CN104498524A - 重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕及构建 - Google Patents
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Abstract
一种重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕及构建，属于基因工程领域，它包括(1)克隆噬菌PhiX174溶菌基因与创伤弧菌溶细胞素基因vvhA(2)构建溶菌质粒载体p-E-OmpK(3)迟缓爱德华菌的转化和筛选(4)菌脱的获得。本发明构建的表达创伤弧菌溶细胞素基因vvhA免疫保护抗原基因vvhA的重组迟缓爱德华菌菌蜕疫苗，具有对迟缓爱德华菌和创伤弧菌的共同免疫保护效果。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地涉及一种展示创伤弧菌溶细胞素基因vvhA的重组迟缓爱德华菌菌蜕及构建方法。
背景技术
细菌菌蜕是通过调控噬菌体PhiX174的裂解基因E在革兰氏阴性细菌中表达而形成的无细胞浆和繁殖能力的细菌空壳，包含细菌原有LPS、类脂、肽聚糖等天然的免疫刺激复合物，无须使用佐剂就能诱导更强的免疫反应。因此，菌蜕不仅可以直接作为疫苗使用，而且还可作为递呈异源抗原的重组疫苗及作为核酸疫苗甚至药物的递送载体。本发明旨在建立迟缓爱德华菌菌蜕作为创伤弧菌溶细胞素基因vvhA的递送载体制备的方法及免疫保护应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种
重组创伤弧菌(Vibrio vulnificus)基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕及构建方法
本发明提供一种重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕。
本发明提供一种重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法，步骤如下：
(1)克隆噬菌PhiX174溶菌基因与创伤弧菌溶细胞素基因vvhA,所述的噬菌PhiX174溶菌基因简称E基因，所述的创伤弧菌溶细胞素基因vvhA简称vvhA基因；
(2)构建溶菌质粒载体p-E-vvhA
根据噬菌体PhiX174溶菌基因和创伤弧菌溶细胞素基因vvhA的序列设计引物，上、下游引物末端分别引入限制性酶切位点EcoRI和BamHI，并在E基因下 游引物和vvhA基因上游引物中加上linker序列；并以人工合成的E基因和vvhA基因为模板分别进行PCR扩增，回收目的片段，并以纯化后的目的片段为模板，以E基因上游引物和vvhA基因下游引物进行第二次扩增，将E基因和vvhA基因片段连接到一起，用试剂盒纯化PCR产物得到融合基因片段E-vvhA；用BamHI和EcoRI双酶切融合基因片段E-vvhA，经0.8％琼脂糖凝胶电泳后割胶回收各片段，回收后的片段与经相同双酶切并割胶回收的pBV220大片段连接转化Top10感受态细胞，用E基因上游引物和vvhA基因下游引物对转化后培养生长的菌落进行PCR筛选，所得阳性克隆送公司进行测序鉴定正确后，溶菌质粒载体命名为p-E-vvhA，并用质粒提取试剂盒提取溶菌质粒载p-E-vvhA；
所述的E基因上游引物EcoRI-E-F：5’GAGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTG-3’，
所述的E基因下游引物linker-E-R：5’
-CTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCTCCTTCTGCACGTA-3’；
所述的vvhA基因上游引物l inker-vvhA-F：
5’GTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCCCATTCGCCAGCAGTTAC-3’
所述的vvhA基因下游引物BamHI-vvhA-R：
5’-TTAGGGATCCCTAATCGCCTTCCCAATAC-3’；
(3)迟缓爱德华菌的转化和筛选
按照常规方法制备迟缓爱德华菌感受态细胞，迟缓爱德华菌冰浴10min，加入溶菌质粒载体p-E-vvhA 10μL，冰浴30min，42℃热休克90s，冰浴1-2min，加入800μL不含抗生素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基液体培养基，28℃80～100rpm/min振荡培养45min-1h，12,000×g离心1min,去部分上清，剩余40-50μL上清液重悬沉淀，重悬沉淀后的液体均匀涂布于含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基平板上，28℃培养过夜，所得阳性克隆即含溶菌质粒载体p-E-vvhA的迟缓爱德华菌；
(4)菌脱的获得
