CN103255089A - 一株强毒迟缓爱德华氏菌疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)菌株及其应用方法，该菌株分离自大菱鲆成鱼体中，是一种具有较强毒力的野生菌株，其保藏编号为：CGMCC No.7197。该菌株抗原的制备方式包括灭活菌体、菌蜕成分、减毒菌株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上；生产的疫苗可以是使用该菌株制备的抗原的单一成分，也可以使用该菌株制备的抗原与其他细菌的抗原混合生产联合疫苗，也可以将制备的单一或联合疫苗的抗原添加佐剂生产疫苗；免疫应用中疫苗的接种方式可以采用注射免疫、创伤免疫、浸浴免疫或口服免疫。

Description

一株强毒迟缓爱德华氏菌疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉水产养殖动物的微生物学及免疫学领域，具体涉及一株迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)菌株1101及其应用。

背景技术

迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)由Hoshina(1962)首次从鳗鲡(Anguillajapanica)中分离，是革兰氏阴性短杆菌，菌体大小约1μm(直径)×2-3μm(长度)，兼性厌氧，与鲇鱼爱德华氏菌(E.ictaluri)和保科爱德华氏菌(E.hoshinae)同属于肠杆菌科爱德华氏菌属。迟缓爱德华氏菌对多种鱼类具有致病性，已报道可感染的鱼类有：斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、大口黑鲈(Micropterus salmoides)、鳗鲡(A.japonica)、鲻鱼(Mugil cephalus)、犁齿鲷(Evynnis japonica)、罗非鱼(Tilapia nilotica)、奇努克鲑鱼(Oncorhynchus tshawytscha)、红鲷(Chrysophrys major)、五条魳(Seriolaquinqueradiata)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、海鲈(Moronesaxatilis)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)、胡鲶(Clarias batrachus)、锦鲤(Anabastestudineus)、欧洲鳗(Anguilla anguilla)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、丝足鱼(Trichogaster trichopterus)、地图鱼(Astronotus ocellatus)、剑尾鱼(Xiphophorushelleri)和斑马鱼(Danio rerio)等。该菌株另也有感染两栖类(蟾蜍、牛蛙等)、爬行类(蜥蜴、蛇、海龟、中华鳖等)、鸟类(企鹅、秃鹰、鸵鸟及一些水鸟等)、哺乳类(海狮、海牛、猪、狗、牛、猴子等)的报道。除以上动物外，该菌株可感染人类，引起人的肠胃炎、流行性腹泻和败血症等症状。该菌呈世界性分布，普遍存在于淡水和海水环境中，主要分布在中国、澳大利亚、日本、印度、以色列、马来群岛、美国、巴拿马等热带和亚热带国家和地区，该菌是当前水产养殖业中的有着极大危害的病原菌之一。以往采用抗生素和化学药物等方法进行预防或治疗，会带来诸多问题，如病原的耐药性、药物残留、食品安全及环境污染等问题。近年来，通过发展疫苗免疫技术为基础的综合防控技术体系来达到病害控制已被许多国家认可。

相对其他常规致病细菌，迟缓爱德华氏菌具有以下两个特点。首先，迟缓爱德华氏菌菌株的血清型众多，且目前对该病原的血清分型尚没有统一标准。Sakazaki(1967)等对256株迟缓爱德华氏菌的抗原结构进行了分析，认定有17个O抗原群和11个H抗原群。Park(1983)等对从鳗鱼中分离的445株迟缓爱德华氏菌进行了O抗原凝集分析，其中有270株被认为属于不同4个血清群，即A、B、C、D四个血清型，其中主要从肾脏中分离所得的血清型A的致病力最强。此外，迟缓爱德华氏菌是一种胞内寄生菌，已有报道证实该病原可在机体的上皮及巨噬细胞等细胞中生长并繁殖，具有多种逃避机体的免疫杀伤的性能(Janda等，1991和1995；Strauss等，1997等；Ling等，2000；Rao等，2001；Okuda等，2006)。以上两点，给该病原疫苗开发带来了一定的困难，但多年来，科技工作者仍然做了大量的工作进行迟缓爱德华氏菌不同种类的疫苗的研究尝试，并取得了一定的成果。

上世纪90年代以来，国内外就开展了许多迟缓爱德华氏菌疫苗的研究工作，不同学者采用各自分离的迟缓爱德华氏菌菌株制备的灭活疫苗所产生的免疫保护力存在相当大的差异。Gutierrez和Miyazaki(1994)用福尔马林灭活的迟缓爱德华氏菌SH-89133菌株注射免疫日本鳗的相对保护率(RPS)仅为12.5-25％；Sun等(2011)报道用迟缓爱德华氏菌TX1菌株的福尔马林灭活疫苗免疫牙鲆的RPS只有33.3％；Hossain等(2011)进行多种灭活方法制备迟缓爱德华氏菌V-1菌株的免疫原性的比较，其中采用福尔马林灭活疫苗通过腹腔注射日本鳗后，其RPS为56％。

