JPS59227296A - 複合プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ダラム陽性菌のストレプトコッカス−フエカ
リｘ　（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉ
ｓ）のプラスミドと、ダラム陰性菌のニジエリシア・コ
リ（Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏυ）即ち、大腸菌の
ベクターとから合成された大腸菌又は枯草菌のクローニ
ングベクターとして有用な新規な複合プラスミドに関す
るものである。

更に詳しくは、本発明は、ストレプトコッカス・フェカ
リスのプラスミドｐＡＭα１由来のテトラサイクリン耐
性遺伝子領域（Ｔｃ　）と、大腸菌のベクターｐＡｃｙ
ｃ　１７７由来のアンピシリン耐性遺伝子領域（Ａ＋ｎ
ｐ）と、更に、上記プラスミドｐＡＭα１由来の複製開
始領域（ＯｒｉｐＡＭα１）及び上記ｐＡｅＹｃ１７７
由来の複製開始領域（０口１７７）のうち少な（ともい
ずれか一方を有し、上記テトラサイクリン耐性遺伝子領
域には、制限酵素Ｂａ１ｉ及びＨｐａ工　に対する全領
域中唯−の認識切断部位が位置し、更に、上記アンピシ
リン耐性遺伝子領域には、制限酵素Ｂｇｌ■、Ｐｖｕ　
ｌ及び均工■の各々に対する全領域中唯−の認識切断部
位が位置することを特徴とする新規な複合プラスミドに
関するものである。

−・般に、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ遺伝子操作では、所望の外
来１）　Ｎ　Ａを宿主細胞内に移入させて、その遺伝情
報を発現させるためには、宿主細胞に適合したベクター
を使用することが要請されている。

遺１云子操作におけるベクターに関しては、研究例の多
い大腸菌の宿主−ベクター系にて最もよく解明されてい
るが、最近では、大腸菌以外の微生物、例えば、工業的
に有用な微生物である枯草菌、抗生物質の生産菌である
放線菌、醸造分野で広く利用されている酵母などに関し
ても、宿主−ベクター系の開発研究が活発に行われてい
る。

ところで、ベクターとしての必須条件が、自己複製に必
要な遺伝子配列と、外来ＤＮＡを挿入するための制限酵
素の認識切断部位の存在であることが知られているが、
実用化のためには、例えば、遺伝子操作を可能にし、且
つ、容易にするための制限酵素の種類とその認識切断部
位、形質発現の効率、形質転換体の検出等に必要なマー
カー遺伝子の存在、宿主細胞との適合性と宿主域、宿主
細胞内での安定性、更には、仮想される生物災害のリス
クの逓減を企図した生物的封じ込めに対する適応性など
、種々の条件を満すような特性が要請されることから、
大腸菌、枯草菌の宿主−ベクター系に関しても実際上有
用なベクターの開発例が余り多くはないのが現状である
。

かかる現状に鑑み、本発明者らは、これまでに、大腸菌
、及びアミラーゼなどの生産菌として工業的に有用な枯
草菌について、その宿主−ベクター系を確立すべく、有
用なプラスミドベクターの開発研究を積重ねてきた。そ
の結果、ストレプトコッカス・フェカリスのプラスミド
ｐＡＭα１　と、大腸菌のベクターＩ）ＡＣＹＣ１７７
とから合成した複合プラスミドが、大腸菌又は枯草菌の
遺伝子操作におけるベクターとして好適な種々の特性を
保有していることを見出して、本発明を完成するに至う
た。

本発明の複合プラスミドの構成は、ストレプトコッカス
、フェカリスＤＳ５　（ＡＴＣＣ１４５０Ｂ）のプラス
ミドｐＡＭα１　と、大腸菌のベクターｐへ〇ＹＣ１７
γとを、上記ｐＡＭα１　由来のテトラサイクリン耐性
遺伝子領域（’Ｉ’ｃ）と、上記ｐＡ、ＣＹＣ−１７７
由来のアンピシリン耐性遺伝子領域（Ａ＋ｎｐ）と１、
更に、上記ｐＡＭα１由来の複製開始領域（Ｃ）ｒ　ｉ
　ｐＡＭα１）及び上記ｐＡｃＹ０１７７由来の複製開
始領域（Ｏｒｉ　１７７　）のうち少なくともいずれか
一方を含むように、酵素的に切断し、連結することによ
り、作製した複合プラスミドであり、具体的には、その
欠失領域の相違に基づいて分子量の異なる２棟類のプラ
スミド、すなわぢ、ｐＨＹ３６０　、ｐｉ−ＩＹ３１１
５と命名される各複合プラスミドを含むものである。

上記この発明に係わる複合プラスミド１ｊ、いずれも、
そのＤＮＡ上にテトラサイクリン及びアンピシリンに対
する耐性遺伝子領域を有しているので、形質転換に際し
ては、宿主細胞に対して両薬剤に関する耐性形質を付与
する特性を備えている。この特性は、所望の外米ＤＮＡ
を組込んだ組換えプラスミド保有菌株、すなわち、形質
転換体を取得するに際して、その検出及び選択を行うた
めの選択マーカーの役割を果すものである。加えて、上
記この発明に係わる複合プラスミドのテトラサイクリン
耐性遺伝子領域には、制限酵素−臣す−■及びＨｐａｉ
に対する全領域中唯−の認識切断部位が位置すると共に
、そのアンピシリン耐性遺伝子領域には、三種類の制限
酵素Ｂｇｌ■、　　ＰｖｕＩ及びＰｓｔ　Ｉの各々に刻
する全領域中唯−の認識切断部位が位置しているので、
かかる制限酵素により、この発明に係わる複合プラスミ
ドのＤＮＡを特異的に切断する限り、該ＤＮＡ中に不所
望の多数の切断部位を生じてこれが断片化してしまうこ
とはない。

