易发生通译现象。

Description

一种菌影载体的构建方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种菌影载体的构建方法。
背景技术
菌影是由于噬菌体裂解基因E在革兰氏阴性菌中表达的裂解蛋白使菌体的内外膜出现40nm-200nm的小孔，因渗透压的作用使菌体的内容物溢出而成的细菌空壳。菌影疫苗在制作过程中，受物理和化学因素的破坏因素小，基本保持了免疫原的天然结构，能够作为良好的免疫原对动物起到免疫保护作用。在国外菌影疫苗作为多联苗、多价苗即将进入市场，但在国内，对于菌蜕的研究尤其是作为运输载体的研究还刚刚起步，其中还有很多问题需要我们去研究和探讨。
菌影作为免疫原直接作用机体，也可作为载体向机体递送蛋白质、核酸以及其他药物，均获得了一定的进展。菌影作为载体递送蛋白质，主要用两种途径实现：（一）将纯化好的蛋白直接浸泡装载到菌影中，添加钙黄绿素可以使膜囊与菌影内膜相融合将菌影缝合起来；（二）利用锚定蛋白将目的蛋白固定靶向细菌内膜上。在现有的重组菌影疫苗中，用于传输外源亚单位蛋白的膜锚定序列主要有：外膜锚定蛋白OmpA（在细胞膜外表达）、胞浆周隙锚定蛋白SbsA（在细胞周质中表达）、内膜锚定蛋白E’（噬菌体PhiX174裂解蛋白E上的第1-54位氨基酸）和L’（在细胞内膜中表达）。
目前研究者利用锚定蛋白将目的蛋白固定靶向细菌内膜上制备菌影的方法均是将裂解基因E、锚定序列以及目的蛋白串联表达，这对目的蛋白的大小以及空间结构均有要求，且目的蛋白与锚定序列串联后的空间结构可能会干扰裂解基因E的表达。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种构建菌影载体的新方法。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种菌影载体，所述菌影载体包含锚定基因E’、巴氏杆菌OmpH基因、pBV220-E载体的表达原件ci857-E-T1T2和质粒载体pET28a。
进一步地，所述菌影载体为双向表达载体，且两表达系统的方向相反。一种表达系统为pET28a原有的表达系统，可用IPTG诱导表达，用来表达锚定基因与巴氏杆菌OmpH串联基因；另一种表达系统ci857-E-T1T2方向与之相反，通过升温诱导表达裂解基因E，用于制造菌影，两个表达系统独立存在，互不干扰。
其中，所述巴氏杆菌OmpH基因来自牛巴氏杆菌标准株CVCC393。
其中，所述pBV220-E载体的表达原件ci857-E-T1T2为pBV220-E载体基因序列中从阻遏蛋白到终止子的全部基因序列，此序列构成了裂解盒。
本发明还提供了前述菌影载体的构建方法，包括如下步骤：
1）以噬菌体PhiX174RF1质粒为模板，PCR扩增裂解基因E，将裂解基因E与T载体连接，筛选阳性质粒；
2）将步骤1）得到的阳性质粒，亚克隆到质粒pBV220中，得到重组质粒pBV220-E；
3）以步骤2）得到的重组质粒pBV220-E的DNA为模板，PCR扩增E’基因；
4）以巴氏杆菌基因组为模板，PCR扩增OmpH基因，用柔性肽Gly4Ser经overlap PCR将步骤3）得到的E’基因与OmpH基因连接在一起，形成融合片段E’-OmpH；
5）将融合片段E’-OmpH其插入到质粒载体pET28a多克隆位点区的EcoRI、Sal I位点上，经克隆转化入大肠杆菌BL21（DE3）或Rossta（DE3）感受态细胞中，酶切鉴定阳性克隆，得到重组表达载体E’-OmpH-pET28a；
6）将步骤2）得到的重组质粒pBV220-E的ci857-E-T1T2基因序列（从阻遏蛋白到终止子的全部基因序列）亚克隆到重组表达载体E’-OmpH-pET28a的SgrAI和SphI酶切位点上，构建双向表达载体E’-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2。
构建得到的双向表达载体，通过热激，转入大肠杆菌BL21(DE3)或Rossta（DE3）感受态细胞中，酶切鉴定证明双向表达载体E'-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2构建成功。经IPTG、42℃迅速升温诱导表达后，SDS-PAGE、westernblot、菌影28℃培养等鉴定，证明成功制备了锚定牛巴氏杆菌OmpH的大肠杆菌菌影。
