CN103667145A - 迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供野生迟缓爱德华氏菌的4株基因缺失突变株及其衍生菌株，分别为EvpC基因丧失功能的E.tarda^ΔEvpC菌株及其衍生菌株，包括有EsrB基因丧失功能的E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株及其衍生菌株，PstB基因丧失功能的E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}菌株及其衍生菌株，PstC基因丧失功能的E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstC}菌株及其衍生菌株。上述弱毒株的EvpC、EsrB、PstB和PstC等1—3个基因存在引起其功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。较野生1101菌株或其他强毒株，E.tarda^△EvpC、E.tarda^{△EvpCΔEsrB}、E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}和E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstC}菌株的毒力分别不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/40、1/400、1/4000和1/4000。上述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株可作为爱德华氏菌的弱毒疫苗株、基因工程载体或益生菌得到应用。

Description

迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其应用

技术领域

本发明涉水产养殖动物的微生物基因工程技术及免疫学领域，具体涉及迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其应用。

背景技术

迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）由Hoshina（1962）首次从鳗鲡（Anguilla japanica）中分离，与鲇鱼爱德华氏菌（E.ictaluri）和保科爱德华氏菌（E.hoshinae）同属于肠杆菌科爱德华氏菌属。迟缓爱德华氏菌对多种鱼类具有致病性，已报道可感染的鱼类有：斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）、大口黑鲈（Micropterus salmoides）、鳗鲡（A.japonica）、鲻鱼（Mugilcephalus）、犁齿鲷（Evynnis japonica）、罗非鱼（Tilapia nilotica）、奇努克鲑鱼（Oncorhynchus tshawytscha）、红鲷（Chrysophrys major）、五条魳（Seriola quinqueradiata）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、鲤鱼（Cyprinuscarpio）、海鲈（Morone saxatilis）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、胡鲶（Clarias batrachus）、锦鲤（Anabas testudineus）、欧洲鳗（Anguillaanguilla）、黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）、丝足鱼（Trichogastertrichopterus）、地图鱼（Astronotus ocellatus）、剑尾鱼（Xiphophorushelleri）和斑马鱼（Danio rerio）等。该菌株另也有感染两栖类（蟾蜍、牛蛙等）、爬行类（蜥蜴、蛇、海龟、中华鳖等）、鸟类（企鹅、秃鹰、鸵鸟及一些水鸟等）、哺乳类（海狮、海牛、猪、狗、牛、猴子等）的报道。除以上动物外，该菌株可感染人类，引起人的肠胃炎、流行性腹泻和败血症等症状。该菌呈世界性分布，普遍存在于淡水和海水环境中，主要分布在中国、澳大利亚、日本、印度、以色列、马来群岛、美国、巴拿马等热带和亚热带国家和地区，该菌是当前水产养殖业中的有着极大危害的病原菌之一。从首次报道至今，该病原对多种鱼类养殖业造成了巨大损失。较抗生素等药物防治方法，采用疫苗为主的免疫防治技术因具有安全高效无公害等优点，已成为国际上鱼病防控技术发展的趋势。在不同类型疫苗研究中，利用基因工程技术构建的基因工程弱毒株可通过感染宿主的方式诱发机体产生与自然感染接近的免疫应答，从而可产生较为持久的免疫力，与传统疫苗相比，其免疫接种中，具有用量小、成本低及操作方便等优点，另外弱毒株也可开发成为基因工程菌株或作为益生菌而加以应用，因此具有极高的开发应用价值。

早期研究中，有学者利用转座子或基因插入失活的方法对迟缓爱德华氏菌加以改造，但上述方法制备的弱毒株携带有抗生素及外源的基因片段，具有潜在的生物风险。针对这一现状，近年来，人们更多的采用细菌毒力相关基因的无标记缺失技术进行弱毒突变株的构建，该弱毒突变株因其不携带任何抗性标记和外源基因，具有较高的生物安全性，其中双基因或多基因缺失突变株较单基因缺失株又可有效降低因多次传代可能产生的返祖现象，因而更具有开发应用的价值。

病原材料的种株差异会直接影响其基因工程菌株的应用效果，进而也影响其所制备的弱毒疫苗的免疫保护效果。我们在早期研究中从分离到的多株迟缓爱德华氏菌中筛选出1101菌株作为弱毒疫苗开发候选株，该菌株分离自海水养殖鱼类大菱鲆成鱼体中，是一种具有较强毒力的野生菌株，其保藏编号为：CGMCCNo.7197，该菌株制备的灭活疫苗可获得60%以上的免疫保护力的结果，说明该1101菌株具有迟缓爱德华氏菌的免疫保护性抗原。以上述的1101菌株为基础，我们构建了迟缓爱德华氏菌Ⅵ型分泌系统中的毒力蛋白EvpC基因丧失功能的E.tarda^ΔEvpC菌株及其衍生菌株，对鱼类的半致死剂量（LD₅₀）可提高40—4000倍以上，用其作为活疫苗的免疫应用中，受试鱼也可获得较好的免疫保护效果，这一结果也表明E.tarda^ΔEvpC菌株及其衍生菌株作为基因工程弱毒株，具有良好的开发应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其应用方法。

本发明以野生迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）菌株1101为基础（保藏编号为：CGMCC No.7197），利用基因同源重组的原理，采用基因工程技术构建了Ⅵ分泌系统毒力蛋白EvpC基因丧失功能的E.tarda^ΔEvpC株，包括此菌株的衍生菌株，其特征在于该株与野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株相比，存在引起EvpC基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入，即存在引起与SEQ ID NO:1（EvpC基因上游核苷酸序列）和SEQ ID NO:2（EvpC基因下游核苷酸序列）相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。上述的点突变、移位或插入指受内在及外界因素诱导而引起的的该核苷酸序列的错义突变、无义突变、移码突变以及包括转座子标签在内的外源基因插入诱变等，以下同。以斑马鱼为模式动物对其毒力分析结果表明，E.tarda^△EvpC菌株的毒力不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/40，其对鱼的半致死量至少需要1×10⁵cfu/g（菌落形成单位/鱼体重）。

E.tarda^ΔEvpC菌株的衍生菌株中包括迟缓爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统调节蛋白基因EsrB丧失功能的E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株，包括此菌株的衍生菌株，其特征在于E.tarda^ΔEvpCΔEsrB株存在引起E.tarda^ΔEvpC株的EsrB基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入，即存在引起除了与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相同或相近的序列之外，还有与SEQ ID NO:3（EsrB基因上游核苷酸序列）和SEQ ID NO:4（EsrB基因下游核苷酸序列）相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。以大菱鲆为模式动物对其进行的两次毒力分析的结果表明，E.tarda^{△EvpCΔEsrB}菌株毒力不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/400，其对鱼的半致死量至少需要1×10⁶cfu/g（菌落形成单位/鱼体重）。以E.tarda^{△EvpCΔEsrB}菌株作为弱毒株的初步免疫试验结果表明，对爱德华氏菌感染具有较好的免疫保护效果，受试大菱鲆在注射、浸泡和口服免疫后，可分别获得76%、50%和42%免疫保护力。E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株所述衍生菌株中包括的PST操纵子系统基因PstB丧失功能的E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}株，包括此菌株的衍生菌株，其特征于E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}株存在引起E.tarda^ΔEvpCΔEsrB株的PstB基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入，即存在引起除了与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4相同或相近的序列之外，还有与SEQ ID NO:5（PstB基因上游核苷酸序列）和SEQ ID NO:6（PstB基因下游核苷酸序列）相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。以牙鲆为模式动物对其毒力分析结果表明，E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}菌株毒力不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/4000，其对鱼的半致死量至少需要1×10⁸cfu/g（菌落形成单位/鱼体重）；E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株所述衍生菌株中也包括PST操纵子系统基因PstC丧失功能的E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}株，包括此菌株的衍生菌株，其特征于E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstC}株存在引起E.tarda^ΔEvpCΔEsrB株的PstC基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入，即存在引起除了与SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4相同或相近的序列之外，还有与SEQ ID NO:7（PstC基因上游核苷酸序列）和SEQ ID NO:8（PstC基因下游核苷酸序列）相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。以牙鲆为模式动物对其毒力分析结果表明，E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}菌株毒力不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/4000，其对鱼的半致死剂量（LD₅₀）至少需要1×10⁸cfu/g（菌落形成单位/鱼体重）。上述的E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}和E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}菌株作为弱毒株的初步试验结果表明，对爱德华氏菌感染也可提供较好的免疫保护效果，受试牙鲆注射免疫2周后，可分别获得70%和85%免疫保护力。