しかして、上記全領域中唯−の切断部位のいずれかを所
望の外来の異種ＤＮＡの挿入箇所として使用することが
できるものである。

そして、とりわけ、テトラサイクリン耐性遺伝子領域の
制限酵素旦Ｉ」及びＩＩの認識切断部位は、ＤＮＡの６
塩基の中央が切断されるいわゆるフラッシュエンド（ｆ
ｌｕｓｈ　ｅｎｄ）を形成して切断されるので、同種の
制限酵素により切断して作製されたＤＮＡ断片はもとよ
り、他のいかなるフラッシュエンド型の制限酵素で切断
されたｌ）　Ｎ　Ａ断片をも、リンカ−ＤＮＡ等を用い
ることなく、直接的に連結することか可能であり、更に
は、人工的にフラッシュエン〜た１）　Ｎ　Ａ断片をも
クローニングできる特徴を有するものである。

本発明に係わる複合プラスミドは、大腸菌の他に、枯草
菌中でも、前述の二つの複製開始領域、即ち、プラスミ
ドｐＡＭα１由来の複製開始領域（０口ｐＡＭα１）と
、ベクターｐＡｃＹｃ１７７山米の複製開始領域（Ｕｒ
ｉ１７７）とが適切に作用して、安定に増殖し、そのテ
トラサイクリン耐性遺伝子が上記両菌種にて発現するの
で、大腸菌と枯草菌の間を往復できるシャトルベクター
（Ｓｂｕｔｔｌｅ　ｖｅｃｔｏｒ）としての特質を備え
ているものである。

付言するならば、現在、最も研究開発の進んだＤＮＡク
ローニングシステムは、ダラム陰性菌の大［ｉ　（ニジ
エリシア・コＩＪＫ）とそのベクｔｐ−系（ｇ　Ｋ系）
であって、このシステムでは、ダラム陰性菌に由来する
遺伝子、および、ダラム陽性閑に由来するある種の遺伝
子を形質発現させることができる。

ところが、一方、ダラム陽性菌の系に関しては、解明す
べき問題点がより多（残されているので、今日、多大の
関心が払われている。特に、ダラム陽性菌のうち、枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）に関しては
、実用上程々の利点を持つ有用な微生物である反面、そ
の生物学的性状が大腸菌のそれとは全く異っているので
、近年、その遺伝的解析、更には、遺伝子のクローニン
グシステムの開発が非常な関心事となっている。

しかして、かかる規状下で、枯草菌の宿主−ベクター系
を確立することは切迫した産業上の要請となっているか
ら、本発明者らが、ダラム陰性菌の代表菌種である大腸
菌と、ダラム陽性菌の代表菌種である枯草菌の間を往復
できるシャトルベクターを開発し得たことは、ダラム陽
性菌のＩ）　Ｎ　Ａクローニングシステムの確立への一
つの段階を克服するものとして意義深く、しかして、こ
の発明に係わる複合プラスミドは産業的に有用なもので
ある。

そればかりか、他のダラム陽性菌、例えば、ラクトバチ
ルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ　ｌ　Ｉｕｓ　）　、ビヒ
ドバクテリウム属（Ｂｉｆ　ｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　）などに属する微生物の遺伝子の解析や分子育種の面
にも拡俵的に活用できる可能性を有している点で産業上
有望なものである。

次に、この発明に係わる複合プラスミドｐｌ−ＩＹ−３
６０及びｐ１４Ｙ３８５の合成経路と各種中間体を第１
図〜第４図に基づいて説明すれば、ベクターｐＡＣＹＣ
１γγ（第１図（Ａ））及びプラスミドｐＡＭα１（第
１図（Ｂ））を出発原料として、中間体の複合プラスミ
ドｐＨＹ　７８０　　（中間体１）（第１図（ｅ＋、第
２図）　、１）ＨＹ６００　　（中間体２）（第１図（
Ｄｉ、第３図〕及びｐＨＹ４６０　　（中間体３）（第
１図ｔＥ＋、第４図）を経由して、合成されるものであ
る。

続いて、この発明に係わる複合プラスミド及び上記各種
中間体としての複合プラスミドの構成を詳細に説明すれ
ば以下の通りである。

複合プラスミドｐＨＹＴ８０　（中間体１）の構成（１
）　　ｐＨＹｙｓｏは、ストレプトコッカス・７エカリ
スＤＳＳ　（ＡＴＣＣ１４５０Ｂ）のテトラサイクリン
耐性遺伝子領域（Ｔｃ）を含む　プラスミドｐＡＭα１
を制限酵素！ｉｔ　ｎｄ［で切断して得られるＤＮＡ断
片と、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子領域（Ａ＋ｎｐ
）及びカナマイシン耐性遺伝子領域（Ｋｉｎ）を含む　
プラスミドベクターｐＡｅｙｃ１７７を制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌ［で切断して得られるＤＮＡ断片とを、連結して合
成した分子量約７．８メガダルトンの複合プラスミドで
ある。

そして、かかる合成の原料として使用されるプラスミド
ｐＡＭα１及びベクターｐＡｃＹ０１ｒ７は、いずれも
公知のものである（ｐＡＭα１　：　ＰｒｏＣ。

Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ、　７
２．１７２０−１７２４（１９７５）、ｐＡｃＹｃ１７
７　：　　Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１３４．
１１４１−１１５６　（１９７Ｂ））。

なお、合成された複合プラスミドの分子量の決定に際し
ては、大腸菌のλフアージＤＮＡをＨｉ　ｎ　ｒｉ　ｍ
で消化して得られる分子量既知の断片（Ｊ、　Ｍｏ１．
　Ｂｉｏｌ、　、　９８．５５１−５６４　（１９７５
）　）が０．８％７　ｉｆ　Ｏ−スゲル上に描く泳動距
離の基準線との対比により、各種制限酵素で消化された
プラスミドｐＨＹ７８０の各断片の分子量を測定し、そ
れらの総和を算出した。

＋２１　　ｐＨＹ７８Ｇは、そのアンピシリン耐性遺伝
子領域（Ａ＋ｎｐ）に、制限酵素シ已■及びりづ■の各
各に対する全領域中唯−の認識切断部位を有し、更に、
そのテトラサイクリン耐性遺伝子領域（ＴＣ）に、制限
酵素μｉｔ）に対する全領域中唯−の認識切断部位を有
するので、これらの認識切断部位を外来１）　Ｎ　Ａの
挿入部位とすることができる。

