CN105121625A - 针对嗜水气单胞菌的免疫原性组合物 - Google Patents
针对嗜水气单胞菌的免疫原性组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105121625A CN105121625A CN201380062909.3A CN201380062909A CN105121625A CN 105121625 A CN105121625 A CN 105121625A CN 201380062909 A CN201380062909 A CN 201380062909A CN 105121625 A CN105121625 A CN 105121625A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacterium
- aeromonas hydrophila
- fish
- biotype
- composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Abstract
本发明的目的是提供一种组合物,例如免疫原性组合物或疫苗形式,用于保护鱼免受嗜水气单胞菌的感染。本发明还涉及免疫原性含量的两种高毒性嗜水气单胞菌菌株(一种属于生物型A,一种属于生物型B)例如在免疫原性组合物或疫苗中的组合,以提供对嗜水气单胞菌造成的感染的有效的预防性保护。
Description
技术领域
本发明的目的是提供一种例如免疫原性组合物或疫苗形式的组合物,用于保护诸如鲶形目(Siluriformes)、鲈形目(Perciformes)和鲤形目(Cypriniformes)的鱼免受嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)的感染。更具体地,发明人惊讶地发现嗜水气单胞菌的两种不同的生物型,生物型A和B能够在诸如鲶形目、鲈形目和鲤形目的鱼中造成毒性。另外,发明人惊讶地发现将免疫原性含量的两种高毒性嗜水气单胞菌菌株(一种属于生物型A,一种属于生物型B)例如在免疫原性组合物或疫苗中组合,所述组合惊讶地证实能为诸如鲶形目、鲈形目和鲤形目的鱼提供对嗜水气单胞菌造成的感染的有效的预防性保护。
背景技术
在SantosY.etal.1987中,通过分析分离自鱼养殖系统的几种不同的气单胞菌属(Aeromonas)菌株的生化、酶及细胞表面性能,研究某些气单胞菌种(包括嗜水气单胞菌)的表型特征与在虹鳟鱼(Salmogairdneri)中的毒性之间的关系。然而,其并未公开或教导本发明特定的病原性嗜水气单胞菌生物型A和B,或基于所述生物型的任意鱼疫苗。
在EsteveC.etal.1993中,通过腹膜内和水性暴露于某些嗜水气单胞菌菌株,对欧洲鳗鲡进行攻击。基于攻击实验,作者得出结论,嗜水气单胞菌作为欧洲鳗鲡的原发性病原体。然而,其并未公开或教导本发明特定的病原性嗜水气单胞菌生物型A和B,或基于所述生物型的任意鱼疫苗。
在Phanetal.2009中,在越南的湄公河三角洲研究了条纹鲶鱼(Pangasianodonhypophthalamus)密集水产养殖的各个方面。据报道密集渔业养殖的后果是在生产周期的早期至月中期间,死亡率高达30%。作者还报道了鲶鱼养殖的健康管理主要涉及化学处理,经常用抗生素并使用饲料添加剂(维生素C)。然而,其并未公开或教导本发明的特定病原性嗜水气单胞菌生物型A和B,或基于所述生物型的任意鱼疫苗。
在M.E.Martinoetal.2011中,公开了其试图本领域中建立气单胞菌属和发病机制之间明确的联系,其因例如气单胞菌高度复杂的分类学而极为复杂。文章还公开了仅含有潜在毒性因子基因的一小亚类菌株似乎造成感染。还公开了本领域中其试图准确区分气单胞菌种类。还设想经分析的气单胞菌菌株之间的微生物多样性(例如系统发生和分类学的相互关系)能基于多位点序列分型(MLST)和表型特征确定。测试的气单胞菌菌株特别是收集自例如虹鳟鱼、海鲤和鲤鱼的皮肤和肾的嗜水气单胞菌。基于所述方法,作者能够建立经分析的气单胞菌菌株和表型之间的分类学关系,并基本表明了,嗜水气单胞菌符合相同的表型群,描述为嗜水气单胞菌复合物。然而,其并未公开本发明的特定病原性嗜水气单胞菌生物型A和B,或基于所述生物型的任意鱼疫苗。
在PridgeonJ.W.和KlesiusP.H.,2011中,公开了基于毒性和抗生素抗性的嗜水气单胞菌的“2009年西阿拉巴马分离物”的减毒疫苗,其用于沟鲶(Ictaluruspuncatus)和尼罗罗非鱼(Orechromisniloticus)。文章还公开了众所周知嗜水气单胞菌是生化和血清型非常异质的,这被认为是开发针对嗜水气单胞菌的有效的商业化疫苗的最大障碍。另外,文章公开了抗生素抗性的嗜水气单胞菌是减毒的,因此被认为适用于鱼疫苗。腹膜内注射和浸浴均作为疫苗施用的可能途径公开。然而,其并未公开包括两种或更多种特定生物型的嗜水气单胞菌的联合疫苗。
在ZhengW.et.al,2012中,研究了草鱼(Ctenopharyngodonidellus)中嗜水气单胞菌的四种不同毒性和抗生素抗性菌株的细菌感染。根据该文章,使用ATB32GN系统、系统发生分析、肠道菌重复性基因一致性序列-聚合酶链式反应(ERIC-PCR)将所述四种菌株鉴定为不同的嗜水气单胞菌分离物。文章还公开了嗜水气单胞菌的多重感染可能是草鱼养殖中新兴的威胁。然而,尽管大体涉及草鱼和现代渔业中多种嗜水气单胞菌菌株的感染,该文章并未公开或教导适用于预防性治疗所述感染的基于嗜水气单胞菌的组合鱼疫苗。事实上,该文章设想嗜水气单胞菌多重感染的治疗可以通过使用常用渔业药物例如诺氟沙星(诺氟沙星是广谱抗生素,对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有活性)来进行。
中国专利申请CN101642567公开了一种基于非限定的嗜水气单胞菌病原菌株的灭活鱼疫苗,以及所述疫苗的制备,其用于预防和治疗鲤鱼中的细菌性败血症。该疫苗通过该方法限定,其中病原性(但未限定)嗜水气单胞菌菌株提取自感染的鲤鱼并随后用于制备用在疫苗中的细菌悬液。然而,其并未公开或教导本发明的特定病原性嗜水气单胞菌生物型A和B,或基于所述生物型组合的任意鱼疫苗。
现有技术-整体考虑
嗜水气单胞菌是一种广泛分布于水生环境的革兰氏阴性能动的芽孢杆菌,通常被认为是二级病原体,但也能是气单胞菌属败血症的致病物。受影响的鱼种类有罗非鱼、鲶鱼、金鱼、普通鲤鱼和鳗鱼(Priodegonetal2009)。近年来,一些嗜水气单胞菌菌株也被鉴定为对鲤鱼(Zhengetal2012)和鲶鱼(Priodegonetal2009)高毒性的。
在越南的巨鲶(pangasius)养殖中,鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)已是主要死因,根据Phanetal.(2009),越南南部湄公河三角洲98%的养殖受到影响。Phametal.还提到61%的养殖受到红斑影响。红斑病群体中的死亡率最有可能是由嗜水气单胞菌造成的。最近在越南鉴定为出血、造成红斑的疾病(由嗜水气单胞菌造成)已经增加,给渔民造成严重的经济损失。
嗜水气单胞菌在自然界普遍存在,并且甚至发现于鱼肠道。在自然环境中,野生鱼中的嗜水气单胞菌感染通常不会造成严重问题。然而,对于密集的渔业养殖系统,不论这些系统是室外敞池还是室内养鱼池或水槽,必需考虑其他因素。该疾病的普遍发生与鱼的应力状态或类似因素有关。水产养殖领域普遍认同鱼在被错误地对待、过度拥挤、恶劣条件下运输、营养水平较差、水质较差等时易于受到压力。这是本领域周知的。
在所有形式的密集水产养殖中,其中如果一种或多种以高密度饲养,则感染性病原易于在个体之间传播。由于水中病原体传播的有效性及用于商业化大规模渔业养殖的高密度动物,病原体在养殖鱼群体中快速传播。
本领域周知感染嗜水气单胞菌的鱼具有许多不同的症状,从健康鱼的猝死到食欲不振、游动异常、鳃苍白、外观臃肿、皮肤溃疡和突眼症。皮肤溃疡可发生在鱼的任意部位,并且经常被红色组织的亮边围绕。通常受该疾病影响的其他器官包括鳃、肾、肝、脾、胰腺和骨骼肌。症状有变化,因为它们基于各种因素,尤其是与包括生物毒性的细菌群体的多样性相关的因素,以及和鱼相关的因素,如鱼对感染的抗性,菌血症或败血症的存在或缺失,以及环境因素。实际上,嗜水气单胞菌的临床爆发对渔民是潜在的经济灾难。
因此,传统上,养殖鱼中的传染病已通过使用抗生素得到防止。然而,抗生素的使用涉及多种潜在问题。
在针对问题疾病使用相同抗微生物剂的密集、反复药物处理后,一段时间后经常观察到效力降低。作为抗性出现的结果,必需重复治疗或使用新药剂。然而,抗生素抗性并不仅是鱼健康的问题。沉积物和水中的其他细菌能产生抗性,由此在水生环境中传播至其他生物。人们受到的抗性细菌的总体负担在增加,并且会产生新的人类健康问题。
更具体地,迄今为止,对鲶形目、鲈形目和鲤形目鱼的抗嗜水气单胞菌感染的治疗限于两种抗生素,土霉素和增强的磺胺类药物。如上所述,与任意抗生素治疗相关的潜在问题包括剂量水平不足、药量过多、细菌的抗药性和在土霉素用于浸泡和浸浴的情况下钙螯合至硬水。
因此期望减少或优选消除鱼养殖业中的抗生素使用。在这一点上,特别期望在地理区域例如东南亚关注该问题,在那里疫苗开发和通常的预防保健工作并不到位,并且仍持续在使用大量的抗生素。
现有技术-整体考虑-鱼疫苗
20世纪70年代已证实基于福尔马林灭活的肉汤培养物的鱼浸没式疫苗能有效防止某些细菌性鱼感染。这些疫苗的效力随即导致抗生素使用的下降。然而,浸没式疫苗证实具有对某些其他鱼病原体并不令人满意的效果。事实上,在20世纪90年代早期,开发了含有佐剂通常是油佐剂的注射疫苗。
具有良好卫生和有限压力的适当的鱼管理是传染病预防中的主要因素,并且也是疫苗最佳效果所必需的。理想地,疫苗产生针对多种传染病的长期保护,能简便地施用,能安全地用于鱼和管理者,并且有利可图。另外,与抗生素相比,疫苗是环境友好的。
在本领域中已知有几种不同类型的鱼疫苗,包括灭活的、活的、重组的和DNA疫苗。总体上有三种主要的疫苗应用模式:口服、浸没和注射。口服疫苗通常引发短期保护,浸没式疫苗产生更好的保护,而注射疫苗产生最好且最持久的保护且最划算。
然而,疫苗接种如今是大多数现代渔业的组成部分,而且抗生素的使用在过去二十年已大为减少,尤其是在北欧和北美。然而,在南美和东南亚的大部分地区,商业化养鱼场中仍在大量使用抗生素,由此造成上述副作用,例如抗性。因此,期望开发针对由例如养鱼场(例如在东南亚)中的抗生素抗性细菌造成的传染病的特异性和有效的疫苗。
发明概述
本发明涉及嗜水气单胞菌生物型A和B细菌,其有代表性的分离物根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”进行保藏。本发明另外涉及所述生物型的基因型、表型和血清型特征。在另一方面,本发明涉及免疫原性组合物,例如疫苗,其包含免疫原性含量的所述嗜水气单胞菌生物型A和/或B细菌,涉及所述细菌在医学中的用途,以及制备该组合物的方法。
附图说明
图1示出24种气单胞菌菌株的最大似然系统发生树,使用gltA和metG中所用的遗传信息。仅显示自展值(bootstrapvalue)高于50的情况。两个保守的系统发生群标记为A和B。对所有参照菌株显示序列类型(ST)。
图2示出巨鲶的累积死亡率%(y轴)并相对于时间(x轴)曲线化。巨鲶经腹膜内注射生物型A、生物型B或其他嗜水气单胞菌菌株(PQ100155)。持续监测死亡率。
本发明后续将更详细描述。
发明描述
生物型A
发明人发现在鲶形目、鲈形目和鲤形目鱼中的攻击研究中,基于生物型A嗜水气单胞菌的免疫组合物完全防护生物型A,并提供令人满意的针对生物型A的抗体应答。
因此,作为第一个主要方面,本发明涉及分离的嗜水气单胞菌生物型A细菌,所述菌株选自以下组:
(i)根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏于英国SP40JG威尔特郡索尔兹伯里市波顿镇的健康保护局培养物中心(HealthProtectionAgencyCultureCollections,PortonDown,Salisbury,Wiltshire,SP40JG,UK)的保藏号为12082901的细菌;
(ii)能够与来自用i)中限定的细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌。
发明人还能够确立上述生物型A菌株的基因型和表型特征。因此,本发明还涉及具有基因型和/或表型特征的分离细菌,所述特征与以上限定的保藏的生物型A细菌的特征相关。
另外,已经证实以上限定的生物型A细菌能够在感染鱼中诱导特定的临床症状。因此,本发明还涉及细菌,其中表型特征包括当在重10-20g的鱼中经腹膜内注射100-2000cfu/鱼的量以及0.1ml的注射体积时,在巨鲶(pangasius)(巴丁鱼(Pangasianodonhypophthalmus))中诱导败血病,并且任选地,诱导死亡的临床症状的能力。
因此,在其他实施方案中,本发明还涉及以上限定的生物型A的细菌,其中所述表型特征包括在重10-20g的鱼中经腹膜内注射100-2000cfu/鱼的量以及0.1ml注射体积的所述细菌后的2-5天内,在巨鲶(巴丁鱼)中诱导败血病,并且任选地,诱导至少50%死亡的临床症状的能力。
以上限定的生物型A细菌在巨鲶中诱导死亡的能力可以是造成至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或例如至少90%或100%死亡的能力。在具体实施方案中,诱导死亡的能力在细菌分离自临床爆发后不久,即长期储藏之前确定。
