CN105695372A - 一种高致病性嗜水气单胞菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高致病性嗜水气单胞菌及应用，所述的高致病性嗜水气单胞菌为嗜水气单胞菌（<i>Aeromonas</i><i> hydrophila</i>）ZYAH72，保藏编号：CCTCC NO: M2015797。将该嗜水气单胞菌制备成灭活疫苗，得到的疫苗安全无毒害，通过浸泡和注射两种方式均能获得较好的免疫效果，广谱性好。疫苗制作方式快速简便，易于大量制备，本发明为水产类细菌性败血症的防治提供了切实可行的方法。

Description

一种高致病性嗜水气单胞菌及应用

技术领域

本发明涉及动物疫苗技术领域，特别涉及一种高致病性嗜水气单胞菌及应用。

背景技术

嗜水气单胞菌是一种革兰氏阴性菌，系气单胞菌科气单胞菌属，普遍存在于淡水，污水，淤泥，土壤和人畜粪便中，在自然界中广泛分布。该菌可感染鱼类、两栖动物、软体动物，甚至鸟类、爬行类以及哺乳类等多种动物，由其引发的感染或细菌性败血症可导致动物大量死亡。嗜水气单胞菌是我国鱼类养殖史中危害鱼种类最多、鱼龄范围最大、分布区域最广、流行季节最长的一种重要急性传染病。同时，该病原引发的感染广泛分布于世界范围内，给水产养殖大国带了经济损失。研究发现鱼类一旦感染嗜水气单胞菌发病速度极快，发病鱼通常表现为眼球突出，腹下出血，严重时腹部水肿膨胀。该菌的致病机理尚不十分清楚，目前已知的在导致鱼类感染过程中发挥重要作用的致病因子包括核酸酶、气溶素、胞外蛋白酶、肠毒素、溶血素等。

由该菌引起的疾病主要以抗生素和化学药物控制为主，但是抗生素和化学试剂过量使用可导致细菌耐药性增强，并引起环境污染，甚至导致抗生素或化学试剂残留引发食品安全问题。因此，接种疫苗成为预防鱼类病害的最重要手段。目前若干嗜水气单胞菌灭活疫苗已经制备并被证实对特定菌株具有部分免疫保护效果，但由于嗜水气单胞菌菌株有致病性和非致病性菌株之分，所携带毒力因子具有多种组合，因此普遍认为只有筛选带有多种毒力因子的强毒力菌株用于制备灭火疫苗才能更好保护水生生物抵抗不同嗜水气单胞菌致病菌株的感染。因此，筛选一株含有多种毒力因子的强毒力菌株，将其制备灭活疫苗显得尤为重要。

CN105031636A通过PCR方法筛选不同来源的菌株，将其中含有气溶素(aerA)、肠毒素(alt)、丝氨酸蛋白酶(ahp)以及溶血素(β-hly)四个毒力因子的一株菌株灭活，制备成口服疫苗，获得良好效果，能为银鲫提供相对保护率46.7％。

申请人通过筛选，获得了一株至少具备5个毒力因子的高致病性嗜水气单胞菌，经验证，该菌可作为商业疫苗进行生产，具备广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于一种高致病性嗜水气单胞菌，该菌株已于2015年12月29日送往中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)ZYAH72，保藏编号：CCTCCNO:M2015797，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供一种高致病性嗜水气单胞菌在制备嗜水气单胞菌感染疫苗中的应用，利用本发明提供的疫苗，可克服以往灭活疫苗保护效果不高和难以抵抗不同致病菌株感染的弊端，该疫苗特别适用于水产动物的由水气单胞菌引起的嗜水气单胞菌性败血症。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种高致病性嗜水气单胞菌的获得：

申请人自发病或濒死的鱼中，从患病部位划线至TSB固体培养基上，进行致病菌的筛选，通过革兰氏染色镜检、16SrDNA测序、溶血实验、PCR扩增嗜水气单胞菌相关毒力基因、斑马鱼半数致死量实验、小鼠半数致死实验，最终获得了一株高致病性嗜水气单胞菌，该细菌已于该菌株已于2015年12月29日送往中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)ZYAH72，保藏编号：CCTCCNO:M2015797，地址：中国武汉武汉大学。