そして、ｐ）ｉＹ７８０の、各種制限酵素に対する切断
感受性（認識切断部位の数）番ま以下の通りである。

制限酵素　　　　　切断部位数 Ｂａ１■１ Ｂａ＋ｎＨｉ　　　　　　　　　２ ＢｇｌＩ　　　　　　　　　　１ １ｉｃｏｎ４　　　　　　　　　２ ）１ａｅ［’ Ｈｉｎｄ［３ ｐａＩ２ Ｋｐｎ　Ｉ　　　　　　　　　　２ ｐｓｔｌ：　　　　　　　　　　’ ｐｖｕ　Ｉ　　　　　　　　　　２ ｆ３ａｃ　’ｆｌ　　　　　　　　　　１ＳａＩ■１ ＸｂａＩ　　　　　　　　　　１ ＸｈｏＩ　　　　　　　　　　’ なお、上記切断部位数は、ｐＨＹｙａｏを過剰の各種制
限酵素の存在下で完全に消化して得られた消化物をアガ
ロースゲル上にて電気泳動させた際の識別可能なバンド
の数に従って決定されたものである。

更に、詳細な、制限酵素切断地図を第２図に示す。

（３）　　ｐＨＹ７８０は、グラム陰性菌である大腸菌
の生態系内で自己複製可能であるばかりか、その自己複
製されたＤＮＡ上の特定の領域中に存在するアンピシリ
ン（Ａ＋ｎｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｃ　）耐性遺
伝子に由来する耐性形質をその宿主菌に付与するので、
これを形質転換体に対する選択マーカーとして利用する
ことができる。

ｆｌｌ　Ｉ）ＨＹ　６００は上記ｐＨＹ　ｒ　ａ　ｏを
制限酵素とＨｉで切断することにより、約１．８メガク
ルトンのＤＮＡ断片を欠失させた後、得られたＤ　Ｎ　
Ａ断片をＴ　４１Ｊガーゼにより連結して合成した分子
量約６．０メガダルトンの複合プラスミドである。

（２）　　ｐＨＹｓｏｏ　ハ、前記ｐＨＹ　７８０と同
様ニソノアンピシリン耐性遺伝子領域（Ａ＋ｎｐ）に、
制限酵素−ＢｇｌＴ及びＰｓｔＩの各々に対する全領域
中唯−の認識切断部位を有し、更に、そのテトラサイク
リン耐性遺伝子領域（Ｔｃ）に、制限酵素Ｂａ１）に対
する全領域中唯−の認識切断部位を有するので、これら
の認識切断部位を外来ＤＮＡの挿入部位とすることがで
きる。

そして、ｐＨＹａｏｏの、各種制限酵素に対する切断感
受性（認識切断部位の数）は以下の通りである。

制限酵素　　　　　　切断部位数 Ｂａ１ｉ　　　　　　　　　　　Ｉ Ｊ３ａ＋ｎＨＩ　　　　　　　　　　１制限酵素　　　
　　　切断部位数 Ｂｇｌｉ　　　　　　　　　　　ｊ ｈ３ｃｏＲｉ　　　　　　　　　　　２Ｈａｅ　［２ Ｂｉｎｄｌｌｉ　　　　　　　　　　１ｌ−（ｐａ）　
　　　　　　　　　　２見す１１ ｖｕ　ｌ２ Ｓａｃ　ｌ’［ｌ ５ａｌ　■’　　　　　　　　　　Ｉ Ｘｂａｉ　　　　　　　　　　　Ｉ Ｘｈｏ）　　　　　　　　　　　１ 更に、詳細な、制限酵素切断地図を第３図に示す。

（３）　　ｐＨＹｓｏｏは、ｐＨＹ７８０と同様に、グ
ラム陰性菌である大腸菌の生態系内で自己複製可能であ
ると共に、宿主菌にテトラサイクリン及びアンピシリン
に対する耐性形質を付与するので、少な（とも大腸菌の
クローニングベクターとして成立する。

（１１１）ＨＹ４６０は、上記ｐＨＹ　６００を制限酵
素Ｎ王Ｉ及びＳａｌ　ｉで切断することにより、約１．
４・メガダルトンのＤＮＡ断片を欠失させた後、得られ
たＤＮＡ断片をＴ　４１Ｊガーゼにより連結して合成し
た分子量約４．６メガダルトンの複合プラスミドである
。

（２）　　ｐＨＹ４６０は、そのアンピシリン耐性遺伝
子領域（Ａｍｐ）に、制限酵素旦り■、見すＩ及びＰｖ
ｕ■の各々に対する全領域中唯−の認識切断部位を有し
、更に、そのテトラサイクリン耐性遺伝子領域（Ｔｃ）
に、制限酵素旦すＩ及び旦ｐａＩの各々に対する全領域
中唯−の認識切断部位を有するので、これらの認識切断
部位を外米ＤＮＡの挿入部位とすることができる。

そして、ｐｉ−ｉｙ　４６０の、各種制限酵素に対する
切断感受性（認識切断部位の数）は以下の通りである。

制限酵素　　　　　切断部位数 Ｂａ１Ｊ　　　　　　　　　　Ｉ ＢａｍＨｉ　　　　　　　　　　Ｉ Ｂｇｌ　Ｉ　　　　　　　　　　Ｉ ＩシｃｏＬ％（２ Ｈａｅ［２ Ｊ（ｐａＪ　　　　　　　　　　Ｉ Ｐｓｔ　ｉ　　　　　　　　　　１ ｖｕ　ｌｌ ５ａｃ　ＴＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉｂ
ａ１１ 更に、詳細な、制限酵素切断地図を第４図に示す。

（３１ｐＨＹ　４６Ｇは、グラム陽性菌の代表である大
腸菌のみならず、グラム陽性菌の代表である枯草菌の生
態系内で自己複製可能であると共に、これらの宿主菌に
テトラサイクリン耐性遺伝子に由来する耐性形質を付与
するので、大腸菌と枯草菌に両立するクローニン、グベ
クター（シャトル　ベクター）として成立する。

複合プラスミドｐＨＹ３ＢＧの構成 （１）複合プラスミドｐＨＹ３６０は、分子量約３．６
メガダルトンの環状デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である
。