近年来，迟缓爱德华氏菌的减毒疫苗研究也在国内外广泛开展，不同研究者采用各自分离的迟缓爱德华氏菌菌株进行基因敲除，其中一些成果已形成专利。如莫照兰等(2007，2009)的两项发明(200710015285.6和200910164591.5)，以野生迟缓爱德华氏菌强毒株LSE40为基础，进行了EsrB、AroA基因缺失突变株的构建，分别获得了两株单基因缺失和一株双基因缺失的弱毒疫苗株；张元兴等(2009)的发明(200910052707.6)和王启要等(2010)的发明(201010541646.2)公开了以迟缓爱德华氏菌强毒菌株EIB202为基础，进行AroC、EseB等三型分泌系统效应元件基因及内源性质粒缺失的突变株构建，获得了两株迟缓爱德华氏菌弱毒疫苗株。文献报道中，有学者进行了迟缓爱德华氏菌基因缺失突变株的弱毒活疫苗的初步应用实验，如Xiao等(2011)等用构建的14株上述迟缓爱德华氏菌EIB202菌株的基因缺失突变株，肌肉注射免疫斑马鱼，其中的ΔAroCΔEsrC等2株双基因缺失突变株和ΔAroCΔEseBCDΔEsaC多基因缺失突变株具有较好的免疫保护效果，其RPS值为71.3-81.0％。以上结果也说明针对野生型强致病性迟缓爱德华氏菌为基础的减毒活疫苗株的开发应用目前已得到了相当的重视。迟缓爱德华氏菌基因缺失突变株的报道也表明，即使对该病原的同一基因进行敲除，所获得不同菌株的基因缺失突变株半致死剂量(LD50)也有着不同的数值，如Tan等(2005)和上述的Mo等(2007)分别对PPD130/91和LSE40菌株进行了EsrB基因的敲除，所获的这两株单基因缺失突变株表现出约2倍的LD50的差异。

抗原的免疫原性对疫苗的免疫效果起着决定性的作用，不同菌株的种株特性是导致菌株差异的重要原因，这也直接对菌株保护性抗原的免疫原性产生影响。目前，对迟缓爱德华氏菌的菌株之间的差异性研究较少，但已有资料表明该病原在遗传性、致病性及结构上存在较大差异。遗传性方面，生物信息学的分析结果表明，迟缓爱德华氏菌1101菌株的16S-23S区间的碱基序列，与NCBI上已公布的FL6-60等6株迟缓爱德华氏菌有着较大的差异，其同源性在93.2-97.2％之间。已有的报道也证实该病原的鞭毛蛋白存在着一定的遗传差异性。如Okuda等(2007)研究中通过比较了不同来源的运动性和非运动性迟缓爱德华氏菌的两种FliC鞭毛蛋白，发现两者存在22个氨基酸的差异；Jiao等(2009)用迟缓爱德华氏菌TX1菌株的FliC鞭毛蛋白基因(GenBank：FJ971660.1)进行了DNA疫苗的研究，经分析该FIiC基因序列与已报道的EIB202等9株迟缓爱德华氏菌株的相应序列的同源性在95-99％范围内。致病性方面，不同菌株间的差异较大，如Tan等(2002)在一项不同来源的迟缓爱德华氏菌胞外蛋白的蛋白组学比较分析研究中，以丝足鱼为模式动物，进行了包括AL92448菌株等8株弱毒株和AL9379菌株等6株强毒株在内的不同宿主中分离的迟缓爱德华氏菌的致病性比较，结果表明以上14株强弱毒株的LD₅₀之间的最大差异竟可达到10000倍；经测试，迟缓爱德华氏菌菌株1101的致病力对海淡水鱼类的致病力在1.0×10²-9.9×10³CFU/g(菌落形成单位/鱼体体重)范围。一些天然野生菌株因其致病性弱，已有学者尝试将其作为弱毒活疫苗加以应用，孙黎等(2009)的发明(200910230546.5)公开了一种以非致病性的迟缓爱德华氏菌ATCC 15947菌株作为迟缓爱德华氏菌疫苗株的应用，该菌株的LD₅₀是典型致病性迟缓爱德华氏菌的50-500倍；Takano等(2010)对日本鳗中分离的5株迟缓爱德华氏菌弱毒株作为活疫苗的免疫效果进行了比较，腹腔注射牙鲆后，其中E22菌株具有相对较好的免疫效果，其RPS可以达到45％。结构差异上，迟缓爱德华氏菌通常都具有周生鞭毛，但Lan等(2007)报道了一株分离自患病大菱鲆中的无鞭毛且具有致病性的迟缓爱德华氏菌菌株LTB-4。上述迟缓爱德华氏菌疫苗报道中针对不同菌株采用相同灭活方法以及相同基因缺失突变后，疫苗的免疫保护效果的差异也应受到这种菌株间的存在的已知及未知差异的影响。