特别地,根据以上实施方案的鱼可以具有例如10-20g、12-19g、14-19g、16-19g、17-18g或18g的重量。另外,以上实施方案可应用于初始重量为5g的鱼,并且可在生产周期中进一步应用。
另外,在以上实施方案中的注射细菌量可以是100-2000cfu/鱼、200-1500cfu/鱼、300-1000cfu/鱼、400-800cfu/鱼、500-700cfu/鱼或低于500cfu/鱼。
发明人还证实,根据本发明的具体实施方案,以上限定的用于本发明的感兴趣的细菌可以与保藏的生物型A菌株的两种特定的经测序基因具有一定水平的相同性。因此,在本发明的另一个方面,以上限定的生物型A细菌显示出以下基因型特征:其具有甲硫氨酰-tRNA合成酶(metG)基因,该基因包含与SEQIDNO:1所示序列至少99%相同的序列,和/或柠檬酸合酶(gltA)基因,该基因包含与SEQIDNO:2所示序列至少99%相同的序列。
特别地,以上限定的生物型A细菌显示与SEQIDNO:1所示序列99.1%-99.2%、99.2%-99.3%、99.3%-99.4%、99.4%-99.5%、99.5%-99.6%、99.6%-99.7%、99.7%-99.8%、99.8%-99.9%、99.9%-100%的相同性。
另外,以上限定的生物型A细菌显示与SEQIDNO:2所示序列99.1%-99.2%、99.2%-99.3%、99.3%-99.4%、99.4%-99.5%、99.5%-99.6%、99.6%-99.7%、99.7%-99.8%、99.8%-99.9%、99.9%-100%的相同性。
如上所述,发明人另外确立了以上限定的用于本发明的感兴趣的生物型A细菌的血清型特征。因此,在其他方面,本发明涉及以上限定的细菌,其特征在于其与来自用以上鉴定的保藏的生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应的能力,由本文所述的直接凝集试验或玻片凝集试验确定。
在具体实施方案中,使用直接凝集试验:来自所述鱼的血清可以系列稀释添加在适合的容器中,例如微量滴定板中的孔,并且等体积的细菌添加至每个容器或孔。细菌可以通过将单菌落转移至TSB(胰蛋白酶大豆肉汤),随后在28℃孵育12小时制备。容器在适合的温度例如4℃孵育并在例如8小时和24小时后记录结果。当细菌凝集形成肉眼易于观察的结构时为阳性结果。当溶液保持浑浊且不形成聚集时为阴性结果。观察到凝集时的最高血清稀释记录为结果。
可选地,细菌与来自用保藏的细菌免疫的鱼的抗血清反应的能力可使用本文所述的玻片凝集试验确定。玻片凝集试验可通过将一滴无菌盐水置于洁净的玻片上进行。然后将单细菌菌落与水混合。添加一滴鱼血清,30秒后记录结果。当细菌凝集形成肉眼易于观察的结构时为阳性结果。当溶液保持浑浊且不形成聚集时为阴性结果。
在任一测试中,血清优选以1:2的稀释使用,例如1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024或例如1:2048。
在某些实施方案中,根据本发明的细菌是保藏号为12082901的细菌的变体或后代。
生物型B
发明人发现在鲶形目、鲈形目和鲤形目鱼中的攻击研究中,基于生物型B嗜水气单胞菌细菌的免疫组合物完全防护生物型B,并提供令人满意的针对生物型B的抗体应答。
因此,作为第二个主要方面,本发明涉及分离的嗜水气单胞菌生物型B细菌,所述细菌选自以下组:
(i)根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏于英国SP40JG威尔特郡索尔兹伯里市波顿镇的健康保护局培养物中心(HealthProtectionAgencyCultureCollections,PortonDown,Salisbury,Wiltshire,SP40JG,UK)的保藏号为12082902的细菌;
(ii)能够与来自用i)中限定的细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌。
发明人还能够确立以上限定的生物型B菌株的基因型和表型特征。因此,本发明还涉及具有基因型和/或表型特征的细菌,所述特征与以上限定的保藏的生物型B细菌的特征相关。
另外,已经证实以上限定的生物型B细菌能够在感染的鱼中诱导特定的临床症状。因此,本发明还涉及细菌,其中所述表型特征包括在重10-20g的鱼中经腹膜内注射100-6000cfu/鱼的量以及0.1ml的注射体积时,在巨鲶(巴丁鱼)中诱导败血病,并且任选地,诱导死亡的临床症状的能力。
因此,在其他方面中,本发明还涉及以上限定的生物型B的细菌,其中所述表型特征包括在重10-20g的鱼中经腹膜内注射较少的100-6000cfu/鱼的量以及0.1ml注射体积的所述细菌后的2-5天内,在巨鲶(巴丁鱼)中诱导败血病,并且任选地,诱导至少50%死亡的临床症状的能力。
以上限定的生物型B细菌在巨鲶中诱导死亡的能力可以是造成至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或例如至少90%或100%死亡的能力。
特别地,根据以上实施方案的鱼可以具有例如10-20g、12-19g、14-19g、16-19g、17-18g或18g的重量。另外,以上实施方案可应用于初始重量为5g的鱼,并且可在生产周期中进一步应用。
另外,在以上实施方案中的注射细菌量可以是100-6000cfu/鱼、200-5000cfu/鱼、300-4000cfu/鱼、400-3000cfu/鱼、500-2000cfu/鱼、600-1000cfu/鱼或低于500cfu/鱼。
发明人还证实,以上限定的用于本发明的感兴趣的细菌可以与保藏的生物型B菌株的两种特定的经测序基因具有一定水平的相同性。因此,在本发明的另一个方面中,以上限定的生物型B细菌显示出以下基因型特征:其具有甲硫氨酰-tRNA合成酶(metG)基因,该基因包含与SEQIDNO:3所示序列至少99%相同的序列,和/或柠檬酸合酶(gltA)基因,该基因包含与SEQIDNO:4所示序列至少99%相同的序列。
特别地,以上限定的生物型B细菌显示与SEQIDNO:3所示序列99.1%-99.2%、99.2%-99.3%、99.3%-99.4%、99.4%-99.5%、99.5%-99.6%、99.6%-99.7%、99.7%-99.8%、99.8%-99.9%、99.9%-100%的相同性。
另外,以上限定的生物型B细菌显示与SEQIDNO:4所示序列99.1%-99.2%、99.2%-99.3%、99.3%-99.4%、99.4%-99.5%、99.5%-99.6%、99.6%-99.7%、99.7%-99.8%、99.8%-99.9%、99.9%-100%的相同性。
如上所述,发明人另外证实以上限定的用于本发明的感兴趣的生物型B细菌的血清型特征。因此,在其他方面,本发明涉及以上限定的细菌,其特征在于其与来自用以上鉴定的保藏的生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应的能力,由上述直接凝集试验或玻片凝集试验确定。
在某些实施方案中,根据本发明的细菌是保藏号为12082902的细菌的变体或后代。
组合物
发明人发现了基于生物型A嗜水气单胞菌的免疫原性组合物和基于生物型B嗜水气单胞菌的免疫原性组合物,并在鲶形目、鲈形目和鲤形目鱼中的攻击研究中提供分别针对生物型A和B的令人满意的抗体应答和充分保护。在这一点上令人惊讶的发现在于发明人实现了将两种菌株组合在一种疫苗中,当用两种生物型的嗜水气单胞菌(即(i)免疫原性含量的任意嗜水气单胞菌菌株,其例如能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082901的菌株代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应,以及(ii)免疫原性含量的任意嗜水气单胞菌菌株,其例如能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082902的菌株代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应)免疫鱼时,所述免疫抑制似乎被中和。嗜水气单胞菌菌株如本文之前所述。
因此,作为第三个主要方面,本发明涉及包含免疫原性含量的细菌和/或由此来源的抗原性和/或免疫原性材料的组合物。
因此,在一个实施方案中,本发明提供一种组合物,其包含免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌或其来源的抗原性和/或免疫原性材料免疫的鱼的抗血清反应;或包含来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
在其他实施方案中,本发明提供一种组合物,其包含免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应;或包含来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
所述组合物可以是单价免疫原性组合物,特征在于其包含:
(i)权利要求1-6任意项中限定的单个生物型A细菌菌株或包含来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料;或者
(ii)权利要求7-12任意项中限定的单个生物型B细菌菌株或包含来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
在其他实施方案中,本发明提供一种组合物,包含:
(i)抗原性和/或免疫原性材料,选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应,以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料;
和
(ii)抗原性和/或免疫原性材料,选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应,以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
已经能够证实以上限定的生物型A和B细菌的血清型特征,因此,本发明的另一实施方案涉及以上限定的组合物,其中所述嗜水气单胞菌细菌能够与来自用如上限定的嗜水气单胞菌生物型A或B免疫的鱼的抗血清反应,并且其中所述组合物特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞菌细菌是减毒活的、灭活的或杀死形式或其任意混合。
在鱼类养殖领域,疫苗的施用通常要求频繁地处理鱼,例如将鱼麻醉转移至水槽,用疫苗注射鱼并随后在水槽或养鱼池之间转移鱼。这些只是与疫苗接种程序相关活动的实例,其会对养殖鱼潜在地造成压力及增加的死亡率。由于现代水产养殖的大规模,疫苗接种程序昂贵、劳动密集且能够对鱼造成压力。出于这些原因,期望提供针对不同传染病的鱼疫苗,优选以例如组合、多价疫苗形式施用,其含有能够对抗几种传染病的几种抗原。
在这方面,发明人进一步证实将属于生物型A或B的嗜水气单胞菌的分离物与其他抗原,例如但不限于鲶鱼爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)、柱状黄杆菌(Flavobacteriumcolumnaris)、海豚链球菌(Streptococcusiniae)、无乳链球菌(Streptocossusagalactiae)、停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)、副乳房链球菌(Streptococcusparauberis)在例如免疫原性组合物或疫苗中组合能够在由所述抗原攻击的鱼中提供有效的免疫应答。已经证实其中来自(i)嗜水气单胞菌生物型A的抗原与鲶鱼爱德华氏菌组合以及来自(ii)嗜水气单胞菌生物型B的抗原与鲶鱼爱德华氏菌组合的免疫原性组合物或疫苗,防止属于生物型A和生物型B的嗜水气单胞菌以及鲶鱼爱德华氏菌的攻击。
因此,在本发明另一个方面,以上限定的组合物特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞菌细菌与一或多种其他抗原组合,例如来自细菌鲶鱼爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌、柱状黄杆菌、海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、副乳房链球菌的抗原。
进一步经证实,例如通过本发明的免疫原性组合物或疫苗免疫的鱼中的有效的免疫效应要求最小量的抗原。
因此,在本发明另一个实施方案中,以上限定的组合物特征在于(i)嗜水气单胞菌细菌以≥107细菌/ml的量存在,和/或(ii)能够与来自由嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应的嗜水气单胞菌细菌以≥107细菌/ml的量存在,和/或(iii)能够与来自由嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应的嗜水气单胞菌细菌以≥107细菌/ml的量存在。
在系统发生比较研究中,基于24种菌株(11种菌株来源于PHARMAQ,13种为可公开获得的参考菌株),本发明人能够证实本发明的感兴趣的生物型A和B之间的系统发生关系。
因此,在本发明另一个方面,以上限定的组合物特征在于甲硫氨酰-tRNA合成酶(metG)和柠檬酸合酶I(gltA)基因的DNA序列:
(i)在嗜水气单胞菌生物型A细菌中内部比较时相同,以及
(ii)在嗜水气单胞菌生物型B细菌中内部比较时相同,以及