（２１ｐＨＹ３６０は、上記ｐｌ（Ｙ４６０を制限酵素
匣■及びＢｓｔＥＩＩで切断し、更に、Ｓ１ヌクレアー
セで消化してその末端をフラッシュ　エンド（Ｆｌｕｓ
ｈｅｎｄ　）型にした後、得られたＤＮＡ断面をＴ４リ
ガーゼにより、連結して合成した複合プラスミドである
。

（３）　　ｐＨＹ３６０は、そのアンピシリン耐性遺伝
子領域（Ａ、＋ｎｐ）に、制限酵素Ｂｇｌｌ、ＰｓｔＩ
及びｌ’ｖｕＩの各々に対する全領域中唯−の認識切断
部位を有し、更に、そのテトラサイクリン耐性遺伝子領
域（’ｌ″Ｃ）に、制限酵素Ｂａ１）及び当り■の各各
に対する全領域中唯−の認識切断部位を有しているので
、これらの認識切断部位を外来１）ＮＡの挿入部位とす
ることができる。

そして、ｐＨＹ３６０の各種制限酵素に対する切断感受
ｈ（認識切断部位の数）は、以下の通りである。

制限酵素　　　　　切断部位数 Ｂａ１）　　　　　　　　　　Ｉ Ｂｇｌ■Ｉ ＥｃｏＲ，ｉ　　　　　　　　　　１ ｌ−１ｐａ（Ｉ Ｐｓｔ）　　　　　　　　　　、Ｉ Ｐｖｕｌ　　　　　　　　　　ｌ Ｂａｍ１−Ｌｉ　　　　　　　　　Ｉ Ｘｂａ　■１ （４１ｐ１４Ｙ３６０は、ｐＨＹ４６０と同様に、グラ
ム陽性菌である大腸菌及びグラム陽性菌である枯草菌の
生態系内で自己複製可能であると共に、これらの宿主菌
にテトラサイクリン耐性菌質を付与するので、大腸菌及
び枯草菌のクローニングベクターとして成立する。

なお、宿主菌である枯草菌の菌体内におけるｐＨＹ３６
０の安定性について約５０世代の継代培養試験を実施し
て調べた結果、残存するテトラサイクリン耐性菌は約１
０％であった。

複合プラスミドｐＨＹ３８５の構成 （１）複合プラスミドｐＨＹ３８５は、分子量約３．８
５メガダルトン、の環状デオキシリポ核酪（ＤＮＡ、）
である。

＋２１　　ｐｉ−ＩＹ３８５は、上記１）ＨＹ４６Ｇに
より形質転換した枯草菌を、３７℃で約５０世代継代培
養して、ｐＨＹ４ａＯの一部分（約０．７５メガダルト
ン相当）を欠失させて得た複合プラスミドである。

（３１ｐＨＹ３８５は、そのアンピシリン耐性遺伝子領
域（Ａ＋ｎｐ）に、制限酵素旦〔■、旦すＩ及び心四■
の各々に対する全領域中唯−の認識切断部位を有し、更
に、そのテトラサイクリン耐性遺伝子領域（ＴＣ）に、
制限酵素Ｂａ１Ｉ及びＨｐａＩの各各に対する全領域中
唯−の認識切断部位を有するので、これらの認識切断部
位を外来ＤＮＡの挿入部位とすることができる。

そして、ｐＨＹ３８５の各制限酵素に対する切断感受性
（認識切断部位の数）は、以下の通りである。

制限酵素　　　　　切断部位数 艷ＩＩ　　　　　　　　　　１ ｆ３ｇ’ｌｉ　　　　　　　　　　Ｉ Ｅｃｏ　ＲＩ　　　　　　　　　　２ Ｈａｅ［２ Ｈｐａｉ　　　　　　　　　　１ 制限酵素　　　　　切断部位数 均吐１１ ハｒｕ１１ 引回■１ （４１ｐｉ（ｙａａｓは、ｐＨＹ４６０と同様に、ダラ
ム陰性菌である大腸菌及びダラム陽性菌である枯草菌の
生態系内、で自己複製可能であると共に、これらの宿主
菌にテトラサイクリン耐性形質を付与するので、大腸菌
及び枯草菌のクローニングベクターとして成立する。

付言するならば、この複合プラスミドｐＨＹ３８ｓは、
プラスミドｐ　Ａ　Ｍα１由来の複製開始領域（Ｏｒ　
ｉ　ｐＡＭα１）の一部が欠失したように観察されるが
、ダラム陽性菌である枯草菌でも自己複製できることが
確認された。このことから、Ｏｒ　ｉ　ｐＡＭα１は当
該欠失部分を含まないことが判明した。

以上のように構成された、この発明に係わる複合プラス
ミドｐＨＹ３６０　、ｐｉ（ｙａａｓは、大腸菌及び枯
草菌を宿主菌とするＤＮＡ組換え技術により任意の遺伝
子をクローン化する際に必要なベクターとしての条件を
完全に具備しているので、この発明に係わる複合プラス
ミドによれば、大腸菌、枯草菌等の宿主菌に対して、他
の微生物等から、有用物質の生合成あるいはその調節に
関する特定の遺伝子をクローニングすることにより、該
宿主菌の生態系内で有用物質の生産を行わせたり、更に
は、上記特定の遺伝子に係わる遺伝子情報の増幅作用を
通じて生合成系を強化することにより、有用物質の生産
性を増大させたりするための有効な手段を提供すること
ができる。そして、枯草菌に代表されるグラム陽性菌種
の生態系内で他の微生物由来等の種々の遺伝子を発現さ
せることができるので、グラム陽性菌種の遺伝子の解析
や分子育種に有効な手段をも提供することができる。