总体来说，与其他一些水生动物病原菌相比，研究人员在迟缓爱德华氏菌疫苗的研究中所遇到的困难似乎要大得多，许多研究人员不论采用灭活技术、基因工程技术(DNA疫苗等)、蛋白表达及纯化技术(亚单位疫苗)，还是基因敲除的减毒技术，在迟缓爱德华氏菌的疫苗研究中都遇到过大大小小的疫苗保护力偏低的问题。意识到病原材料的具体种株是疫苗研制的关键要素，我们从分离到的多株迟缓爱德华氏菌中选择了迟缓爱德华氏菌1101菌株作为疫苗开发候选株，该菌株分离自海水养殖鱼类大菱鲆成鱼体中，是一种具有较强毒力的野生菌株，其保藏编号为：CGMCC No.7197，实验中用该菌株制备的不论制备的灭活疫苗还是减毒疫苗都能获得60％以上的免疫保护力，这一结果说明迟缓爱德华氏菌1101菌株具有迟缓爱德华氏菌的免疫保护性抗原，具备适宜用于制备疫苗的能力及疫苗开发的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种迟缓爱德华氏菌疫苗株及其应用方法，该菌株可用于该病原不同类型疫苗抗原的制备及其免疫技术中的应用。

本发明所涉及的菌株信息如下：迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)菌株1101，该菌株最初分离自山东海阳市一海水养殖场海水养殖鱼类大菱鲆(Scophthalmus maximus)成鱼体中，是一种具有较强毒力的野生菌株，采用注射攻毒测试方法，对海淡水养殖鱼类的半数致死量(LD₅₀)在1.0×10²-9.9×10³CFU/g(菌落形成单位/鱼体体重)的范围，菌株的分类命名为：迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)；于2013年1月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；保藏编号为：CGMCC No.7197；保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

迟缓爱德华氏菌菌株1101可培养于Luria-Bertani(LB)、胰大豆蛋白胨培养基(TSB)或2216E海水培养基，培养方法如下：从-80℃保存的菌种中挑取少量划线于上述培养基的固体平板，培养温度范围为28-37℃。该菌在2216E琼脂平板中，28℃培养48h后可形成直径小于0.5mm的白色细小菌落；在TSB和LB琼脂平板中，37℃培养36h后可形成直径约0.5mm的微黄色圆形菌落。取上述单菌落接种于上述培养基的培养液中，28-37℃，180r/min摇瓶培养至OD₆₀₀为0.5-0.6，即可获得该菌株的新鲜菌液。迟缓爱德华氏菌菌株1101的抗原包含针对爱德华氏菌的保护性抗原，经实验证实，该保护性抗原具有良好的免疫原性和高度保守性，对爱德华氏菌的感染具有良好的免疫保护作用，其抗原经不同方法制备后适用于生产爱德华氏菌疫苗，抗原的制备方法可以采用灭活菌体、菌蜕成分、减毒菌株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上。其中涉及活疫苗的抗原在免疫应用中，应事先进行充分的安生性评估，以确定其免疫应用中的安全性；生产的疫苗可以是使用该菌株制备的抗原的单一成分，也可以使用该菌株制备的抗原与其他细菌的抗原混合生产联合疫苗，也可以将制备的单一或联合疫苗的抗原添加佐剂生产疫苗；生产的疫苗可以采用注射免疫、创伤免疫、浸浴免疫和口服免疫等免疫接种方式。

抗原的剂量与免疫效果密切相关，剂量过低，不能诱导足够强的免疫应答，剂量过高，也可能会导致机体的免疫耐受，另外，抗原在应用中也应考虑诸如动物生长阶段、抗原种类、疫苗剂型及接种次数等因素对其剂量需求的影响。因此，在实际免疫应用中，抗原的有效剂量的范围，应根据实验数据来进行确定。本发明的迟缓爱德华氏菌菌株1101制备的灭活疫苗注射免疫接种时，可采用腹腔或肌肉注射两种方式，使用的剂量为10⁴-10⁸CFU/g(菌落形成单位/鱼体体重)；创伤免疫(即将受免疫鱼体表进行无菌人工轻微创伤处理，增强鱼体对抗原的吸收)或浸浴免疫接种时，浸泡水体中灭活疫苗的浓度为10⁵-10⁹CFU/mL(菌落形成单位/浸泡水体体积)，浸泡时间2-60min；口服免疫接种时，灭活疫苗可添加于配合饲料中，配合饲料中的10⁵-10¹⁰CFU/g(菌落形成单位/饲料重量)，连续投喂14-30天。以上灭活疫苗在使用中，也可根据实际情况对受免疫鱼实施加强免疫2-3次，两次免疫的时间间隔为14-30天。