将上述步骤转化筛选后的含溶菌质粒载体p-E-vvhA的迟缓爱德华菌接种在 含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，28℃、180rpm过夜震荡培养，然后按照1：100的体积比转接于含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，28℃震荡培养至所述培养液的吸光值OD600nm达0.3-0.4后进行42℃培养，以诱导E基因和vvhA基因表达，42℃培养诱导5小时后，离心收集菌体，用ddH2O、PBS洗后收集菌体，即菌蜕。
进一步，所述步骤(2)的PCR扩增反应体系为：
进一步，所述步骤(2)的PCR扩增条件：95℃5min；94℃1min，68℃4min，共30个循环；72℃10min；用1％琼脂糖凝胶分离并回收相应的目的片段，各取1μL作模板，以E基因上游引物和vvhA基因下游引物进行第二次扩增，将E基因和vvhA基因片段连接到一起，并用试剂盒纯化PCR产物。
本发明还提供根据上述方法获得的一种重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕。
本发明与现有技术相比的有益效果：
细菌菌蜕疫苗(Bacterial ghosts vaccine)是通过调控噬菌体裂解基因E(lys isE)在革兰氏阴性细菌中表达而形成的细菌空壳，因而保持了细菌原有的细胞形态、表面抗原性和黏附性等特性；同时还包含多种天然免疫刺激复合物，无须佐剂就能诱导更强的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫应答，是一种更理想 的新型疫苗和疫苗载体。现有技术已经证明迟缓爱德华菌菌蜕疫苗一种非常理想的口服疫苗；创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种对水产养殖业造成巨大危害的病原弧菌，该菌的溶细胞素基因vvhA具有免疫保护抗原性；同时，业已报道菌蜕疫苗也是一种非常理想的疫苗载体系统。因此，本发明构建的表达创伤弧菌溶细胞素基因vvhA免疫保护抗原基因vvhA的重组迟缓爱德华菌菌蜕疫苗，具有对迟缓爱德华菌和创伤弧菌的共同免疫保护效果。
附图说明
图1geneE电泳结果 1:geneE,M:Marker；
图2gene vvhA电泳结果(1:gene vvhA,M:Marker)；
图3质粒p-E-vvhA结构示意图；
图4已转溶菌质粒的迟缓爱德华菌生长及溶菌过程，0为42℃诱导开始时间，图中数值代表600nm波长下的吸光值；
图5迟缓爱德华菌菌蜕表达创伤弧菌溶细胞素基因vvhA的Western blotting检测，M:Marker A:诱导后B:诱导前。
具体实施方式
下面通过实施例结合附图来对本发明技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
一种重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法，步骤如下：
(1)克隆噬菌体PhiX174溶菌基因与创伤弧菌溶细胞素基因vvhA；
1)人工合成噬菌体PhiX174溶菌基因，也即E基因。
根据GenBank中噬菌体PhiX174溶菌基因序列，人工合成PhiX174溶菌基因，共276bp，序列为：ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGTTTATTGCTGCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAACGGCCTGTCTCATCATGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCGCGTTTACCTTGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACGTGCGTCAA AAATTACGTGCAGAAGGAGTGA。
人工合成后进行电泳，大小为276bp(图1)。测序结果表明噬菌体PhiX174溶菌基因正确合成。
2)人工分段合成创伤弧菌溶细胞素基因vvhA，也即vvhA基因。
根据GenBank中的基因序列，创伤弧菌溶细胞素基因vvhA的基因序列，共1416bp，序列为：
ATGAAAAAAATAACTCTGTTTACCCTTTCTCTTTTAGCTACCGCGGTACAGGTTGGCGCACAAGAATATGTGCCGATTGTTGAGAAACCTATTTACATCACCAGCTCAAAGATTAAGTGTGTGTTGCACACAAGCGGTGATTTCAACGCCACACGAGACTGGTGTAATGCGGGTGCTTCCATCGATGTTCGCGTCAATGTGGCACAAATGCGCTCGGTACAATCGGCAACGTCAGATGGTTTTACTCCTGACGCCAAAATTGTCCGTTTCACCGTCGATGCCGACAAGCCTGGCACGGGTATTCATTTGGTTAACGAGCTACAGCAAGATCACAGCTGGTTCCAGAGTTGGGCAAACCGCCGCACTTACATTGGTCCATTCGCCAGCAGTTACGACCTTTGGGTGAAACCCGTTTCTGGTTACACACCGAAAAAAGCCCGTGACCTACCGCAGAATGAGAACAAAAACTACCAACACCGCGATACTTACGGTTACTCCATCGGTATTAACGGCAAAGTAGGTGCGGAAGTGAACAAAGACGGCCCGAAAGTGGGTGGCGAAGTCAGTGGCTCATTTACCTACAACTACTCGAAGACCTTGGTGTTTGATACAAAAGACTATCGCATCAACAACCGTTCATCATTGAGTGATTTTGATATTTCATTCGAGCGTGAATTTGGGGAATGTGATGAACTGCGCCGCCAAGAGCTTGGATGCTATTTCACCGCCGCTCACTGGGGCAGTGGCTGGGTATTTGATAAGACGAAGTTCAACCCTATCTCTTATTCCAACTTCAAACCGAACTATGACGTTTTGTACGAAGCGCCCGTGTCTGAAACTGGCATAACGGATTTTGAGATGGGCGTGAAACTCAACTATCGTGCACGCTTTGGTACCGTTCTTCCTTCAGCGCTGTTTTCGGTTTACGGCTCTGCGGGCTCGTCAACCAACAGCAGTACTGTGAAACAACGTATTCGCATCGACTGGAATCATCCACTGTTTGAAGCGGAAGCACACGTTACACTGCAGTCATTGAGCAACAACGATCTCTGCCTAGATGTTTATGGTGAGAACGGTGACAAAACGGTTGCGGGTGGTTCGGTTAACGGCTGGAGCTGTCACGGCAGTTGGAACCAAGTTTGGGGCCTAGATAAAGAAGAACGTTATCGTAGCCGAGTGGCATCCGATCGTTGTTTGACCGTAAACGCTGACAAAACGCTCACAGTCGAACAGTGTGGTGCGAACTTAGCACAGAAATGGTATTGGGAAGGCGATAAGCTCATTAGCCGCTATGTTGATGGCAGTAATACTCGCTACCTTCTAAATATTGTTGGTGGTCGTAATGTTCAAGTAACCCCTGAAAATGAAGCAAATCAGGCGCGTTGGAAACCCACATTACAACAAGTCAAACTCTAG。
人工分段合成后PCR技术连接，经琼脂糖电泳，大小为1416bp(图2)。测序结果表明vvhA基因正确合成。
(2)构建溶菌质粒载体p-E-vvhA
根据噬菌体PhiX174溶菌基因和创伤弧菌溶细胞素基因vvhA的序列设计引物，上、下游引物末端分别引入限制性酶切位点EcoRI和BamHI(下划线)，并在E基因下游引物和创伤弧菌vvhA基因上游引物中加上linker序列(下划线)，由公司合成。并以相应人工合成的E基因和vvhA基因为模板进行PCR扩增。
E基因上游引物EcoRI-E-F：5’GAGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTG-3’，E基因下游引物linker-E-R：
5’-CTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCG CCACCCTCCTTCTGCACGTA-3’；
vvhA基因上游引物linker-vvhA-F：
5’GTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCG GTGGCGGCAGC CCATTCGCCAGCAGTTAC-3’
vvhA基因下游引物BamHI-vvhA-R：5’-TTAGGGATCCCTAATCGCCTTCCCAATAC-3’；
融合基因E-vvhA的制备：以引物EcoRI-E-F、linker-E-R，linker-vvhA-F、BamHI-vvhA-R分别进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为：
扩增条件：95℃5min；94℃1min，58℃4min，共30个循环；72℃10min。用1％琼脂糖凝胶分离并回收相应的目的片段，各取1μL作模板，以E基因上游引物和vvhA基因下游引物进行第二次扩增，将E基因和vvhA基因片段连接到一起，得到融合基因片段E-vvhA，并用试剂盒纯化融合基因片段E-vvhA。
用BamHI和EcoRI双酶切融合基因片段E-vvhA，经0.8％琼脂糖凝胶电泳后割胶回收各片段，回收后的片段与经相同BamHI和EcoRI双酶切并割胶回收的pBV220大片段连接转化Top10感受态细胞。用E基因上游引物和vvhA基因下游引物对转化后生长的菌落进行PCR筛选，所得阳性克隆送公司进行测序鉴定正确后，命名为溶菌质粒载体p-E-vvhA(见图3)，并用质粒提取试剂盒提取溶菌质粒载体p-E-vvhA。
(3)迟缓爱德华菌转化和筛选
按照常规方法制备迟缓爱德华菌感受态细胞，迟缓爱德华菌冰浴10min，加入质粒载体p-E-vvhA10μL，冰浴30min，42℃热休克90s，冰浴1-2min，加入800μL不含抗生素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)液体培养基，28℃80～100rpm/min振荡培养45min-1h，12,000×g离心1min,去部分上清，剩余40-50μL液体重悬沉淀，均匀涂布于含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素(Amp)的胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基(TSA)平板上，28℃培养过夜。