続いて、この発明の実施例及び参考例を説明すれば以下
の通りである。

く参考例１〉・・・・・・複合プラスミドｐＨＹ７８０
　（中（１）　　ｐＡｅＹｅ１７７の調製 大腸菌に１２　　ＷＡ８０２ｒ−＋ｎ＋（ｐＡｅＹｃ１
７７）（東京大学応用微生物研究所斎藤研究室保有）を
、Ｌ−ブロス（バクトートリプトン　　（Ｂａｃｔｏ−
ｔｒｙｐｔｏｎ）　　　１％、酵母エキス０．５９Ｉ６
、ＮａＣｌＯ，５％、グル：ｌ−ｘ　　０．１％をｌＮ
−ＮａＯＨでｐＨ７，０に調節したもの）中で、−夜培
養した後、遠心分離処理にて集菌し、これを、１００＋
ｒ＋１！ノ２０＋ｎＭ　　Ｔｒｉｓ−１０＋ｎＭ　　Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨｓ、ｏ）で２回洗滌した。洗滌後の菌体を
９＋ｎ／の　１００＋ｎＭＮａｉｌ−２０＋ｎＭ　　Ｔ
ｒｉｓ−１０＋ｎＭ　　ＥＤＴＡに溶解させた。次いで
、リゾチームとＲＮａｓｅをそれぞれ１００μｇ／＋ｎ
Ｉ！と、５０μｇ／ｍ／とになるように加え、０℃で、
１０分間反応させた後、２％　ＳＤＳを１＋ｎＩ！加え
て、３７℃で５分間、上記反応後の菌を更に溶解させた
。この溶液を０℃で１０分間放置した後、３６．０００
　ｒｐ＋ｎで３０分間遠心分離処理し、分離された上清
をＤＮＡ粗標品として採取した。これに等重量の塩化セ
シウムを加え、５Ｉｎ　ｇ　７ｍ　Ｉ！のエチジウムブ
Ｏ’？イドを０．７＋ｎＩ！加えた。これに３６．００
Ｏｒｐｍ　、　　４０時間の遠心分離処理をほどこして
ＤＮＡ画分を集め、更に３８．００Ｏｒｐｍ　、４０時
間の遠心分離処理を行った。分離されたＤＮＡ画分を飽
和塩化セシウム水で飽和したイソプロパツールを用いて
洗滌することにより、ＥｔＢｒを除去した。次いで、１
０＋ｎＭ　　’Ｉ’ｒｉａ−０，１ｍＭ　　Ｅｌ）ＴＡ
　（ｐＨ７，４）’　　（以下緩衝液Ａという）に対し
て透析し、更に、ＤＮＡと等量のフェノール（緩衝液Ａ
で飽和したもの）を加えて、振とうした。そして、遠心
分離処理により得られた水層を緩衝液Ａに対して透析し
て、第１図（Ａ＋の切断地図で表わされるｐＡｃｙｃ１
’７７１）　Ｎ　Ａを調製した。

（２１ｐＡＭα１の調製 ストレプトコッカス・フェカリス　１）Ｓ５（ＡＴＣＣ
１４５０Ｂ　）を５ｏｏ１ｎｌ！ノロコサ培地（Ｒｏｇ
ｏｓａ　＋ｎｅｄｉｕ＋ｎ　：　１１中　グル：ｌ−Ｘ
　　２０ｇ。

トリプチケース−ペプトン　１０ｇ、酵母エキス５　ｇ
　、　　ト　リ　プ　ト　−　ス　　　　３　　ｇ　　
、　　　Ｋ２ＨＰＯ４３ｇ。

Ｋ　Ｈ，２ＰＯ２３ｇ、クエン酸アンモニウム　２ｇ、
酢酸ナトリウム　Ｉｇ、ツイーン８０　１ｇ、Ｍｇ８０
４・）（２ｏ　　Ｏ，５７５ｇ、　　Ｌ−システィン塩
酸塩０、５ｇ、　Ｍｎ５０４１１２Ｈ２１Ｊ　　Ｏ，１
２ｇ％ＦｅＳＯ４゛−γＨ２０８４＋ｎｇを含む：ｐＨ
６，８）にて−夜培養した。

後述のＤＮＡ抽出処理は、（１）項記載のｐＡＣＹＣ−
１７７の調整の場合と同様の方法により、行った。

次いで、抽出されたＤ　Ｎ　Ａ　０．５＋ｎ７を、ニト
ロセルロース遠心管中の１２＋ｎｊ’の５％〜３０％庶
糖グラディエンド上にのせた。緩衝液としては、５Ｇ＋
ｎＭ　　Ｔｒｉｓ−５０＋ｎＭ　　ＥＤＴＡ−５０１ｎ
Ｍ　　ＮａＣＩ（ｐＨ８，０）を使用した。２０．００
０　ｒ　ｐａｎ、　１６時間、１０℃で遠心分離処理し
た後、上記ニトロセルロース遠心管の底に穴を開けて、
１０滴づつ分画した。各分画中のＤＮＡ１０μｌを０．
８％アガロースゲル上で電気泳動させて、そのＤＮＡの
分子量を確認した。そして、分子量６メガダルトンの８
画分を緩衝液Ａで透析した。以上の処理を経て、第１図
ＦＢｌの切断地図で表わされるｐＡＭα１をβ１、ｒｌ
の混合物から分離した。

（３１ｐＡｃＹｃ１７７及びｐＡＭα１の切断と連結上
記（１）項（２）項記載の処理により得られた１０μｌ
の各ＤＮＡ、（０，１〜０．２μｇ　　ＤＮＡ量）に、
１μｌの１００倍量緩衝液（１０＋ｎＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ（ｐｌ−１７，６）、７＋ｎＭ　　ＭｇＣｌ２．
７＋ｎＭ　　β−メルカプトエタノｕ −ル、５０＋ｎＭ　　ＮａＣＩ）を加えた後、更に、　
／。。

のＨｉｎｄ［Ｉを１ｔｔｌ添加し、これを３７℃、６０
分間　　（反応させた。そして、６０℃、１０分間でこ
の反応を停止させた後、　′／量の５Ｍ　　Ｎａ１ｌ　
を加０ え、更に、全量の２倍量の一２０℃の冷エタノールを加
え、これを−２０℃、３０分間冷却した。更に、これを
１５．００Ｏｒｐｍ、０℃、５分間、遠心分離処理した
後、上清を捨てて、沈殿物を再び一２０℃エタノールで
洗滌した。これを１５．　Ｇｏｏ　ｒｐ＋ｎ、０℃、２
分間、遠心分離処理した後、上溝のエタノールを捨てて
、更に、エタノールを完全に蒸発させた。

