CN104531739A - 重组弧菌抗原OmpK的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法 - Google Patents

Abstract

一种重组弧菌抗原OmpK的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法，属于基因工程领域，它包括(1)克隆噬菌PhiX174溶菌基因与弧菌外膜蛋白OmpK基因(2)构建溶菌质粒载体p-E-OmpK(3)迟缓爱德华菌的转化和筛选(4)菌脱的获得。本发明构建的表达弧菌共同免疫保护抗原OmpK的重组迟缓爱德华菌菌蜕疫苗具有对迟缓爱德华菌和多种致病弧菌的免疫保护效果。

Description

重组弧菌抗原OmpK的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法

技术领域

本发明属于基因工程领域,具体地涉及一种重组弧菌抗原OmpK的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法。

背景技术

细菌菌蜕是通过调控噬菌体PhiX174的裂解基因E在革兰氏阴性细菌中表达而形成的无细胞浆和繁殖能力的细菌空壳，因其保持了细菌原有的细胞形态、细菌表面抗原性和黏附性等特性。同时，菌蜕包含LPS、类脂、肽聚糖等天然的免疫刺激复合物，无须使用佐剂就能诱导更强的免疫反应。因此，菌蜕不仅可以直接作为疫苗使用，而且还可作为递呈异源抗原的重组疫苗及作为核酸疫苗甚至药物的递送载体。本发明旨在建立迟缓爱德华菌菌蜕作为弧菌外膜蛋白OmpK的递送载体的制备方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种重组弧菌抗原OmpK的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法_。本发明构建的表达弧菌共同免疫保护抗原OmpK的重组迟缓爱德华菌菌蜕疫苗具有对迟缓爱德华菌和多种致病弧菌的免疫保护效果。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种重组弧菌抗原OmpK的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法_，步骤如下：

(1)克隆噬菌PhiX174溶菌基因与弧菌外膜蛋白OmpK基因,所述的噬菌PhiX174溶菌基因简称E基因，所述的弧菌外膜蛋白OmpK基因简称OmpK基因；

(2)构建溶菌质粒载体p-E-OmpK

根据噬菌体PhiX174溶菌基因和弧菌外膜蛋白OmpK基因序列设计引物，上、下游引物末端分别引入限制性酶切位点EcoRI和BamHI，并在E基因下游引物和OmpK基因上游引物中加上l inker序列；以引物EcoRI-E-F、l inker-E-R人工合成的E基因为模板进行PCR扩增，以引物l inker-OmpK-F、BamHI-OmpK-R人工合OmpK基因为模板进行PCR扩增；，回收目的片段，并以纯化后的目的片段为模板，以加l inker的引物进行第二次扩增，将E基因和OmpK基因片段连接到一起，用试剂盒纯化PCR产物得到融合基因片段E-OmpK；用BamHI和EcoRI双酶切融合基因片段E-OmpK，经0.8％琼脂糖凝胶电泳后割胶回收各片段，回收后的片段与经相同双酶切并割胶回收的pBV220大片段连接转化Top10感受态细胞，用引物EcoRI-E-F/BamHI-OmpK-R对转化后培养生长的菌落进行PCR筛选，所得阳性克隆送公司进行测序鉴定正确后，溶菌质粒载体命名为p-E-OmpK，并用质粒提取试剂盒提取溶菌质粒载p-E-OmpK；

所述的E基因上游引物EcoRI-E-F：5’GGAATTCATGGTACGCTGGACTTTG-3’，

所述的E基因下游引物l inker-E-R：

5’-CTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCTCCTTCTGCACGTA-3’

所述的OmpK基因上游引物l inker-OmpK-F：

5’GTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCGATTACTCTGACGGCG-3’

所述的OmpK基因下游引物BamHI-OmpK-R：5’-TTAGAACTTGTAAGTTACTG C-3’；

(3)迟缓爱德华菌的转化和筛选

按照常规方法制备迟缓爱德华菌感受态细胞，冰浴10min，加入溶菌质粒载体p-E-OmpK 10μL，冰浴30min，42℃热休克90s，冰浴1-2min，加入800μL不含抗生素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基液体培养基，28℃80～100rpm/min振荡培养45min-1h，12,000×g离心1min,去上清，剩余40-50μL上清液重悬沉淀，重悬沉淀后的液体均匀涂布于含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基平板上，28℃培养过夜，得到转化筛选后的含溶菌质粒载体p-E-OmpK的迟缓爱德华菌；