本发明的迟缓爱德华氏菌菌株1101，其所制备疫苗抗原可应用于鱼类、两栖类和爬行类的免疫接种，包括海水养殖鱼类(如牙鲆、大菱鲆、半滑舌鳎、石斑鱼、鲈鱼、真鲷、军曹鱼、大西洋鲑、河纯等)、半咸水养殖鱼类(如罗非鱼、虹鳟、鲻鱼等)、洄游鱼类(如鳗鲡、小黄鱼等)、淡水养殖鱼类(如青鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲤鱼、鲫鱼、鲶鱼、鳜鱼、鲟鱼、澳洲宝石鲈等)、观赏鱼(如金鱼、锦鲤等)、两栖类(如牛蛙、大鲵等)和爬行类(如鳖、龟、蛇等)的疫苗接种。不同的水生动物的抗原的免疫剂量有所不同，对于特定水生动物及特定抗原的在使用中的具体剂量，应该进行单独测试。

本发明的积极效果在于：本发明找到了具有较高毒力的迟缓爱德华氏菌菌株1101，该菌株的抗原包含针对爱德华氏菌的保护性抗原，适合用于制备爱德华氏菌的各类疫苗抗原，用1101菌株制备的疫苗可通过注射、浸泡或口服途径对爱德华氏菌感染具有良好的免疫保护作用，适于用作疫苗的生产和应用。迟缓爱德华氏菌对多种抗生素的抗药性较强，本发明所涉及的迟缓爱德华氏菌1101菌株的特征使其具有针对爱德华氏菌疫苗的开发应用价值，其疫苗产品可对养殖鱼类的爱德华氏病进行有效安全预防，降低水产养殖业中因病害所导致的损失，减少或消除由于爱德华氏菌病发生所致的消毒剂、抗生素等化学药物的滥用，显著提高水产养殖动物及其产品的安全，以及病原菌抗药性增加所带来的生物安全风险。

附图说明

图1.是迟缓爱德华氏菌菌株1101的16SrRNA序列系统发育树。

图2.是迟缓爱德华氏菌菌株1101的16S-23S rRNA区间序列系统发育树。

具体实施方式

实施例1：从大菱鲆中分离迟缓爱德华氏菌菌株1101的分离

挑选出患出血病症状典型的濒死大菱鲆，用70％酒精棉球对病鱼体表进行消毒，用无菌剪刀剪开腹腔并取出病鱼肝、肾、脾等组织小块(约0.2×0.2×0.2cm³)于1mL无菌离心管中，在超净工作台上用无菌PBS(pH7.2)反复冲洗，用接种环蘸取上述病灶组织，划线接种于添加2％琼脂的海水2216E培养基(酵母提取物1g，胰化蛋白胨5g，FePO₄0.1g，海水定容至1L，pH7.6-7.8)，28℃培养24-48h，从平板上挑取优势菌落中的单菌落，再次进行平板划线，进行纯化培养。纯化后的菌落可进行细菌形态特征，生理生化特性检测及分子生物学的鉴定。

实施例2：迟缓爱德华氏菌菌株1101的培养

迟缓爱德华氏菌菌株1101可培养于LB培养基(胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，去离子水定容至1L，pH7.0)、TSB培养基(北京陆桥技术有限责任公司)或2216E培养基(根据培养基成分中海水的有无，该培养基分为两种，其一：同实施例1；其二：酵母提取物1g，胰化蛋白胨5g，FePO₄0.1g，NaCl 34g，去离子水定容至1L，pH7.6-7.8)，上述培养基的固体平板的配制中则需要另外添加2％琼脂。菌株培养方法如下：从-80℃保存的菌种中挑取少量划线于上述培养基的固体平板，在28-37℃培养24-48h，即可在平板上获得单克隆菌落，取一单菌落接种于上述培养基的培养液中，28-37℃，180r/min摇瓶培养至OD₆₀₀为0.5-0.6，即可获得该菌株的新鲜菌液。

实施例3：迟缓爱德华氏菌菌株1101的生理生化特征

迟缓爱德华氏菌菌株1101的生理生化试验，参照API20E(法国梅里埃公司)自动鉴定卡使用说明进行鉴定，结果用Apilab plus3.3.3软件进行分析。另附加氧化酶试验，并按东秀珠等(2001)所述测定生理生化方法进行补充鉴定。

试验结果表明氧化酶阴性，API20E自动鉴定卡鉴定结果如表1所示，显示菌株1101为迟缓爱德华氏菌，可信度为99％。

表1迟缓爱德华氏菌1101菌株API20E生化鉴定结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性

实施例4：迟缓爱德华氏菌菌株1101药敏试验

采用纸片扩散法，将培养24h的迟缓爱德华氏菌菌株1101以无菌海水鱼用生理盐水从固体平板上洗下，制成1.5×10⁸CFU/mL的菌悬液，取80μL菌悬液涂布于TSB培养基平板，用无菌镊子将抗生素纸片(杭州微生物试剂有限公司)贴在平板表面，28℃恒温培养48h后观察抑菌圈直径的大小。试验结果见表2所示。