(iii)当嗜水气单胞菌生物型A与嗜水气单胞菌生物型B比较时,其显示gltA95-99.9%的DNA序列相同性,以及
(iv)当嗜水气单胞菌生物型A与嗜水气单胞菌生物型B比较时,其显示metG95-99.9%的DNA序列相同性,以及
(v)当嗜水气单胞菌生物型A与嗜水气单胞菌生物型B比较时,其显示95-99.9%的DNA序列相同性。
对此,在第(iii)点中,gltA95-99.9%的DNA序列相同性包括:优选96-99%的gltADNA序列相同性,更优选97-98%的gltADNA序列相同性以及最优选97.4%的gltADNA序列相同性。
在第(iv)点中,metG95-99.9%的DNA序列相同性包括:优选95.5-98%的metGDNA序列相同性,更优选96-97%的metGDNA序列相同性以及最优选96.2%的metGDNA序列相同性。
在第(v)点中,当gltA和metG进行比较时,95-99.9%的DNA序列相同性包括:优选比较时95.5-98%的DNA序列相同性,更优选比较时96-97%的DNA序列相同性以及最优选比较时96.8%的DNA序列相同性。
作为另一个实施方案,以上限定的组合物为适合腹膜内注射的剂型,例如0.01-0.2ml/剂量的体积,更优选0.03-0.15ml/剂量的体积,甚至更优选0.05-0.1ml/剂量的体积。
在本发明另一个实施方案中,以上限定的组合物的剂量限定为包含≥107细菌/ml的量的能够与来自由嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌,和/或≥107细菌/ml的量的能够与来自由嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌。
发明人指出具有来自生物型A的抗原的疫苗防止属于血清群A的嗜水气单胞菌攻击,但不能防止属于血清群B的嗜水气单胞菌攻击。具有来自生物型B的抗原的疫苗防止属于血清群B的嗜水气单胞菌攻击,但不能防止属于血清群A的嗜水气单胞菌攻击。如果疫苗含有来自两种生物型即嗜水气单胞菌生物型A和B的抗原,该疫苗防止来自生物型A和B的嗜水气单胞菌分离物的攻击。
另外已经指出,包含生物型A和生物型B的联合疫苗能够有效提供针对来自例如东南亚的例如嗜水气单胞菌的临床爆发,诸如越南湄公河三角洲的临床爆发所测试的菌株的保护。
因此,在这方面,以上限定的组合物的另一方面是免疫原性组合物例如疫苗形式。
在另一方面,本发明涉及如上限定的细菌或组合物,用于防止或减少鱼中败血病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生,所述鱼特别包括鲶形目、鲈形目和鲤形目的鱼。如果属于鲶形目,所述鱼优选为巨鲶(巴丁鱼)。
用途
作为第四个主要方面,本发明涉及如上限定的细菌或组合物用于制备防止或减少鱼中败血病的发生和/或用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生的药物的用途。
在本发明的具体实施方案中提供上文所述嗜水气单胞菌生物型A的细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型A细菌的抗原性和/或免疫原性材料在制备用于制备防止或减少鱼中败血病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生的组合物中的用途,其中所述组合物与包含嗜水气单胞菌生物型B细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型B细菌的抗原性和/或免疫原性材料的组合物共同施用。
在相等的特定技术方案中本发明提供上文所述嗜水气单胞菌生物型B细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型B细菌的抗原性和/或免疫原性材料在制备用于制备防止或减少鱼中败血病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生的组合物中的用途,其中所述组合物与包含上文所述嗜水气单胞菌生物型A细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型A细菌的抗原性和/或免疫原性材料的组合物共同施用。
其他实施方案提供了包含上文所述嗜水气单胞菌生物型A细菌和/或来自所述嗜水气单胞菌生物型A细菌的免疫原性材料的组合物,用于防止或减少鱼中败血病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生,其中所述组合物与包含上文所述嗜水气单胞菌生物型B细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型B细菌的抗原性和/或免疫原性材料的组合物共同施用。
其他实施方案提供了包含上文所述嗜水气单胞菌生物型B细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型B细菌的抗原性和/或免疫原性材料的组合物,用于防止或减少鱼中败血病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生,其中所述组合物与包含上文所述嗜水气单胞菌生物型A细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型A细菌的抗原性和/或免疫原性材料的组合物共同施用。
在这方面,所述鱼优选是鲶形目、鲈形目和鲤形目。如果属于鲶形目,所述鱼优选为巨鲶(巴丁鱼)。
制备方法
作为第五个主要方面,本发明涉及制备如上限定的组合物的方法,包含组合
(i)抗原性和/或免疫原性材料,选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应,以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料;
和
(ii)抗原性和/或免疫原性材料,选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应,以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
实施例部分提供本发明上述方面的试验背景。
发明详述
用于免疫原性组合物/疫苗的细菌形式
本发明的联合疫苗的细菌可以减毒活形式、灭活形式例如菌苗或甚至片段化形式存在。这一点的重要因素是细菌的免疫原性性能仍然存在。
减毒活细菌相对于菌苗的优势在于它们易于给予而无需佐剂。而且它们自复制到一定程度,直至它们被免疫系统停止,由此能给予较低数量的细胞。另一方面,当细菌以菌苗形式存在时这些细菌也呈现免疫原性特征,其中菌苗相对于减毒活细菌的优势在于它们在应用中非常安全。
因此,在该实施方案的一个优选形式中,本发明涉及免疫原性组合物或疫苗,其中嗜水气单胞菌细胞是灭活的。
细菌的灭活可以通过化学或物理方式获得。化学灭活可通过用例如但不限于酶、甲醛(福尔马林)、β-丙内酯或乙烯亚胺或其衍生物、有机溶剂和/或去污剂处理细菌而进行。物理灭活可有利地通过使细菌接受高能辐射例如UV光、γ辐照或X-射线而进行。这些都是本领域熟知的灭活方式。本发明人的经验是,甲醛(福尔马林)灭活的确是灭活嗜水气单胞菌生物型A和B的有用方式。因此,在一个优选实施方案中,细菌通过添加甲醛灭活。
与其他抗原组合的嗜水气单胞菌生物型A和B
本发明的免疫原性组合物或疫苗还包含将嗜水气单胞菌生物型A和B与其他抗原组合,例如但不限于鲶鱼爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌、柱状黄杆菌、海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、副乳房链球菌。
药物学可接受的载体-佐剂
疫苗是来自特定病原性生物的抗原的各种制备物,其为非病原性的。它们刺激免疫系统并增加对来自特定病原体后续感染疾病的抗性。疫苗可以是基于水或基于油的。通常,注射疫苗是基于油的,因为油提供佐剂性质。这是指油增加疫苗的效力以及期望的保护时间。
适用于油包水乳液的本发明的油佐剂是例如矿物油或可代谢油。可代谢油是例如植物油诸如花生油和大豆油,动物油诸如鱼油角鲨烷和角鲨烯,以及生育酚及其衍生物。
本发明的适合的佐剂是例如油包水乳液、水包油乳液和水包油包水双乳液。本领域已知特别是灭活疫苗,例如菌苗当以油包水乳液给予时显示改善的免疫原性。
疫苗或免疫原性组合物经常与稳定剂混合,例如保护易降解蛋白不被降解,例如增加疫苗的保质期。本发明的有用的稳定剂是碳水化合物例如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、右旋糖酐或葡萄糖,蛋白诸如白蛋白或酪蛋白或其降解产物,以及缓冲液,诸如碱金属磷酸盐,均为本领域已知。
另外,所述疫苗可悬浮于一或多种药物学可接受的载体中。
适用于本发明的疫苗的药物学可接受的载体的实例为无菌水、盐水、含水缓冲液例如PBS等等。
本发明的免疫原性组合物或疫苗,尤其是包含菌苗的免疫原性组合物疫苗在优选方案中也可含有免疫刺激物质。
本发明的免疫原性组合物或疫苗还可包含所谓的“载体”。载体是一种化合物,细菌附着于它,但不与它共价结合。这些载体是生物微囊、微藻酸盐、脂质体和大溶胶(macrosol,亲水性的物质溶解在疏水性的溶剂中而得到),均为本领域已知。
另外,免疫原性组合物或疫苗可包含一或多种适合的表面活性化合物或乳化剂,均为本领域已知。
对适于鱼类和贝类疫苗的佐剂的进一步的阐述可见于JanRaa(1996)的综述文章,其内容通过引用整体并入本文。有用的无机佐剂是本领域技术人员已知的,并且记载于JCAguilarandEGRodriguez,2007,Vaccine25,3752-3762,其内容通过引用整体并入本文。
施用途径(剂型)
可以使用本领域已知的多种施用方式。本发明的免疫原性组合物或疫苗优选通过注射、浸没、浸渍或经口服施用给鱼。浸没施用和腹膜内注射是尤其吸引人的施用方式。作为本发明的优选实施方案,菌苗与佐剂经腹膜内注射是非常有效的接种途径。
尽管可以包括其他剂型,包括基于鱼饲料的固体剂型或用于浸没的液体形式,但本发明的剂型优选为液体剂型,更优选为用于注射,例如腹膜内注射的液体剂型。
以下所列为本发明疫苗施用的几种不同的途径和方式。
口服途径
口服接种抗原是本领域已知的,其中疫苗与饲料混合,或包被于饲料上(包封,topdressed)或生物包囊化。当抗原要整合入饲料中时,需考虑抗原的热敏感性。当疫苗用作饲料中的包被(topdressing)时,通常使用包被剂,以防止抗原从片剂中沥滤,或防止抗原在鱼胃的酸性环境中分解。
当需对鱼苗接种时,可使用生物包囊作用。例如,活饲料诸如卤虫无节幼体(Artemianauplii)、挠足虫或轮虫在疫苗悬液中孵育,之后喂给鱼苗。由于这些活生物是非选择性滤食动物,它们将在其消化道内积累抗原,由此将其自身转化为活的微胶囊。
浸没疫苗
皮肤上皮和鳃具有以广谱及特异性方式保护鱼的机制。浸没接种基于粘膜表面识别其接触的病原体的能力运作。当将鱼浸入含有稀释的疫苗的水中时,来自疫苗的悬浮的抗原可被皮肤和鳃吸收。然后,存在于皮肤和鳃上皮的特化的细胞例如抗体分泌细胞将被活化,并当鱼在后期暴露于活的病原体时保护鱼。定位于皮肤和鳃上皮的其他细胞,例如抗原递呈细胞(巨噬细胞/树突细胞)也吸收疫苗抗原并将其转运至特化的组织,在此建立系统免疫应答。
在浸没接种中,由两种应用方法:浸渍(dip)和浸浴(bath)。在浸渍接种中,将鱼非常短时(通常为30秒)地浸入高浓度疫苗溶液中,通常1份疫苗产物对9份水。对于浸浴接种,鱼较长时间(通常一至几个小时)暴露于较低浓度的疫苗。
注射接种
注射接种需要对鱼轻度麻醉。这减少由于接种的压力,防止机械性损伤并帮助鱼从处理中更快恢复。
注射疫苗可以通过肌内或腹膜内(腹膜腔中)注射施用,但后者是迄今最普遍的并在本发明中优选。腹膜内注射接种包括将疫苗沉积于腹膜腔中,重要的是针应该穿透鱼的目标腹壁1-2mm。短针可能使疫苗沉积于肌肉系统,并造成炎症和差的免疫应答。
作为接种的结果,通常需要两周或更多周(通常约400度日(degreeday))以形成良好的免疫保护。因此,重要的是在接种后的几周内不要对鱼施压,因为已知压力会抑制免疫系统。
注射疫苗具有许多主要的优势,使其成为优选的接种方法。注射疫苗提供长期的保护,即优选整个生产周期,并且其允许多种抗原组合在单独施用给予的单一疫苗中。另外,渔民可以确保群体中的每条鱼均接受疫苗并且剂量正确。
疫苗中所用细菌的量/体积
应当理解,本发明的疫苗应当含有抗原,其量在将组合物适当施用(例如腹膜注射)于鱼后,足以引发免疫应答,优选保护性应答。
当欲进行腹膜注射时,剂型优选具有0.01-0.2ml/鱼的体积,更优选0.03-0.1ml/鱼的体积,甚至更优选0.05-0.1ml/鱼的体积。
相关基因型和表型特征
在其他实施方案中,用于本发明疫苗的细菌是具有与保藏菌株相关或相似的基因型特征的菌株或分离物。“相关或相似”是指如果根据实施例2进行遗传分型,所述菌株将落入与保藏菌株相同的种类/组。落入与本发明保藏菌株相同的种类/组定义为与实施例2的两种基因具有超过99%的核苷酸序列相同性。
在其他实施方案中,用于本发明疫苗的细菌是具有与保藏菌株相关或相似的表型特征的菌株或分离物。“相关或相似”是指表型相似/相关的菌株或分离物将与针对保藏菌株制备的抗血清反应。
本发明的疫苗适用于鱼中,例如鲶形目、鲈形目和鲤形目的鱼中,其包括但不限于巨鲶属、巨鲶(Pangasionodon)属、鮰属、丽鲷属、罗非鱼属和鲤属。
巨鲶