(4)菌脱的获得 

将上述步骤转化筛选后的含溶菌质粒载体p-E-OmpK的迟缓爱德华菌接种在含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，28℃、180rpm过夜震荡培养，然后按照1：100的体积比转接于含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，28℃震荡培养至所述培养液的吸光值OD₆₀₀nm达0.3-0.4后进行42℃培养，以诱导E基因和OmpK基因表达，42℃培养诱导5小时后，4000rpm离心4～5分钟收集菌体，用ddH₂O洗菌体沉淀1次、PBS洗三次后收集所剩菌体，即菌蜕，-20℃冰箱保存备用。

进一步，所述步骤(2)的PCR扩增反应体系为：

进一步，所述步骤(2)的PCR扩增条件：95℃5min；94℃1min，68℃4min，共30个循环；72℃10min；用1％琼脂糖凝胶分离并回收相应的目的片段，各取1μL作模板，以加l inker的引物进行第二次扩增，将E基因和OmpK基因片段连接到一起，并用试剂盒纯化PCR产物。

进一步，所述的弧菌为哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌。

本发明还提供一种上述方法构建的重组弧菌抗原OmpK的迟缓爱德华菌菌蜕疫苗。

本发明与现有技术相比的有益效果：

细菌菌蜕疫苗(Bacterial ghosts vaccine)是通过调控噬菌体裂解基因E(lys isE)在革兰氏阴性细菌中表达而形成的细菌空壳，是一种无需添加佐剂的新型疫苗和疫苗载体。现有技术已经证明弧菌外膜白OmpK是哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)等病原弧菌共同的免疫保护抗原，但免疫原性很低，必须添加佐剂或使用疫苗载体等才能有更好的免疫保护效果；菌蜕疫苗是一种非常理想的疫苗，也是一种非常理想的疫苗载体系统。因此，本发明构建的表达弧菌共同免疫保护抗原OmpK的重组迟缓爱德华菌菌蜕疫苗具有对迟缓爱德华菌和多种致病弧菌的免疫保护效果，达到一种疫苗预防多种疾病的功能。

附图说明

图1geneE电泳结果1:geneE,M:Marker；

图2gene OmpK电泳结果(1:geneE,M:Marker)；

图3质粒p-E-OmpK结构示意图；

图4重组溶菌质粒p-E-OmpK双酶切鉴定：1：p-E-OmpK，M：Marker；

图5已转溶菌质粒的迟缓爱德华菌生长及溶菌过程，0为42℃诱导开始时间，图中数值代表600nm波长下的吸光值；

图6迟缓爱德华菌菌蜕表达弧菌外膜蛋白OmpK的电泳图谱；M:Marker 1:诱导后5h(30ul)，2:诱导前(30ul)，3:诱导后5h(10ul)，4,5:诱导前(10ul)；

图7迟缓爱德华菌菌蜕表达弧菌外膜蛋白OmpK的Western blotting检测，M:Marker A:诱导后B:诱导前。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图来对本发明技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

一种重组弧菌抗原OmpK的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法：步骤如下：

(1)克隆噬菌体PhiX174溶菌基因与副溶血弧菌外膜蛋白OmpK基因；

1)人工合成噬菌体PhiX174溶菌基因，也即E基因。

根据GenBank中噬菌体PhiX174溶菌基因序列，人工合成PhiX174溶菌基因，共276bp，序列为：ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGTTTATTGCTGCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAACGGCCTGTCTCATCATGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCGCGTTTACCTTGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACGTGCGTCAAAAATTACGTGCAGAAGGAGTGA。

人工合成后进行电泳，大小为276bp(图1)。测序结果表明噬菌体PhiX174溶菌基因正确合成。

2)人工合成副溶血弧菌外膜蛋白OmpK基因，也即OmpK基因。

根据GenBank中设计副溶血弧菌外膜蛋白OmpK基因的序列，人工合成膜蛋白OmpK基因序列，共759bp，序列为：ATGGATTACTCTGACGGCGATATCCACAAAAACGATTACAAGTGGATGCAATTTAACCTAATGGGTGCATTCAACGAGAAAGGTTATGCTGAATCTTCTCATGATTACCTAGAGATGGAATTCGGCGGTCGCTCTGGTATTTTCGATCTTTACGGTTACGTTGACGTATTCAACCTAGCTTCTGACCCAGGCAGCGACAAAGCTGGCGGCGAGAAAATCTTCATGAAATTCGCACCACGTATGTCTCTAGACGCGCTAACTGGTAAAGACCTATCTTTCGGTCCTGTTCAAGAGCTATACGTTTCTACTCTAATGGAGTGGGGCGGTAACTCTGACGTTAACTCTCAAAAAGTCGGTCTAGGTTCTGACGTGATGGTACCTTGGTTAGGCAAAATCGGCCTAAACCTATACGGTACTTACGATGGCAACAAGAAAGATTGGAACGGTTTCCAAGTTTCTACTAACTGGTTCAAACCATTCTTCTTCTTCGAGAACGGTTCATTCATTTCTTACCAAGGTTACATCGATTACCAATTCGGTATGGATGACGACAAAGGTAACAAGTTCAACACTACAGCGTCTAACGGCGGTGCAATGTTCAACGGTATCTACTGGCACTCTGACCGCTTTGCAGTTGGTTACGGTCTAAAACTTTACAAAGACGTGTACGGTTTCAAAGACGGCGAAGCTCTACCATGGGGTCACAAACCAGAATCTTCTGGTGCAGGTCACTACGTAGCAGTAACTTACAAGTTCTAA。