以上结果也表明E.tarda^ΔEvpC菌株及其衍生菌株已具备适宜用于制备弱毒疫苗的能力及疫苗开发的应用前景。

本发明的E.tarda1101^ΔEvpC株（迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda），其中一个菌株于2013年8月21日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8061。

E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株（迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda），于2013年8月21日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8062；

E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}株，于2013年8月21日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8063；

E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPst}c株，于2013年8月21日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8064；

本发明的迟缓爱德华氏菌E.tarda^△EvpC、E.tarda^{△EvpCΔEsrB}、E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}和E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstC}菌株及其衍生菌株可培养于Luria-Bertani（LB）、胰大豆蛋白胨培养基（TSB）或2216E海水培养基，培养方法如下：从-80℃保存的菌种中挑取少量划线于上述培养基的固体平板，培养温度范围为28—37℃，24—48h后，取上述单菌落接种于上述培养基的培养液中，28—37℃，180r/min摇瓶培养至OD₆₀₀为0.5—0.6，即可获得该菌株的新鲜菌液。迟缓爱德华氏菌弱毒株作为疫苗菌株可以有多种应用方式，生产的疫苗可以是使用该弱毒株的活菌，也可以使用该弱毒株的灭活菌、菌蜕成分及部分抗原；可以制备源于该弱毒株的单一疫苗，可以制备该菌株与源于其他病原的联合疫苗，也可以将制备的单一或联合疫苗再添加佐剂生产疫苗产品，还可以是将弱毒株作为表达一种或多种外源抗原的活菌载体中的疫苗应用。弱毒株与佐剂配伍应用中，佐剂可与疫苗抗原混合制成疫苗制剂，也可以不与疫苗抗原制成单一制剂但同时使用，也可以与疫苗抗原不同时使用。由本发明迟缓爱德华氏菌弱毒株生产的疫苗在接种应用中，可以采用浸泡免疫、口服免疫、创伤免疫（即将受免疫鱼体表进行无菌人工轻微创伤处理，增强鱼体对抗原的吸收）和注射免疫等多种不同的免疫接种方式。抗原的剂量与免疫效果密切相关，剂量过低，不能诱导足够强的免疫应答，剂量过高，也可能会导致机体的免疫耐受。因此，为取得较好的免疫效果，在抗原接种前，应先确定疫苗接种的有效剂量范围，其中，弱毒株作为活疫苗或活菌载体应用中，因其潜在的毒力并未完全丧失，还应事先确定其免疫应用中的安全接种剂量范围。此外，抗原在应用中也应考虑诸如动物生长阶段、抗原种类、疫苗剂型及接种次数等因素对其剂量需求的影响。本发明的迟缓爱德华氏菌弱毒株作为活疫苗应用中，注射免疫接种时，可采用腹腔或肌肉注射两种方式，使用的剂量为10⁴—10⁷CFU/g(菌落形成单位/鱼体重)；创伤免疫或浸浴免疫接种时，浸泡水体中活疫苗的浓度为10⁶—10⁹CFU/mL(菌落形成单位/浸泡体积)，浸泡时间2min—12h；口服免疫接种时，配合饲料中活疫苗的添加剂量为10⁶—10⁹CFU/g(菌落形成单位/饲料重量)，连续投喂2—7天。以上活疫苗在使用中，还可根据实际情况对受免疫鱼实施加强免疫2—3次，两次免疫的时间间隔为14—30天。

本发明的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其所制备疫苗抗原可应用于鱼类、两栖类和爬行类的免疫接种，用于预防经免疫接种的水生动物发生爱德华氏菌病，包括海水养殖鱼类（如牙鲆、大菱鲆、半滑舌鳎、石斑鱼、鲈鱼、真鲷、军曹鱼、大西洋鲑、河鲀等）、半咸水养殖鱼类（如罗非鱼、虹鳟、鲻鱼等）、洄游鱼类（如鳗鲡、小黄鱼等）、淡水养殖鱼类（如青鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲤鱼、鲫鱼、鲶鱼、鳜鱼、鲟鱼、澳洲宝石鲈、黄颡鱼等）、观赏鱼类（如金鱼、锦鲤等）、两栖类（如牛蛙、大鲵等）和爬行类（如鳖、龟、蛇等）的疫苗接种。不同的水生动物的抗原的免疫剂量有所不同，对于特定水生动物及特定抗原的在使用中的具体剂量，应该进行单独测试。

迟缓爱德华氏菌为一种胞内寄生菌，可在上皮细胞及巨噬细胞等胞内生长繁殖，具有多种逃避机体的免疫杀伤的能力，其弱毒株在安全性具有保证的前提下，具有进一步开发成为基因工程菌株的潜在价值，其应用包括可以作为在质粒转化、噬粒转染、外源基因整合、DNA疫苗等方面所需的基因工程菌株，也可以在克隆特定的核酸序列，表达特定基因编码的外源蛋白、多肽，转录特定基因编码的单链或双链RNA等方面获得应用。迟缓爱德华氏菌弱毒株作为载体在应用前，有必要进行对该载体系统的安全性及外源基因遗传稳定性的评估，应用中的接种方式也可采用浸泡、口服、创伤和注射等接种方式。

本发明的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株也可作为益生菌加以应用，可以作为陆生动物或水生动物肠道、体表定植或体内暂存的益生菌，用于刺激动物非特异性免疫力的提高或抑制致病微生物的存在与繁殖。弱毒株作为益生菌，其应用的接种方式也可采用浸泡、口服、创伤和注射等接种方式，为确保应用中的安全性，应用前，也应确定不同接种方式中使用的安全剂量范围。

本发明的积极效果在于：本发明的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株无任何抗性标记及外源基因，其中的双基因和三基因缺失弱毒株及其衍生株可有效降低了减毒株在使用中可能发生的返祖现象，进一步提高了疫苗的安全性。免疫接种后，弱毒株可通过感染宿主的方式，通过在机体中的繁殖生长，进而诱发机体产生与自然感染接近的免疫应答，这对于可在胞内感染并具有免疫逃避能力的爱德华氏菌感染的有效免疫防控具有重要意义，使用中具有用量小、成本低及接种方便等优点。对鱼类初步免疫试验结果，已证实本发明的弱毒株一次注射、浸泡或口服途径接种均对爱德华氏菌感染具有较好的免疫保护作用。本发明的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株也可用于包括重组活疫苗在内的不同基因工程菌株的开发，也可作为水生生物的有益菌而加以应用。本发明的应用也可有效减少或消除由于爱德华氏菌病发生所致的消毒剂、抗生素等化学药物的滥用，因此也具有显著的经济及生态效益。