该菌株在血琼脂平板上具有较强的溶血活性，含有气溶素(aerA)，丝氨酸蛋白酶(ahp)，溶血素(hly)，肠毒素(alt)，金属蛋白酶(ast)等五个毒力因子，在生化实验中呈氧化酶、阿拉伯糖、七叶苷、精氨酸双水解酶、葡萄糖产气、水杨素为阳性反应，6％NaCl胨水为阴性反应。在普通TSB固体培养基或液体培养基中生长良好，生长所需适宜温度为28-30℃。

一种高致病性嗜水气单胞菌在制备嗜水气单胞菌感染疫苗中的应用，包括利用现有方法将该菌制备为由水气单胞菌引起的水产动物的细菌性败血症疫苗，或其为有效成分之一与其他疫苗制备为多联疫苗。

所述的水产动物包括但不限于：草鱼、鲫、鳙、鲢、鳜、鲤、青鱼、罗非鱼、鳗鲡、白鲫、银鲫、鲟、黄尾鲴、鳊、斑点叉尾鮰、金鱼、黄鳝、牙鲆等鱼类；还包括蛙、大鲵、虾、蟹、鳖、龟等水生动物。

本发明所述的嗜水气单胞菌还可用于制备哺乳动物的嗜水气单胞菌感染疫苗，特别是小鼠的嗜水气单胞菌感染疫苗。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、与通过抗生素和化学药物防控该病原相比，疫苗具有成本低，特异性高，环境友好型的特点。

2、含有较多的毒力因子，可提供更多的有效免疫原。

3、该菌株在活体中的致病性强于致病标准株，并且高于本实验室分离的其他菌株。

4、本疫苗不需要佐剂就能获得较好的免疫效果，并能有效抵抗嗜水气单胞菌的感染。

5、能够为帮助鱼类抵抗不同来源的嗜水气单胞菌致病菌株的感染。

6、疫苗的效果在鱼类和哺乳动物中均得到验证。

7、使用本发明的疫苗，可以有效的预防由嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症，减少鱼类患病率和死亡率，从而减少淡水鱼养殖业的经济损失。

8、使用本发明提供的疫苗，可显著增强水产动物的免疫力，提高抗病表型。

附图说明

图1为嗜水气单胞菌ZYAH72溶血活性检测示意图。

图2为嗜水气单胞菌ZYAH72的毒力因子PCR扩增示意图。

其中M：DNAMarker2k，泳道1-5依次为aer、alt、ahp、ast、hly基因。

图3为嗜水气单胞菌ZYAH72和致病标准株的毒力比较示意图。

图4为嗜水气单胞菌ZYAH72生长曲线示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。所述试剂或材料，如未特别说明，均来自于商业渠道。

实施例1：

一种高致病性嗜水气单胞菌的获得：

(1)筛选具有多种毒力因子的强致病性嗜水气单胞菌

A.在超净台中解剖发病或濒死的鱼中，从患病部位划线至TSB固体培养基上，28℃培养18h-24h，挑取平板上单菌落转接至新鲜培养基上纯培养；在TSB固体培养基上典型菌落为圆形，浅黄色，半透明，表面光滑，湿润，边缘整齐的菌落。

B.取上述平板上纯培养的单菌落，用法国梅里埃公司的API细菌鉴定试剂条进行生化鉴定(见表1)，并进行革兰氏染色观察菌落形态。

表1：分离株部分生理生化鉴定结果

C.扩增候选菌株的16SrDNA并测序，在与数据库中已有的嗜水气单胞菌数据进行同源性比对，结果显示其同源性为99％。

D.根据生理生化检测，革兰氏染色镜检菌落形态及16SrDNA测序结果确定分离的菌株为嗜水气单胞菌；

E.筛选能够表达溶血素并具有溶血活性的菌株，本发明最终获得的ZYAH72菌株的溶血活性见图1。

F.扩增相关毒力基因，结果显示本发明获得的嗜水气单胞菌ZYAH72菌至少具有气溶素(aerA)，丝氨酸蛋白酶(ahp)，溶血素(hly)，热稳定肠毒素(ast)和细胞紧张性肠毒素(alt)毒力因子，经过筛选初步确定分离株ZYAH72为高致病性嗜水气单胞菌(见图2)。

将该菌株的aerA，alt，ahp，ast和hly五个毒力因子人工敲除，发现该菌株与野生菌相比，其致病性显著减弱，但依然能与阳性血清发生强烈反应。

(2)在两种活体模型中确定此分离株为强毒力菌株

A.小鼠半数致死量

如图3所示，在存活率曲线中，分别将不同的菌株以5×10⁶CFU/每只剂量通过腹腔注射的方式感染6周龄Balb/c小鼠，观察小鼠的死亡情况。结果显示，ZYAH72的致病性显著高于传统嗜水气单胞菌标准株(以下简称为致病标准株)。

将不同菌株10倍稀释后，腹腔注射小鼠，观察一周内小鼠的死亡数量。根据Karber方法计算不同菌株的LD₅₀值，结果显示ZYAH72的LD₅₀值为9.99×10⁵CFU，致病标准株的LD₅₀为2.75×10⁷CFU(表2)。

表2ZYAH72和致病标准株对小鼠的LD₅₀

B.斑马鱼半数致死量。

将不同菌株5倍稀释后，腹腔注射体长3-4CM斑马鱼，观察一周内斑马鱼的死亡数量。根据Karber法计算不同菌株LD₅₀值，其中ZYAH72的LD₅₀值为1.32×10⁴CFU，传统嗜水气单胞菌标准株(以下简称为致病标准株)为8.01×10⁶CFU(表3)。

表3ZYAH72和致病标准株的LD₅₀

至此，获得了一株高致病性嗜水气单胞菌，该细菌已于该菌株已于2015年12月29日送往中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)ZYAH72，保藏编号：CCTCCNO:M2015797，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

嗜水气单胞菌ZYAH72的复苏及生长曲线：

嗜水气单胞菌ZYAH72的培养：从-80度冰箱取出保存于甘油中菌种，划线于TSB固体培养基上，于28℃恒温箱中培养24h左右，再挑取平板上单菌落在新鲜TSB固体培养基上划线培养，如此传代复苏2次后，从TSB固体培养基中挑取单菌落接种于TSB液体培养基中，然后在28℃，180r/min摇床培养，每隔1小时测定其OD_600nm吸光值，同样操作作用于致病标准株，结果表明ZYAH72和致病标准株均在2h左右进入对数期，4h～5h进入平台期，约含有10⁸～10⁹CFU/mL，在进入平稳期后ZYAH72的吸光值要高于致病标准株，说明本发明中分离株ZYAH72生长速率略高于致病标准株(图4)。

实施例3：

嗜水气单胞菌ZYAH72灭活疫苗的制备：

最佳甲醛浓度的选择：

在培养好的菌液中加入分别终浓度为0.1％-0.8％(体积分数)的甲醛溶液对此强致病性嗜水气单胞菌进行灭活，28℃摇床中继续培养12小时后，将不同灭活疫苗涂布在TSB固体培养基上，结果显示当甲醛浓度为0.3％-0.8％时均能制得完全灭活疫苗，同时根据抗原损失程度结果表明，当甲醛终浓度为0.5％时，灭活疫苗的抗原损失最小，并以此甲醛浓度制得的灭活疫苗作为免疫疫苗。

灭活疫苗的制备：

将分离得到的强致病性嗜水气单胞菌ZYAH72在哥伦比亚血平板上复壮2代，挑取血平板上的单菌落接种于TSB培养基中，28℃摇床中培养12小时，使用酶标仪检测其OD595nm值，达到1.02此时菌体浓度为1.1×10⁹CFU/mL；在培养基中加入终浓度为0.5％的甲醛溶液制备灭活疫苗，28℃摇床中继续培养24小时，在5000rpm下离心10min，收集菌体，并使用PBS重悬菌体3次以除去残留甲醛，最后使用PBS重悬菌体，此时菌体浓度在1.1×10⁹CFU/mL，即为制备的嗜水气单胞菌灭活疫苗，用于以下实施例。

实施例4：

一种高致病性嗜水气单胞菌在制备水产动物细菌性败血症疫苗中的应用：

安全性实验：30条体长3-4CM斑马鱼，在实验室中饲养4天后进行安全性检测，其中分别使用3×10¹⁰CFU/mL浸泡免疫(实施例3制备的灭活疫苗)和4×10⁸CFU实施例3制备的灭活疫苗腹腔注射鱼斑马鱼处理15条斑马鱼，结果表明所用斑马鱼一切正常，无任何死亡，内脏解剖也未见任何异常。

免疫实验：

随机挑选体长3-4CM健康斑马鱼用于免疫攻毒实验，实验分组及处理方式如下(每组15条斑马鱼)：

浸泡免疫组：将斑马鱼浸泡在3×10⁸CFU/mL的灭活疫苗中，浸泡时间为8分钟，之后放入清水中浸泡3min，再转移至大的水箱中连续培养；

浸泡对照组：将斑马鱼浸泡在PBS中8分钟，之后放入清水中浸泡3min，再转移至大的水箱中连续培养；

腹腔注射免疫组：每条斑马鱼腹腔注射20μL浓度为3×10⁶CFU/mL的灭活疫苗；

腹腔注射对照组：每条斑马鱼腹腔注射20μLPBS；

所有组别在相同条件下饲养。第一次免疫后2周，以相同方式进行第二次免疫；进行加强免疫。第二次免疫2周后，用嗜水气单胞菌野生株ZYAH72对以上各组进行攻毒(攻毒剂量是1个LD100)。然后观察两周各组情况，记录死亡数。

结果显示，用ZYAH72攻毒后，浸泡对照组和腹腔注射对照组腹部出血，出现败血症的症状，无斑马鱼存活，提取死亡斑马鱼内脏组织涂布于在TSB固体培养基上，挑取单菌落经过PCR验证可以检测出大量的嗜水气单胞菌；浸泡免疫组15条斑马鱼死亡8条，腹腔注射免疫组15条斑马鱼死亡7条，存活的斑马鱼没有出现任何的临床症状，解剖存活斑马鱼内脏也没有观察到明显的病理现象，并提取内脏组织涂布于在TSB固体培养基上，只能检测较少的嗜水气单胞菌。

进一步的，申请人利用本领域的传统菌株J-1(CGMCCNO.3220，CN201010158115致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒)对也上述各组进行了免疫攻毒实验，除攻毒菌株不一样外，其他条件与上述完全相同。结果显示，用J-1菌株攻毒后，浸泡对照组和腹腔注射对照组无斑马鱼存活，浸泡免疫组15条斑马鱼死亡7条，腹腔注射组15条斑马鱼死亡7条。

以上说明本发明的灭活嗜水气单胞菌疫苗具有很好的保护效果，能够有效预防由嗜水气单胞菌引起的鱼类细菌性败血症。

同时申请人还检测了只免疫一次的斑马鱼(免疫分组及处理方式如上所述)对不同攻毒菌株(攻毒菌株分别为ZYAH72、J-1和W2，攻毒剂量均为1个LD100)的保护情况，实验结果显示：各组的浸泡对照组和腹腔注射对照组均无斑马鱼存活；ZYAH72攻毒后，浸泡免疫组15条斑马鱼死亡10条，腹腔注射组15条斑马鱼死亡9条；J-1攻毒后，浸泡免疫组15条斑马鱼死亡9条，腹腔注射组15条斑马鱼死亡7条；W2攻毒后，浸泡免疫组15条斑马鱼死亡9条，腹腔注射组15条斑马鱼死亡7条。

由于本实验中所用的第一株菌株为ZYAH72，该菌株来源于湖北的发病鲫鱼；第二株用于攻毒的菌株J-1(CGMCCNO.3220，CN201010158115致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒)菌株是江苏省发病银鲫中分离得到，是常用的致病标准菌株；采用的第三株菌来自江苏省爆发败血症团头鲂养殖区的病鱼分离株W2(中国农学通报2014,30(8):29-35)，该菌株为强致病性菌株。因此，该实验结果表明该灭活疫苗能够抵抗不同来源菌株的感染，具有一定的广谱性。

实施例5：

一种高致病性嗜水气单胞菌在制备水产动物细菌性败血症疫苗中的应用：

安全性实验：100g-150g的健康草鱼30条，在实验室中饲养2周后进行疫苗安全性检测，其中分别使用浸泡(浸泡浓度为3*10¹⁰CFU/mL)和腹腔注射(腹腔注射200μL浓度为3*10¹⁰CFU/mL灭活疫苗，即6×10⁹CFU每条草鱼)处理15条草鱼，结果表明所用草鱼一切正常，无任何死亡，内脏解剖也未见任何异常。

免疫实验：

随机挑选健康草鱼(100g-150g)用于免疫攻毒实验，实验分组及处理方式如下(每组15条草鱼)：

浸泡免疫组：将草鱼浸泡在浓度为3*10⁸CFU/mL的灭活疫苗中，浸泡时间为8分钟，之后放入清水中浸泡3min，再转移至大的水箱中连续培养；

浸泡对照组：将草鱼浸泡在PBS中8分钟，之后放入清水中浸泡3min，再转移至大的水箱中连续培养；

腹腔注射免疫组：每条草鱼腹腔注射200μL浓度为1*10⁸CFU/mL的灭活疫苗；

腹腔注射对照组：每条草鱼腹腔注射200μLPBS；

所有组别在相同条件下饲养。第一次免疫后2周，通过相同方式对上述各组进行第二次免疫。第二次免疫2周后，用嗜水气单胞菌野生株ZYAH72对以上各组进行攻毒(攻毒剂量是1个LD100)。然后观察两周各组情况，记录死亡数。

结果显示，用野生株ZYAH72攻毒后，浸泡对照组和腹腔注射对照组腹部出血，出现败血症的症状，无草鱼存活；浸泡免疫组15条草鱼死亡7条，腹腔注射免疫组15条草鱼死亡6条，存活的草鱼没有出现任何的临床症状，腹腔解剖后同样没有观察到任何病变现象。

进一步的，申请人利用本领域的传统菌株J-1和W2(两种菌株的攻毒剂量均为1个LD100)对也上述各草鱼组进行了免疫攻毒实验，除攻毒菌株不一样外，其他条件与上述完全相同。结果显示，用J-1菌株攻毒后，浸泡对照组和腹腔注射对照组无草鱼存活，浸泡免疫组15条草鱼死亡6条，腹腔注射组15条草鱼死亡5条。用W2菌株攻毒后，浸泡对照组和腹腔注射对照组无草鱼存活，浸泡免疫组15条草鱼死亡6条，腹腔注射组15条草鱼死亡5条。存活的草鱼没有出现任何的临床症状，腹腔解剖后同样没有观察到任何病变现象。

说明本发明中强致病性嗜水气单胞菌灭活疫苗的免疫效果较好，能够有效的预防和控制有嗜水气单胞菌导致的细菌性败血症。

实施例6：

嗜水气单胞菌ZYAH72疫苗在小鼠中的免疫原性及保护力的检测：

安全实验：10只3周龄雌性Balb/c小鼠(湖北省疾病防御控制中心)，在实验室中饲养3天后进行疫苗安全性检测，其中10只小鼠腹腔注射200μL含有2*10⁸CFU灭活疫苗，结果表明10只实验小鼠一切正常，无任何死亡，内脏解剖也未见任何异常。

免疫实验：

3周龄雌性Balb/c小鼠，在实验室中饲养3天后随机分组。实验分组及处理方式如下(每组15只)：

腹腔注射免疫组：每只小鼠腹腔注射200μL含有2*10⁶CFU灭活疫苗；

腹腔注射对照组：每只小鼠腹腔注射200μLPBS；

所有组别在相同条件下饲养。第一次免疫后2周，通过相同方式对上述各组进行第二次免疫。第二次免疫2周后，用ZYAH72对以上各组进行攻毒(攻毒剂量是1个LD100)。然后观察两周内各组情况，记录死亡数。

结果显示，用ZYAH72攻毒后，腹腔注射对照组全部死亡，腹腔注射免疫组15只小鼠死亡4只。免疫组存活小鼠并未出现任何异常临床症状，提取内脏组织只能检测到很少的嗜水气单胞菌。

同时，申请人考察了J-1和W2菌株攻毒(攻毒剂量均为1个LD100)后小鼠存活情况，J-1和W2菌株攻毒实验除攻毒菌株不同外，其余与上述完全相同。结果显示，J-1攻毒后，对照组全部死亡，腹腔注射免疫组15只小鼠死亡3只。W2攻毒后，对照组全部死亡，腹腔注射免疫组15只小鼠死亡3只。免疫组存活小鼠并未出现任何异常临床症状，提取内脏组织只能检测到很少的嗜水气单胞菌。

同时，申请人对二免两周后(不攻毒)的各组的小鼠通过ELISA检测免疫组小鼠血清抗体滴度在波长450nm处检测其分光光度，表明阳性孔发生了明显的抗原抗体反应。表明本发明的疫苗具有良好的免疫原性和较好的保护效果，同时能对不同来源的致病菌株提供保护。

Claims (5)

1.一种高致病性嗜水气单胞菌，其特征在于：嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）ZYAH72，保藏编号：CCTCCNO:M2015797。

2.权利要求1所述的嗜水气单胞菌在制备嗜水气单胞菌感染的疫苗中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：权利要求1所述的嗜水气单胞菌在制备水产动物细菌性败血症疫苗中的应用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：权利要求1所述的嗜水气单胞菌在制备哺乳动物嗜水气单胞菌感染的疫苗中的应用。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的疫苗为灭活疫苗，灭活时甲醛终浓度为0.5%。