本发明还提供了前述菌影载体在大肠杆菌菌影中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明所述菌影载体E’-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2，能够使目的蛋白与菌影独立表达。所述菌影载体中的裂解盒（pBV220-E从阻遏蛋白到终止子的全部序列）独立存在于pET28a的非多克隆位点区，与pET28a原有的表达系统形成2个独立的表达系统，且方向相反，便于在pET28a的多克隆位点区插入目的蛋白基因，避免了目的蛋白基因对裂解基因E的干扰，蛋白表达时不会影响目的蛋白的构象，且不易发生通译现象。
附图说明
图1为菌影载体E’-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2的构建流程图；
图2为pBV220-E/DH5α菌影电镜投射图；
图3为DH5α正常大肠杆菌电镜投射图；
图4为重组融合蛋白表达的SDS-PAGE结果；
其中：
M为蛋白质Marker；
1为诱导前的重组表达载体E’-Omph-pET28a-ci857-E-T1T2/Bl21(DE3)；
2为重组表达载体E’-Omph-pET28a-ci857-E-T1T2/Bl21(DE3)先28℃IPTG诱导12h后42℃诱导2h；
3为37℃IPTG诱导5h的E’-Omph-pET28a-ci857-E-T1T2/Bl21(DE3)重组菌；
4为28℃IPTG诱导12h的E’-Omph-pET28a-ci857-E-T1T2/Bl21(DE3)重组菌；
5为28℃IPTG诱导5h的E’-Omph-pET28a-ci857-E-T1T2/Bl21(DE3)重组菌。
6为37℃IPTG诱导5h E’-Omph-pET28a-ci857-E-T1T2/Rossta(DE3)重组菌；
7为28℃IPTG诱导12h E’-Omph-pET28a-ci857-E-T1T2/Rossta(DE3)重组菌；
8为28℃IPTG诱导5h的E’-Omph-pET28a-ci857-E-T1T2/Rossta(DE3)重组菌；
图5为重组蛋白E’-OmpH的Western blot分析；
其中：
M为蛋白预染marker；
1为阴性对照；
2为重组蛋白E’-OmpH；
图6（a）为E’-OmPH-PET28a-ci857-E-T1T2/BL21IPTG诱导后四小时切片图；
图6（b）为E’-OmPH-PET28a-ci857-E-T1T2/BL21IPTG诱导四小时后升温诱导2h制成的菌影切片图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实验材料：pBV220（含有λpL/pR启动子、阻遏蛋白cI857）本实验室保存。噬菌体PhiX174质粒RF1和pMD18-T：购自大连TAKALA生物公司。E.coli宿主菌BL21（DE3）、宿主菌Rossta(DE3)、原核表达载体pET28a均为本实验室保存。巴氏杆菌CVCC393购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，限制性内切酶购自美国fermentas公司。
实施例1以pBV220为载体制备大肠杆菌菌影
1、E基因的设计与合成
应用Oligo6.0及primer5.0软件，根据GenBank中登录的噬菌体PhiX174裂解基因E的编码序列（NC-001422)设计引物。在上游引物5′末端引入限制性酶切位点EcoRI，下游5′末端引入限制性酶切位点Sal I限制性酶切位点，两端分别随意加入几个保护性碱基。引物由上海生工合成部门进行合成。
E上游引物E1：5'-CGCGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTG-3’，下划线内序列为限制性酶切位点EcoRI酶切位点。
E下游引物E2：5′-ACGCGTCGACTCACTCCTTCCGCACGTAAT-3’，下划线内序列为限制性酶切位点Sal I酶切位点。
2、E基因的PCR扩增
将TAKARA公司编号为D3040噬菌体PhiX174RF15000r/min离心5min；加入500μLddH2O悬浮沉淀；取5μL作为PCR扩增模板。
PCR反应体系见表1：
表150μL PCR反应体系
反应条件如下：95℃扩增预变性5min，94℃变性50s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃终延伸5min，4℃保存1h。
3、目的基因的克隆与鉴定
用胶回收试剂盒回收目的片段E与pMD18-T连接，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞（200μL菌液），挑取大小匀称的露珠状菌落接种于含100ug/ml Amp+的LB培养基中培养，提取质粒，分别用PCR鉴定和限制性内切酶EcoRI、Sal I进行双酶切鉴定。