これにより得られたＩ）　Ｎ　Ａ断片に２０μｌの滅菌
水を加えて溶解させ、１１０１ｎ　ＡＴ”Ｐ　　３１１
１．１００＋ｎＭ　ジチオスレイト−／Ｌ／　　３μｌ
、６６０＋ｎＭＴｒｉｓ−）（ＣＩ　（ｐＨ７，６）　
−６６＋ｎＭ　　ＭｇＣｌ２　３　ｌｉｔを加え、更に
、４００Ｌ＋／μｌのＴ４リガーゼを０．５μｌ加えた
。１５℃で一夜反応を行わせた後、１２０μｌの滅菌水
を加えて、全量を１５０μｌとした。

４）大腸菌の形質転換 大腸菌１（１２Ｃ６００ｒ　＋ｎ　　（東京大学応用微
生物研究所斎藤研究室保有）を、Ｌ−ブロス中で一夜培
養した。この培養液０．０５＋ｎＪを５＋ｎ／のＬ−グ
ロスに加えて、３７’Ｃで２時間１０分の振とう培養を
行った。地心分離処理にて集菌した後、得られた菌を０
℃の０．１ＭＣａＣｌ　２水で洗滌し、０．２５＋ｎｌ
　（Ｄ　０℃、ｏ、　＋＋ｖｒ　　ｅａｃ１２水に溶解
することにより、コンピテント細胞を作製した。そして
、０．１＋ｎ／　のコンピテント細胞に対して０．１＋
ｎｊの、上記（３）項記載の処理で得たＩ）ＮＡ（濃度
１μｇ／ｌｒ＋／）を加え、０℃にて５分間放置した後
、０．８＋ｎＩ！のＬ−ブロスを加えて、３７℃で１時
間培養した。次いで、この培養液をＬ−ブロスに１．５
９６寒天と、２０μｇ／ＩｎＩ！ノテトラサイタリンと
、３０μｇ／＋ｎ／のアンピシリンとを添加・して成る
選択培地の表面上に塗布して、３７℃で一夜培養した。

その際、この選択培地上でコロニーを形成した１０株の
形質転換体について、保有プラスミドの大きさを調べた
。

（５）　　プラスミドＤＮＡの抽出とその分子量の測定
形質転換体をＬ−ブロス中で一夜培養した培養液５Ｉｎ
Ｉ！を分離処理にて集菌した。次いで、分離された菌を
０．５＋ｎ／の１［１０ｍＭ　　Ｎａ１ｌ−５０＋ｎＭ
Ｔｒｉｓ−１０＋ｎＭ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ乙４）に溶
解させた。

この溶液に０．２＋ｎｌ！の２　＋ｎ　ｇ／ｒｎ　ｌ　
　リゾチーム−０、５ｍｇ／ｍｌ　　ＲＮａｓｅを加え
て、３７℃で５分間反応させた。０．１＋ｎ／の２９Ｉ
６　ｓＤ８溶液を加えて、３０℃で１〜２分間更に反応
させ、ｏ　’ｃで１０分間放置後、この溶液を２０．０
００　ｒ　ｐａｎで０℃、１ｏ分間、遠心分離処理した
。分離された上清０．５ｍｌに緩衝液Ａで飽和したフェ
ノール０．５ｍ、／を加え、よく混合した。更に、これ
を１５．０００　ｒ　ｐａｎで３分間室温で遠心分離処
理し、水層を採取し、その５０μｌづつを０．８９６ア
ガロースゲル電気泳動させて、その分子量を測定した。

上記処理により、１０株の形質転換体について、プラス
ミドの大きさを調べたところ、分子量約乙８メガダルト
ンであった。

このようにして、第１図（Ａｌ（Ｂｌの切断地図で表わ
されるｐＡｃＹｃｆγ１、ｐＡＭα１から合成された複
合プラスミドのうち、第１図ｆＣ）の切断地図で表わさ
れるものを［）ＨＹγ８０と命名し、他の−っをｐｌ−
ＩＹＩＩと命名した。

これにより、少なくとも、第１図ｆｃ）の切断地図で表
わされるｐＨＹγ８０が大腸１菌の生態系内で安定に増
殖し、形質発現することが確認された。

なお、ｐＨＹ７８Ｇへの連結に際しては、ｐＡＣＹＣ−
１７７のＤＮＡ断片と、ｐＡＭα１のそれとの連結方向
の異る同分子量の他の複合プラスミドｐＨＹ１１も同時
的に生成されるが、両複合プラスミドｐＨ，Ｙ７８０　
、ｐＨＹｌｌは、μ狸Ｈ■を用いて、切断処理すること
により、断片の大きさの異る二つのグループとして分：
雅することができる。そして、第１図（Ｃ）の切断地図
に基づいて、二つの複製開始領域（Ｏｒ　ｉ　ｐＡＭα
１）、（０ｒｉ１７７　）のうち、少なくとも、双方を
共に欠失させることな（、しかも、二つの遺伝子領域（
Ｔｃ）　　（Ａｍｐ）中に存在する全領域中唯−の制限
酵素認識切断部位の数を増大させるべく、両遺伝子領域
（Ｔｃ）　（Ａｍｐ）中の制限酵素認識切断部位と同一
の切断部位を含む全領域中の部分を切断除去するために
使用可能な制限酵素の存否の観点から、両複合プラスミ
ドＩ）ＨＹ７８０、ｐＨＹｌｌのうちｐＨＹ７８０が後
続の縮小化処理に有望なものとして選択された。

〈参考例２〉・・・・・・ｉ介ヱＩ玉工工」■１吐」浬
間体２）の合成 （１）　　ｐＨＹγ８０の切断と連結 参考例１で作製された形質転換体である大腸菌Ｃ６００
ｒ　＋ｎ　　（ｐＨＹ７８０　）　カラ、参考例１（５
）項□記載の方法と同様の方法により、プラスミドＤＮ
Ａを抽出した。抽出されたＤＮＡ　１μｇ／２゜μｉに
２μｍの緩衝液（１００＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ
Ｈ−７、６）　、７０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．７０　ｍＭβ
−メルカプトエタノール、５００＋ｎＭ　ＮａＣｌ　）
を加え、さらに、４ｕ／μｌの制限酵素Ｂａ＋ｎＨＩを
１μｌ加えて、３１℃で６００分間反応せた。６０℃、
１０分間熱処理してこの反応を停止させた後、８０μｌ
の水を加え、２μｌの５Ｍ　　ＮａＣ１を加え、更に、
−２０℃ノエタノール２００μｌを加えて、−２０℃で
３０分間放置し、次いで、０℃で５分間、１０．００Ｏ
ｒｐｍの遠心分離処理によりＤＮＡを集めた。これを、
２００μＥの一２′０℃エタノールで洗滌した後、２０
μｌの水に溶解させ、Ｔ４１Ｊガーゼを用いて参考例１
（３）項記載の方法と同様の方法で連結処理を行った。