人工合成后进行电泳，大小为759bp(图2)。测序结果表明OmpK基因正确 合成。

(2)构建溶菌质粒载体p-E-OmpK

根据噬菌体PhiX174溶菌基因和副溶血弧菌外膜蛋白OmpK基因序列设计引物，上、下游引物末端分别引入限制性酶切位点EcoRI和BamHI(下划线)，并在E基因下游引物和OmpK基因上游引物中加上l inker序列(下划线)，由公司合成。并以相应人工合成的E基因和OmpK基因为模板进行PCR扩增。

E基因上游引物EcoRI-E-F：5’GGAATTCATGGTACGCTGGACTTTG-3’，

E基因下游引物l inker-E-R：

5’-CTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCG CCACCCTCCTTCTGCACGTA-3’；

OmpK基因上游引物l inker-OmpK-F：

5’GTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCG GTGGCGGCAGCGATTACTCTGACGGCG-3’

OmpK基因下游引物BamHI-OmpK-R：5’-TTAGAACTTGTAAGTTACTGC-3’；

PCR扩增反应体系为：

扩增条件：95℃5min；94℃1min，68℃4min，共30个循环；72℃10min。用1％琼脂糖凝胶分离并回收相应的目的片段，各取1μL作模板，以加l inker的 引物进行第二次扩增，将E基因和OmpK基因片段连接到一起，得到融合基因片段E-OmpK，并用试剂盒纯化融合基因片段E-OmpK。

用BamHI和EcoRI双酶切融合基因片段E-OmpK，经0.8％琼脂糖凝胶电泳后割胶回收各片段，回收后的片段与经相同BamHI和EcoRI双酶切并割胶回收的pBV220大片段连接转化Top10感受态细胞。用特异引物EcoRI-E-F/BamHI-OmpK-R对转化后生长的菌落进行PCR筛选，所得阳性克隆送公司进行测序鉴定正确后，命名为溶菌质粒载体p-E-OmpK(见图3)，并用质粒提取试剂盒提取溶菌质粒载体p-E-OmpK。

(3)迟缓爱德华菌转化和筛选

按照常规方法制备迟缓爱德华菌感受态细胞，冰浴10min，加入质粒载体p-E-OmpK 10μL，冰浴30min，42℃热休克90s，冰浴1-2min，加入800μL不含抗生素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)液体培养基，28℃80～100rpm/min振荡培养45min-1h，12,000×g离心1min,去上清，剩余约50μL液体重悬沉淀，均匀涂布于含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素(Amp)的胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基(TSA)平板上，28℃培养过夜。

从上述过夜培养的平板中挑取单个菌落，接种于3mL含含终浓度为100ug/mlAmp的TSB液体培养基中，28℃震摇培养过夜，提取质粒进行PCR鉴定。

对转入溶菌质粒载体p-E-OmpK的迟缓爱德华菌进行PCR扩增、电泳结果出现预期条带(同图1、图2)。对重组质粒载体p-E-OmpK双酶切、电泳，出现约3390bp和903bp的条带(图4)；与理论上的结论相符，初步证明为阳性重组质粒。