巨鲶是一类鲶形目鲶鱼,属于巨鲶(Pangasiidae)属。巨鲶(Pangasiidae)是泰国湄公河和湄南河流域本地的。国际市场最重要的养殖鱼是巴丁鱼。它们在北美和澳大利亚经常被标记为“巴沙鱼”。在欧洲,这些有通常以“巨鲶(pangasius)”或“巨鲶(panga)”上市。巨鲶(Pangasiidae)是世界上生长最快的水产养殖类型之一,并且大多数养殖的巨鲶来自同一个物种,巴丁鱼。还有一小部分是博氏巨鲶(Pangasiusbocourti)。越南是巨鲶种的主要生产者。
巨鲶(Pangasianodon)属中的种类包括但不限于巴丁鱼和湄公河巨鲶(Pangasianodongigas)。巨鲶属包括但不限于:博氏巨鲶(Pangasiusbocourti)、噬贝鲶(Pangasiusconchophilus)、贾巴鲶(Pangasiusdjambal)、长巨鲶(Pangasiuselongatus)、大肩巨鲶(Pangasiushumeralis)、马来亚巨鲶(Pangasiuskinabatanganensis)、克氏巨鲶(Pangasiuskrempfi)、姜黄巨鲶(Pangasiuskunyit)、拉氏巨鲶(Pangasiuslarnaudii)、石口巨鲶(Pangasiuslithostoma)、大线巨鲶(Pangasiusmacronema)、马哈卡门西斯巨鲶(Pangasiusmahakamensis)、湄公巨鲶(Pangasiusmekongensis)、鼠眼巨鲶(PangasiusMyanmar)、细尾巨鲶(Pangasiusnasutus)、尼氏巨鲶(Pangasiusnieuwenhuisii)、巨鲶(Pangasiuspangasius)、多齿巨鲶(Pangasiuspolyuranodon)、李奥菲勒斯巨鲶(Pangasiusrheophilus)、沙巴巨鲶(Pangasiussabahensis)和长丝巨鲶(Pangasiussanitwongsei)。
河鲶(Ictaluruspunctatis)
河鲶也是鲶形目的一种。本发明的疫苗还涉及河鲶,其为北美最多的鲶鱼种类,因为过去十年该种类在美国水产养殖的快速增长。河鲶还产于例如中国等其他国家。
罗非鱼类群
罗非鱼群(tribeTilapiini)属于鲈形目丽鱼科(Cichlids)。该群包括口孵非鲫属、帚齿非鲫属和罗非鱼属。罗非鱼类群是在渔业养殖中商业化最重要的鱼类之一,这缘于它们的尺寸、快速生长、其食草动物本性和适口性。
罗非鱼是渔业养殖努力的焦点,例如在中国(世界上最大的罗非鱼生产者),随后是埃及、印度尼西亚、菲律宾、泰国、巴西、越南和台湾。
罗非鱼群(tribeTilapiini)的种类包括但不限于尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)、奥利亚口孵非鲫(Oreochromisaureus)、亨氏口孵非鲫(Oreochromishunteri)、红腹非鲫(Tilapiabakossiorum)、巴劳氏非鲫(Tilapiabaloni)、比氏非鲫(Tilapiabemini)、双线非鲫(Tilapiabilineata)、短手非鲫(Tilapiabrevimanus)、巴苏非鲫(Tilapiabusumana)、布氏非鲫(Tilapiabuttikoferi)、深非鲫(Tilapiabythobates)、卡布拉非鲫(Tilapiacabrae)、金马伦非鲫(Tilapiacameronensis)、喀麦隆非鲫(Tilapiacamerunensis)、塞西非鲫(Tilapiacessiana)、科菲非鲫(Tilapiacoffea)、康杰非鲫(Tilapiacongica)、达氏非鲫(Tilapiadageti)、德氏非鲫(Tilapiadeckerti)、杂色非鲫(Tilapiadiscolor)、黄非鲫(Tilapiaflava)、吉纳非鲫(Tilapiaguinasana)(OtjikotoTilapia)、几内亚非鲫(Tilapiaguineensis)(Guineantilapia)、大咽非鲫(Tilapiagutturosa)、瓦鳞非鲫(Tilapiaimbriferna)、喜暖非鲫(Tilapiaismailiaensis)、贾氏非鲫(Tilapiajallae)、乔克非鲫(Tilapiajoka)、科特非鲫(Tilapiakottae)、卢卡非鲫(Tilapialouka)、珍珠非鲫(Tilapiamargaritacea)、点非鲫(Tilapiamariae)(Blackmangrovecichlid)、尼翁非鲫(Tilapianyongana)、伦氏非鲫(Tilapiarendalli)(Bluetilapia)、溪非鲫(Tilapiarheophila)、鲁氏非鲫(Tilapiaruweti)(Okavangotilapia)、施氏非鲫(Tilapiasnyderae)、斯氏非鲫(Tilapiasparrmanii)(Bandedbream)、绵非鲫(Tilapiaspongotroktis)、索氏非鲫(Tilapiatholloni)/赛氏非鲫(Tilapiathysi)、沃氏非鲫(Tilapiawalteri)、齐氏非鲫(Tilapiazillii)(Cichlid)。
鲤鱼
鲤鱼是鲤形目和鲤科的各种淡水鱼,这是欧洲和亚洲本地的非常大的类群的鱼。鲤鱼的种类包括但不限于:鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)(silvercarp)、鲤鱼(Cyprinuscarpio)(commoncarp)、草鲤鱼(Ctenopharyngodonidella)(grasscarp)、鳙鱼(Hypophthalmichthysnobilis)(bigheadcarp)、黑鲫(Carassiuscarassius)(Cruiancarp)、卡特拉魮(Cyprinuscatla)(Catlacarp)、卷须鲮(Cirrhinuscirrhosus)(Mrigalcarp)、青鱼(Mylopharyngodonpiceus)(Blackcarp)、鲮鱼(Cirrhinusmolitorella)(Mudcarp)和南亚野鲮(Labeorohita)(Roho).
定义
嗜水气单胞菌
嗜水气单胞菌是革兰氏阴性杆状细菌,0.3-1微米宽,1-3微米长。嗜水气单胞菌通常被认为是鱼中的无毒或二级病原体,并且主要见于温暖气候地区。该细菌可见于淡水或微咸水中,并且经常对最常见抗生素具有抗性。嗜水气单胞菌已知在许多种鱼中造成疾病,例如罗非鱼(尼罗口孵非鲫)、鲶鱼(Clariasbatrachus,Ichtaluruspunctatus)、金鱼(Crassiusauratus)、普通鲤鱼(Cyprinuscarpio)、鳗鱼(欧洲鳗鲡)和虹鳟鱼(虹鳟)(Santosetal1988,PridgeonandKlesius2011,Esteveetal1994)。
分离
当与本发明的细菌相关使用时,术语“分离”指从其天然环境,例如来自其鱼宿主的细胞和组织中脱离时的细菌。特别的,术语“分离”指培养物,例如来自感染宿主的组织样品的细菌纯培养物。
联合疫苗/多价疫苗
联合疫苗/多价疫苗定义为一种疫苗,其由组合成单一产物的两种或更多种单独的免疫原组成。
尽管单价疫苗设计为针对单一抗原或单一微生物免疫,多价联合疫苗能够提供针对多种不同疾病的免疫。与多价疫苗相比,单价疫苗通常提供针对相关抗原的增加的免疫。这可以解释为在多价疫苗中,当其在接种的鱼中产生免疫应答时,不同生物型之间会发生干扰,而在单价疫苗中则不会发生该干扰。
临床爆发
临床爆发是流行病学研究术语,用于流行病学以描述在特定时间和地点疾病的发生高于预期。
运动型气单胞菌属败血症(败血病)
败血症(又名败血病)是指在血流中存在病原性生物,导致败血病。
由嗜水气单胞菌造成的败血病或运动型气单胞菌属败血症是越南巨鲶养殖中最常见的疾病之一。在湄公河三角洲,运动型气单胞菌属败血症可整年发作,因季节由湿变干或诸如处理、运输、高水平的亚硝酸盐、氨等的应激物尤其会造成显著损失。运动型气单胞菌属败血症的临床症状是来自细菌的溶血素造成的出血。
大多数被感染鱼所观察到的外部迹象是大头、突眼症、鱼表面红化、肛门和鳍出血。溃疡性皮肤病变也常见于被感染的鱼,伴随鳍或尾坏死(腐鳍病)。
在内部,临床积水中会有过量清澈或微红液体,但大多数情况下,主要特征是具有亮红色的内脏充血。脾可视化增大、变圆且显示樱桃红。增大的肾脏经历了液化性坏死,并且当其被切开时,坏死性液体渗出。
发明人证实嗜水气单胞菌是对巨鲶鱼非常高毒性的病原体。在一个实验中,100-2000cfu生物型A/鱼的攻击剂量和100-6000cfu生物型B/鱼的攻击剂量在2天内造成60-100%的鱼死亡率。观察到运动型气单胞菌属败血症的临床病症,并从死鱼中重新分离出嗜水气单胞菌。
在本领域中,当涉及嗜水气单胞菌时,温度的突然变化或对鱼的处理或转移会导致损失。运动型气单胞菌属败血症会在整个养殖周期中造成损失,在特定水塘中会反复爆发。在爆发期内,养殖的鱼会被其他病原体感染,给渔民造成严重损失。
生物型
用于例如本发明的组合物或疫苗的细菌是具有与保藏菌株相关或相似的基因型特征的菌株或分离物。“相关或相似”是指如果根据实施例2对基因型相似/相关的菌株或分离物进行遗传分型,它们将落入与保藏菌株相同的组,即与SEQIDNo.1和2(生物型A)或SEQIDNo.3和4(生物型B)具有至少99%的相同性。
另外,用于例如本发明的组合物或疫苗的细菌是具有与保藏菌株相关或相似的表型特征的菌株或分离物。“相关或相似”是指例如表型相似/相关的菌株或分离物将与针对保藏菌株制备的抗血清反应。
免疫原性含量
嗜水气单胞菌细胞的免疫原性含量是诱导免疫应答所必需的抗原的含量,与未接种的鱼相比,所述免疫应答至少能够降低疾病的严重性和/或感染发生率。
序列相同性
在本发明的上下文中,术语“序列相同性”是指两个核苷酸序列之间的同源性程度的定量测量。如果进行比较的两个序列不等长,它们必须进行比对以产生最好的可能的匹配,其允许插入缺口或可选地,在核苷酸末端截断。序列相同性可根据计算,其中Ndif是比对时两个序列中不相同残基的总数,并且其中Nref是一个序列中的残基数。因此,DNA序列AGTCAGTC将与序列AATCAATC具有75%的序列相同性(Ndif=2,Nref=8)。缺口被计算为特定残基的非相同性,即DNA序列AGTGTC将与DNA序列AGTCAGTC具有75%的序列相同性(Ndif=2,Nref=8)。
对于所有与核苷酸序列相关的本发明的实施方案,一或多个序列之间的序列相同性百分比也可基于使用clustalW软件(http:/www.ebi.ac.uk/clustalW/index.html)以默认设置进行的比对。对于核苷酸序列比对,这些设置是:比对=3Dfull,GapOpen10.00,GapExt.0.20,GapseparationDist.4,DNA权重矩阵:相同性(IUB)。对于氨基酸序列比对,这些设置是:比对=3Dfull,GapOpen10.00,GapExt.0.20,GapseparationDist.4,蛋白质权重矩阵:Gonnet。
可选地,核苷酸序列可以使用程序DNASISMax进行分析,序列比较可在http://www.paralign.org/进行。该服务基于两种名为Smith-Waterman(SW)和ParAlign的比较算法。第一种算法由Smith和Waterman(1981)公开并且是一种成熟的方法,其发现两个序列的最优局部比对。另一种算法ParAlign是序列比对的启发方法,关于该方法的细节公开于Rognes(2001)。可以使用得分矩阵和空位罚分以及E-值的默认设置。
基因型特征
术语“基因型特征”广义上是指个体基因或基因组的一或多个部分的组成,并总是反应在个体DNA序列中。
表型特征
术语“表型特征”在本申请中是指生物的一或多个可观察的性能,其由个体的遗传基因型和/或非遗传环境变异(例如转录变异、移动DNA和质粒、基因组重排等)的相互作用产生。在本发明的上下文中,术语“相关表型特征”包括任意以下特征:大小、形状。“表型特征”还包括在鱼中诱导任意嗜水气单胞菌的临床症状,包括本申请中所述的严重病理征象的能力。“表型特征”还包括细菌显示与保藏菌种相同的抗原的能力,即与针对保藏菌种制备的抗血清反应。
药物学可接受的载体
药物学可接受的载体可以是水或缓冲液,或乳剂例如水包油或油包水乳剂。
油包水乳剂
包含水和油的乳剂通常是指油包水乳剂、水包油或水包油包水乳剂。乳剂究竟变成油包水乳剂或水包油乳剂取决于两相的体积分数和乳化剂类型。通常,乳化剂稳定乳剂。
病理学
嗜水气单胞菌对许多生物具有毒性,并且在进入宿主体内后,其穿过血流到达第一可用器官。嗜水气单胞菌被认为是机会性病原体,指其很少感染健康个体。嗜水气单胞菌被广泛认为是鱼病原体。当感染嗜水气单胞菌时,鱼可以出现疡、烂尾病、腐鳍病和出血性败血症。出血性败血症造成病变,其导致鳞片脱落、鳃及肛区出血、溃疡、突眼症和腹部水肿。
种系发生
种系发生涉及生物之间的进化关系。这通常通过分析感兴趣的生物中的一或几个保守基因(通常是进化缓慢的管家基因)的DNA(或翻译蛋白)序列而进行。该基因必须在经分析的所有生物中均存在。用于该目的的最“著名”的基因是16SrRNA基因,其在所有细菌之间高度保守。然而,由于其非常高水平的保守性,其通常不适于在相同种内比较不同的菌株。因此,其他保守性较低的管家基因用于区分相似的细菌菌株。并且通过同时组合几种管家基因的进化,种系发生预测变得更强力。多位点序列分型(MLST),又名多位点序列分析(MLSA)通过将来自例如5-9种基因的序列信息组合实现此目的。种系发生关系通常以种系发生树代表,其使用生物DNA序列作为输入由复杂算法产生。
多位点序列分型(MLST)