（２）大腸菌の形質転換 次いで、このＤＮＡを用いて、大腸菌ＫＩ２ｅ６００ｒ
＋ｎ−に対する形質転換を行った。形質転換体は、２０
μｇ／ｍｌテトラサイクリン、３ｏμｇ／ｍ！アンピシ
リンに耐性を示した・。この形質転換体のうち、１０株
について、参考例１（５）項記載の方法と同様の方法に
より、プラスミドの大きさを調べたところ、全て、分子
量約６メガダルトンであった。

このようにして、第１図１（、’）の切断地図で表わさ
れるｐｌ（Ｙ２Ｏ２から合成された、第１図（Ｄｉの切
断地図で表わされる複合プラスミドをｐ　ＨＹ　６００
と命名した。そして、上記処理により、このｆ）ＨＹ６
００も、少なくとも、大腸菌に対するクローニングベク
ターとして使用可能であることが確認された。

く参考例３〉・・・・・・複合プラスミドｐＨＹ４６０
　（中間体３）の合成 参考例２で作製されたｐ　ＨＹ　ｓ　ｏ　ｏを、制限酵
素−Ｘｈｏ■及びΣ１■を用いて参考例１（３）項記載
の処理と同様の酵素処理により、切断し、更に、そのＤ
ＮＡ断片をＴ４リガーゼを用いた酵素処理により連結し
てから、参考例１（４）項記載の方法と同様の方法によ
り、大腸菌に形質転換し、分子量約４．６メガダルトン
のプラスミド（ｐＨＹ−４６０）を作製した。これによ
り、第１図（１））の切断地図で表わされるｐＨＹ６０
０から第１図（Ｅｌの切断地図で表わされるｐＨＹ４６
０が生成された。

（１）コンピテント細胞の調製 り一寒天平板上で一夜培養した枯草菌（艷史−１１ｕｓ
　　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　Ｍａｒｂｕｒｇ　１６Ｂ　
（東京大学応用微生物研究所斎藤研究室保有）を培地■
　（スピザイセン　　ミネラル培地（５ｐｉｚｉｚｅｎ
　＋ｎｉｎｅｒａ１ｍｅｄｉｕ＋ｎ）　：　　Ｋ２ＨＰ
Ｏ４１，４、％％ＫＨ２ＰＯ４０，６％、（Ｎ　Ｈ４）
２８０４　０．２９６、クエン酸ナトリウム０．１％、
Ｍｇ５Ｏ＜　＠　７Ｈ２００，０２％、　グルコース　
０．５％に対してカゼイン加水分解物０．０２９６、Ｌ
−）リプトファン　５０μｇ／ｍｌを加えたもの）に対
して、Ｉ　Ｘ１０　、Ａｎ！程度接種した。これを３ｒ
℃で振とう培養して、約４時間経過後、静止期に入った
段階で、培地■（培地■のＬ−トＩＪブトファンを５ｔ
ｔｇ　／ｍｌとし、更に、５＋ｎＭ　Ｍｇ８０４を加え
たもの）中で、１０倍に薄めて培養を続行した。培養液
中の菌は９０分後に、コンピテント（ｃｏ＋ｎｐｅｔｅ
ｎｔ）状態に達した。このコンピテント細胞０．Ｌｎｌ
！に参考例３にて作製されたｐＨＹ−４６０複合プラス
ミドのＤＮＡ溶液０．１　ｍｌを加えて３７℃で、９０
分間振とう培養しながら形質転換を行った。

（２）形質転換体の検出 １）　Ｎ　Ａ　（ｐＨＹ４６０　）をとり込ませた形質
転換体を２０μｇ／＋ｎｊ’のテトラサイタリンを含む
Ｌ−寒天平板上に塗布して、３７℃で２４時間培養した
。

得られたコロニーにつき、参考例１と同様の方法により
プラスミドの存在を確認した。複製されたプラスミドｐ
ＨＹ４６０は、分子量約４．６メガダルトンのものであ
った。

そして、参考例１（５）項記載の方法と同様の方法によ
り、大腸＠に１２　　Ｃ６００ｒ　＋ｎ　　（７）形質
転換も確認された。これにより、複合プラスミドｐＨＹ
４６０は、少なくとも、大腸菌と枯草菌の双方の宿主−
ベクター系におけるクローニア　／ｆ　ベクター、即ち
、シャトルベクターであることが判明した。

なお、形質転換体としての大腸菌に１２　　（、’６０
０ｒ−ｍ　（ｐＨＹ４６０　）及び枯草菌１６８　（ｐ
ＨＹ４６０　）は、それぞれ、受託番号　微工研菌寄第
６８１３号及び微工研菌寄第６８７４号として工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託済みである。

（実施例１〉・・・・・・複合プラスミドｐＨＹ　Ｓ６
０の合基 参考例３にて作製したｐＨＹ４ｓｏを、制限酵素Ｓａｃ
■及びＢｓｔＢＩＩを用いて、参考例１（３）項記載の
処理と同様の酵素処理により切断し、更に、Ｓ１ヌクレ
アーゼで処理した後、Ｔ４１Ｊガーゼを用いて、得られ
たＤＮＡ断片を連結した。

上記Ｓ１ヌクレアーゼによる処理に際しては。

制限酵素で処理したＤＮＡ断片に対して、・５０ｕ／μ
ｌの８１ヌクレアーゼを含む８１反応用緩衝液（３０＋
ｎＭ　　酢酸ナトリウム（９Ｈ４，６）　、　５０＋ｎ
ＭＮａｅｌ、ｌ　＋ｎＭ　　ＺｎＳＯ４，５９６グリセ
ロール）を加えて、３７℃にて５分間反応させた。