从上述过夜培养的平板中挑取单个菌落，接种于3mL含终浓度为100ug/ml Amp的TSB液体培养基中，28℃震摇培养过夜，提取质粒进行PCR鉴定。
对转入溶菌质粒载体p-E-vvhA的迟缓爱德华菌进行PCR扩增、片段大小与预期条带一致，与理论上的结论相符，初步证明为阳性重组质粒。
对疑似转入溶菌质粒载体p-E-vvhA的迟缓爱德华菌进行质粒序列测定，测序结果表明重组溶菌质粒载体p-E-vvhA与设计完全符合。测序结果如下：
GATACGAAACGAAGCATTGGTTAAAAATTAAGGAGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGTTTATTGCTGCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAACGGCCTGTCTCATCATGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCGCGTTTACCTTGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTT ACTGACGCAGAAGAAAACGTGCGTCAAAAATTACGTGCAGAAGGAGGGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCCCATTCGCCAGCAGTTACGACCTTTGGGTGAAACCCGTTTCTGGTTACACACCGAAAAAAGCCCGTGACCTACCGCAGAATGAGAACAAAAACTACCAACACCGCGATACTTACGGTTACTCCATCGGTATTAACGGCAAAGTAGGTGCGGAAGTGAACAAAGACGGCCCGAAAGTGGGTGGCGAAGTCAGTGGCTCATTTACCTACAACTACTCGAAGACCTTGGTGTTTGATACAAAAGACTATCGCATCAACAACCGTTCATCATTGAGTGATTTTGATATTTCATTCGAGCGTGAATTTGGGGAATGTGATGAACTGCGCCGCCAAGAGCTTGGATGCTATTTCACCGCCGCTCACTGGGGCAGTGGCTGGGTATTTGATAAGACGAAGTTCAACCCTATCTCTTATTCCAACTTCAAACCGAACTATGACGTTTTGTACGAAGCGCCCGTGTCTGAAACTGGCATAACGGATTTTGAGATGGGCGTGAAACTCAACTATCGTGCACGCTTTGGTACCGTTCTTCCTTCAGCGCTGTTTTCGGTTTACGGCTCTGCGGGCTCGTCAACCAACAGCAGTACTGTGAAACAACGTATTCGCATCGACTGGAATCATCCACTGTTTGAAGCGGAAGCACACGTTACACTGCAGTCATTGAGCAACAACGATCTCTGCCTAGATGTTTATGGTGAGAACGGTGACAAAACGGTTGCGGGTGGTTCGGTTAACGGCTGGAGCTGTCACGGCAGTTGGAACCAAGTTTGGGGCCTAGATAAAGAAGAACGTTATCGTAGCCGAGTGGCATCCGATCGTTGTTTGACCGTAAACGCTGACAAAACGCTCACAGTCGAACAGTGTGGTGCGAACTTAGCACAGAAATGGTATTGGGAAGGCGATTAGGGATCCCTAA
(4)菌脱的获得
在5mL含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素(Amp)的TSB中接种含溶菌质粒载体p-E-vvhA的迟缓爱德华菌感受态细胞，28℃过夜震荡培养(180rpm)，然后转接2mL于200mL含100ug/ml氨苄青霉素的TSB中，28℃震荡培养至OD600nm达0.4左右后进行42℃培养，以诱导E基因和vvhA基因表达。每隔0.5小时后抽样检测各培养物OD600nm。结果显示，诱导0.5小时后，菌液的OD600nm略有升高，诱导1小时后，由于细菌的降解，菌液的OD600nm开始迅速下降，8小时后到达最低值后基本稳定不变(图4)，表明已经获得菌蜕。
(5)迟缓爱德华菌菌蜕表达创伤弧菌溶细胞素基因vvhA的鉴定
诱导溶菌后，超声波粉碎迟缓爱德华菌菌蜕，蛋白质电泳，并进行产物的电转移：SDS-PAGE结束后，取出凝胶，按下列结构层次制备聚丙烯酰胺凝胶-膜 “三明治”：一层滤纸-凝胶-PVDF膜-一层滤纸。用一干净的小试管轻轻滚过凝胶-膜“三明治”，以清除各层之间的气泡。滤纸、硝酸纤维素(NC)膜预先在转移缓冲液中平衡15-20min。将固定好的凝胶-膜“三明治”转移至电转移仪中，凝胶侧朝向负极，NC膜侧朝向正极，以0.8mA/cm2的电流转移90分钟。
封闭：PVDF膜用5％脱脂奶粉室温封闭2小时或者4℃过夜。
洗膜Ⅰ：弃去封闭液，用PBST缓慢震荡洗膜3次，每次10min。
一抗：弃去PBST，加入兔抗vvhA多克隆抗体IgG(1：5000稀释于PBS溶液)，37℃缓慢振摇作用至少1h，过夜可增强灵敏度。
洗膜Ⅱ：弃去一抗，用PBST洗膜3次，每次10min。
二抗：弃去PBST，加入按1：5000稀释于PBS溶液的羊抗兔酶标二抗，37℃缓慢振摇作用至少1h或过夜。
洗膜Ⅲ：弃去酶标二抗，用TBS洗膜3次，每次10min。