表2迟缓爱德华氏菌菌株1101药敏试验结果

注：R＝耐药，I＝中介，S＝敏感

以上结果表明在所试的16种药物中，该菌株对大多数药物有着不同程度的耐药性，但其中多粘菌素、利福平、庆大霉素对该菌表现出具有一定的抑菌作用。迟缓爱德华氏菌菌株1101的药敏谱表现出该菌株部分遗传特征，该菌株对大多数抗生素存在抗性，反映了抗生素的滥用已经使多数抗生素不能用于迟缓爱德华氏菌病的治疗，迟缓爱德华氏菌疫苗的研发和生产对水产养殖产业来说十分迫切。

实施例5：基于迟缓爱德华氏菌菌株1101的16S rRNA基因的PCR扩增及其序列分析

(1)细菌DNA的制备：细菌样品DNA的制备采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)进行DNA提取。

(2)PCR扩增：采用细菌16S rRNA基因的通用引物(27F/1492R)进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下：

上述的反应体系中的(Version 2.0)购自Takara生物工程有限公司。PCR扩增反应程序：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min 30s，35个循环；72℃延伸8min，1个循环。所获DNA片段用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(Zymo，美国)进行纯化后，由生工生物工程(上海)有限公司进行DNA测序。

(3)系统发育学分析：考虑测序中，荧光染料的干扰可导致引物3’端后面的几十个碱基不一定能够准确判读的因素，实际序列比对中，对所获得的测序序列(1446bp)起始和末尾的20bp碱基进行了去除，对剩下的1406bp碱基的序列(SEQ ID NO：1)在NCBI上进行同源性检索，从中选取17个相关菌株的16S rRNA基因序列，采用Clustalx(1.83)软件进行多序列比对，进一步采用MEGA 4软件的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发生树(见图1)。

结果表明1101菌株与迟缓爱德华氏菌聚类，与爱德华菌属的另两种菌，即鲇鱼爱德华氏菌和保科爱德华氏菌均无聚类。其中与CP001135.1等9株迟缓爱德华氏菌16S rRNA基因同源性相似性在99.9％-100％之间，结合着实施例3中的菌株1101的生理生化特征结果，可准确地将菌株1101鉴定为迟缓爱德华氏菌。

实施例6：基于迟缓爱德华氏菌菌株1101的EsrB基因的PCR扩增及其序列分析

(1)细菌DNA的制备：同实施例5。

(2)PCR扩增：根据迟缓爱德华氏菌(GenBank：CP001135.1)的序列，设计用于扩增EsrB基因的引物，引物序列如下：

EsrB-F：5’-GAT GCC GAT GCC AGA CAA-3’

EsrB-R：5’-AAA GCC CGC AGC AAA CC-3’

PCR扩增反应体系参见实施例5。PCR方法反应程序：94℃预变性4min，1个循环；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸5min，1个循环。所获DNA片段用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(Zymo，美国)进行纯化后，按天根生化科技(北京)有限公司的pGM-T克隆试剂盒使用说明要求与载体pGM-T连接，并转化入大肠杆菌DH5d感受态菌株中，并用通用RV-M/M13-47引物进行阳性克隆菌株的筛选验证，阳性菌株由生工生物工程(上海)有限公司进行DNA测序。所获测序DNA序列(SEQ ID NO：2)进行了系统发育学分析，结果表明380bp碱基的扩增序列具备了迟缓爱德华氏菌菌株1101的EsrB基因的特征。

实施例7：基于迟缓爱德华氏菌菌株1101的H1yB基因上游序列的PCR扩增及其序列分析

(1)细菌DNA的制备：同实施例5。

(2)PCR扩增：根据迟缓爱德华氏菌(GenBank：CP001135.1)的序列，设计用于扩增H1yB基因上游序列的引物，引物序列如下：

H1yB-F：5’-CAAGATTAGCGCATCCTTTG-3’

H1yB-R：5’-CGGCGTATTGTCCCAGAA-3’

PCR扩增反应体系参见实施例5。PCR方法反应程序：94℃预变性4min，1个循环；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min，1个循环。所获PCR产物经实施例6中的相同步骤，最终获得DNA序列(SEQ ID NO：3)，系统发育学分析结果表明该590bp碱基的扩增序列具备了迟缓爱德华氏菌H1yB基因上游序列的特征。

实施例8：基于迟缓爱德华氏菌菌株1101的16S-23S rRNA基因区间序列的PCR扩增及其序列分析

(1)细菌DNA的制备：同实施例5。

(2)PCR扩增：根据迟缓爱德华氏菌(GenBank：CP001135.1)的序列，设计用于扩增包括16S-23S rRNA基因区间在内的核苷酸序列(1090bp)的引物，引物序列如下：