4、目的基因的测序
阳性重组质粒送华大基因测序，结果与目的基因对比。
5、pBV220-E的表达裂解
1）pBV220-E的诱导表达
将鉴定正确的pBV220-E/DH5α菌株在含100ug/ml氨苄青霉素的LB固体培养基中接种划线，取单菌落接种于含100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，次日取过夜的菌液按1%的接种量再次接种5ml含100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，至OD600值为0.4-0.6左右时，迅速升温至42℃，继续震荡培养，进行升温诱导E基因表达。每30min取样检测各培养OD600值，直至OD600值不再下降为止。升温诱导前后各取少量菌液，用无菌PBS稀释相同倍数后涂布于LB平板，28℃培养48h，计算活菌数(cfu/mL)和裂解率：裂解率=（1-诱导后cfu/诱导前cfu)×100％。
2）菌影的制备及电镜观察
根据（5）-1的试验结果，选择最佳的诱导时间进行诱导，将培养物以3500rpm室温离心15min，弃上清，沉淀送哈尔滨兽医研究所电镜组进行电镜透射电镜观察。结果如图2（以pBV220-E为载体的大肠杆菌菌影）、图3（正常的大肠杆菌）。由图2、图3可看出菌影因大部分内容物溢出在透射电镜下观察为白色空腔，而正常大肠杆菌的内容物完整，在透射电镜下观察下整个菌体颜色均一。
实施例2重组质粒E’-OmpH-pET28a的构建
1、引物的设计与合成
由于两段基因是应用overlap PCR方法串联在一起的，所以根据已构建好的重组质粒pBV220-E和OmpH设计两对重叠互补引物，并在上游引物F15’末端引入BamH I限制性酶切位点（下划线所示），下游引物K2的3’末端引入XhoI限制性酶切位点（下划线所示）。以重组原核表达质粒pBV220-E为模板，引物F1和F2扩增锚定基因E’，以巴氏杆菌CVCC393的基因组为模板，引物K1和K2扩增OmpH基因，再利用引物F1和K2扩增E’-OmpH融合基因。引物的核苷酸序列如下：
E’上游引物F1：5’-CGCGGATCCATGGTACGCTGGACTTTGTG-3’
E’下游引物F2：5’-CCGCCACCGCTGCCACCCCCGCCGACGCTCGACGCCATTAATAAT-3’
OmpH上游引物K1：5’-TGGCAGCGGTGGCGGGGGATCAGCAGTCGCAGCAGTAGCAGC-3’
OmpH下游引物K2：5’-CCGCTCGAGTTAAACGACATTGCCTTTTGTTGTT-3’
2、E’基因和OmpH基因的扩增
1）以pBV220-E为模板，F1和F2为引物扩增E’基因。
PCR反应体系见表2：
表250μL PCR反应体系
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环；72℃终延伸10min。取5μLPCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。
2）以巴氏杆菌CVCC393基因组为模板，K1和K2为引物扩增OmpH基因。
PCR反应体系见表3：
表350μL PCR反应体系
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸90s，共30个循环；72℃终延伸10min。取5μLPCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。
3）E’-OmpH融合基因的扩增
对上述两种基因的PCR产物进行回收与纯化，以E’、OmpH基因的回收产物为模板，以F1和K2为引物通过overlap PCR拼接和扩增E’-OmpH基因片段，预期片段大小为1149bp。
PCR反应体系见表4：
表450μL PCR反应体系
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。取5μLPCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。
3、E’-OmpH融合基因表达载体的构建
将扩增的E’-OmpH基因进行回收与纯化，用BamHⅠ和XhoI双酶切目的片段及载体pET28a，分别回收目的片段和载体，T4DNA Ligase22℃连接1h。将连接产物转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，以卡那霉素抗性筛选，提取阳性克隆质粒，经PCR鉴定以及BamHⅠ和XhoI双酶切鉴定。取鉴定为阳性的重组克隆菌送上海生工生物技术有限公司进行序列测定，测序正确的重组质粒命名为E’-OmpH-pET28a。