显色：称取6mg DAB粉，溶解于10mLPBS中，加入10μL30％H2O2后过滤。将PVDF膜置于显色液中，显色3～5min，待出现特异性反应条带后，用双蒸水洗膜终止显色反应。
诱导溶菌后，超声波粉碎，蛋白质电泳和westernblot分析显示，迟缓爱德华菌成功展示创伤弧菌溶细胞素基因vvhA(图5)。
(6)免疫保护与攻击试验
将120尾斑马鱼随机分成4组：菌蜕组(A组)、菌蜕组(B组)和PBS对照组2组(C组、D组)，每组30尾。免疫方法为腹腔注射，先用100mg/L的MSS麻醉斑马鱼，然后使用胰岛素专用注射器U-100腹腔注射疫苗和PBS，免疫前24h停止喂食，免疫剂量为1×106CFU/10μL/尾，PBS组10μL/尾，各组均在2周后用相同处理加强免疫一次。
用菌蜕与PBS免疫后，未见斑马鱼出现任何行为变化和疾病症状。攻毒后观察2周，记录死亡情况，计算保护率(见表1)。
表1攻毒后的免疫保护率
A 菌蜕免疫，迟缓爱德华菌攻毒
B 菌蜕免疫，创伤弧菌攻毒
C PBS免疫，迟缓爱德华菌攻毒
D PBS免疫，创伤弧菌攻毒。
Claims (5)
1.一种重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕。
2.根据权利要求1所述的一种重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法，其特征在于它的步骤如下：
(1)克隆噬菌PhiX174溶菌基因与创伤弧菌溶细胞素基因vvhA,所述的噬菌PhiX174溶菌基因简称E基因，所述的创伤弧菌溶细胞素基因vvhA简称vvhA基因；
(2)构建溶菌质粒载体p-E-vvhA
根据噬菌体PhiX174溶菌基因和创伤弧菌溶细胞素基因vvhA的序列设计引物，上、下游引物末端分别引入限制性酶切位点EcoRI和BamHI，并在E基因下游引物和vvhA基因上游引物中加上l inker序列；并以人工合成的E基因和vvhA基因为模板分别进行PCR扩增，回收目的片段，并以纯化后的目的片段为模板，以E基因上游引物和vvhA基因下游引物进行第二次扩增，将E基因和vvhA基因片段连接到一起，用试剂盒纯化PCR产物得到融合基因片段E-vvhA；用BamHI和EcoRI双酶切融合基因片段E-vvhA，经0.8％琼脂糖凝胶电泳后割胶回收各片段，回收后的片段与经相同双酶切并割胶回收的pBV220大片段连接转化Top10感受态细胞，用E基因上游引物和vvhA基因下游引物对转化后培养生长的菌落进行PCR筛选，所得阳性克隆送公司进行测序鉴定正确后，溶菌质粒载体命名为p-E-vvhA，并用质粒提取试剂盒提取溶菌质粒载p-E-vvhA；
所述的E基因上游引物EcoRI-E-F：5’GAGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTG-3’，
所述的E基因下游引物l inker-E-R：5’
-CTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCTCCTTCTGCACGTA-3’；
所述的vvhA基因上游引物l inker-vvhA-F：
5’GTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCCCATTCGCCAGCAGTTAC-3’；
所述的vvhA基因下游引物BamHI-vvhA-R：
5’-TTAGGGATCCCTAATCGCCTTCCCAATAC-3’；
(3)迟缓爱德华菌的转化和筛选
按照常规方法制备迟缓爱德华菌感受态细胞，迟缓爱德华菌冰浴10min，加入溶菌质粒载体p-E-vvhA 10μL，冰浴30min，42℃热休克90s，冰浴1-2min，加入800μL不含抗生素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基液体培养基，28℃80～100rpm/min振荡培养45min-1h，12,000×g离心1min,去部分上清，剩余40-50μL上清液重悬沉淀，重悬沉淀后的液体均匀涂布于含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基平板上，28℃培养过夜，所得阳性克隆即含溶菌质粒载体p-E-vvhA的迟缓爱德华菌；
(4)菌脱的获得
将上述步骤转化筛选后的含溶菌质粒载体p-E-vvhA的迟缓爱德华菌接种在含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，28℃、180rpm过夜震荡培养，然后按照1：100的体积比转接于含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，28℃震荡培养至所述培养液的吸光值OD600nm达0.3-0.4后进行42℃培养，以诱导E基因和vvhA基因表达，42℃培养诱导5小时后，离心收集菌体，用ddH2O、PBS洗涤收集菌体，即菌蜕。
3.根据权利要求2所述的一种重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法，其特征在于所述步骤(2)的PCR扩增反应体系为：