次いで、参考例１（４）項記載の方法と同様の方法に従
って、上記処理にて得られたＤ　Ｎ　Ａ（ｐＨＹ−３６
０）による大腸菌に１２　　Ｃ６００ｒ−＋ｎ−（７）
形質転換を生起させ、これにより、テトラサイクリンと
アンピシリンに耐性を示す形質転換体を得た。

この形質転換体について、その保有するプラスミドの大
きさを参考例１（５）項記載の方法と同様の方法に従っ
て調べたところ、全ての形質転換体は分子量約３．６メ
ガダルトンのものであることが判明した。

そして、参考例４記載の方法と同様の方法により、枯草
菌　Ｍａｒｂｕｒｇ　１６８の形質転換体をも得ること
ができた。

このようにして、第１図（Ｅ）の切断地図で表わされる
ｐＨＹ４６０から合成された、第１図（Ｆ）の切断地図
で表わされる複合プラスミドをｐｔ−ｔｙ３ａ。

と命名した。そして、このｐ）−ＩＹ３＋Ｈ１は上述の
転換体の取得により、大腸菌及び枯草菌のクローニング
ベクターとして有用であることが確認された。

なお、形質転換体としての大腸菌に１２　　Ｃ６０Ｃ６
００ｒ−ｐＨＹ３６０　）及び枯草菌　Ｍａｒｌ）ｕｒ
ｇ　１６　Ｂ（ｐＨＹ３６０　）は、それぞれ、受託番
号微工研菌寄第Ｔ１１２号及び微工研菌寄第１１１０号
として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託済みであ
る。

参考例４記載の方法により、ｐＨＹ４６．０を用いて枯
草菌を形質転換させることにより、得た形質転換体につ
いて、３７℃にて約５０代の継代培養を行った。その際
の培養は、参考例４（２）項記載の方法と同様に、２０
μｇ／＋ｎ／のテトラサイクリンを含むＬ−寒天平板上
（バタトートリプトン（Ｂａｃｔｏ　−ｔｒｙｐｔｏｎ
）　　１％、酵母エキス　０．５％、Ｎａ１ｌ　　０．
５％、グルーｙ　−ｘ　　０．１　％を１Ｎ−ＮａＯＨ
でｐＨ，７，０に調節したものを含む）に形質転換体を
塗布して、３７℃にて行われた。

上記培養にて得られたコロニーにつき、参考例１（５）
項記載の方法と同様の方法により、プラスミドの存在を
確認した。

その結果、形質転換体１２株中４株の割合で、分子３１
３．８５メガダルトンのプラスミドを保有することが確
認された。そして、このプラスミドの構成を、制限酵素
による切断処理にて解析したところ、このプラスミドは
、　ｐｉ−ＩＹ４６ｏから、その一部分、より詳細には
、Ｘｂａ　ｉと１３ａ＋ｎＨｉの認識部位を含む分子量
約０．７５メガダルトンの領域が欠失して生成された新
規なプラスミドであることが判明した。

このようにして、第１図ｆＥ）の切断地図で表わされる
ＰＩ（Ｙ４６０から合成された複合プラスミドをＩ）Ｈ
Ｙ３８５と命名した。

そして、参考例１　（４）（５）項記載の方法と同様の
方法に従って、このｐＨＹＳ１１５による大腸菌に１２
Ｃ６００ｒ−＋ｎ−の形質転換が確認されたので、この
ｐＨＹ３８５は、大腸菌及び枯草菌の宿主−ベクター系
におけるクローニングベクターとして有用なものである
。

なお、形質転換体としての大腸菌に１２　　ｃ　６００
ｒ　＋ｎ−（ｐＨＹ３８５）及び枯草菌１６Ｂ　（ｐＨ
Ｙ３８５　）は、受託番号微工研菌寄第１１１３号及び
微工研菌寄第１１１１号として、工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託済みである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明に係わる複合プラスミドｐＨＹ３６
０及びｐＨＹ３８５の合成経路を示すものである。図中
、（Ａ）及びＣＢ＋は、出発原料としてのベクターｐＡ
ＣＹＣ１７７及びプラスミドｐＡＭα１の制限酵素によ
る切断地図を、また、（Ｃ１、（Ｄ）及び（Ｅ）は、合
成中間体の切断地図を、そして、ｆＦｌ及び（Ｑは、こ
の発明に係わる複合プラスミドｐＨＹ　３６０及びｐＨ
Ｙ３８５の切断地図を、それぞれ示すものである。 第２図〜第４図は、上記合成中間体の切断地図を詳細に
示すものである。 特許出願人　株式会社　ヤクルト本社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１ストレフトコツカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔ
   ｏ−ｃｏｃｃｕｓ　　ｆａｅｃａｌｉｓ）のプラスミド
   ｐＡＭα１由来のテトラサイクリン耐性遺伝子領域と、
   エシエリシ７−：１９　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　
   ｃｏｌｉ　）のベクターｐＡＣＹＣ１７Ｔ由来のアンピ
   シリン耐性遺伝子領域と、上記プラスミドｐＡＭα１由
   米の複製開始領域及び上記ベクター［）ＡＣ，’ＹＣ１
   ７７由来の複製開始領域を有し、前記テトラサイクリン
   耐性遺伝子領域には、制限酵素用ｉ１１及びＨｐａ■に
   対する全領域中唯−の認識切断部位が位置し、更に、前
   記アンピシリン耐性遺伝子領域には、制限酵素Ｂｇ’　
   Ｉ　、Ｐｖｕ）及びＰｓｔｉ　（Ｄ各々ニ対スル全領域
   中唯−の認識切断部位が位置することを特徴とする複合
   プラスミド。 （２）約３．６メガダルトンの分子量と、下記の制限酵
   素認識切断部位の配列とにより特徴づけらハる特許請求
   の範囲第１項記載の複合プラスミドＤＨＹ３６０゜ （３）約３．８５メガダルトンの分子量と、下記の制限
   酵素認識切断部位の配列とにより特徴づけられる特許請
   求の範囲第１項記載の複合プラスミドｏＨＹ　３８５　
   。