16S-23S-F：5’-CCCTTATCCTTTGTTGCC-3’

16S-23S-R：5’-TTTCCAGACGCTTCCAC-3’

PCR扩增反应体系参见实施例5。PCR方法反应程序：94℃预变性6min，1个循环；94℃变性20s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸6min，1个循环。PCR产物由生工生物工程(上海)有限公司进行DNA测序，参见实施例5的方法，对所获序列中相应的16S-23S rRNA基因区间的354bp碱基序列(SEQ ID NO：4)进行了系统发育学分析及系统发育树构建(见图2)，结果表明迟缓爱德华氏菌菌株1101的该区间序列与NCBI上已公布的FL6-60(GenBank：CP002154.1)等6株迟缓爱德华氏菌的序列具有较大的差异性，其同源性相似性在93.2％-97.2％之间。

实施例9：迟缓爱德华氏菌菌株1101对斑马鱼半致死剂量(LD₅₀)测定

(1)迟缓爱德华氏菌菌株1101的培养：将对数生长期的迟缓爱德华氏菌1101(约1×10⁵CFU/mL)以1∶100的比例接种至TSB液体培养基中，28℃恒温培养箱，180rpm振荡培养5h，6000rpm，4℃离心10min收集菌体，以无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤菌体三次，并用PBS重悬菌体，制成1×10⁹CFU/mL菌悬液。

(2)试验鱼饲养及管理：选用健康斑马鱼(0.32±0.08)g，置于斑马鱼养殖设备(上海海圣水族设备厂)中，水温为(28±1)℃。每日灯光照明12h。试验期间按鱼体重3％投喂配合饲料日投喂2次，定期对滤网进行清洗消毒，试验前暂养2周。斑马鱼注射前用MS222(1∶10000稀释)进行浸泡麻醉处理。

(3)试验分组：将新鲜培养的菌液(1×10⁹CFU/mL)用PBS(PH7.2)10倍系列稀释，分为7组，另设一组注射PBS作为对照组。每组斑马鱼30尾，置于10L槽内，经MS222麻醉后，各组分别腹腔注射10μL的10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²CFU/mL及PBS(pH7.2)，实验重复3次。

(4)统计与分析：实验观察4周，各组斑马鱼死亡数见表3。实验中对各组中濒死鱼随机取1-3尾，浸泡于MS222(1∶5000)过量麻醉致死后，加入适量TSB匀浆后涂布EIM培养基(Edwardsiella Ictaluri Medium，北京陆桥技术有限责任公司定制)，28℃培养48h，参照Pressley等(2005)的方法进行斑马鱼感染迟缓爱德华氏菌致死认定。迟缓爱德华氏菌菌株1101对斑马鱼的LD₅₀的计算方法采用Reed-Muench法。

表3迟缓爱德华氏菌菌株1101对斑马鱼LD₅₀实验死亡鱼记录表

试验期间对照组中斑马鱼无死亡，斑马鱼为迟缓爱德华氏菌菌株1101感染至死。3次LD₅₀重复实验结果分别为2.27×10³CFU/g、1.82×10³CFU/g和1.69×10³CFU/g，即迟缓爱德华氏菌1101菌株对斑马鱼LD₅₀剂量为(1.93±0.30)×10³CFU/g，该数值表明迟缓爱德华氏菌菌株1101对斑马鱼具有强致病性。

实施例10：迟缓爱德华氏菌菌株1101对大菱鲆LD₅₀测定

(1)迟缓爱德华氏菌菌株1101的培养：同实施例9。

(2)试验鱼饲养及管理：健康大菱鲆(3.6±1.2g)，置于10L水槽中，水温为17±1℃。每日换水，清污2次，投喂2次，每天配合饲料投喂量为鱼体重的3％。实验前暂养2周。

(3)试验分组：将新鲜培养的菌液(1×10⁹CFU/mL)用PBS(pH7.2)10倍系列稀释，分为8组，另设一组注射PBS作为对照组。每组10尾，经MS222麻醉后，各组分别腹腔注射100μL的10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²CFU/mL及PBS(pH7.2)，实验重复2次。

(4)统计与分析：实验观察14天，各组大菱鲆死亡数见表4。濒死大菱鲆浸泡于MS222过量麻醉致死后，参见Pressley等(2005)的方法取内脏组织用于大菱鲆感染迟缓爱德华氏菌致死认定。迟缓爱德华氏菌1101菌株对大菱鲆的LD₅₀的计算方法采用Reed-Muench法。

表4迟缓爱德华氏菌菌株1101对大菱鲆LD₅₀实验死亡鱼记录表

试验期间对照组中大菱鲆鱼无死亡，大菱鲆为迟缓爱德华氏菌菌株1101感染至死。2次LD₅₀重复实验结果分别为3.46×10²CFU/g和2.78×10²CFU/g，即迟缓爱德华氏菌菌株1101对大菱鲆LD₅₀剂量为(3.12±0.48)×10²CFU/g，该数值表明迟缓爱德华氏菌菌株1101对大菱鲆具有强致病性。

实施例11：弗氏不完全佐剂与灭活迟缓爱德华氏菌菌株1101疫苗配伍免疫罗非鱼的应用方式

用福尔马林制备迟缓爱德华氏菌1101菌株2×10⁸CFU/mL灭活疫苗，将等量的疫苗与弗氏不完全佐剂(Freund’s Adjuvant Incomplete，Sigma)分别吸入两个无菌注射器内，两注射器之间以无菌胶管相连，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。制备好的乳化剂滴入冷水中，乳滴若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即视为合格。腹腔注射用MS222(1∶9000)进行浸泡麻醉处理后的大菱鲆，接种剂量为100μL/尾，移入新鲜海水中正常养殖。对照组则腹腔注射无菌PBS(pH7.2)，免疫后30-60天，对大菱鲆腹腔注射10倍LD₅₀剂量的新鲜迟缓爱德华氏菌菌液，进行人工感染试验。感染后14-30天，统计死亡率，并计算RPS。其RPS值超过70％，则视为合格。

本应用方式中所用的福尔马林灭活迟缓爱德华氏菌疫苗也可用其他物理或化学的灭活病原的方法加以制备，物理方法如热灭活、细胞破碎、紫外、超声或反复冻融等，化学方法如采用强酸、强碱或戊二醛等试剂。免疫方法及评估同上。

实施例12：迟缓爱德华氏菌菌株1101抗原在鳗鲡饲料中用量确定的应用方式

首先制备迟缓爱德华氏菌1101菌株的抗原，该抗原的制备方法包括灭活菌体、菌蜕成分、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上。应用中，选择健康日本鳗鲡，各试验组均设3个平行组，20尾/平行组。试验饲料制备中，对照组的饲料按日本鳗鲡配合饲料配方将各原料粉碎到至60目，逐级混匀后加水搅拌，用适宜孔径的绞肉机制成饲料颗粒，7个试验组的饲料制备方法同上，另在原料中添加上述迟缓爱德华氏菌1101菌株的抗原，抗原/饲料重量比(g/kg)依次为1×10^-5/1、1×10^-4/1、1×10^-3/1、1×10^-2/1、1×10^-1/1、1/1和10/1。制备的饲料颗粒剪成适宜长度，经自然凉干后贮藏于4℃的冰箱中保存。

免疫实施中，实验各组每天按鱼体体重的3％投喂相应饲料，连续投喂14天后，再投喂正常饲料。30天后，各组进行加强免疫一次，方法同上。60天后，对鳗鲡腹腔注射10倍LD₅₀剂量的新鲜迟缓爱德华氏菌菌株1101菌液，进行人工感染试验。感染后14-30天，统计死亡率，计算RPS，并综合抗原制备成本的考虑，进行迟缓爱德华氏菌菌株1101抗原在日本鳗鲡饲料中用量的确定。

实施例13：迟缓爱德华氏菌菌株1101灭活疫苗与中草药添加剂配伍，免疫牛蛙的应用方式。

中草药添加剂以金银花提取物为例。将灭活疫苗与金银花提取物添加于实验饲料中，两者在饲料中适宜添加量的确定，参照实施例12中的方法。实验期间对照组中的牛蛙不进行免疫接种。免疫组的牛蛙首先进行浸泡免疫，再进行口服免疫加强二次，即首先浸泡于灭活细菌的终浓度为10⁸-10⁹CFU/mL的疫苗制剂中10-20min后取出，14-30天后，连续7-14天投喂含有上述实验饲料。30天后，再用实验饲料进行加强免疫一次，方法同上。60天后，对牛蛙腹腔注射10倍LD₅₀剂量的新鲜迟缓爱德华氏菌菌株1101菌液，进行人工感染试验。感染后14-30天，统计死亡率，计算RPS，RPS值超过60％则视为合格。

本实施例中的中草药添加剂可为单一中草药的单一有效成分、多种有效成分的混合物或粗提取物等，也可为两种或两种以上中草药上述成分的混合物。与迟缓爱德华氏菌菌株1101灭活疫苗配伍应用中，其免疫方法及免疫效果评估同上。