对疑似转入溶菌质粒载体p-E-OmpK的迟缓爱德华菌进行质粒序列测定，测序结果表明重组溶菌质粒载体p-E-OmpK与设计完全符合。测序结果如下：

GATACGAAACGAAGCATTGGTTAAAAATTAAGGAGGAATTCCCGGGGATCCATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGTTTATTGCTGCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAACGGCCTGTCTCATCATGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCGCGTTTACCTTGCGTGTACGCGCAGGAAACAC TGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACGTGCGTCAAAAATTACGTGCAGAAGGAGGGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCGATTACTCTGACGGCGATATCCACAAAAACGATTACAAGTGGATGCAATTTAACCTAATGGGTGCATTCAACGAGAAAGGTTATGCTGAATCTTCTCATGATTACCTAGAGATGGAATTCGGCGGTCGCTCTGGTATTTTCGATCTTTACGGTTACGTTGACGTATTCAACCTAGCTTCTGACCCAGGCAGCGACAAAGCTGGCGGCGAGAAAATCTTCATGAAATTCGCACCACGTATGTCTCTAGACGCGCTAACTGGTAAAGACCTATCTTTCGGTCCTGTTCAAGAGCTATACGTTTCTACTCTAATGGAGTGGGGCGGTAACTCTGACGTTAACTCTCAAAAAGTCGGTCTAGGTTCTGACGTGATGGTACCTTGGTTAGGCAAAATCGGCCTAAACCTATACGGTACTTACGATGGCAACAAGAAAGATTGGAACGGTTTCCAAGTTTCTACTAACTGGTTCAAACCATTCTTCTTCTTCGAGAACGGTTCATTCATTTCTTACCAAGGTTACATCGATTACCAATTCGGTATGGATGACGACAAAGGTAACAAGTTCAACACTACAGCGTCTAACGGCGGTGCAATGTTCAACGGTATCTACTGGCACTCTGACCGCTTTGCAGTTGGTTACGGTCTAAAACTTTACAAAGACGTGTACGGTTTCAAAGACGGCGAAGCTCTACCATGGGGTCACAAACCAGAATCTTCTGGTGCAGGTCACTACGTAGCAGTAACTTACAAGTTCTAACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAA 

(4)菌脱的获得 

在5mL含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素(Amp)的TSB中接种含溶菌质粒载体p-E-OmpK的迟缓爱德华菌感受态细胞，28℃过夜震荡培养(180rpm)，然后转接2mL于200mL含100ug/ml氨苄青霉素的TSB中，28℃震荡培养至OD₆₀₀nm达0.4左右后进行42℃培养，以诱导E基因和OmpK基因表达。每隔0.5小时后抽样检测各培养物OD₆₀₀nm。结果显示，诱导0.5小时后，菌液的OD_600nm略有升高，诱导1小时后，由于细菌的降解，菌液的OD_600nm开始迅速下降，8小时后到达最低值后基本稳定不变(图5)，表明已经获得菌蜕。

(5)迟缓爱德华菌菌蜕表达弧菌外膜蛋白OmpK的鉴定

诱导溶菌后，超声波粉碎迟缓爱德华菌菌蜕，蛋白质电泳，并进行产物的电转移：SDS-PAGE结束后，取出凝胶，按下列结构层次制备聚丙烯酰胺凝胶-膜“三明治”：一层滤纸-凝胶-PVDF膜-一层滤纸。用一干净的小试管轻轻滚过凝胶-膜“三明治”，以清除各层之间的气泡。滤纸、硝酸纤维素(NC)膜预先在 转移缓冲液中平衡15-20min。将固定好的凝胶-膜“三明治”转移至电转移仪中，凝胶侧朝向负极，NC膜侧朝向正极，以0.8mA/cm2的电流转移90分钟。

封闭：PVDF膜用5％脱脂奶粉室温封闭2小时或者4℃过夜。

洗膜Ⅰ：弃去封闭液，用PBST缓慢震荡洗膜3次，每次10min。

一抗：弃去PBST，加入兔抗OmpK多克隆抗体IgG(1：5000稀释于PBS溶液)，37℃缓慢振摇作用至少1h，过夜可增强灵敏度。

洗膜Ⅱ：弃去一抗，用PBST洗膜3次，每次10min。

二抗：弃去PBST，加入按1：5000稀释于PBS溶液的羊抗兔酶标二抗，37℃缓慢振摇作用至少1h或过夜。

洗膜Ⅲ：弃去酶标二抗，用TBS洗膜3次，每次10min。

显色：称取6mg DAB粉，溶解于10mLPBS中，加入10μL30％H₂O₂后过滤。将PVDF膜置于显色液中，显色3～5min，待出现特异性反应条带后，用双蒸水洗膜终止显色反应。

诱导溶菌后，超声波粉碎，蛋白质电泳和westernblot分析显示，迟缓爱德华菌成功展示副溶血弧菌外膜蛋白OmpK(图6、图7)。

(6)免疫保护与攻击试验

将120尾斑马鱼随机分成4组：菌蜕组(A组)、菌蜕组(B组)和PBS对照组2组(C组、D组)，每组30尾。免疫方法为腹腔注射，先用100mg/L的MSS麻醉斑马鱼，然后使用胰岛素专用注射器U-100腹腔注射疫苗和PBS，免疫前24h停止喂食，免疫剂量为1×10⁶CFU/10μL/尾，PBS组10μL/尾，各组均在2周后用相同处理加强免疫一次。

用菌蜕与PBS免疫后，未见斑马鱼出现任何行为变化和疾病症状。攻毒后观察2周，记录死亡情况，计算保护率(见表1)。

表1 攻毒后的免疫保护率

A 菌蜕免疫，迟缓爱德华菌攻毒

B 菌蜕免疫，弧菌攻毒

C PBS免疫，迟缓爱德华菌攻毒

D PBS免疫，弧菌攻毒。

Claims (5)

1.一种重组弧菌抗原OmpK的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法_，其特征在于它的步骤如下：

(1)克隆噬菌PhiX174溶菌基因与弧菌外膜蛋白OmpK基因,所述的噬菌PhiX174溶菌基因简称E基因，所述的弧菌外膜蛋白OmpK基因简称OmpK基因；

(2)构建溶菌质粒载体p-E-OmpK

根据噬菌体PhiX174溶菌基因和弧菌外膜蛋白OmpK基因序列设计引物，上、下游引物末端分别引入限制性酶切位点EcoRI和BamHI，并在E基因下游引物和OmpK基因上游引物中加上l inker序列；以引物EcoRI-E-F、l inker-E-R人工合成的E基因为模板进行PCR扩增，以引物l inker-OmpK-F、BamHI-OmpK-R人工合OmpK基因为模板进行PCR扩增；，回收目的片段，并以纯化后的目的片段为模板，以加l inker的引物进行第二次扩增，将E基因和OmpK基因片段连接到一起，用试剂盒纯化PCR产物得到融合基因片段E-OmpK；用BamHI和EcoRI双酶切融合基因片段E-OmpK，经0.8％琼脂糖凝胶电泳后割胶回收各片段，回收后的片段与经相同双酶切并割胶回收的pBV220大片段连接转化Top10感受态细胞，用引物EcoRI-E-F/BamHI-OmpK-R对转化后培养生长的菌落进行PCR筛选，所得阳性克隆送公司进行测序鉴定正确后，溶菌质粒载体命名为p-E-OmpK，并用质粒提取试剂盒提取溶菌质粒载p-E-OmpK；

所述的E基因上游引物EcoRI-E-F：5’GGAATTCATGGTACGCTGGACTTTG-3’，

所述的E基因下游引物l inker-E-R：

5’-CTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCTCCTTCTGCACGTA-3’

所述的OmpK基因上游引物l inker-OmpK-F：

5’GTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCGATTACTCTGACGGCG-3’

所述的OmpK基因下游引物BamHI-OmpK-R：5’-TTAGAACTTGTAAGTTACTG C-3’；

(3)迟缓爱德华菌的转化和筛选

按照常规方法制备迟缓爱德华菌感受态细胞，冰浴10min，加入溶菌质粒载体p-E-OmpK 10μL，冰浴30min，42℃热休克90s，冰浴1-2min，加入800μL不含 抗生素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基液体培养基，28℃80～100rpm/min振荡培养45min-1h，12,000×g离心1min,去上清，剩余40-50μL上清液重悬沉淀，重悬沉淀后的液体均匀涂布于含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基平板上，28℃培养过夜，得到转化筛选后的含溶菌质粒载体p-E-OmpK的迟缓爱德华菌；

(4)菌脱的获得

将上述步骤转化筛选后的含溶菌质粒载体p-E-OmpK的迟缓爱德华菌接种在含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，28℃、180rpm过夜震荡培养，然后按照1：100的体积比转接于含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，28℃震荡培养至所述培养液的吸光值OD₆₀₀nm达0.3-0.4后进行42℃培养，以诱导E基因和OmpK基因表达，42℃培养诱导5小时后，4000rpm离心4～5分钟收集菌体，用ddH₂O洗菌体沉淀1次、PBS洗三次后收集所剩菌体，即菌蜕，-20℃冰箱保存备用。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)的PCR扩增反应体系为：

。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)的PCR扩增条件：95℃5min；94℃1min，68℃4min，共30个循环；72℃10min；用1％琼脂糖凝胶分 离并回收相应的目的片段，各取1μL作模板，以加l inker的引物进行第二次扩增，将E基因和OmpK基因片段连接到一起，并用试剂盒纯化PCR产物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的弧菌为哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌。

5.一种权利要求1-4任何一项所述方法构建的重组弧菌抗原OmpK的迟缓爱德华菌菌蜕疫苗。