MLST是分子生物学中用于多位点分型的技术。其过程能够使用多种管家基因(即组成型基因,以相对恒定的水平转录)的内部片段的DNA序列表征微生物种的分离物。该表征基于这些管家基因的序列差异。
玻片凝集试验
凝集反应是例如含抗原的微生物的悬液中在特异性抗体存在时的凝块。
玻片凝集试验是一种试验,其中一定含量的浓缩抗原和例如鱼血清在玻片上混合以反应特定时间,之后确定凝集反应的存在。
相对生存百分比(RPS)
RPS代表鱼的百分比,若不针对给定疾病进行防护,该鱼会因此死亡,即由于接种而存活的鱼的比例。经济上可接受的成功接种应当超过60%的RPS值,这意味着在疾病爆发的情况下,未针对该特定疾病接种的鱼会比接种的鱼蒙受至少三倍的死亡损失。
RPS=[l-(接种组死鱼%/对照组死鱼%)]*100
应当注意,本发明诸多方面之一中描述的实施方案和特征也可用于本发明的其他方面。
本发明中引用的所有专利和非专利参考文献通过引用整体并入本文。
项目
1.分离的嗜水气单胞菌生物型A细菌,所述菌株选自以下组:
(i)根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏于英国SP40JG威尔特郡索尔兹伯里市波顿镇的健康保护局培养物中心(HealthProtectionAgencyCultureCollections,PortonDown,Salisbury,Wiltshire,SP40JG,UK)的保藏号为12082901的细菌;
(ii)能够与来自用i)中限定的细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌。
2.根据项目1的细菌,所述细菌具有与项目1中限定的保藏的细菌相关的基因型和/或表型特征。
3.根据项目1或2的细菌,其中所述表型特征包括当在重10-20g的鱼中经腹膜内注射100-2000cfu/鱼的量以及0.1ml的注射体积时,在巨鲶(巴丁鱼)中诱导败血病,并且任选地,诱导死亡的临床症状的能力。
4.根据之前项目任意项的细菌,其中所述表型特征包括在重10-20g的鱼中经腹膜内注射100-2000cfu/鱼的量以及0.1ml注射体积的所述细菌后的2-5天内,在巨鲶(巴丁鱼)中诱导败血病,并且任选地,诱导至少50%死亡的临床症状的能力。
5.根据之前项目任意项的细菌,其中所述基因型特征包含甲硫氨酰-tRNA合成酶(metG)基因,该基因包含与SEQIDNO:1所示序列至少99%相同的序列,和/或柠檬酸合酶(gltA)基因,该基因包含与SEQIDNO:2所示序列至少99%相同的序列。
6.根据之前项目任意项的细菌,其中与来自用所述保藏的细菌免疫的鱼的抗血清反应的能力由本文所述的玻片凝集试验确定。
7.分离的嗜水气单胞菌生物型B细菌,所述菌株选自以下组:
(i)根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏于英国SP40JG威尔特郡索尔兹伯里市波顿镇的健康保护局培养物中心(HealthProtectionAgencyCultureCollections,PortonDown,Salisbury,Wiltshire,SP40JG,UK)的保藏号为12082902的细菌;
(ii)能够与来自用i)中限定的细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌。
8.根据项目7的细菌,所述细菌具有与项目7中限定的保藏的细菌相关的基因型和/或表型特征。
9.根据项目7或8的细菌,其中所述表型特征包括当在重10-20g的鱼中经腹膜内注射100-6000cfu/鱼的量以及0.1ml的注射体积时,在巨鲶(巴丁鱼)中诱导败血病,并且任选地,诱导死亡的临床症状的能力。
10.根据项目7-9任意项的细菌,其中所述表型特征包括在重10-20g的鱼中经腹膜内注射100-6000cfu/鱼的量以及0.1ml注射体积的所述细菌后的2-5天内,在巨鲶(巴丁鱼)中诱导败血病,并且任选地,诱导至少50%死亡的临床症状的能力。
11.根据项目7-10任意项的细菌,其中所述基因型特征包含甲硫氨酰-tRNA合成酶(metG)基因,该基因包含与SEQIDNO:3所示序列至少99%相同的序列,和/或柠檬酸合酶(gltA)基因,该基因包含与SEQIDNO:4所示序列至少99%相同的序列。
12.根据项目7-11任意项的细菌,其中与来自用所述保藏的细菌免疫的鱼的抗血清反应的能力由本文所述的玻片凝集试验确定。
13.一种组合物,其包含免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌或其来源的抗原性和/或免疫原性材料免疫的鱼的抗血清反应;或包含来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
14.一种组合物,其包含免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应;或包含来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
15.一种组合物,包含:
(i)抗原性和/或免疫原性材料,选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应,以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料;
和
(ii)抗原性和/或免疫原性材料,选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应,以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
16.根据项目13-15任意项的组合物,其中能够与来自由嗜水气单胞菌生物型A免疫的鱼的抗血清反应的所述嗜水气单胞菌细菌如项目1-7任意项限定。
17.根据项目13-16任意项的组合物,其中能够与来自由嗜水气单胞菌生物型B免疫的鱼的抗血清反应的所述嗜水气单胞菌细菌如项目8-12任意项限定。
18.根据项目13-17任意项的组合物,特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞菌细菌是减毒活的形式。
19.根据项目13-18任意项的组合物,特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞菌细菌是灭活的形式。
20.根据项目13-19任意项的组合物,特征在于免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌是杀死的形式。
21.根据项目13-20任意项的组合物,特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞菌细菌以减毒活的、灭活的和杀死形式的混合物存在。
22.根据项目13-21任意项的组合物,特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞菌细菌与一或多种其他抗原组合,例如来自细菌鲶鱼爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌、柱状黄杆菌、海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、副乳房链球菌的抗原。
23.根据项目13-22任意项的组合物,特征在于嗜水气单胞菌细菌以≥107细菌/ml的量存在。
24.根据项目13-23任意项的组合物,特征在于能够与来自由嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应的所述嗜水气单胞菌细菌以≥107细菌/ml的量存在。
25.根据项目13-24任意项的组合物,特征在于能够与来自由嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应的所述嗜水气单胞菌以≥107细菌/ml的量存在。
26.根据项目13-25任意项的组合物,其中甲硫氨酰-tRNA合成酶(metG)和柠檬酸合酶I(gltA)基因的DNA序列:
(i)在嗜水气单胞菌生物型A细菌中内部比较时相同,以及
(ii)在嗜水气单胞菌生物型B细菌中内部比较时相同,以及
(iii)当嗜水气单胞菌生物型A与嗜水气单胞菌生物型B比较时,其显示gltA95-99.9%的DNA序列相同性,以及
(iv)当嗜水气单胞菌生物型A与嗜水气单胞菌生物型B比较时,其显示metG95-99.9%的DNA序列相同性,以及
(v)当嗜水气单胞菌生物型A与嗜水气单胞菌生物型B比较时,其显示95-99.9%的DNA序列相同性。
27.根据项目13-26任意项的组合物,特征在于组合物为适合腹膜内注射的剂型。
28.根据项目27的组合物,特征在于剂型优选具有0.01-0.2ml/剂量的体积。
29.根据项目28的组合物,其中每个剂量包含以≥107细菌/ml的量存在的能够与来自由嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌,和/或以≥107细菌/ml的量存在的能够与来自由嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌。
30.根据项目13-29任意项的组合物,特征在于其为免疫原性组合物。
31.根据项目13-30任意项的组合物,特征在于其为疫苗形式。
32.根据项目1-12任意项的细菌或根据项目13-31任意项的组合物,用于防止或减少鱼中败血病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生。
33.根据项目32的细菌或组合物,特征在于所述鱼是鲶形目、鲈形目和鲤形目的鱼。
34.根据项目33的细菌或组合物,其中所述鱼是巨鲶(巴丁鱼)。
35.根据项目1-12任意项的细菌或根据项目13-31任意项的组合物用于制备防止或减少鱼中败血病的发生和/或用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生的药物的用途。
36.根据项目35的用途,特征在于所述鱼是鲶形目、鲈形目和鲤形目的鱼。
37.根据项目36的用途,其中所述鱼是巨鲶(巴丁鱼)。
38.根据项目1-6任意项的细菌或来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料在制备用于防止或减少鱼中败血病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生的组合物中的用途,其中所述组合物与包含根据项目7-12任意项的细菌的组合物共同施用。
39.根据项目7-12任意项的细菌或来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料在制备用于防止或减少鱼中败血病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生的组合物中的用途,其中所述组合物与包含根据项目1-6任意项的细菌的组合物共同施用。
40.一种组合物,包含根据项目1-6任意项的嗜水气单胞菌生物型A细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型A细菌的抗原性和/或免疫原性材料,用于防止或减少鱼中败血病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生,其中所述组合物与包含根据项目7-12任意项的嗜水气单胞菌生物型B细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型B细菌的抗原性和/或免疫原性材料的组合物共同施用。
41.一种组合物,包含根据项目7-12任意项的嗜水气单胞菌生物型B细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型B细菌的抗原性和/或免疫原性材料,用于防止或减少鱼中败血病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生,其中所述组合物与包含根据项目1-6任意项的嗜水气单胞菌生物型A细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型A细菌的抗原性和/或免疫原性材料的组合物共同施用。
42.制备项目13-31任意项限定的组合物的方法,包含组合
(i)抗原性和/或免疫原性材料,选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应,以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料;
和
(ii)抗原性和/或免疫原性材料,选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应,以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
在以下非限制性实施例中将对本发明做更为详细的描述。
实施例1:从巨鲶分离嗜水气单胞菌
嗜水气单胞菌在巨鲶中造成名为败血病或运动型气单胞菌属败血症的疾病。这是越南巨鲶养殖中最常见的疾病之一。在湄公河地区,当季节由湿变干,和/或当鱼因例如处理、运输、高水平的亚硝酸盐或氨或其他类型的环境压力受到压力时,运动型气单胞菌属败血症的爆发更为普遍。
运动型气单胞菌属败血症的临床症状是溶血素造成的出血。被感染鱼通常所观察到的外部迹象是大头、突眼症、鱼表面红化以及肛门和鳍出血。溃疡性皮肤病变也常见于被感染的鱼,伴随鳍或尾坏死(腐鳍病)。