实施例3双向表达载体E’-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2的构建与表达
1、引物设计及合成
根据已发表的pBV220的表达系统基因序列，应用软件Primer5.0及Oligo6.0以pBV220的阻遏蛋白ci857、E基因和终止子T1T2为模板设计一对引物C1、T1扩增裂解系统ci857-E-T1T2基因，在其上游引物5’端引入SgrAI限制性内切酶位点（下划线部分），下游引物5’端引入SphI限制性内切酶位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
引物的核苷酸序列如下：
ci857上游引物C1：5’-TACATACrCCGGyGTCAGCCAAACGTCTCTTC-3’(SgrAI)
T1T2下游引物T1：5’-ACATGCATGCGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG-3’(SphI)
PCR扩增的核酸片段大小为1888bp。
2、裂解系统ci857-E-T1T2基因的扩增
以pBV220-E为模板，C1和T1为引物扩增ci857-E-T1T2基因。
PCR反应体系见表5：
表550μL PCR反应体系
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。取5μL PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。
3、双向表达载体的构建及鉴定
对裂解系统ci857-E-T1T2基因的PCR产物进行回收与纯化，用SgrAI和SphI双酶切回收后的目的片段ci857-E-T1T2以及重组载体E’-OmpH-pET28a，分别回收目的片段和载体，T4DNA Ligase22℃连接过夜。将连接产物转化至E.coli BL21（DE3）和E.coli rossta（DE3）感受态细胞中，以卡那霉素抗性筛选，提取阳性克隆质粒，经PCR鉴定以及SgrAI和SphI双酶切鉴定。取鉴定为阳性的重组克隆菌送上海生工生物技术有限公司进行序列测定，测序正确的重组质粒命名为E’-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2。
实施例4双向表达载体的表达和菌影的检测
1、重组蛋白的诱导表达
细菌的培养：挑取重组菌单菌落(E’-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2/BL21、E’-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2/rossta)，接种于3mL含Kan+抗性的LB液体培养基中，37℃、220rpm/min振摇培养过夜。分别取8只试管，每管放Kan+抗性LB液体培养基5mL，取培养过夜的菌液E’-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2/BL21接种于试管1、2、3、4、5，取培养过夜的菌液E’-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2/rossta接种于试管6、7、8，每管接种50μL，28℃，220rpm振摇培养至光密度（OD600=0.4）左右时，测每管OD600值做好记录，同时取1号试管1mL菌液作为诱导前标本，12000rpm/min离心1min收集菌体沉淀-20℃冻存备用。
E’-OmpH的诱导表达：将各管IPTG的加入量为1mol/L，使IPTG终浓度为1mM/ml。2号试管先28℃IPTG诱导12h后42℃诱导2h；3、4、5号试管分别37℃IPTG诱导5h、28℃IPTG诱导12h、5h；6、7、8号试管分别37℃IPTG诱导5h、28℃IPTG诱导12h、5h，每管取1ml同上法收集菌体沉淀，剩余各管菌液迅速放42℃摇床，测各管OD600值。将各沉淀加入50μLPBS和50μL2×SDS上样缓冲液，煮沸加热10min，SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离，考马斯亮蓝染色3h后，脱色观察结果。
裂解基因E的表达：将E’-OmpH诱导后剩余菌液迅速放入42℃摇床中160rpm/min振摇2h，每隔30min测OD600值，直至OD600值不在降低。