4.根据权利要求2所述的一种重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法，其特征在于所述步骤(2)的PCR扩增条件：95℃5min；94℃1min，68℃4min，共30个循环；72℃10min；用1％琼脂糖凝胶分离并回收相应的目的片段，各取1μL作模板，以E基因上游引物和vvhA基因下游引物进行第二次扩增，将E基因和vvhA基因片段连接到一起，并用试剂盒纯化PCR产物。
5.根据权利要求2-4任何一项所述构建的重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕。
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|---|---|
| CN (1) | CN104498524A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110218692A (zh) * | 2019-06-17 | 2019-09-10 | 青岛农业大学 | 一种创伤弧菌的菌蜕疫苗及其制备、应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101818200A (zh) * | 2010-03-04 | 2010-09-01 | 宁波博奥生物工程有限公司 | 创伤弧菌核酸定量检测试纸条 |
| CN101985610A (zh) * | 2010-10-26 | 2011-03-16 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种伤寒沙门氏菌菌蜕、制备方法及作为递送系统的应用 |
| CN102827925A (zh) * | 2012-04-24 | 2012-12-19 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法 |
| CN103146732A (zh) * | 2013-01-28 | 2013-06-12 | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 | 高效裂解串联基因，高效裂解质粒及构建方法和应用 |
| CN103667145A (zh) * | 2013-12-11 | 2014-03-26 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其应用 |
| CN104232502A (zh) * | 2014-03-06 | 2014-12-24 | 北京市水产科学研究所 | 维罗纳气单胞菌菌蜕、其制备方法及应用 |
-
2014
- 2014-12-31 CN CN201410853242.5A patent/CN104498524A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101818200A (zh) * | 2010-03-04 | 2010-09-01 | 宁波博奥生物工程有限公司 | 创伤弧菌核酸定量检测试纸条 |
| CN101985610A (zh) * | 2010-10-26 | 2011-03-16 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种伤寒沙门氏菌菌蜕、制备方法及作为递送系统的应用 |
| CN102827925A (zh) * | 2012-04-24 | 2012-12-19 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法 |
| CN103146732A (zh) * | 2013-01-28 | 2013-06-12 | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 | 高效裂解串联基因，高效裂解质粒及构建方法和应用 |
| CN103667145A (zh) * | 2013-12-11 | 2014-03-26 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其应用 |
| CN104232502A (zh) * | 2014-03-06 | 2014-12-24 | 北京市水产科学研究所 | 维罗纳气单胞菌菌蜕、其制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 张家敏等: "创伤弧菌vvhA 基因的克隆、原核表达系统的构建及鉴定", 《中国微生态学杂志》 * |
| 李桂军等: "创伤弧菌溶细胞素基因在大肠杆菌中的表达及溶血活性鉴定", 《中国人兽共患病学报》 * |
| 王雪鹏: "迟缓爱德华菌菌蜕疫苗的构建及动物免疫试验", 《中国博士学位论文全文数据库》 * |
| 王雪鹏等: "表达弧菌外膜蛋白OmpK 的重组迟缓爱德华菌菌蜕的构建", 《中国水产学会鱼病专业委员会2013年学术研讨会论文摘要汇编》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110218692A (zh) * | 2019-06-17 | 2019-09-10 | 青岛农业大学 | 一种创伤弧菌的菌蜕疫苗及其制备、应用 |
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