在内部,临床积水中会有过量清澈或微红液体,但大多数情况下,主要特征是具有亮红色的内脏充血。脾可视化增大、变圆且显示樱桃红。增大的肾脏经历了液化性坏死,并且当其被切开时,坏死性液体渗出。
为了分离嗜水气单胞菌,将无菌细菌环插入鱼肾或脾并在例如胰蛋白酶大豆琼脂平板上直接划线。嗜水气单胞菌显示为乳白色圆形菌落。嗜水气单胞菌为革兰氏阴性杆状细菌,0.3-1微米宽,1-3微米长。
实施例2:嗜水气单胞菌的种系发生
为了对通过实施例1所述方法获得的嗜水气单胞菌分离物进行分类,使用简化的MLST-方案,其基于Martinoetal.,2011(通过引用并入本文),使用甲硫氨酰-tRNA合成酶(metG)和柠檬酸合酶I(gltA)基因中的遗传信息进行种系发生预测。
使用Martinoetal.,2011中所述引物进行PCR,其通过引用并入本文。使用Vector软件对DNA序列进行装配、质检和修整。外部参照序列获自http://pubmlst.orq/aeromonas,包括来自Martinoetal.,2011的所有嗜水气单胞菌菌株,以及一些其他的用于参照目的的气单胞菌属种(完整的菌株信息参见下表)。在MEGA5中进行序列比对和种系发生预测,如Tamuraetal.,2011中所述,其通过引用并入本文,参数如下:
统计方法:最大似然法(100引导重复(Bootstrap重复))
替代模型:Tamura-Nei模型
评级:不变位点的γ分布(16个不连续的γ类别)
基于对metG和gltA的DNA序列分析,发明人限定了经分析菌株的两个不同的并且独立的种系发生组。为了简便起见,这两个组在图1中被标为A和B。这两组中的菌株内部比较时相同,然而当与另一组中的菌株相比时,它们显示出gltA97.4%的DNA序列相同性,metG96.2%的DNA序列相同性以及组合时(gltA+metG)96.8%的DNA序列相同性。
表1:种系发生比较中包括的所有24种菌株的信息如上所示,由来自PHARMAQ的11种菌株和13种参照菌株组成。*如基于网络的MLST序列数据库(http://pubmlst.org/aeromonas)所限定。**表格由Martinoetal.,2011调整而得。
实施例3a从鱼中分离的不同的嗜水气单胞菌菌株的毒性
如实施例1所述分离嗜水气单胞菌生物型A(AL20258)、生物型B(AL20212)和PQ110155(非生物型A或B),并在TSB中繁殖24小时。在28℃淡水中饲养的重18g的鱼(巴丁鱼)注射0.1ml的两种不同浓度的细菌悬液(低于500cfu/鱼)。攻击后持续观察死亡率。嗜水气单胞菌生物型A和B引发快速死亡,而PQ110155无毒性。随着攻击剂量的使用,与生物型B相比,注射生物型A的鱼产生更高的死亡率。死鱼均显示气单胞菌败血症的症状。
该实验表明嗜水气单胞菌生物型A和B对巨鲶具有毒性并且是巨鲶的原发性病原体。
实施例3b从鱼中分离的不同的嗜水气单胞菌菌株的毒性
约12.5g重的巨鲶在27℃的淡水中饲养。嗜水气单胞菌生物型A或B的不同分离物通过腹膜内注射用于攻击在分开的水槽中的20条鱼的平行组。每天计数死亡率并计算累积死亡率。所有水槽中的鱼均显示运动型气单胞菌属败血症的临床症状。使用≤6000细菌/鱼的剂量,所有菌株均诱导鱼快速的高死亡率。
该实验表明嗜水气单胞菌菌株生物型A和B均具有毒性并造成巨鲶的死亡。一些菌株在用≤1000细菌/鱼的剂量攻击时造成死亡,而其他菌株在用略高的攻击剂量时造成高死亡率。嗜水气单胞菌可以是巨鲶的原发性病原体。
表3:来自生物型A或B的不同的嗜水气单胞菌菌株用于攻击约12.5g的巨鲶。用%计算每个水槽中的累积死亡率。
实施例4:来自巨鲶的嗜水气单胞菌分离物的血清学
200条平均重量为30g的巨鲶鱼(巴丁鱼)分为2组并用嗜水气单胞菌的单价疫苗接种,所述单价疫苗基于菌株AL20136=生物型A或基于菌株AL20212=生物型B。
疫苗配制为油包水乳液疫苗,每条鱼经腹膜内注射0.1ml疫苗。接种后4周收集用来自各自疫苗接种的鱼的血液样品。血液冷却(18-20℃)保存并使其凝结,然后在6000rpm离心5分钟,之后收集血清。血清用于96孔板中的玻片凝集试验和直接凝集试验。
用于所述试验的细菌的制备:
如实施例1所述从巨鲶分离细菌。冷冻保存的细菌在TSA(胰蛋白酶大豆琼脂)上复苏并在28℃孵育12小时。在TSA上孵育后,单菌落转移至TSB(胰蛋白酶大豆肉汤)然后在28℃孵育12小时。
细菌培养物在3500rpm离心15分钟,去除培养基,清洗细菌一次并在无菌盐水中重悬。用1%福尔马林灭活细菌悬液并在4℃储存备用。
凝集试验-96孔板测试:
直接凝集试验用于检测收集自两个不同的接种鱼组的血清与收集自巨鲶的24种不同的嗜水气单胞菌菌株之间的交叉反应。
在平板中将血清稀释两倍,并将等体积的如上所述制备的细菌添加至每孔。包括阳性和阴性对照。将平板放在4℃,8小时和24小时后记录结果。当细菌聚集形成肉眼易于观察的结构时为阳性结果。当溶液保持浑浊且不形成聚集时为阴性结果。观察到凝集的最高血清稀释的孔数记录为结果。抗血清的相应稀释如下:
孔 | 抗血清稀释 |
1 | 未稀释 |
2 | 1∶2 |
3 | 1∶4 |
4 | 1∶8 |
5 | 1∶16 |
6 | 1∶32 |
7 | 1∶64 |
8 | 1∶128 |
9 | 1∶256 |
10 | 1∶512 |
11 | 1∶1024 |
12 | 1∶2048 |
表4:在各孔中的抗血清稀释
玻片凝集试验:
使用以下程序。将一滴无菌盐水置于干净的玻片上。挑取来自TSA平板的单菌落并与水混合。添加一滴鱼血清,30秒后记录结果。当细菌聚集形成肉眼易于观察的结构时为阳性结果。当溶液保持浑浊且不形成聚集时为阴性结果。
用含有来自嗜水气单胞菌生物型A或B的抗原的油包水疫苗接种巨鲶。接种后4周从接种的鱼采集血液样品。当鱼接种时,它们将对疫苗应答并产生针对疫苗中的抗原的特异性抗体。鱼血清凝集嗜水气单胞菌生物型A或生物型B细菌的能力表明这些生物型是否相似。如果生物型相似,血清将以相同的水平使其凝集。
结果表明来自生物型A接种的鱼的血清与生物型A菌株的凝集比生物型B菌株好很多,反之亦然。这证实生物型A和生物型B代表两种不同的嗜水气单胞菌生物型。当针对一种生物型产生抗血清时,该抗血清不与其他生物型产生相同的反应,反之亦然。
接种后4周
表5a:来自96孔板凝集试验的结果。来自生物型A接种的鱼的血清。测试来自10条鱼的血清。显示凝集的最高血清稀释的孔记录为试验结果。
表5b:来自96孔板凝集试验的结果。来自生物型B接种的鱼的血清。测试来自10条鱼的血清。显示凝集的最高血清稀释的孔记录为试验结果。
嗜水气单胞菌
继而测试分离自巨鲶的几种其他菌株与来自生物型A或生物型B疫苗接种的鱼的血清的凝集。这通过玻片凝集试验进行。
来自玻片凝集试验的结果:
No | ID | 抗生物型A | 抗生物型B | 血清群 |
1 | PQ110255 | + | - | A |
2 | AL20136 | + | - | A |
3 | AL20215 | - | + | B |
4 | AL20262 | + | - | A |
5 | AL20255 | + | - | A |
6 | PQ110466 | + | - | A |
7 | AL20257 | + | - | A |
8 | PQ110098 | + | - | A |
9 | PQ110458 | + | - | A |
10 | PQ110445 | + | - | A |
11 | AL20258 | + | - | A |
12 | PQ120160 | + | - | A |
13 | AL20212 | - | + | B |
14 | PQ110367 | + | - | A |
15 | PQ110488 | + | - | A |
16 | PQ110440 | + | - | A |
17 | AVH74 | + | - | A |
18 | PQ110501 | - | - | 无 |
19 | PQ110503 | + | - | A |
20 | PQ110345 | + | - | A |
21 | AL20263 | + | - | A |
22 | PQ120604 | + | - | A |
23 | PQ110490 | + | - | A |
24 | PQ110228 | + | - | A |
表6:通过所述直接凝集试验测试分离自巨鲶的不同气单胞菌属菌株。+=观察到凝集。=未观察到凝集。
结果表明分离自巨鲶中的气单胞菌属越南临床爆发的大多数菌株属于生物型A或B。
实施例5:嗜水气单胞菌生物型A和生物型B之间的交叉保护
制备具有属于生物型A或B的嗜水气单胞菌的不同分离物的疫苗(水溶液或油包水乳液中的灭活细菌),并通过腹膜内注射0.05ml所述疫苗对巨鲶进行免疫。抗原浓度≥107细菌/ml。巨鲶在标准条件下保持在28±2℃的淡水中。接种后2-20周通过向腹膜腔注射1000-10000cfu的嗜水气单胞菌对鱼进行攻击。每天计数死鱼,攻击持续直至两天内任意组中不再发生死亡。使用以下公式计数相对生存%(RPS):
RPS=[l-(接种组死鱼%/对照组死鱼%)]*100
当RPS≥60时,鱼被认为受到疫苗保护。
+=保护,-=未保护
表7:用含有来自生物型A、B或两者的抗原的疫苗免疫的巨鲶通过不同的生物型A或B菌株进行攻击。“+”表示鱼受到疫苗保护。“-”表示鱼未受到疫苗保护。
结果表明具有来自生物型A的抗原的疫苗防止属于生物型A的嗜水气单胞菌攻击,但不能防止属于生物型B的嗜水气单胞菌攻击。具有来自生物型B的抗原的疫苗防止属于生物型B的嗜水气单胞菌攻击,但不能防止属于生物型A的嗜水气单胞菌攻击。
如果疫苗含有来自两种嗜水气单胞菌生物型的抗原,该疫苗防止来自生物型A和B的嗜水气单胞菌分离物的攻击。
实施例6.针对嗜水气单胞菌的联合疫苗
根据标准方法制备具有属于生物型A或B的嗜水气单胞菌和鲶鱼爱德华氏菌的分离物的疫苗(油包水乳剂),并通过腹膜内注射0.05ml对巨鲶进行免疫。嗜水气单胞菌抗原的浓度≥107细菌/ml,并且鲶鱼爱德华氏菌抗原的浓度≥109细菌/ml。巨鲶在标准条件下保持在28℃±2℃的淡水中。接种后2周和17周通过向腹膜腔注射1000-6000cfu的嗜水气单胞菌生物型A或生物型B或≥104的鲶鱼爱德华氏菌对鱼进行攻击。嗜水气单胞菌生物型A和B以及鲶鱼爱德华氏菌菌株用于攻击。每天计数死鱼,攻击持续直至两天内任意组中不再发生死亡。使用以下公式计算相对生存%(RPS)
RPS=[l-(接种组死鱼%/对照组死鱼%)]*100
当RPS≥60时,鱼被认为受到疫苗保护。
结果表明具有来自嗜水气单胞菌生物型A和B以及鲶鱼爱德华氏菌的组合抗原的疫苗防止属于生物型A和生物型B的嗜水气单胞菌以及鲶鱼爱德华氏菌的攻击。
表8:用含有来自嗜水气单胞菌生物型A和B以及鲶鱼爱德华氏菌的抗原的疫苗对鱼进行接种。接种后2周和17周通过用嗜水气单胞菌生物型A、嗜水气单胞菌生物型B或鲶鱼爱德华氏菌进行攻击,测量疫苗的保护效果。产生相对生存百分比(RPS)≥60的疫苗被认为是保护性的。(+=保护性疫苗,相对生存百分比(RPS)≥60)。
实施例7:罗非鱼(尼罗罗非鱼)中的嗜水气单胞菌接种和攻击
在可控的实验室试验中测试含有嗜水气单胞菌生物型A、嗜水气单胞菌生物型B以及鲶鱼爱德华氏菌的疫苗在罗非鱼(尼罗罗非鱼)中的效力,其中接种和未接种(对照)的鱼接受实验性攻击。120条罗非鱼接种含有嗜水气单胞菌生物型A、嗜水气单胞菌生物型B以及鲶鱼爱德华氏菌的0.05ml的多价(油包水乳液)疫苗。抗原浓度≥107细菌/ml。接种和对照鱼(120条罗非鱼)经标记并于28℃共同保持在相同的水槽中。
接种3周后,将30条来自接种组的鱼和30条来自未接种对照组的鱼转移至攻击水槽,并以两种不同的攻击剂量在重复水槽中使用嗜水气单胞菌生物型A进行攻击(水槽1-4)。每天计数死鱼,攻击持续直至两天内任意组中不再发生死亡。使用以下公式计数相对生存%(RPS):
RPS=[l-(接种组死鱼%/对照组死鱼%)]*100
结论:嗜水气单胞菌生物型A在罗非鱼中具有毒性。含有嗜水气单胞菌生物型A的多价疫苗引发针对嗜水气单胞菌生物型A攻击的保护。
实施例8.在不同种鱼类中的嗜水气单胞菌接种和攻击
制备含有嗜水气单胞菌抗原的疫苗并通过腹膜内注射进行鱼接种。所用的鱼类是由普通鲤鱼(Cyprinuscarpio)代表的鲤鱼和南亚野鲮(Labeorohita)、由尼罗罗非鱼代表的罗非鱼和澳洲肺鱼(Latexcalcarifer)。接种2-4周后,用至少一种嗜水气单胞菌毒性菌株对鱼进行攻击,未接种对照组中的死亡率与接种鱼中的死亡率进行比较。计算相对生存百分比,具有RPS≥60的疫苗被认为有效。
微生物保藏的收据
以下菌株已根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”进行保藏。
发明人于2012年8月29日将以下细菌菌株保藏于保藏机构“英国SP40JG威尔特郡索尔兹伯里市波顿镇的健康保护局培养物中心(HealthProtectionAgencyCultureCollections,PortonDown,Salisbury,Wiltshire,SP40JG,UK)”,保藏号如下:
嗜水气单胞菌,生物型A(AL20133)保藏号12082901
嗜水气单胞菌,生物型B(AL20215)保藏号12082902
参考文献
(i)MartinoME,FasolatoL,MontemurroF,RosteghinM,ManfrinA,PatarnelloT,NovelliE,CardazzoB.ApplEnvironMicrobiol.2011Jul;77(14):4986-5000.Epub2011Jun3.