实施例14：含有迟缓爱德华氏菌菌株1101灭活疫苗的多联疫苗，免疫牙鲆的应用方式

首先用传统灭活方法(如福尔马林灭活、热灭活、高压灭活等)对鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和迟缓爱德华氏菌菌株1101进行灭活，再将三者按1∶1∶1的比例配制成三联疫苗，该疫苗中三种灭活细菌的终浓度均为10⁸CFU/mL。应用中，牙鲆腹腔注射100μL制备的三联疫苗，30天后将实验鱼随机分成三小组，各小组分别用10倍LD₅₀剂量的新鲜鳗弧菌、嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌菌液，进行人工感染试验，感染采用腹腔注射方式。感染后14-30天，统计死亡率，并计算RPS，感染实验结果中对以上三种菌的任何一种其RPS超过70％，即视为该三联疫苗具有较好的免疫效果。

实施例15：迟缓爱德华氏菌菌株1101抗原注射免疫接种大菱鲆时免疫剂量的确定的应用方式

以迟缓爱德华氏菌菌株1101的灭活疫苗作为免疫抗原，免疫接种以腹腔注射为例。首先制备迟缓爱德华氏菌菌株1101的灭活疫苗。免疫应用中，选择健康大菱鲆，各试验组均设3个平行组，20尾/平行组。各组均采用腹腔注射的方式进行免疫接种，对照组注射无菌PBS(pH7.2)。5个免疫组抗原的注射剂量为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵和1×10⁴CFU/尾。各组鱼在注射前，均用MS222进行麻醉处理。30天后，对大菱鲆腹腔注射10倍LD₅₀剂量的新鲜迟缓爱德华氏菌菌液，进行人工感染试验。感染后30-60天，统计死亡率，并计算各免疫组的RPS值，以此进行迟缓爱德华氏菌菌株1101灭活疫苗腹腔注射免疫接种罗非鱼时，所用免疫剂量的确定。

采用迟缓爱德华氏菌菌株1101的菌蜕成分、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上作为抗原加以应用时，其免疫应用中的抗原剂量的确定方法同上。

Claims (10)

1.一株迟缓爱德华氏菌菌株1101，其特征是所述菌株为分离自海水养殖鱼类的野生菌株迟缓爱德华氏菌菌株1101，其保藏编号为：CGMCC No.7197。

2.如权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌菌株1101，其特征在于所述菌株的16s rRNA、EsrB、H1yB基因上游碱基序列和16s-23s rRNA区间碱基序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，这些基因具有该菌株的特征性。

3.如权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌菌株1101，其特征在于所述菌株对海淡水鱼类具有较强的致病性，注射攻毒的半数致死量在1.0×10²-9.9×10³CFU/g的范围。

4.如权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌菌株1101，其特征是该菌株可培养于LB、TSB或2216E培养基，培养方法如下：从保存的菌种中挑取少量划线于上述培养基的固体平板，培养温度范围为28-37℃，在2216E琼脂平板中，28℃培养48h后可形成直径小于0.5mm的白色细小菌落；在TSB和LB琼脂平板中，37℃培养36h后可形成直径约0.5mm的微黄色圆形菌落，将单菌落接种于上述培养基的培养液中，28-37℃，180r/min摇瓶培养至OD₆₀₀为0.5-0.6获得该菌株的新鲜菌液。

5.权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌菌株1101的应用，其特征是该菌株的抗原包含针对爱德华氏菌保护性抗原，该保护性抗原具有良好的免疫原性和高度保守性，用该菌株制备的抗原经免疫接种后对爱德华氏菌感染具有良好的免疫保护作用，该菌株适用于生产爱德华氏菌的疫苗。

6.权利要求5所述的迟缓爱德华氏菌菌株1101的应用，其特征在于所述的抗原的制备方法包括灭活菌体、菌蜕成分、减毒菌株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上。

7.权利要求5所述的迟缓爱德华氏菌菌株1101的应用，其特征在于生产的疫苗可以是使用该菌株制备的抗原的单一成分，也可以使用该菌株制备的抗原与其他细菌的抗原混合生产联合疫苗，也可以将制备的单一或联合疫苗的抗原添加佐剂生产疫苗。

8.权利要求5所述的迟缓爱德华氏菌菌株1101的应用，其特征在于所生产的疫苗采用注射免疫、创伤免疫、浸浴免疫和口服免疫等免疫接种方式。

9.如权利要求7所述的迟缓爱德华氏菌菌株1101的应用，其特征在于所生产的灭活疫苗注射免疫接种时，可采用腹腔或肌肉注射两种方式，使用的剂量为10⁴-10⁸CFU/g；创伤免疫或浸浴免疫接种时，浸泡水体中灭活疫苗的浓度为10⁵-10⁹CFU/mL，浸泡时间2-60min；口服免疫接种时，灭活疫苗可添加于配合饲料中，配合饲料中的10⁵一10¹⁰CFU/g，连续投喂14-30天。

10.权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌株1101在制备预防爱德华氏菌感染的药物中的应用，所述药物免疫接种的对象包括海水养殖鱼类、半咸水养殖鱼类、洄游鱼类、淡水养殖鱼类、观赏鱼类、淡水养殖的两栖类和爬行类。

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