重组蛋白E’-OmpH经大量表达、用镍柱亲和层析试剂盒纯化后对蛋白浓度测定后，进行Western-blot分析。结果如图4、图5所示。图4为重组蛋白E’-OmpH的SDS-PAGE图，蛋白大小在42KDa左右，蛋白表达量比较少。图5为重组蛋白E’-OmpH的Western-blot图。
2、双向表达载体裂解曲线的绘制及菌影的投射电镜镜检
E’-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2/BL21经过IPTG、28℃5h、37℃诱导5、12h之后可见OD600值有不同程度升高（经蛋白电泳均发现有微量蛋白表达），此时迅速加入到42℃摇床进行升温诱导，IPTG28℃诱导5h，之后42℃诱导1.5h左右可获得最大裂解率，而其他两种方法因42℃诱导时OD600值已经太高，裂解不明显。测OD600值，绘制裂解曲线，将诱导后的E’-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2/BL21送入哈尔滨兽医研究所电镜组做透射电镜切面图，结果如图6（a）、图6（b）。图6（a）为加入IPTG诱导后的大肠杆菌透射图；图6（b）为加入IPTG后在28℃诱导5h后，42℃诱导2h的菌影透射图。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种菌影载体，其特征在于，所述菌影载体包含锚定基因E’、巴氏杆菌OmpH基因、pBV220-E载体的表达原件ci857-E-T1T2和质粒载体pET28a，所述菌影载体为双向表达载体；
所述菌影载体的构建方法包括如下步骤：
1)以噬菌体PhiX174RF1质粒为模板，PCR扩增裂解基因E，将裂解基因E与T载体连接，筛选阳性质粒；
2)将步骤1)得到的阳性质粒，亚克隆到质粒pBV220中，得到重组质粒pBV220-E；
3)以步骤2)得到的重组质粒pBV220-E的DNA为模板，PCR扩增E’基因；
4)以巴氏杆菌基因组为模板，PCR扩增OmpH基因，用柔性肽Gly4Ser经overlap PCR将步骤3)得到的E’基因与OmpH基因连接在一起，形成融合片段E’-OmpH；
5)将融合片段E’-OmpH其插入到质粒载体pET28a多克隆位点区的EcoRI、Sal I位点上，经克隆转化入大肠杆菌BL21或Rossta感受态细胞中，酶切鉴定阳性克隆，得到重组表达载体E’-OmpH-pET28a；
6)将步骤2)得到的重组质粒pBV220-E的ci857-E-T1T2基因序列亚克隆到重组表达载体E’-OmpH-pET28a的SgrAI和SphI酶切位点上，构建双向表达载体E’-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2。
2.如权利要求1所述的菌影载体，其特征在于，所述巴氏杆菌OmpH基因来自牛巴氏杆菌标准株CVCC393。
3.如权利要求1所述的菌影载体，其特征在于，所述pBV220-E载体的表达原件ci857-E-T1T2为pBV220-E载体基因序列中从阻遏蛋白到终止子的全部基因序列。
4.权利要求1-3任一项所述的菌影载体的构建方法，其特征在于， 所述构建方法包括如下步骤：
1)以噬菌体PhiX174RF1质粒为模板，PCR扩增裂解基因E，将裂解基因E与T载体连接，筛选阳性质粒；
2)将步骤1)得到的阳性质粒，亚克隆到质粒pBV220中，得到重组质粒pBV220-E；
3)以步骤2)得到的重组质粒pBV220-E的DNA为模板，PCR扩增E’基因；
4)以巴氏杆菌基因组为模板，PCR扩增OmpH基因，用柔性肽Gly4Ser经overlap PCR将步骤3)得到的E’基因与OmpH基因连接在一起，形成融合片段E’-OmpH；
5)将融合片段E’-OmpH其插入到质粒载体pET28a多克隆位点区的EcoRI、Sal I位点上，经克隆转化入大肠杆菌BL21或Rossta感受态细胞中，酶切鉴定阳性克隆，得到重组表达载体E’-OmpH-pET28a；
6)将步骤2)得到的重组质粒pBV220-E的ci857-E-T1T2基因序列亚克隆到重组表达载体E’-OmpH-pET28a的SgrAI和SphI酶切位点上，构建双向表达载体E’-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2。
5.权利要求1-3任一项所述的菌影载体在构建大肠杆菌菌影中的应用。
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