(ii)JandaJM,AbbottSL.ClinMicrobiolRev.2010Jan;23(l):35-73.Review.
(iii)http://pubmlst.org/aeromonas,
(iv)TamuraK,PetersonD,PetersonN,StecherG,NeiM,KumarS.MolBiolEvol.2011Oct;28(10):2731-9.Epub2011May4.
(v)JanRaa(1996),ReviewsinFisheriesScience4(3):229-228.
(vi)JCAguilarandEGRodriguez,2007,Vaccine25,3752-3762
(vii)SantosY,ToranzoAE,BarjaJL,NietoTP,VillaTG.InfectImmun.1988Dec;56(12):3285-93.
PridgeonJW,KlesiusPH.DisAquatOrgan.2011Jul12;95(3):209-15
(viii)EsteveC,AmaroC,ToranzoAE.FEMSMicrobiolLett.1994Mar
15;117(l):85-90
(ix)ZhengW,CaoHandYangX(2012)AfricanJournalofMicrobiologyResearch,Vol6(21)pp4512-4520
(x)PridgeonJW,KlesiusPH,MuX,CarterD,FlemingK,XuD,SrivastavaK,ReddyG(2011)Veterinarymicrobiology152(117-125)
序列表
SEQIDNO.1:编码生物型A(AL20133)中的gltA的基因的DNA序列>20133_gltA
TTCCTGCACATGATGTTTGGCGTGCCGACCGAAGAGTACAAGGTCAACCCCATCGTCGAACGCGCCATGGACCGCATCTTCACCCTGCATGCGGATCACGAGCAGAACGCCTCCACCTCCACCGTGCGTCTGGCCGGCTCGTCCGGTGCCAACCCGTTCGCCTGTATCGCCGCGGGGATCGCCTCCCTGTGGGGACCGGCCCACGGCGGTGCCAACGAAGCCTGCCTCAAGATGCTCGAGGAGATCGGCTCCGTGGATCGCATCCCCGAGTACATCGCCAAGGCCAAGGACAAGAACGATCCGTTCCGTCTGATGGGCTTCGGTCACCGGGTCTACAAGAACCACGACCCCCGTGCCACCGTGATGCGCGAAACCTGTCACGAGGTACTGACCGAGCTGCAGATCAAGGATCCGCTGCTGGACGTGGCCATGGAGCTGGAGCGCATCGCGCTGTCCGACCCCTACTTCATCGAGAAGAAGCTCTACCCGAACGTG
SEQIDNO.2:编码生物型A(AL20133)中的metG的基因的DNA序列>20133_metG
GCCGATATCTGGGTTCGTTATCAGCGAATGCGCGGTCACCAGGTGCACTTTGTCTGTGCCGACGATGCCCATGGCACCCCGATCATGCTCAAGGCCCAACAGCTGGGGATCACCCCGGAAGAGATGATCGCGGCAGTCTCCCAGGAGCACCAGGCCGACTTCGCCGGGTTCAACATCAGTTTTGACAACTATCACTCCACCCACAGCGACGAGAACCGTGAGCTGGCCGGGCTTATCTACGGCCGTCTGCAGGCCGGCGGCAAGATCAAAAGCCGCACCATCTCCCAGCTGTTCGATCCGGAAAAATCCATGTTCCTGCCGGATCGTTTCGTCAAGGGCACCTGCCCCAAGTGCAAGTCCCCGGAGCAGTATGGCGACAACTGCGACAGCTGCGGCGCTACCTACAGCCCGACCGAACTGATCGATCCGAAATCCGCCGTCTCCGGCGCTACCCCGGTGATGAAGGACTCCGAGCACTTCTTCTTCGACCTGCCGCAGTTTGAG
SEQIDNO.3:编码生物型B(AL20215)中的gltA的基因的DNA序列>20215_gltA
TTCCTGCACATGATGTTTGGCGTGCCGACCGAGGAGTACAAGGTCAACCCCATCGTCGAACGCGCCATGGACCGCATCTTTACCCTGCATGCGGACCACGAGCAGAACGCCTCCACCTCCACCGTGCGTCTGGCCGGCTCCTCCGGCGCCAACCCGTTTGCCTGTATCGCCGCGGGGATCGCCTCCCTGTGGGGACCGGCCCACGGTGGTGCCAACGAAGCCTGCCTCAAGATGCTCGAGGAGATCGGCTCCGTTGACCGCATTCCCGAATACATCGCCAAGGCCAAGGACAAGAACGATCCATTCCGTCTGATGGGCTTCGGTCACCGGGTCTACAAGAACCACGACCCCCGTGCCACCGTGATGCGCGAAACCTGTCACGAGGTACTGACCGAGCTGCAGATCAAGGATCCGCTGCTGGACGTGGCCATGGAGCTGGAGCGCATCGCGCTCTCCGACCCCTACTTCATCGAGAAGAAGCTCTACCCGAACGTG
SEQIDNO.4:编码生物型B(AL20215)中的metG的基因的DNA序列>20215_metG
GCCGATATCTGGGTTCGTTATCAGCGAATGCGCGGTCACCAGGTGCACTTTGTCTGTGCCGACGATGCCCACGGCACCCCGATAATGCTCAAGGCCCAACAGCTGGGGATCACCCCGGAAGAGATGATCGCGGCCGTCTCCAAGGAACACCAGGCCGACTTCGCCGGGTTCAACATCAGTTTTGACAACTATCACTCCACCCACAGCGACGAGAACCGCGAGCTGGCGGAGCTGATCTACGGCCGTCTGCAGGCCGGCGGCAAGATCAAGAGCCGCACCATCTCCCAGCTGTTCGATCCGGAAAAGTCCATGTTCCTGCCGGATCGCTTCGTCAAGGGTACCTGCCCCAAGTGCAAGTCCCCGGAGCAGTATGGCGACAACTGTGACAGCTGCGGCGCCACCTACAGCCCGACCGAGCTGATTGATCCGAAATCCGCCGTCTCCGGCGCCACCCCGGTGATGAAGGACTCCGAGCACTTCTTCTTCGATCTGCCGCAGTTTGAA
Claims (37)
1.分离的嗜水气单胞菌生物型A细菌,所述菌株选自以下组:
(i)根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏于英国SP40JG威尔特郡索尔兹伯里市波顿镇的健康保护局培养物中心(HealthProtectionAgencyCultureCollections,PortonDown,Salisbury,Wiltshire,SP40JG,UK)的保藏号为12082901的细菌;
(ii)能够与来自用i)中限定的细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌。
2.根据权利要求1的细菌,其中,所述细菌具有与权利要求1中限定的保藏的细菌相关的基因型和/或表型特征。
3.根据权利要求1或2的细菌,其中,所述表型特征包括当在重10-20g的鱼中经腹膜内注射100-2000cfu/鱼的量以及0.1ml的注射体积时,在巨鲶(巴丁鱼)中诱导败血病,并且任选地,诱导死亡的临床症状的能力。
4.根据之前权利要求任意项的细菌,其中,所述表型特征包括在重10-20g的鱼中经腹膜内注射100-2000cfu/鱼的量以及0.1ml注射体积的所述细菌后的2-5天内,在巨鲶(巴丁鱼)中诱导败血病,并且任选地,诱导至少50%死亡的临床症状的能力。
5.根据之前权利要求任意项的细菌,其中,所述基因型特征包含甲硫氨酰-tRNA合成酶(metG)基因,该基因包含与SEQIDNO:1所示序列至少99%相同的序列,和/或柠檬酸合酶I(gltA)基因,该基因包含与SEQIDNO:2所示序列至少99%相同的序列。
6.根据之前权利要求任意项的细菌,其中,与来自用所述保藏的细菌免疫的鱼的抗血清反应的所述能力由本文所述的玻片凝集试验确定。
7.分离的嗜水气单胞菌生物型B细菌,所述菌株选自以下组:
(i)根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏于英国SP40JG威尔特郡索尔兹伯里市波顿镇的健康保护局培养物中心(HealthProtectionAgencyCultureCollections,PortonDown,Salisbury,Wiltshire,SP40JG,UK)的保藏号为12082902的细菌;
(ii)能够与来自用i)中限定的细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌。
8.根据权利要求7的细菌,所述细菌具有与权利要求7中限定的保藏的细菌相关的基因型和/或表型特征。
9.根据权利要求7或8的细菌,其中,所述表型特征包括当在重10-20g的鱼中经腹膜内注射100-6000cfu/鱼的量以及0.1ml的注射体积时,在巨鲶(巴丁鱼)中诱导败血病,并且任选地,诱导死亡的临床症状的能力。
10.根据权利要求7-9任意项的细菌,其中,所述表型特征包括在重10-20g的鱼中经腹膜内注射100-6000cfu/鱼的量以及0.1ml注射体积的所述细菌后的2-5天内,在巨鲶(巴丁鱼)中诱导败血病,并且任选地,诱导至少50%死亡的临床症状的能力。
11.根据权利要求7-10任意项的细菌,其中,所述基因型特征包含甲硫氨酰-tRNA合成酶(metG)基因,该基因包含与SEQIDNO:3所示序列至少99%相同的序列,和/或柠檬酸合酶I(gltA)基因,该基因包含与SEQIDNO:4所示序列至少99%相同的序列。
12.根据权利要求7-11任意项的细菌,其中与来自用所述保藏的细菌免疫的鱼的抗血清反应的所述能力由本文所述的玻片凝集试验确定。
13.一种组合物,其包含免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌或其来源的抗原性和/或免疫原性材料免疫的鱼的抗血清反应;或包含来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
14.一种组合物,其包含免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应;或包含来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
15.一种组合物,包含:
(i)抗原性和/或免疫原性材料,选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应,以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料;
和
(ii)抗原性和/或免疫原性材料,选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应,以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
16.根据权利要求13-15任意项的组合物,其中,能够与来自由嗜水气单胞菌生物型A免疫的鱼的抗血清反应的所述嗜水气单胞菌细菌如权利要求1-7任意项限定。
17.根据权利要求13-16任意项的组合物,其中,能够与来自由嗜水气单胞菌生物型B免疫的鱼的抗血清反应的所述嗜水气单胞菌细菌如权利要求8-12任意项限定。
18.根据权利要求13-17任意项的组合物,特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞菌细菌是减毒活的形式。
19.根据权利要求13-18任意项的组合物,特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞菌细菌是灭活的形式。
20.根据权利要求13-19任意项的组合物,特征在于免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌是杀死的形式。
21.根据权利要求13-20任意项的组合物,特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞菌细菌以减毒活的、灭活的和杀死形式的混合物存在。
22.根据权利要求13-21任意项的组合物,特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞菌细菌与一或多种其他抗原组合,例如来自细菌鲶鱼爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌、柱状黄杆菌、海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、副乳房链球菌的抗原。
23.根据权利要求13-22任意项的组合物,特征在于嗜水气单胞菌细菌以≥107细菌/ml的量存在。
24.根据权利要求13-23任意项的组合物,特征在于能够与来自由嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应的所述嗜水气单胞菌细菌以≥107细菌/ml的量存在。
25.根据权利要求13-24任意项的组合物,特征在于能够与来自由嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应的所述嗜水气单胞菌以≥107细菌/ml的量存在。
26.根据权利要求13-25任意项的组合物,其中甲硫氨酰-tRNA合成酶(metG)和柠檬酸合酶I(gltA)基因的DNA序列:
(i)在嗜水气单胞菌生物型A细菌中内部比较时相同,以及
(ii)在嗜水气单胞菌生物型B细菌中内部比较时相同,以及
(iii)当嗜水气单胞菌生物型A与嗜水气单胞菌生物型B比较时,其显示gltA95-99.9%的DNA序列相同性,以及
(iv)当嗜水气单胞菌生物型A与嗜水气单胞菌生物型B比较时,其显示metG95-99.9%的DNA序列相同性,以及
(v)当嗜水气单胞菌生物型A与嗜水气单胞菌生物型B比较时,其显示95-99.9%的DNA序列相同性。
27.根据权利要求13-26任意项的组合物,特征在于组合物为适合腹膜内注射的剂型。
28.根据权利要求27的组合物,特征在于剂型优选具有0.01-0.2ml/剂量的体积。
29.根据权利要求28的组合物,其中,每个剂量包含以≥107细菌/ml的量存在的能够与来自由嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌,和/或以≥107细菌/ml的量存在的能够与来自由嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌。
30.根据权利要求13-29任意项的组合物,特征在于其为免疫原性组合物。
31.根据权利要求13-30任意项的组合物,特征在于其为疫苗形式。
32.根据权利要求1-12任意项的细菌或根据权利要求13-31任意项的组合物,用于防止或减少鱼中败血病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生。
33.根据权利要求32的细菌或组合物,特征在于所述鱼是鲶形目、鲈形目和鲤形目的鱼。
34.根据权利要求33的细菌或组合物,其中,所述鱼是巨鲶(巴丁鱼)。
35.一种组合物,包含根据权利要求1-6任意项的嗜水气单胞菌生物型A细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型A细菌的抗原性和/或免疫原性材料,用于防止或减少鱼中败血病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生,其中,所述组合物与包含根据权利要求7-12任意项的嗜水气单胞菌生物型B细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型B细菌的抗原性和/或免疫原性材料的组合物共同施用。
36.一种组合物,包含根据权利要求7-12任意项的嗜水气单胞菌生物型B细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型B细菌的抗原性和/或免疫原性材料,用于防止或减少鱼中败血病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生,其中,所述组合物与包含根据权利要求1-6任意项的嗜水气单胞菌生物型A细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型A细菌的抗原性和/或免疫原性材料的组合物共同施用。
37.制备权利要求13-31任意项限定的组合物的方法,包含组合
(i)抗原性和/或免疫原性材料,选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应,以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料;