以下通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的培养

迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株E.tarda^△EvpC、E.tarda^{△EvpCΔEsrB}、E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}和E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstC}可培养于LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，去离子水定容至1L，pH7.0）、TSB培养基（北京陆桥技术有限责任公司）或2216E培养基（根据培养基成分中海水的有无，该培养基分为两种，其一：酵母提取物1g，胰化蛋白胨5g，FePO₄0.1g，海水定容至1L，pH7.6—7.8；其二：酵母提取物1g，胰化蛋白胨5g，FePO₄0.1g，NaCl34g，去离子水定容至1L，pH7.6—7.8），上述培养基的固体平板的配制中则需要另外添加2%琼脂。菌株培养方法如下：从-80℃保存的菌种中挑取少量划线于上述培养基的固体平板，在28—37℃培养24—48h，即可在平板上获得单克隆菌落，取一单菌落接种于上述培养基的培养液中，28—37℃，180r/min摇瓶培养至OD₆₀₀为0.5—0.6，即可获得该菌株的新鲜菌液。

实施例2：迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒疫苗E.tarda^△EvpC菌株的构建方法

（1）EvpC基因上、下游核苷酸序列扩增及连接

以迟缓爱德华氏菌1101菌株（保藏编号为：CGMCC No.7197）DNA为模板，用引物EvpC-up-for/EvpC-up-rev进行EvpC基因上游片段F1（826bp）扩增，所获序列记为SEQ ID NO：1。用引物EvpC-down-for/EvpC-down-rev进行EvpC基因下游片段F2（583bp）扩增，所获序列记为SEQ ID NO：2。对SEQ ID NO：1和2进行测序及系统发育学分析，结果表明以上两序列具备了迟缓爱德华氏菌菌株的EvpC基因上、下游的序列特征。

上述引物序列如下：

EvpC-up-for：AAGGTACCGGTCGAGTCATTCAATTTT

EvpC-up-rev：ACCAATTTTGCCGCCATCAACCTTATCCAGTT

EvpC-down-for：GGCGGCAAAATTGGTCCTG

EvpC-down-rev：AAGGTACCCCGTCGAGGTTGAAAAGG

以上述纯化后的F1、F2为模板，用引物EvpC-up-for/EvpC-down-rev进行Overlap PCR扩增，所获片段即为EvpC基因上、下游核苷酸连接序列F1-F2（1409bp）。

（2）重组自杀质粒的构建及电转

用KpnⅠ内切酶（Takara生物工程有限公司，大连），对上述的F1-F2产物和pRE112自杀质粒进行酶切，获得酶切后的F1-F2产物及线性pRE112片段再用T4DNA连接酶（NEB有限公司，北京）16℃连接过夜，构建重组自杀质粒pRE112-DEvpC。再将该重组自杀质粒电转化入事先制备的大肠杆菌（Escherichia coli）SM10菌株的电转感受态细胞中，加入适量的LB培养基，37℃振荡培养60min，取适量菌液涂布含有氯霉素（34μg/mL，以下浓度同）的LB固体平板上，以筛选含有pRE112-DEvpC重组自杀质粒的大肠杆菌SM10菌株。

（3）两次同源重组构建E.tarda^△EvpC菌株

取OD600值约为0.5左右的160μL SM10（pRE112-DEvpC）和40μL1101新鲜菌液，混匀，离心并用200μL新鲜LB培养基洗2次，转移至TSA平板中央，28℃静置培养24h进行第一次同源重组。用PBS冲洗菌液并涂布含有氯霉素和粘菌素（12.5μg/mL，以下浓度同）的TSA平板，28℃静置培养48h后，用EvpC-up-for/EvpC-down-rev进行菌落PCR以筛选正确的第一次同源重组子。将第一次正确同源重组的菌落接种至5mL新鲜LB培养基中，28℃，振荡培养48h，进行2次同源重组后，涂布于含有粘菌素和含有10—20%蔗糖的TSA平板上，28℃静置培养48h后，将同一单菌落分别划线于含有粘菌素的TSA及含有氯霉素和粘菌素的TSA平板，选取在含有上述粘菌素的TSA平板上生长但在上述含有氯霉素和粘菌素TSA平板上不生长的菌落进行PCR检测，PCR阳性检测结果中含有单一F1-F2条带的菌落即是E.tarda^△EvpC菌株，该菌株于2013年8月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8061。

除以上方法外，也可采用其他的基因工程技术，通过SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入的方式来构建EvpC丧失功能的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其衍生菌株。

实施例3：迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒疫苗E.tarda^{△EvpCΔEsrB}菌株的构建方法

（1）EsrB基因上、下游核苷酸序列扩增及连接

以迟缓爱德华氏菌1101菌株DNA为模板，用引物EsrB-up-for/EsrB-up-rev进行EsrB基因上游片段F3（860bp）扩增，所获序列记为SEQ ID NO：3。用引物EsrB-down-for/EsrB-down-rev进行EsrB基因下游片段F4（765bp）扩增，所获序列记为SEQ ID NO：4。对SEQ ID NO：3和4进行测序及系统发育学分析，结果表明以上两序列具备了迟缓爱德华氏菌菌株1101的EsrB基因上、下游的序列特征。上述引物序列如下：

EsrB-up-for：AAGGTACCGGCGACAATCCCGATCTG

EsrB-up-rev：ATCCGTAATCTCTTGGCGGAGCTGAGCAACTGGG

EsrB-down-for：CAAGAGATTACGGATGCCATC

EsrB-down-rev：AAGGTACCGAAAGGCTCTCCGTTGA

以上述纯化后的F3、F4为模板，用引物EsrB-up-for/EsrB-down-rev进行Overlap PCR扩增，所获片段即为EsrB基因上、下游核苷酸连接序列F3-F4（1625bp）。

（2）重组自杀质粒的构建及电转

参加实施例2的方法构建重组自杀质粒pRE112-DEsrB和含有该重组自杀质粒的大肠杆菌SM10菌株。

（3）两次同源重组构建E.tarda^{△EvpCΔEsrB}菌株

用OD600值约为0.5左右的160μL含有pRE112-DEsrB质粒的大肠杆菌SM10（实施例3）和40μL迟缓爱德华氏菌E.tarda^ΔEvpC的新鲜菌液，混匀，离心并用200μL新鲜LB培养基洗2次，转移至TSA平板中央，28℃静置培养24h进行第一次同源重组。另参见实验例2中的方法进行二次同源重组及筛选确认，最终获得E.tarda^{△EvpCΔEsrB}菌株，该菌株于2013年8月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8062。

除以上方法外，也可采用其他的基因工程技术，在已有EvpC丧失功能的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株基础上，通过SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入的方式来构建EvpC和EsrB基因丧失功能的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其衍生菌株。

实施例4：迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒疫苗E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}菌株构建方法

（1）PstB基因上、下游核苷酸序列扩增及连接

以迟缓爱德华氏菌1101菌株DNA为模板，用引物PstB-up-for/PstB-up-rev进行PstB基因上游片段F5（822bp）扩增，所获序列记为SEQ ID NO：5。用引物PstB-down-for/PstB-down-rev进行PstB基因下游片段F6（648bp）扩增，所获序列记为SEQ ID NO：6。对SEQ ID NO：5和6进行测序及系统发育学分析，结果表明以上两序列具备了迟缓爱德华氏菌菌株1101的PstB基因上、下游的序列特征。

上述引物序列如下：

PstB-up-for：5'AAGGTACCATCCTGCTATCCACCTTT3'

PstB-up-rev：5'AGGGGCGGTAAACAGGTTGGTCGGGTCTGTCAC3'

PstB-down-for：5'CTGTTTACCGCCCCTGC3'

PstB-down-rev：5'AAGGTACCAATACGCTGGGAATGGT3'

以上述纯化后的F5、F6为模板，用引物PstB-up-for/PstB-down-rev进行Overlap PCR扩增，所获片段即为PstB基因上、下游核苷酸连接序列F5-F6（1470bp）。

（2）重组自杀质粒的构建及电转

参加实施例2的方法构建重组自杀质粒pRE112-DPstB和含有该重组自杀质粒的大肠杆菌SM10菌株。

（3）两次同源重组构建E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}菌株

用OD600值约为0.5左右的160μL含有pRE112-DPstB质粒的大肠杆菌SM10和40μL迟缓爱德华氏菌E.tarda^ΔEvpCΔEsrB的新鲜菌液，混匀，离心并用200μL新鲜LB培养基洗2次，转移至TSA平板中央，28℃静置培养24h进行第一次同源重组。另参见实验例2中的方法进行二次同源重组及筛选确认，最终获得E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}菌株，该菌株于2013年8月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8063。

除以上方法外，也可采用其他的基因工程技术，在已有EvpC和EsrB基因丧失功能的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株基础上，通过SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入的方式来构建EvpC、EsrB和PstB基因丧失功能的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其衍生菌株。

实施例5：迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒疫苗E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstC}菌株构建方法

（1）PstC基因上、下游核苷酸序列扩增及连接

以迟缓爱德华氏菌1101菌株DNA为模板，用引物PstC-up-for/PstC-up-rev进行PstC基因上游片段F7（332bp）扩增，所获序列记为SEQ ID NO：7。用引物PstC-down-for/PstC-down-rev进行PstC基因下游片段F8（657bp）扩增，所获序列记为SEQ ID NO：8。对SEQ ID NO：7和8进行测序及系统发育学分析，结果表明以上两序列具备了迟缓爱德华氏菌菌株1101的PstC基因上、下游的序列特征。

上述引物序列如下：

PstC-up-for：5'AAGGTACCAAGGACAGCGGCGGCAA3'

PstC-up-rev：5'CTCAGCAAACTCATTGATAGGCACCAGCGCG3'

PstC-down-for：5'AATGAGTTTGCTGAGGCGGAGTC3'

PstC-down-rev：5'AAGGTACCGTGGTGCGGATAACG3'

以上述纯化后的F7、F8为模板，用引物PstC-up-for/PstC-down-rev进行Overlap PCR扩增，所获片段即为PstC基因上、下游核苷酸连接序列F7-F8（989bp）。

（2）重组自杀质粒的构建及电转

参加实施例2的方法构建重组自杀质粒pRE112-DPstC和含有该重组自杀质粒的大肠杆菌SM10菌株。

（3）两次同源重组构建E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstC}菌株

用OD600值约为0.5左右的160μL含有pRE112-DPstC质粒的大肠杆菌SM10和40μL迟缓爱德华氏菌E.tarda^{△EvpCΔEsrB}的新鲜菌液，混匀，离心并用200μL新鲜LB培养基洗2次，转移至TSA平板中央，28℃静置培养24h进行第一次同源重组。另参见实验例2中的方法进行二次同源重组及筛选确认，最终获得E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstC}菌株，该菌株于2013年8月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8064。

除以上方法外，也可采用其他的基因工程技术，在已有EvpC和EsrB基因丧失功能的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株基础上，通过SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入的方式来构建EvpC、EsrB和PstC基因丧失功能的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其衍生菌株。

实施例6：迟缓爱德华氏菌E.tarda^△EvpC菌株对斑马鱼半致死剂量（LD₅₀）测定

（1）迟缓爱德华氏菌E.tarda^△EvpC菌株的培养：将对数生长期的迟缓爱德华氏菌E.tarda^△EvpC（约1×10⁵CFU/mL）以1：100的比例接种至TSB液体培养基中，28℃恒温培养箱，180rpm振荡培养5h，6000rpm，4℃离心10min收集菌体，以无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤菌体三次，并用PBS重悬菌体，制成1×10⁹CFU/mL菌悬液。

（2）试验鱼饲养及管理：选用健康斑马鱼（0.29±0.07g），置于斑马鱼养殖设备（上海海圣水族设备厂）中，水温为（28±1）℃。每日灯光照明12h。试验期间按鱼体重3%投喂配合饲料日投喂2次，定期对滤网进行清洗消毒，试验前暂养2周。斑马鱼注射前用MS222（1:10000稀释）进行浸泡麻醉处理。

（3）试验分组：将新鲜培养的菌液（1×10⁹cells/mL）用PBS（pH7.2）10倍系列稀释，分为7组，另设一组只注射PBS作为对照。每组15尾，置于10L槽内。MS222进行麻醉后，分别注射10μL的10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²CFU/mL及PBS（pH7.2），实验重复2次。实验观察2周，每日记录死亡鱼数。

（4）统计与分析：实验观察14天，各组斑马鱼死亡数见表1，注射PBS的对照组中斑马鱼无死亡。实验中对各组中濒死鱼随机取1—3尾，浸泡于MS222（1:5000）过量麻醉致死后，加入适量TSB匀浆后涂布EIM培养基（EdwardsiellaIctaluri Medium，北京陆桥技术有限责任公司定制），28℃培养48h，参照Pressley等（2005）的方法进行斑马鱼感染迟缓爱德华氏菌致死认定。迟缓爱德华氏菌菌株对斑马鱼的LD₅₀的计算方法采用Reed-Muench法。

表1.迟缓爱德华氏菌1101和E.tarda^△EvpC菌株对斑马鱼LD₅₀实验死亡鱼记录表

试验期间对照组中斑马鱼无死亡，参照Pressley等（2005）的方法可以认为斑马鱼是迟缓爱德华氏菌菌株感染至死。计算得出1101菌株对斑马鱼LD₅₀剂量为（2.10±0.13）×10³CFU/g（两次重复实验结果分别为2.01×10³CFU/g、2.19×10³CFU/g），E.tarda^△EvpC菌株对斑马鱼LD₅₀剂量为（1.50±0.06）×10⁵CFU/g（两次重复实验结果分别为1.54×10⁵CFU/g、1.45×10⁵CFU/g）。这一结果表明EvpC基因的缺失降低了迟缓爱德华氏菌1101菌株的毒力，E.tarda^△EvpC菌株较野生1101菌株其LD₅₀约提高了71倍。

实施例7：迟缓爱德华氏菌E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株对大菱鲆LD₅₀一次测定

（1）迟缓爱德华氏菌E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株的培养：参见实施例6。

（2）试验鱼饲养及管理：健康大菱鲆（3.6±1.2g），置于10L水槽中，水温为17±1℃。每日换水，清污2次，投喂2次，每天配合饲料投喂量为鱼体重的3%。实验前暂养2周。

（3）试验分组：将新鲜培养的1101菌液和E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌液（1×10⁹CFU/mL）用PBS（pH7.2）10倍系列稀释，分为8组，另设一组注射PBS作为对照组。每组10尾，经MS222麻醉后，各组分别腹腔注射100μL的10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²CFU/mL及PBS（pH7.2），实验重复2次。

（4）统计与分析：实验观察14天，各组大菱鲆死亡数见表2。濒死大菱鲆浸泡于MS222过量麻醉致死后，参见Pressley等（2005）的方法取内脏组织用于大菱鲆感染迟缓爱德华氏菌致死认定。迟缓爱德华氏菌对大菱鲆的LD₅₀的计算方法采用Reed-Muench法。

表2.迟缓爱德华氏菌1101和E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株对大菱鲆LD₅₀一次实验死亡鱼记录表

试验期间对照组中大菱鲆鱼无死亡，参照Pressley等（2005）的方法可以认为大菱鲆是迟缓爱德华氏菌菌株感染至死。1101菌株2次LD₅₀重复实验结果分别为3.46×10²CFU/g和2.78×10²CFU/g，即迟缓爱德华氏菌1101菌株对大菱鲆LD₅₀剂量为（3.12±0.48）×10²CFU/g。1101^ΔEvpCΔEsrB菌株2次LD₅₀重复实验结果分别为4.08×10⁶cfu/g和1.89×10⁶cfu/g，即迟缓爱德华氏菌菌株E.tarda^ΔEvpCΔEsrB对大菱鲆LD₅₀剂量为（2.99±1.55）×10⁶CFU/g。这一结果表明EvpC和EsrB基因的缺失降低了迟缓爱德华氏菌1101菌株的毒力，E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株较野生1101菌株其LD₅₀提高了9000多倍。

实施例8：迟缓爱德华氏菌E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株对大菱鲆LD₅₀二次测定

（1）试验用鱼及养殖管理：大菱鲆（6.2±0.8g）试验前于圆形玻璃钢桶（盛水1米³）中暂养2周，流水养殖，水温为19±2℃。每日换水并清污2次，投喂2次，暂养期间每日按鱼体重3%投喂配合饲料。

（2）试验分组：将新鲜培养的1101菌液和E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌液（1x10⁹CFU/mL）用PBS（pH7.2）10倍系列稀释，另设一组注射PBS作为对照组。每组10尾，菌液及PBS的注射剂量为100μL，注射前用MS222进行麻醉，实验重复3次。

（3）统计与分析：实验观察14天，统计各组大菱鲆死亡数。濒死大菱鲆浸泡于MS222过量麻醉致死后，参见Pressley等（2005）的方法取内脏组织用于大菱鲆感染迟缓爱德华氏菌致死认定。迟缓爱德华氏菌对大菱鲆的LD₅₀的计算方法采用Reed-Muench法。

试验期间对照组中大菱鲆鱼无死亡，参照Pressley等（2005）的方法可以认为大菱鲆是迟缓爱德华氏菌菌株1101感染至死。经计算1101菌株3次LD₅₀重复实验结果分别为4.09×10¹CFU/g、6.8×10¹CFU/g和5.44×10¹CFU/g，即迟缓爱德华氏菌菌株1101对大菱鲆LD₅₀剂量为（5.44±1.36）×10¹CFU/g。E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株3次LD₅₀重复实验结果分别为4.48×10⁵CFU/g、4.56×10⁵CFU/g和4.03×10⁵CFU/g，即迟缓爱德华氏菌菌株E.tarda^ΔEvpCΔEsrB对大菱鲆LD₅₀剂量为（4.35±0.29）×10⁵CFU/g。这一结果表明E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株较野生1101菌株其LD₅₀提高了8000倍。

实施例9：迟缓爱德华氏菌E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}和E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstC}菌株对牙鲆半致死剂量（LD₅₀）测定

（1）迟缓爱德华氏菌E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}和E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstC}菌株的培养：参见实施例6。

（2）试验鱼饲养及管理：健康牙鲆（4.7±1.1g），置于盛水140L塑料桶中，水温为27±1℃。每日换水，清污2次，投喂2次，每天配合饲料投喂量为鱼体重的3%。

（3）试验分组：将新鲜培养的菌液用PBS（pH7.2）10倍系列稀释，实验分为6组，各组设2个平行（10尾/平行），MS222进行麻醉后，进行腹腔注射，另设一组只注射PBS作为对照。实验观察2周，每日记录死亡鱼数。

（4）统计与分析：实验观察14天，各组牙鲆死亡数见表3，注射PBS的对照组中牙鲆无死亡。牙鲆感染迟缓爱德华氏菌致死认定及LD₅₀的计算方法参见实施例6。

表3.迟缓爱德华氏菌1101、E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}和E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstC}菌株对牙鲆LD₅₀实验死亡鱼记录表

试验期间对照组中牙鲆无死亡，参照Pressley等（2005）的方法可以认为牙鲆是迟缓爱德华氏菌菌株感染至死。计算得出1101菌株对牙鲆LD₅₀剂量为（8.89±2.42）×10²CFU/g（两次重复实验结果分别为7.18×10²CFU/g、1.06×10³CFU/g）。两株三基因缺失株中，只有最高剂量的注射组出现鱼死亡，其余各组均无死亡。其中，E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstC}菌株对牙鲆注射剂量达到5.58×10⁷CFU/g时，该组死亡牙鲆数也小于受试鱼的半数（两平行组中，死亡牙鲆数分别为1尾和2尾），因此，该三基因缺失株对牙鲆的牙鲆LD₅₀剂量应大于5.58×10⁷CFU/g。以上结果表明EvpC、EsrB和PstC三基因的缺失大大降低了迟缓爱德华氏菌1101菌株的毒力，E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstC}菌株较野生1101菌株其LD₅₀至少提高了53000多倍；E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}菌株对牙鲆注射剂量达到4.74×10⁷CFU/g时，该组死亡牙鲆数也小于受试鱼的半数（两平行组中，死亡牙鲆数各分别为1尾），因此，该三基因缺失株对牙鲆的牙鲆LD₅₀剂量应大于4.74×10⁷CFU/g。以上结果表明EvpC、EsrB和PstB三基因的缺失大大降低了迟缓爱德华氏菌1101菌株的毒力，E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}菌株较野生1101菌株其LD₅₀至少提高了62000多倍。

实施例10：迟缓爱德华氏菌E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株作为活疫苗注射免疫大菱鲆

（1）迟缓爱德华氏菌E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株的培养：参见实施例6。

（2）试验鱼饲养及管理：选用健康大菱鲆（3.6±1.2）g，置于整理箱中（盛水0.09米³）中，水温为18±2℃，盐度28‰±2‰，24小时连续充气，每日清污一次，每日换水一次，换水量为2/3，正式实验前，暂养2周。试验期间按鱼体重3%投喂配合饲料，日投喂2次，注射前对大菱鲆用MS222（1:9000）进行浸泡麻醉处理。

（3）试验分组：对大菱鲆进行随机分组，各组设3个平行组，每平行组25尾，接种方式为腹腔注射免疫，试验设有一组注射PBS作为对照组。两个免疫组中注射迟缓爱德华氏菌E.tarda^ΔEvpCΔEsrB的剂量分别为10⁴CFU/尾、10⁶CFU/尾。

（4）免疫后攻毒：免疫30天后，按5.63×10⁴CFU/尾的剂量对大菱鲆腹腔注射新鲜培养的野生迟缓爱德华氏菌，进行人工感染试验。攻毒后14天统计各试验组的死亡率，并记算RPS，计算方法同实施例6。

（5）免疫效果评估：计算结果表明，注射10⁴CFU/尾和10⁶CFU/尾的迟缓爱德华氏菌E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株组的RPS分别为（66.7±2.3）%和（76.0±4.0）%。这一结果表明，本发明的迟缓爱德华氏菌菌株E.tarda^ΔEvpCΔEsrB对注射免疫大菱鲆具有着较好的免疫保护效果。

实施例11：迟缓爱德华氏菌E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株作为活疫苗浸泡、口服免疫大菱鲆

（1）迟缓爱德华氏菌E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株的培养：参见实施例6。

（2）试验用鱼及养殖管理：同实施例8。

（3）试验分组：口服及浸泡免疫中，对大菱鲆进行随机分组，各组设3个平行，每平行组50尾。口服免疫实验中，对照组投喂正常配合饲料，免疫组投喂含有迟缓爱德华氏菌E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株的免疫饲料，连续投喂2天，每天投喂2次，每天按鱼体体重的3%进行饲料投喂，免疫组的受试鱼摄入E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株的剂量10⁸CFU/尾，2天后各组投喂正常配合饲料；浸泡免疫实验中，对照组受试鱼置于海水中浸泡，免疫组受试鱼浸泡于含有E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株浓度为10⁸CFU/mL的海水中，上述各组浸泡30min后再移入正常海水中。

（4）免疫后攻毒：免疫30天后，大菱鲆浸泡于浓度为1.88×10⁶CFU/mL的新鲜野生迟缓爱德华氏菌液中1h，进行人工感染试验。攻毒后14天统计各试验组的死亡率，并记算RPS，计算方法同实施例7。

（5）免疫效果评估：计算结果表明，E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株作为活疫苗应用中，用10⁸CFU/尾的剂量实施口服免疫和10⁸CFU/mL的浓度实施浸泡免疫，均可对大菱鲆的爱德华氏菌感染具有较好的免疫保护效果，较对照组其RPS分别为（42.4±17.6）%和（50.1±16.8）%。结合实施例11的结果可见，E.tarda^ΔEvpCΔEsrB菌株具有活疫苗的开发应用前景。

实施例12：迟缓爱德华氏菌E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}和E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}菌株作为活疫苗注射免疫牙鲆

（1）迟缓爱德华氏菌E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}和E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}菌株的培养：参见实施例6。

（2）试验鱼饲养及管理：同实施例9。

（3）试验设计：对实施例10中LD₅₀实验用两组牙鲆鱼，分别为E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}（注射剂量为2.64×10⁷CFU/尾）组和E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}（注射剂量为2.24×10⁷CFU/尾）组，腹腔注射新鲜培养的野生迟缓爱德华氏菌，进行人工感染试验，试验另设一组注射PBS作为对照组（设两个平行，10尾/平行），各组的注射剂量为1.58×10⁵CFU/尾（37.6倍的LD₅₀剂量）。攻毒后7天统计各组的死亡率，并记算RPS，计算方法同实施例6。

（4）免疫效果评估：攻毒后的第3后，对照组牙鲆全部死亡，攻毒后第7天的统计结果表明，E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}（注射剂量为2.64×10⁷CFU/尾）组的RPS值为（85.0±7.1）%（两平行组的RPS组分别为80%和90%）；E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}（注射剂量为2.24×10⁷CFU/尾）组的RPS值为（70.0±0）%（两平行组的RPS组都为70%）。上述结果表明，本发明的迟缓爱德华氏菌菌株E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}和E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}作为弱毒活疫苗可对牙菱鲆提供较好的免疫保护效果。

迟缓爱德华氏菌E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}和E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}菌株作为活疫苗注射免疫牙鲆

实施例13：迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株抗原注射接种牙鲆时免疫剂量确定的应用方式

迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株以E.tarda^{△EvpCΔEsrB}为例，首先参见实施例7的方法制备该菌株的1×10⁹CFU/mL菌悬液。弱毒活疫苗注射免疫剂量的确定中，选择健康牙鲆，各试验组均设3个平行组，20尾/平行组，对照组注射无菌PBS（pH7.2），4个实验组腹腔注射上述的剂量为1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵和1×10⁴CFU/尾。各组鱼在注射前，均用MS222进行麻醉处理。注射后观察14—30天，实验组中无鱼死亡，视为该实验组所用注射剂量为安全剂量。免疫接种后14—30天后，用10倍LD₅₀剂量的新鲜迟缓爱德华氏菌菌液腹腔注射感染牙鲆。感染后30—60天，统计死亡率，根据各免疫组的RPS值，对E.tarda^{△EvpCΔEsrB}菌株作为弱毒活疫苗腹腔注射免疫接种牙鲆适宜免疫剂量的确定。

上述应用方式中示例用的牙鲆也可为迟缓爱德华氏菌可感染的其他鱼类，所用菌株也可为本发明的E.tarda^ΔEvpC或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}菌株或上述菌株的衍生菌株，免疫接种方式也可以为肌肉注射的方式。采用本发明的迟缓爱德华氏菌弱毒株的菌蜕成分、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上作为抗原加以应用时，其免疫应用中的抗原剂量的确定参考上述方法。

实施例14：迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株浸泡接种黄颡鱼时免疫剂量的确定的应用方式

迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株以E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}为例，首先参见实施例7的方法制备该菌株的1×10⁹CFU/mL菌悬液。弱毒活疫苗浸泡免疫剂量的确定中，选择健康黄颡鱼，各试验组均设3个平行组，20尾/平行组，对照浸泡于无菌PBS（pH7.2）中，4个实验组浸泡弱毒活疫苗的浓度为1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、和1×10⁶CFU/mL，浸泡时间30min—12h。浸泡后观察14—30天，实验组中无鱼死亡，视为该实验组所用浸泡剂量为安全剂量。免疫接种14—30天后，用10倍LD₅₀剂量的新鲜迟缓爱德华氏菌菌液腹腔注射黄颡鱼。感染后30—60天，统计死亡率，根据各免疫组的RPS值，确定E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}菌株作为弱毒活疫苗浸泡免疫接种黄颡鱼的适宜免疫剂量。

本应用方式中示例用的黄颡鱼也可为迟缓爱德华氏菌可感染的其他鱼类，所用菌株也可为本发明的E.tarda^△EvpC或E.tarda^{△EvpCΔEsrB}或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}菌株或上述菌株的衍生菌株，免疫接种也可以采用创伤免疫接种的方式。

实施例15：迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株口服接种日本鳗鲡时免疫剂量确定的应用方式

迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒苗株以E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}为例，首先对健康日本鳗鲡进行随机分组，各试验组设3个平行组，20尾/平行组。试验饲料制备中，对照组的饲料按日本鳗鲡配合饲料配方将各原料粉碎到至60目，逐级混匀后加水搅拌，用适宜孔径的绞肉机制成饲料颗粒，7个试验组的饲料制备方法同上，其中细菌/饲料重量比（g/kg）依次为1×10^-5/1、1×10^-4/1、1×10^-3/1、1×10^-2/1、1×10^-1/1、1/1和10/1。制备的饲料颗粒剪成适宜长度，经自然凉干后贮藏于4℃的冰箱中保存。

免疫实施中，实验各组每天按鱼体体重的3%投喂相应饲料，连续投喂2—7天后，再投喂正常饲料。30天后，各组进行加强免疫一次，方法同上。60天后，对日本鳗鲡腹腔注射10倍LD₅₀剂量的新鲜迟缓爱德华氏菌菌液，进行人工感染试验。感染后14—30天，统计死亡率，计算RPS，并综合抗原制备成本的考虑，进行迟缓爱德华氏菌弱毒株抗原在日本鳗鲡饲料中适宜用量的确定。

上述应用方式中示例中所用菌株也可为本发明的E.tarda^△EvpC或E.tarda^{△EvpCΔEsrB}或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}菌株或上述菌株的衍生菌株，所用的鳗鲡也可为迟缓爱德华氏菌可感染的其他鱼类。

实施例16：迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株与中草药添加剂配伍，免疫牛蛙的应用方式。

迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株以E.tarda^{△EvpCΔEsrB}为例，中草药添加剂以金银花提取物为例。首先参考实施例14、15的方法分别进行弱毒株对牛蛙浸泡及口服（添加于饲料中）免疫接种剂量。免疫实施中，健康牛蛙首先浸泡于含有弱毒株疫苗制剂中2min—12h后取出，14—30天后，连续2—7天投喂含有弱毒疫苗的免疫饲料。口服免疫接种后的14—30天后，再用上述免疫饲料进行加强免疫一次，方法同上。二次口服免疫后30天，对牛蛙腹腔注射10倍LD₅₀剂量的新鲜迟缓爱德华氏菌菌液，进行人工感染试验。感染后14—30天，统计死亡率，RPS值超过60%则视为合格。

上述应用方式中示例所用菌株也可为本发明的E.tarda^△EvpC或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}菌株或上述菌株的衍生菌株，示例所用的中草药添加剂可为单一中草药的单一有效成分、多种有效成分的混合物或粗提取物等，也可为两种或两种以上中草药上述成分的混合物。上述应用方式中也可应用于迟缓爱德华氏菌可感染的其他鱼类。

实施例17：含有迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的多联疫苗，免疫罗非鱼的应用方式

首先制备终浓度均为2×10⁹CFU/mL的鳗弧菌（Vibrio anguillarum）和海豚链球菌（Streptococcus iniae）菌株的灭活疫苗，灭活方法可以采用传统灭活（如福尔马林灭活、热灭活、高压灭活等）的方式。首先将等比例的上述灭活疫苗与弱毒活疫苗混合，配制成三联疫苗，该疫苗中灭活疫苗的终浓度均为10⁹CFU/mL，弱毒活疫苗的终浓度为参见实施例10中方法确定的迟缓爱德华氏菌E.tarda^△EvpC或E.tarda^{△EvpCΔEsrB}或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}菌株或上述菌株的衍生菌株对罗非鱼免疫应用的适宜剂量。免疫实施应用中，罗非鱼腹腔注射100μL制备的三联疫苗，另设一组注射PBS（pH7.2）作为对照组。30天后，免疫组和对照组各随机分成三小组，分别用10倍LD₅₀剂量的新鲜鳗弧菌、嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌菌液，进行人工感染试验，感染采用腹腔注射方式。感染后14—30天，统计死亡率，并计算RPS，感染实验结果中对以上三种菌的任何一种其RPS超过70%，即视为该三联疫苗具有较好的免疫效果。

上述迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株也可不与灭活疫苗混合使用，而单独对鱼进行注射、浸泡、创作或口服免疫，其免疫接种的时间可在灭活疫苗注射接种之前或之后。本实施例的应用方式中也可应用于迟缓爱德华氏菌可感染的其他鱼类。

实施例18：迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株结合促进抗原吸收的透皮性佐剂接种斑点叉尾鮰的应用方式

首先参见实施例11确定迟缓爱德华氏菌E.tarda^△EvpC或E.tarda^{△EvpCΔEsrB}或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}或上述菌株的衍生菌株对斑点叉尾鮰浸泡免疫的接种剂量，再结合安全剂量的可有效促进抗原进入鱼体的透皮性佐剂对鱼进行浸泡免疫接种，上述弱毒活疫苗可与透皮性佐剂同时使用，也可在应用于透皮性佐剂之后。受试鱼在弱毒活疫苗和透皮性佐剂中的浸泡免疫时间为30min—12h，7—14天后，可再上述的弱毒疫苗进行浸泡（30min—12h）或口服（连续投喂含弱毒疫苗的饲料2—7天）的方式进行加强免疫，30—60天后，腹腔注射10倍LD₅₀剂量的新鲜迟缓爱德华氏菌菌液，进行人工感染试验。感染后14—30天，统计死亡率，RPS值超过60%，即视为该免疫方式具有较好的免疫效果。上述示例用斑点叉尾鮰也可以为迟缓爱德华氏菌可感染的其他鱼类。

实施例19：用绿色荧光蛋白标记的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株进行细菌侵染鱼体示踪研究中的应用方式

首先制备本发明的迟缓爱德华氏菌E.tarda^△EvpC或E.tarda^{△EvpCΔEsrB}或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}菌株或上述菌株的衍生菌株的电转化感受态细胞，将绿色荧光蛋白质粒（GFPuv）电转化入上述新鲜感受态细胞中，加入新鲜LB液体基，180r/min，培养约50min后，涂布含有Amp（100μg/mL）的LB固体平板，28℃静置过夜培养，筛选并确认含有GFPuv质粒的阳性克隆。将健康的大菱鲆浸泡于上述绿色荧光标记的菌液（浓度为1×10⁸CFU/mL）30min—12h后，移入海水中正常饲养。细菌在鱼体各组织中的侵染定植研究中，取样时间为移入海水后的30min、1h、5h、12h、24h、48h、72h和120h，每次取鱼3尾。首先进行尾静脉采血0.1mL，然后分别取皮肤、鳃、肝脏和肠道各约0.1g。血样直接涂布含Amp（100μg/mL）的TSA平板，其它样品加适量的无菌PBS加以研磨，样品悬液10倍比稀释后，涂布含Amp（100μg/mL）的TSA平板。上述平板置于28℃静置过夜培养后，进行细菌计数。组织学研究中，取皮肤、鳃、肝脏和肠道组织各一份置于戴维森氏AFA（Davidson's AFA）固定液中，进行组织切片的观察。

综合上述结果，进行迟缓爱德华氏菌弱毒株侵染鱼体示踪的分析研究。上述示例用大菱鲆也可以为迟缓爱德华氏菌可感染的其他鱼类。

实施例20：用迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株作为活疫苗载体构建多效价疫苗的应用方式

首先参见实施例10的方法确定迟缓爱德华氏菌E.tarda^△EvpC或E.tarda^{△EvpCΔEsrB}或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}菌株或上述菌株的衍生菌株作为活疫苗的应用剂量，以此作为活疫苗载体。以此为基础，在体外重组构建一个可在上述弱毒株中进行高效表达并能稳定遗传的质粒，该质粒携带有一种或多种其他鱼类病原的保护性抗原基因。再将该质粒转化入弱毒株中，即完成携带外源抗原的活疫苗载体菌株的构建。利用该活疫苗载体菌株作为多价疫苗即可对受试鱼实施免疫接种，接种方式可以是注射、口服、浸泡或创作方式，随着菌株在鱼体内的生长繁殖，迟缓爱德华氏菌的自身抗原及表达的外源抗原即可提呈给宿主免疫系统，刺激机体产生高效的免疫应答，从而达到多效价疫苗的目的。在免疫效果评估中，可用野生迟缓爱德华氏菌和与携带的外源抗原对应的病原，对鱼体分别或同时进行人工感染实验，30天后，计算RPS。注射免疫接种方式中，对其中的任一种病原的RPS达到70%，其他接种方式中，RPS超过60%，即视为合格。

上述构建的多价疫苗也可应用于包括虾蟹等在内的甲壳类动物的免疫接种中，所构建的质粒携带有一种或多种甲壳类病原的保护性抗原基因，免疫评估的方法同上。

实施例21：迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株作为载体系统的基因工程菌的构建方式

首先确定迟缓爱德华氏菌E.tarda^△EvpC或E.tarda^{△EvpCΔEsrB}或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}菌株或上述菌株的衍生菌株在应用中的安全剂量范围。另构建携带外源基因，并可在上述弱毒株中无抗生素选择压力条件下也可稳定遗传的质粒。将该质粒转化入上述弱毒株中，即完成以迟缓爱德华氏菌弱毒株作为载体系统的基因工程菌株。所构建的基因工程菌在应用中，根据不同的科学研究或实际需要对受试生物进行接种，其接种方式可采用注射、口服、浸泡或创伤方式。

实施例22：用迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株作为益生菌的应用方式

迟缓爱德华氏菌弱毒株以E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}为例，首先参见实施例13的方法确定浸泡接种大菱鲆的适宜剂量，浸泡时间为30min—12h，第14天后，再重复浸泡一次，时间同上。每次浸泡后的连续7—14天，进行鱼体不同消化器官中迟缓爱德华氏菌的分布及定量分析。第30天，用除迟缓爱德华氏菌之外的病原微生物（如鳗弧菌或大菱鲆虹彩病毒等）进行浸泡攻毒。实验中另设对照组。感染后14—30天，统计死亡率，根据各免疫组的RPS值，结合上述细菌在各消化器官的定量分析结果，进行E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstB}菌株作为益生菌对大菱鲆免疫保护效果的评估。

上述应用方式中示例用的大菱鲆也可为迟缓爱德华氏菌可感染的其他鱼类，所用菌株也可为本发明的E.tarda^ΔEvpC、E.tarda^{△EvpCΔEsrB}或E.tarda^{△EvpCΔEsrBΔPstC}菌株及其上述菌株的衍生菌株，免疫接种方式也可以为注射（肌肉或腹腔）、创伤或口服的方式。

Claims (19)

1.迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其应用，其特征是迟缓爱德华氏菌的Ⅵ型分泌系统毒力蛋白基因EvpC丧失功能的菌株（E.tarda^ΔEvpC株），包括此菌株的衍生菌株。

2.如权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于该弱毒株与野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株相比，存在引起EvpC基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入，即存在引起与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。

3.如权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tarda^△EvpC的毒力不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/40，其对鱼的半致死量至少需要1×10⁵cfu/g(菌落形成单位/鱼体重)。

4.如权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于E.tarda^ΔEvpC株Ⅲ型分泌系统的调节蛋白基因EsrB丧失功能的菌株（E.tarda^ΔEvpCΔEsrB株），包括此菌株的衍生菌株。

5.如权利要求4所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tarda^ΔEvpCΔEsrB株存在引起E.tarda^ΔEvpC株的EsrB基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入，即存在引起除了与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相同或相近的序列之外，还有与SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。

6.如权利要求4所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tarda^{△EvpCΔEsrB}毒力不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/400，其对鱼的半致死量至少需要1×10⁶cfu/g（菌落形成单位/鱼体重）。

7.如权利要求4所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于在E.tarda^ΔEvpCΔEsrB株的PST操纵子系统基因PstB丧失功能的菌株（E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}株），包括此菌株的衍生菌株。

8.如权利要求7所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}株存在引起E.tarda^ΔEvpCΔEsrB株的PstB基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入，即存在引起除了与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4相同或相近的序列之外，还有与SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。

9.如权利要求7所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstB}株毒力不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/4000，其对鱼的半致死量至少需要1×10⁸cfu/g（菌落形成单位/鱼体重）。

10.如权利要求4所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于在E.tarda^ΔEvpCΔEsrB株的PST操纵子系统基因PstC丧失功能的菌株（E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstC}株），包括此菌株的衍生菌株。

11.如权利要求10所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstC}株存在引起E.tarda^ΔEvpCΔEsrB株的PstC基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入，即存在引起除了与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4相同或相近的序列之外，还有与SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。

12.如权利要求10所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tarda^{ΔEvpCΔEsrBΔPstC}株毒力不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/4000，其对鱼的半致死剂量（LD₅₀）至少需要1×10⁸cfu/g（菌落形成单位/鱼体重）。

13.如权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的应用，其特征在于上述迟缓爱德华氏菌弱毒株可作为疫苗菌株、基因工程菌株、有益菌株等应用。

14.如权利要求13所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的应用，其特征在于该弱毒株作为的疫苗菌株的应用，可以是使用该弱毒株的活菌，也可以使用该弱毒株的灭活菌、菌蜕成分、部分抗原；可以制备源于该弱毒株的单一疫苗，可以制备该菌株与源于其他病原的联合疫苗，也可以将制备的单一或联合疫苗再添加佐剂生产疫苗产品，还可以是将弱毒株作为表达外源抗原的活菌载体的疫苗应用。

15.如权利要求14所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的应用，其特征在于所生产的疫苗可采用浸泡免疫、口服免疫、创伤免疫和注射免疫等免疫接种方式。

16.如权利要求14所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的应用，其特征在于注射免疫接种时，可采用腹腔或肌肉注射两种方式，使用的剂量为10⁴—10⁷cfu/g(菌落形成单位/鱼体重)；创伤免疫或浸浴免疫接种时，浸泡水体中活疫苗的浓度为10⁶—10⁹cfu/mL(菌落形成单位/浸泡体积)，浸泡时间2min—12h；口服免疫接种时，配合饲料中活疫苗的添加剂量为10⁶—10⁹cfu/g(菌落形成单位/饲料重量)，连续投喂2—7天。

17.如权利要求14所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的应用，其特征在于免疫接种的对象包括海水养殖鱼类、半咸水养殖鱼类、洄游鱼类、淡水养殖鱼类、观赏鱼类和淡水养殖的两栖类和爬行类，用于预防经免疫接种的水生动物发生爱德华氏菌病。

18.如权利要求13所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的应用，其特征在于该弱毒株可以作为基因工程菌株的应用，可以在质粒转化、噬粒转染、外源基因整合、DNA疫苗等方面所需的基因工程菌株，在克隆特定的核酸序列，表达特定基因编码的外源蛋白、多肽，转录特定基因编码的单链或双链RNA等方面获得应用。

19.如权利要求13所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的应用，其特征在于该弱毒株作为有益菌株的应用，可以作为陆生动物或水生动物肠道、体表定植或体内暂存的益生菌，用于刺激动物非特异性免疫力的提高或抑制致病微生物的存在与繁殖。