和
(ii)抗原性和/或免疫原性材料,选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌,所述细菌能够与来自由根据“1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约”保藏的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应,以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010388106.9A CN111840531A (zh) | 2012-10-24 | 2013-10-24 | 针对嗜水气单胞菌的免疫原性组合物 |
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
VN1-2012-03153 | 2012-10-24 | ||
VN201203153 | 2012-10-24 | ||
DKPA201370328 | 2013-06-18 | ||
DKPA201370328 | 2013-06-18 | ||
PCT/EP2013/072319 WO2014064217A1 (en) | 2012-10-24 | 2013-10-24 | Immunogenic composition against aeromonas hydrophila |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010388106.9A Division CN111840531A (zh) | 2012-10-24 | 2013-10-24 | 针对嗜水气单胞菌的免疫原性组合物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105121625A true CN105121625A (zh) | 2015-12-02 |
CN105121625B CN105121625B (zh) | 2020-10-16 |
Family
ID=49619879
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010388106.9A Pending CN111840531A (zh) | 2012-10-24 | 2013-10-24 | 针对嗜水气单胞菌的免疫原性组合物 |
CN201380062909.3A Active CN105121625B (zh) | 2012-10-24 | 2013-10-24 | 针对嗜水气单胞菌的免疫原性组合物 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010388106.9A Pending CN111840531A (zh) | 2012-10-24 | 2013-10-24 | 针对嗜水气单胞菌的免疫原性组合物 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP2912198B1 (zh) |
CN (2) | CN111840531A (zh) |
CR (1) | CR20150246A (zh) |
ES (1) | ES2655679T3 (zh) |
MX (1) | MX368601B (zh) |
NO (1) | NO2912198T3 (zh) |
WO (1) | WO2014064217A1 (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105695372A (zh) * | 2016-04-18 | 2016-06-22 | 华中农业大学 | 一种高致病性嗜水气单胞菌及应用 |
CN105886429A (zh) * | 2016-04-18 | 2016-08-24 | 华中农业大学 | 一种无抗生素标记的嗜水气单胞菌减毒菌及应用 |
CN106906141A (zh) * | 2017-02-21 | 2017-06-30 | 河南师范大学 | 一种嗜水气单胞菌活菌疫苗菌株的筛选方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101642567A (zh) * | 2009-01-14 | 2010-02-10 | 张秀军 | 一种嗜水气单胞菌灭活疫苗及其制备 |
WO2010099444A2 (en) * | 2009-02-27 | 2010-09-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Modified live aeromonas hydrophila vaccine for aquatic animals |
US20120258139A1 (en) * | 2011-04-06 | 2012-10-11 | Yuping Wei Pridgeon | Attenuated Live Vaccines for Aquatic Animals |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101484184B (zh) * | 2006-07-06 | 2012-07-04 | 英特威国际有限公司 | 抗链球菌的联合疫苗 |
-
2013
- 2013-10-24 NO NO13792604A patent/NO2912198T3/no unknown
- 2013-10-24 MX MX2015005112A patent/MX368601B/es active IP Right Grant
- 2013-10-24 CN CN202010388106.9A patent/CN111840531A/zh active Pending
- 2013-10-24 ES ES13792604.4T patent/ES2655679T3/es active Active
- 2013-10-24 EP EP13792604.4A patent/EP2912198B1/en active Active
- 2013-10-24 CN CN201380062909.3A patent/CN105121625B/zh active Active
- 2013-10-24 WO PCT/EP2013/072319 patent/WO2014064217A1/en active Application Filing
-
2015
- 2015-05-11 CR CR20150246A patent/CR20150246A/es unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101642567A (zh) * | 2009-01-14 | 2010-02-10 | 张秀军 | 一种嗜水气单胞菌灭活疫苗及其制备 |
WO2010099444A2 (en) * | 2009-02-27 | 2010-09-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Modified live aeromonas hydrophila vaccine for aquatic animals |
US20120258139A1 (en) * | 2011-04-06 | 2012-10-11 | Yuping Wei Pridgeon | Attenuated Live Vaccines for Aquatic Animals |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JULIA W.PRIDGEON等: "development and efficacy of novobiocin and rifampicin resistant aeromonas hydrophila as novel vaccines in channel catfish and nile tilapia", 《VACCINE》 * |
M CRUMLISH等: "Experimental challenge studies in Vietnamese catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage), exposed to Edwardsiella ictaluri and Aeromonas hydrophila", 《JOURNAL OF FISH DISEASES》 * |
MARIA ELENA MARTINO等: "Determination of Microbial Diversity of Aeromonas Strains on the Basis of Multilocus Sequence Typing, Phenotype, and Presence of Putative Virulence Genes", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
沈锦玉: "嗜水气单胞菌的研究进展", 《浙江海洋学院学报(自然科学版)》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105695372A (zh) * | 2016-04-18 | 2016-06-22 | 华中农业大学 | 一种高致病性嗜水气单胞菌及应用 |
CN105886429A (zh) * | 2016-04-18 | 2016-08-24 | 华中农业大学 | 一种无抗生素标记的嗜水气单胞菌减毒菌及应用 |
CN105695372B (zh) * | 2016-04-18 | 2018-05-08 | 华中农业大学 | 一种高致病性嗜水气单胞菌及应用 |
CN106906141A (zh) * | 2017-02-21 | 2017-06-30 | 河南师范大学 | 一种嗜水气单胞菌活菌疫苗菌株的筛选方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO2912198T3 (zh) | 2018-04-21 |
ES2655679T3 (es) | 2018-02-21 |
EP2912198A1 (en) | 2015-09-02 |
CN111840531A (zh) | 2020-10-30 |
WO2014064217A1 (en) | 2014-05-01 |
MX2015005112A (es) | 2015-10-29 |
CR20150246A (es) | 2015-08-14 |
MX368601B (es) | 2019-10-09 |
CN105121625B (zh) | 2020-10-16 |
EP2912198B1 (en) | 2017-11-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Marudhupandi et al. | Vibrio parahaemolyticus a causative bacterium for tail rot disease in ornamental fish, Amphiprion sebae | |
US10022433B2 (en) | Fish vaccine | |
Sumithra et al. | Pathological investigations of Vibrio vulnificus infection in Genetically Improved Farmed Tilapia (Oreochromis niloticus L.) cultured at a floating cage farm of India | |
CN108939062A (zh) | 一种杀鲑气单胞菌疫苗及其应用 | |
DK181323B1 (en) | Method and composition comprising probiotic bacteria for increasing weight of fish and isolated strains of psychrobacter and pseudomonas | |
US9913888B2 (en) | Fish vaccine | |
Dorrestein | Passerines | |
CN105121625A (zh) | 针对嗜水气单胞菌的免疫原性组合物 | |
Lio-Po et al. | Infectious diseases of warmwater fish in fresh water. | |
Kunttu | Characterizing the bacterial fish pathogen Flavobacterium columnare, and some factors affecting its pathogenicity | |
Monir et al. | Pathogenesis of Aeromonas species in stinging catfish Shing (Heteropneustes fossilis) of Bangladesh | |
Kahiesh Esfandiari et al. | Growth performance, palatability and water stability of oral feed-based vaccines against Streptococcus agalactiae in red tilapia (Oreochromis sp.) | |
Kassa et al. | Bacterial flora of Nile tilapia of pond fish and their relationship with predisposing factors | |
KR20170001379A (ko) | 조피볼락의 비정형 에어로모나스 살모니시다의 불활화 백신 조성물 | |
Cain et al. | Infectious diseases of coldwater fish in fresh water. | |
Taukhid et al. | Streptococcosis on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) in Indonesian freshwater aquaculture | |
Padrós et al. | Diseases Caused by Amoebae in Fish: An Overview. Animals 2021, 11, 991 | |
NANTONGO et al. | Molecular characterization of Edwardsiella species isolated from Oreochromis niloticus and Clarias gariepinus in Wakiso District, Uganda | |
Mohammed | Studies on the Epidemiology, Vaccination, Susceptibility, and Treatment of Columnaris Disease in Fishes | |
Wise et al. | A Review of Bacterial Co-Infections in Farmed Catfish: Components, Diagnostics, and Treatment Directions. Animals 2021, 11, 3240 | |
Kirkland | Evaluation of the live-attenuated vaccine AquaVac-COL® on hybrid channel x blue catfish fingerlings in earthen ponds | |
Mursidi et al. | Vibriosis in Fish: A Review on Disease Development and Prevention. | |
Dong | Disease Resistance of Different Genetic Types of Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Female× Blue Catfish, I. furcatus, Male Hybrid Catfish | |
Farto Seguín et al. | Increased survival of juvenile turbot Scophthalmus maximus by using bacteria associated with cultured oysters | |
Zachariah | Evaluating the effect of two commercial antimicrobial products on Salmonella spp. in the aquatic habitat of the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |