RU2520082C2 - Способ получения "теней"бактериальных клеток (bg) - Google Patents

Способ получения "теней"бактериальных клеток (bg) Download PDF

Info

Publication number
RU2520082C2
RU2520082C2 RU2010134400/10A RU2010134400A RU2520082C2 RU 2520082 C2 RU2520082 C2 RU 2520082C2 RU 2010134400/10 A RU2010134400/10 A RU 2010134400/10A RU 2010134400 A RU2010134400 A RU 2010134400A RU 2520082 C2 RU2520082 C2 RU 2520082C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
bacterial cells
gene
propiolactone
beta
shadows
Prior art date
Application number
RU2010134400/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2010134400A (ru
Inventor
Вернер ЛЮБИТЦ
Original Assignee
Вернер ЛЮБИТЦ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Вернер ЛЮБИТЦ filed Critical Вернер ЛЮБИТЦ
Publication of RU2010134400A publication Critical patent/RU2010134400A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2520082C2 publication Critical patent/RU2520082C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0283—Shigella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A61K2039/55594—Adjuvants of undefined constitution from bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения препарата "теней" бактериальных клеток, фармацевтическую композицию, которая является вакциной или адъювантом, способ инактивации живых бактериальных клеток в препарате "теней" бактериальных клеток и применение бета-пропиолактона. Способ включает получение препарата "теней" бактериальных клеток и обработку препарата "теней" бактериальных клеток бета-пропиолактоном в конечной концентрации от 0,01% до 1% (об./об.), при которой количество живых бактериальных клеток в указанном препарате "теней" снижается по меньшей мере на 103-104. Фармацевтическая композиция включает эффективное количество препарата "теней" бактериальных клеток, обработанного бета-пропиолактоном в конечной концентрации от 0,01% до 1% (об./об.), и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или адъювант. Предложенное изобретение позволяет получать препарат "теней" бактериальных клеток, практически не содержащий живых бактериальных клеток. 4 н. и 14 з.п. ф-лы, 13 ил., 7 пр.

Description

Изобретение относится к получению "теней" бактериальных клеток с применением бета-пропиолактона для окончательной инактивации бактерий.
Пустые оболочки клеток грамотрицательных бактерий, так называемые "тени" бактериальных клеток (BG), получают контролируемой гетерологичной экспрессией гена, который осуществляет частичный лизис бактерий, в частности грамотрицательных бактерий (EP A 0291021, EP A 0516655). Например, литический ген может быть геном Е бактериофага PhiX174, кодирующим полипептид, который встраивается в комплекс клеточной оболочки грамотрицательных бактерий и приводит к образованию трансмембранной туннельной структуры через внутреннюю и внешнюю мембраны. Внутренний диаметр этой туннельной структуры составляет примерно от 20 до 400 нм, в частности от 40 до 200 нм или от 500 до 1000 нм в зависимости от условий, при которых протекает лизис. Цитоплазматические компоненты высвобождаются при помощи этой туннельной структуры, в результате чего получается комплекс пустой клеточной оболочки с интактной морфологией, так называемая "тень" бактериальной клетки.
Хотя литический процесс, приводящий к получению BG без цитоплазматического содержимого, является довольно эффективным, некоторое число клеток, обычно около одной клетки/104 клеток, остаются интактными. Регулируемая соэкспрессия гена лизиса бактерий, например гена Е бактериофага PhiX174, и гена нуклеазы с целью генерирования не содержащих нуклеиновых кислот "теней" бактериальных клеток приводит к синергистическому повышению эффективности процесса киллинга и, соответственно, к значительному снижению числа живых бактериальных клеток в BG-препарате, как раскрывается в WO 03/006630.
Использование "теней" бактериальных клеток в качестве убитых вакцин или адъювантов и получение "теней" рекомбинантных бактериальных клеток, несущих гетерологичные белки в структурах своих оболочек, раскрываются в WO 91/13555 и WO 93/01791. "Тени" бактериальных клеток пригодны также в качестве носителей или переносчиков активных соединений, как описано в WO 00/53163.
Чтобы сделать применение "теней" бактериальных клеток в качестве убитых вакцин более безопасным, в частности, в медицине, необходимо обеспечить BG препараты, не содержащие живых бактериальных клеток.
Таким образом, технической проблемой, составляющей основу настоящего изобретения, является обеспечение BG препаратов, не содержащих живых бактериальных клеток.
Удивительным образом было установлено, что практически все потенциально не убитые бактерии инактивируются в случае использования стерилизующего средства как последней стадии способа получения BG, в котором указанным стерилизующим средством является бета-пропиолактон (BPL). Удивительным образом было установлено также, что целостность препарата "теней" бактериальных клеток сохраняется после обработки бета-пропиолактоном.
Химическая формула бета-пропиолактона - C3H4O2, его молекулярная масса равна 72,06 г/моль. Бета-пропиолактон представляет собой бесцветную жидкость, хорошо растворимую в воде; продукты его распада являются безвредными соединениями, образующимися в результате самодеструкции. Бета-пропиолактон используется как стерилизующее средство для обработки вакцин, тканевых трансплантатов, хирургических инструментов, ферментов, плазмы крови, воды, молока и питательной среды и как летучий (парофазный) дезинфектант в замкнутых пространствах. Его стерилизующее действие используется для борьбы с вегетативными бактериями, патологическими грибками и вирусами.
Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к способу получения "теней" бактериальных клеток, практически не содержащих живых бактериальных клеток, который включает обработку указанных "теней" бактериальных клеток бета-пропиолактоном. Предпочтительно количество сохранившихся живыми бактериальных клеток в препарате "теней" бактериальных клеток снижается, по меньшей мере, на 103, более предпочтительно - на 104, еще более предпочтительно - на 105 и наиболее предпочтительно - на 106 или даже более.
В вышеописанном способе бета-пропиолактон предпочтительно добавляется в конечной концентрации от 0,01% до 1% (об./об.), более предпочтительно - от 0,025% до 0,5% (об./об.). Бета-пропиолактон может добавляться в препарат в одну или более стадий, например в две последовательные стадии, причем добавляемые две порции предпочтительно равны по количеству, причем вторая порция бета-пропиолактона добавляется примерно через 15-45 мин, например примерно через 30 мин. Бета-пропиолактон предпочтительно добавляется в виде жидкости. Возможно добавление в виде паров или аэрозоля либо в других формах.
Предпочтительным аспектом настоящего изобретения является то, что "тени" бактериальных клеток инактивируются в течение от 10 до 60 мин, более предпочтительно - в течение от 15 до 45 мин, еще более предпочтительно - в течение от 25 до 35 мин.
Кроме того, согласно настоящему изобретению добавление бета-пропиолактона проводится предпочтительно при температуре от 15°C до 55°C, более предпочтительно - от 26°C до 50°C, еще более предпочтительно - от 35°C до 45°C, даже более предпочтительно - от 36°C до 44°C, наиболее предпочтительно - от 38°C до 43°C.
Препарат "теней" бактериальных клеток настоящего изобретения может быть получен способом, включающим следующие стадии:
(а) обеспечение бактериальных клеток, содержащих ген, кодирующий литический белок, способный к образованию туннельной структуры в оболочке бактериальной клетки,
(б) необязательно культивирование бактериальных клеток в условиях, в которых литический ген не экспрессируется,
(в) подвергание бактериальной клетки воздействию условий, при которых литический ген экспрессируется, а цитоплазматические компоненты бактериальных клеток высвобождаются, и
(г) получение готовых "теней" бактериальных клеток.
Предпочтительным примером гена, кодирующего литический белок, является ген E бактериофага phiX174.
Особенно предпочтительно, чтобы бактериальные клетки, используемые для вышеописанного способа получения "теней" бактериальных клеток, дополнительно кодировали фермент, способный к гидролизу цитоплазматических компонентов в бактериальной клетке, как описано в WO 03/006630. Соответствующий способ получения "теней" бактериальных клеток включает следующие дополнительные стадии:
(а) необязательно культивирование бактериальных клеток в условиях, при которых ферментный ген не экспрессируется,
(б) подвергание бактериальной клетки воздействию условий, при которых ферментный ген экспрессируется, а цитоплазматические компоненты бактериальных клеток разрушаются.
Ген, кодирующий гидролитический фермент, предпочтительно является геном нуклеазы, в частности, геном нуклеазы, продуцируемой Staphylococcus aureus (WO 03/006630).
В особенно предпочтительном варианте воплощения изобретения литический ген и ферментный ген оперативно связаны с регулирующей экспрессию контрольной последовательностью. В более предпочтительном варианте каждый из литического гена и ферментного гена оперативно связывается с автономной контрольной последовательностью, регулирующей экспрессию, и входит в состав одного или нескольких векторов. Таким образом, экспрессия обоих генов может инициироваться по отдельности, например в разное время процедуры культивирования.
Предпочтительно клетки культивируются в условиях, репрессирующих и литический ген, и ферментный ген. Затем добавлением индуктора, такого как IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид), индуцируется экспрессия фермента, например, когда ферментный ген переходит под контроль химически регулируемого промотора, такого как промотор lac, или его производного. В более предпочтительном варианте фермент экспрессируется в форме, которая является неактивной, по меньшей мере, частично и которая может активироваться на более поздней стадии добавлением простетической группы к культуре.
Позднее, например через 20 мин - 1,5 ч, более предпочтительно - примерно через 45 мин, за счет повышения температуры, например, до 42°C-44°C индуцируется экспрессия литического гена, например, когда литический ген оперативно связывается с регулируемым температурой промотором, таким как промотор PR или PL фага лямбда, в комбинации с модифицированной последовательностью оператора и температуро-чувствительным репрессором cl857 (WO 98/07874). После этого примерно через 30 мин - 2 ч, например примерно через 90 мин, активируется фермент добавлением требуемой для его действия простетической группы, например, ионов металлов, таких как Mg2+ и/или Са2+. Экспрессия литического белка Е может индуцироваться также химическими реагентами, например арабинозой при клонировании под системой химически индуцируемого промотора/оператора.
В этом контексте особое преимущество имеет то, что опосредованная бета-пропиолактоном инактивация не-E-лизированных бактерий эффективна как при рестриктивной, так и при пермиссивной температуре.
В следующем предпочтительном варианте воплощения изобретения бета-пропиолактон добавляется после индуцирования лизиса и после активации гидролитического фермента, если таковая проводится, и до или после очистки препарата "теней" бактериальных клеток, при этом предпочтительным является добавление бета-пропиолактона до очистки. Добавление бета-пропиолактона после очистки требует дополнительной стадии очистки, например, перед его применением, последующей модификацией и/или лиофилизацией "теней" бактериальных клеток.
При крупномасштабном производстве препаратов "теней" бактериальных клеток предпочтительно рекомендуется проводить концентрирование "теней" бактериальных клеток после их сбора, например, из ферментера путем центрифугирования, тангенциальной фильтрации, лиофилизации, распылительной сушки или другими способами. После концентрирования может добавляться бета-пропиолактон в количествах и при условиях, оговоренных выше.
Изобретение относится также к композиции, включающей обработанный бета-пропиолактоном препарат "теней" бактериальных клеток, как описано выше, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или адъювант. Композиция пригодна в качестве вакцины или адъюванта, например иммуностимулирующего соединения, которое используется либо одно, либо в комбинации с иммуногеном, индуцирующим усиление иммунного ответа. Композиция пригодна для применения в медицине и ветеринарии. Более того, "тени" бактериальных клеток, не содержащие живых клеток, могут использоваться в качестве носителей для лечебных и диагностических средств, таких как полипептиды (например, антитела, цитокины, интерфероны, хемокины), ферменты и неиммуногенные или иммуногенные полипептиды или пептиды, нуклеиновые кислоты и низкомолекулярные активные вещества (например, пептиды, гормоны, антибиотики, противоопухолевые агенты, стероиды, иммуномодуляторы), как раскрывается в WO 2005/011713, при этом "тени" бактериальных клеток могут герметично фасоваться, например, как описано в WO 01/54672 или WO 2005/011713.
Помимо этого, изобретение относится к применению бета-пропиолактона в производстве препарата "теней" бактериальных клеток, в котором препарат "теней" бактериальных клеток является, в частности, фармацевтическим препаратом.
Следует заметить, что все патентные и не относящиеся к патентам документы, обсуждаемые в настоящем описании, включены в перечень ссылок, принятых во внимание при составлении настоящей заявки.
Описание фигур
Фиг.1 - Схема способа получения BG на основе Shigella flexneri 2а BG с экспрессией E-SNUC плазмидой pGLN1c.
Фиг.2 - Конструкция плазмиды pGLysivb.
Фиг.3 - Репрезентативный график ферментации S. flexneri 2а (pGLN1c) с визуализацией моментов времени A-M в ходе способа получения BG.
Фиг.4 - Сравнительная оценка Е. coli NM522 (pBBR1MCS5, без E-лизиса) и Е. coli BG NM522 (pGLysivb, плазмида Е-лизиса), необработанных и обработанных BPL в конечной концентрации 0,05% BPL при 42°C.
Фиг.4A - Е. coli NM522 (backbone-плазмида (плазмида-основа, pBBR1MCS5, без Е-лизиса): необработанные клетки против BPL-обработанных.
Фиг.4B - Е. coli BG NM522 (pGLysivb, плазмида E-лизиса): необработанные клетки против BPL-обработанных.
Фиг.5 - Температурное исследование для оценки эффективности действия BPL при различных температурах.
Фиг.6 - Сравнительная оценка Е. coli NM522 BG и Е. coli NM522, полученных в масштабе ферментера на 20 л и обработанных BPL в конечной концентрации 0,05% BPL при 42°C в течение 30 мин.
Фиг.6A - Е. coli BG NM522 (pGLysivb, плазмида Е-лизиса), обработанные BPL.
Фиг.6B - Е. coli NM522 (backbone плазмида pBBR1MCS5, без Е-лизиса), обработанные BPL.
Фиг.7 - Е. coli NM522 BG, полученные комбинацией Е-лизиса и нуклеазы (Е-SNUC) в масштабе ферментера на 20 л и инактивированные BPL в конечной концентрации 0,025% BPL при 42°С в течение 30 мин.
Фиг.8 - Исследование консистенции в ходе способа получения BG из Shigella flexneri 2a BG (E-SNUC) с использованием 0,05%-ного BPL в течение 30 мин для окончательной инактивации.
Фиг.9 - Данные ПЦР анализа в режиме реального времени консистенции образцов, отобранных при получении BG из Shigella flexneri 2a в ходе 5 процессов ферментации S. flexneri 2а (pGLN1c). Среднее ± SD (стандартное отклонение) в 5 циклах ПЦР в режиме реального времени, соответствующих 5 процессам ферментации; d.1. = предел обнаружения = 0,02 нг ДНК/мл.
Фиг.10 - Ферментация Shigella flexneri 2а (backbone плазмида pBBR1MCS5), инактивированных 0,05%-ном BPL (контроль).
Фиг.10A - ATCC 700930 (pBBR1MCS5) цикл 1.
Фиг.10B - ATCC 700930 (pBBR1MCS5) цикл 2.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1. Получение "теней" бактериальных клеток (BG) путем комбинирования E-лизиса с обработкой нуклеазой и последующей обработкой бета-пропиолактоном (BPL) в качестве стадии окончательной инактивации (см. фиг.1)
Грамотрицательные бактерии (например, Е. coli или Shigella flexneri 2a в настоящем исследовании) трансформируются плазмидой pGlysivb (кодирующей ген лизиса Е; конструкция плазмиды представлена на фиг.2) или pGLN1c (кодирующей как ген лизиса Е, так и ген SNUC нуклеазы, продуцируемой Staphylococcus aureus; WO 03/006630). Плазмиды - pGlysivb и pGLN1c - жестко регулируют экспрессию гена лизиса Е повышением температуры с 35°С до 42°С-44°С под мутированным термочувствительным Лямбда-промотором (λPRmut), а экспрессия SNUC зависит от индукции upstream (т.е. расположенного "вверх по течению" в направлении 5′ конца) lac-промотора добавлением IPTG. Следствием экспрессии белка Е является образование между внутренней и внешней мембранами бактерий Е-специфичной туннельной структуры, которая приводит к "выталкиванию" цитоплазматического содержимого, включающего хромосомную и плазмидную ДНК, в культуральную среду. При описанных условиях, по меньшей мере, 99,9% всех бактерий превращаются в процессе Е-лизиса в BG. Для гарантированного получения BG, не содержащих нуклеиновых кислот, активируется вторая система в случае "использования" плазмидой pGLN1c способности SNUC к расщеплению ДНК и РНК. Нуклеаза экспрессируется за 30 мин до индуцирования экспрессии гена Е во время фазы экспоненциального роста бактерий и активируется по окончании Е-лизиса добавлением хлорида магния и хлорида кальция. Для полной инактивации всех потенциально не убитых бактерий в ферментационный бульон проводится добавление BPL двумя порциями в качестве последней стадии способа получения BG. Спустя 30 мин инкубации с BPL при 42°С-44°С, BG собираются путем центрифугирования или тангенциальной фильтрации, интенсивно промываются в стерильной воде и подвергаются лиофилизации.
В ходе способа получения BG отбираются образцы культуральной жидкости в фиксированные моменты времени (обозначенные A-M на фиг.3) для определения оптической плотности, колониеобразующих единиц (CFU), внешнего вида BG под микроскопом, а также для ПЦР анализа ДНК-содержания в режиме реального времени. Параметры ферментации, такие как pH, скорость потока воздуха, рО2, скорость перемешивания и температура, автоматически документируются программой ферментации. В ходе исследования консистенции все параметры сохранялись в узком окне.
Чтобы определить, имеет ли окончательная инактивация бактерий добавлением BPL перед сбором BG решающее значение для способа получения BG, отбирали 3 л культуральной среды из ферментера перед добавлением BPL в момент времени K. Культуральную среду в склянке обрабатывали BPL в конечной концентрации 0,05%, который добавляли двумя порциями с концентрацией BPL 0,025% (моменты времени K и L). Добавление BPL двумя порциями рекомендуется для предупреждения возможного обсеменения (например, в результате образования капель под крышкой склянки) и достижения эффективности инактивации. Для последующего анализа выживаемости бактерий 3 л BG+BPL-обработанного материала собирали в момент времени M (в 6 бутылочек, каждая из которых содержала 400 мл суспензии BG) путем центрифугирования (15 мин при 8000 об/мин).
После центрифугирования супернатанты отбрасывали, а осадки BG интенсивно промывали стерильной водой. На первой стадии промывки каждый осадок BG ресуспендировали в 400 мл стерильной деионизированной воды и после центрифугирования хранили в течение ночи при -20°C. Последующие стадии промывки имели целью довести объем материала до конечного объема 40 мл (стадия промывки 2: 4-кратно × 400 мл стерильной деионизированной воды; стадия промывки 3: 2-кратно × 400 мл стерильной деионизированной воды; стадия промывки 4: 1-кратно × 400 мл стерильной деионизированной воды). Альтернативно BPL-обработка может также проводиться на этой стадии процесса.
Конечный осадок от центрифугирования ресуспендировали добавлением 40 мл стерильной деионизированной воды и распределяли в 2 склянки для лиофилизации; остаток образца (~5 мл) переносили в третью склянку для лиофилизации. После лиофилизации материал проверяли на стерильность. Каждое тестирование на стерильность проводили трижды. Примерно 10 мг каждого препарата BG помещали в мерные пробирки эппендорф. Затем в каждую пробирку добавляли по 1,5 мл LBv-среды, и ресуспендировали лиофилизированный материал. 1 мл суспензии заливали в пустую чашку Петри и добавляли 20 мл LBv агара (охлажденного соответствующим образом до ощущения рукой как теплый). После застывания агара чашку инкубировали при 28°С в течение 24 ч. Для посева на чашку с LBv агаром использовали 100 мкл суспензии BG, инкубацию проводили при 28°С в течение 24 ч. 200 мкл суспензии "теней" высевали на чашку с LBv агаром и инкубировали при 28°C в течение 24 ч. 100 мкл суспензии "теней" использовали для инокуляции 5 мл LBv и инкубировали в течение 24 ч при 28°C. После обогатительной инкубации последней среды 100 мкл и 200 мкл высевали на LBv агар и инкубировали при 28°C в течение 24 ч. Остаток суспензии BG хранили при 4°С. Посев и подсчет количества бактерий на чашках, используемых для проведения теста на стерильность, проводили с помощью системы WASP (Don Whitley Scientific, Ltd.).
Для ПЦР в режиме реального времени отбирали образцы культуральной жидкости в процессе ферментации в моменты времени В-М. Все циклы ПЦР в режиме реального времени выполняли в стандартизированных условиях с применением прибора Biorad IQ Icycler, амплифицирующего фрагмент кассеты устойчивости к гентамицину плазмиды (pGLN1c) лизиса/SNUC. Индивидуальную кривую устойчивости для количественной оценки pGLNIc строили по каждому ПЦР циклу в режиме реального времени, показавшему коэффициент корреляции, по меньшей мере, 0,998.
Пример 2. Сравнительная оценка Е. coli NM522 (pBBR1MCS5, без Е-лизиса) и Е. coli BG NM522 (pGlysivb, плазмида E-лизиса), необработанных и обработанных BPL в конечной концентрации 0,05% BPL при 42°С
Результат
Данные по Е. coli NM522 (pBBR1MCS5), которые были обработаны 0,05% BPL при 42°С (фиг.4A), показывают, что снижение жизнеспособности на ~5 log отмечалось в мелкомасштабных экспериментах, в то время как Е. coli BG NM522 (pGlysivb), обработанные 0,05%-ном BPL при 42°С (фиг.4B), не показали выживания бактерий. Применение концентрации BPL, равной 0,05%, при температуре 42°С и продолжительности 30 мин достаточно для обеспечения надежной инактивации Е-лизированных бактерий: живых клеток при подсчете не было обнаружено. Обработка бактерий Е. coli таким же количеством BPL при тех же параметрах не приводила к полной инактивации.
Пример 3. Температурное исследование для оценки эффективности действия BPL при различных температурах
Стерилизующая активность BPL и его самодеструкция в воде зависят от температуры. Для установления температурного профиля инактивации бактерий в условиях получения BG было проведено исследование с целью сравнительной оценки скорости инактивации Е. coli NM522 pGlysivb при начальном содержании CFU (КОЕ) примерно 1·103/мл с применением 0,05%-ного BPL при 4 различных температурах (16°C, 28°C, 36°C и 42°C).
Результат
Удалось продемонстрировать высокую скорость инактивации с помощью BPL (15 мин) при производстве BG при 42°C по сравнению с более низкими температурами (30 мин при 36°C). За 30 мин количество CFU (КОЕ) снизилось примерно на 1,5 log при 28°C и очень незначительно (менее чем на 0,5 log) при 16°С. Была определена температурно-зависимая скорость реакции (фиг.5).
Пример 4. Сравнительная оценка Е. coli NM522 BG и Е. coli NM522, полученных в масштабе ферментера на 20 л и обработанных BPL в конечной концентрации 0,05% BPL при 42°С в течение 30 мин
Для определения инактивирующего действия BPL на E. coli NM522 (pBBR1MCS5) при тех же условиях ферментации, какие применялись для полной инактивации BG, полученных из Е. coli NM522 (pGlysivb) (фиг.6A), были проведены контрольные ферментации с использованием Е. coli NM522, трансформированных backbone плазмидой (плазмидой-основой) pBBR1MCS5 (без лизиса, без нуклеазы) (фиг.6B). Скорость киллинга под действием BPL, а также концентрацию ДНК в бактериальных образцах измеряли в моменты времени и при условиях ферментации, указанных в описании способа получения BG (пример 1, фиг.3).
Результат
Данные по изучению ферментации бактерий Е. coli NM522 (backbone плазмида pBBR1MCS5), которые были обработаны 0,05%-ном BPL при 42°C (фиг.6B), показали снижение жизнеспособности на ~3 log, тогда как в случае Е. coli BG, полученных из NM522 (pGlysivb) и обработанных 0,05%-ном BPL при 42°C (фиг.6A), достигалась полная инактивация: живых CFU (КОЕ) к концу способа получения BG не было обнаружено. (Фиг.6A) В случае Е. coli NM522 BG (pGlysivb) в ферментере емкостью 20 л окончательная и надежная стадия инактивации в способе получения BG может достигаться за счет обработки 0,05%-ном BPL в течение 30 мин при 42°С. (Фиг.6B) В случае Е. coli NM522 (backbone плазмида pBBR1MCS5) в ферментере емкостью 20 л окончательная инактивация Е. coli не может быть достигнута за счет обработки 0,05%-ном BPL в течение 30 мин при 42°С. Снижение жизнеспособности бактерий составило ~3 log.
Пример 5. Е. coli NM522 BG, полученные путем комбинирования E-лизиса с обработкой нуклеазой (E-SNUC) в ферментере емкостью 20 л и инактивированные BPL в конечной концентрации 0,025% при 42°С в течение 30 мин
Результат
Проводившиеся в ходе получения BG измерения BPL-концентрации, которая применялась для полной инактивации бактерий в BG, не содержащих ДНК (E-SNUC BG), из Е. coli NM522 (pGlysivb, кодирующая ген лизиса Е; pSNUCIQ3, кодирующая ген SNUC нуклеазы, продуцируемой Staphylococcus aureus; Mayr et al., 2005), показали, что указанная концентрация составила менее 0,025% (фиг.7). В способе получения Е. coli NM522 BG (pGlysivb, pSNUCIQ3), не содержащих ДНК, в ферментере емкостью 20 л окончательная и надежная инактивация может достигаться обработкой 0,025%-ном BPL в течение 30 мин при 42°С (фиг.7).
Пример 6. Исследование консистенции Shigella flexneri 2a BG (E-SNUC) в ходе получения BG с использованием 0,05%-ного BPL в течение 30 мин для окончательной инактивации
Исследование консистенции позволило получить суммарные данные по пяти процессам ферментации, все из которых проводились при параметрах, указанных в кратком описании способа получения BG, представленного на фиг.3 (см. пример 1).
Для визуальной оценки консистенции в процессе ферментации фиг.8 показывает средние значения CFU±SD в конкретные моменты отбора образцов (C = индукция лизиса, E = активация SNUC, K = 1-е добавление BPL, L = 2-е добавление BPL и M = сбор клеток). Как указано выше в описании способа получения BG (пример 1, фиг.3), образцы в процессе ферментации отбирали в моменты времени В-М для ПЦР анализа в режиме реального времени остаточной ДНК в образцах BG. Для визуальной оценки консистенции по данным ПЦР в режиме реального времени фиг.9 показывает среднее содержание ДНК в нг/мл собранной культуры ± SD в конкретные моменты отбора образцов (C = индукция лизиса, E = активация SNUC, K = 1-е добавление BPL, L = 2-е добавление BPL и M = сбор клеток).
Результат
Исследование консистенции в ходе способа получения Shigella flexneri 2а BG показало высокую корреляцию показателей консистенции во все моменты времени их измерения в течение всего процесса (фиг.9). Тесты на стерильность проводились, как указано в кратком описании способа получения BG (пример 1, фиг.3). Материал для тестов на стерильность собирали дважды - в момент времени K, т.е. до добавления BPL, и в момент времени M, т.е. в конце способа получения BG. Установлено, что все тестируемые образцы BG были стерильными. ПЦР анализ в режиме реального времени проводили с целью выявления снижения содержания ДНК в ходе всего процесса. Образцы показали хорошую консистенцию; предел обнаружения ДНК (=0,02 нг ДНК/мл культуры) был достигнут в готовом материале образцов, отобранных в момент времени M.
Пример 7. Ферментация с использованием Shigella flexneri 2a (pBBR1MCS5), инактивированных 0,05%-ном BPL, в качестве контроля
Для определения инактивирующего действия BPL на бактерии Shigella flexneri 2a применялись такие же условия ферментации, что и в двух контрольных ферментациях для получения BG из Shigella flexneri 2a, трансформированных backbone плазмидой pBBR1MCS5 (без лизиса, без нуклеазы). Скорость киллинга под воздействием BPL, а также концентрация ДНК в бактериальных образцах измерялись в моменты времени и при условиях ферментации, указанных в описании способа получения BG (пример 1, фиг.3).
Результат
В обоих процессах ферментации S. flexneri 2a (backbone плазмида pBBR1MCS5) инактивация 0,05%-ном BPL приводила к уменьшению количества живых клеток (CFU) на 4 log (фиг.10A, B). Это указывает на то, что, в отличие от E-лизиса или комбинированного E-лизиса/SNUC, одного BPL в конечной концентрации 0,05% недостаточно для киллинга всех бактерий за 30 мин.
Полученные в режиме реального времени данные контрольных ферментации не показали снижения ДНК.

Claims (18)

1. Способ получения препарата "теней" бактериальных клеток, включающий стадии:
(а) получения препарата "теней" бактериальных клеток и
(б) последующей обработки препарата "теней" бактериальных клеток бета-пропиолактоном в конечной концентрации от 0,01% до 1% (об./об.), при которой количество живых бактериальных клеток в указанном препарате "теней" снижается по меньшей мере на 103-104.
2. Способ по п.1, в котором количество оставшихся жизнеспособными бактериальных клеток в указанном препарате "теней" снижается по меньшей мере на 105 или на 106.
3. Способ по п.1, в котором "тени" бактериальных клеток обрабатываются бета-пропиолактоном в конечной концентрации от 0,025% до 0,5%.
4. Способ по п.1, в котором добавление бета-пропиолактона проводится в две последовательные стадии.
5. Способ по п.1, в котором добавление бета-пропиолактона проводится при температуре от 26°C до 50°C, предпочтительно от 35°C до 45°C, более предпочтительно - при температуре от 38°C до 43°C.
6. Способ по п.1, в котором "тени" бактериальных клеток инактивируются в течение от 10 до 60 мин, предпочтительно от 15 до 45 мин, более предпочтительно от 25 до 35 мин.
7. Способ по п.1, в котором препарат "теней" бактериальных клеток получают путем:
(а) обеспечения бактериальных клеток, содержащих ген, кодирующий литический белок, способный к формированию туннельной структуры в комплексе оболочки бактериальной клетки,
(б) необязательно культивирования бактериальных клеток в условиях, при которых литический ген не экспрессируется,
(в) подвергания бактериальной клетки воздействию условий, при которых литический ген экспрессируется, а цитоплазматические компоненты бактериальных клеток высвобождаются, и
(г) получения готовых "теней" бактериальных клеток.
8. Способ по п.7, в котором ген, кодирующий литический белок, является геном Е бактериофага phiX174.
9. Способ по п.7, в котором бактериальные клетки дополнительно кодируют фермент, способный к гидролизу цитоплазматических компонентов в бактериальной клетке, включающий следующие стадии:
(а) необязательно культивирования бактериальных клеток в условиях, при которых ферментный ген не экспрессируется,
(б) подвергания бактериальной клетки воздействию условий, при которых ферментный ген экспрессируется, а цитоплазматические компоненты бактериальных клеток разрушаются.
10. Способ по п.9, в котором ген, кодирующий гидролитический фермент, является геном нуклеазы, предпочтительно геном нуклеазы, продуцируемой Staphylococcus aureus.
11. Способ по п.9, в котором литический ген и ферментный ген оперативно связаны с регулирующей экспрессию контрольной последовательностью.
12. Способ по п.11, в котором каждый из литического гена и ферментного гена оперативно связан с автономной контрольной последовательностью, регулирующей экспрессию, и входит в состав одного или нескольких векторов.
13. Способ по п.12, в котором экспрессия литического гена и экспрессия фермента индуцируются в разные моменты времени.
14. Способ инактивации живых бактериальных клеток в препарате "теней" бактериальных клеток, включающий обработку живых бактериальных клеток бета-пропиолактоном в конечной концентрации от 0,01% до 1% (об./об.).
15. Фармацевтическая композиция, которая является вакциной или адъювантом, включающая эффективное количество препарата "теней" бактериальных клеток, обработанного бета-пропиолактоном в конечной концентрации от 0,01% до 1% (об./об.), и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или адъювант.
16. Композиция по п.15 для применения в медицине.
17. Композиция по п.15 для применения в ветеринарии.
18. Применение бета-пропиолактона в конечной концентрации от 0,01% до 1% (об./об.) для инактивации живых бактериальных клеток в препарате "теней" бактериальных клеток.
RU2010134400/10A 2008-01-18 2009-01-16 Способ получения "теней"бактериальных клеток (bg) RU2520082C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2197708P 2008-01-18 2008-01-18
US61/021,977 2008-01-18
PCT/EP2009/000272 WO2009090093A1 (en) 2008-01-18 2009-01-16 Bacterial ghost (bg) production process using betapropiolactone (blp) for final inactivation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2010134400A RU2010134400A (ru) 2012-02-27
RU2520082C2 true RU2520082C2 (ru) 2014-06-20

Family

ID=40532591

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2010134400/10A RU2520082C2 (ru) 2008-01-18 2009-01-16 Способ получения "теней"бактериальных клеток (bg)

Country Status (13)

Country Link
US (1) US7968323B2 (ru)
EP (1) EP2240570B1 (ru)
CN (1) CN102224237B (ru)
AU (1) AU2009204952B2 (ru)
CA (1) CA2710814C (ru)
DK (1) DK2240570T3 (ru)
ES (1) ES2452471T3 (ru)
NZ (1) NZ586669A (ru)
PL (1) PL2240570T3 (ru)
PT (1) PT2240570E (ru)
RU (1) RU2520082C2 (ru)
SI (1) SI2240570T1 (ru)
WO (1) WO2009090093A1 (ru)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101934072B (zh) * 2010-03-24 2012-05-23 天津农学院 一种制备App菌影的方法及App菌影装载巴氏杆菌抗原制备亚单位疫苗的方法
CN101991863B (zh) * 2010-04-28 2012-11-07 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种双重靶向dna疫苗及其构建方法
PL2591798T3 (pl) 2011-11-09 2015-04-30 Werner Lubitz Szczepionka do zastosowania w immunoterapii nowotworów
CN103436550B (zh) * 2013-07-26 2015-04-15 黑龙江八一农垦大学 一种菌影载体的构建方法
WO2015103793A1 (zh) * 2014-01-13 2015-07-16 深圳市汉科生物工程有限公司 用带有活性因子的细胞空壳作为淋巴细胞体外培养增效剂的制备及其应用方法
US10526574B2 (en) 2014-02-21 2020-01-07 Bird-C Gmbh & Co. Kg Fed-batch process for the production of bacterial ghosts
EP3195878A1 (en) 2016-01-22 2017-07-26 Werner Lubitz Bacterial ghosts for the treatment of cancer
KR101825439B1 (ko) 2016-04-15 2018-02-05 배재대학교 산학협력단 염산 처리에 의한 그람양성 박테리아 고스트의 제조 방법
EP3700552A1 (en) 2017-10-25 2020-09-02 Allero Therapeutics BV Treatment of immune diseases by administration of antigen-specific formulations
KR102178334B1 (ko) 2019-01-29 2020-11-12 배재대학교 산학협력단 황산을 이용하는 박테리아 고스트 제조방법, 상기 방법으로 제조된 박테리아 고스트 및 이의 용도
CN110812473A (zh) * 2019-12-10 2020-02-21 广东君睿生物技术研究有限公司 一种副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪多杀性巴氏杆菌病三联灭活疫苗及其制备方法
CN110951666A (zh) * 2019-12-27 2020-04-03 江苏农牧科技职业学院 一种双蛋白表达的大肠杆菌菌蜕及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2989435A (en) * 1957-01-03 1961-06-20 Philips Corp Method of chemical sterilization of aqueous liquids containing bacteria or spores ofbacteria
EP0460480A2 (en) * 1990-06-07 1991-12-11 Bayer Corporation Bacterin for the treatment of necrophorum diseases and a method for the production thereof
RU2059417C1 (ru) * 1992-10-01 1996-05-10 Данилевич Василий Николаевич Способ стерилизации питательных сред
WO2003006630A2 (en) * 2001-07-11 2003-01-23 Apovia Ag Nucleic acid free ghost preparations

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3715840A1 (de) 1987-05-12 1988-12-01 Boehringer Mannheim Gmbh Fuer ein lytisch wirksames, chimaeres protein kodierende rekombinante dna und ihre verwendung
DE4005874A1 (de) 1990-02-24 1991-11-07 Boehringer Mannheim Gmbh Traegergebundene rekombinante proteine, verfahren zur herstellung und verwendung als immunogene und vakzine
WO1991013555A1 (en) 1990-03-07 1991-09-19 Engelhard Corporation Animal feed additive and method for inactivating mycotoxins present in animal feeds
DE10003241A1 (de) 2000-01-26 2001-08-02 Werner Lubitz Verschließen von Bakterienghosts
US7560113B2 (en) * 2003-06-23 2009-07-14 Nova Sterilis, Inc. Inactivating organisms using carbon dioxide at or near its supercritical pressure and temperature conditions
DE10335796A1 (de) 2003-08-05 2005-03-03 Lubitz, Werner, Prof. Dr. Verschliessen von Bakterienghosts durch bioaffine Wechselwirkungen

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2989435A (en) * 1957-01-03 1961-06-20 Philips Corp Method of chemical sterilization of aqueous liquids containing bacteria or spores ofbacteria
EP0460480A2 (en) * 1990-06-07 1991-12-11 Bayer Corporation Bacterin for the treatment of necrophorum diseases and a method for the production thereof
RU2059417C1 (ru) * 1992-10-01 1996-05-10 Данилевич Василий Николаевич Способ стерилизации питательных сред
WO2003006630A2 (en) * 2001-07-11 2003-01-23 Apovia Ag Nucleic acid free ghost preparations

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009204952B2 (en) 2013-02-07
SI2240570T1 (sl) 2014-04-30
CA2710814C (en) 2014-10-14
NZ586669A (en) 2012-06-29
US20100092516A1 (en) 2010-04-15
DK2240570T3 (en) 2014-03-10
US7968323B2 (en) 2011-06-28
RU2010134400A (ru) 2012-02-27
ES2452471T3 (es) 2014-04-01
CA2710814A1 (en) 2009-07-23
AU2009204952A1 (en) 2009-07-23
EP2240570A1 (en) 2010-10-20
PT2240570E (pt) 2014-02-17
PL2240570T3 (pl) 2014-05-30
WO2009090093A1 (en) 2009-07-23
CN102224237B (zh) 2014-03-12
EP2240570B1 (en) 2013-12-11
CN102224237A (zh) 2011-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2520082C2 (ru) Способ получения "теней"бактериальных клеток (bg)
CN101977616B (zh) 制备噬菌体混合物的方法以及该噬菌体混合物在抗生素抗性葡萄球菌治疗中的用途
US10604548B2 (en) Minicircle DNA vector vaccine platform for foot-and-mouth disease and methods thereof
CN113583971A (zh) 一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用
KR101617464B1 (ko) Ｉｐｖ―ｄｐｔ 백신
CN113583973A (zh) 一株高裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体rdp-kp-20007及其应用
CN113564133B (zh) 柯萨奇病毒a16型毒株及其免疫原性组合物和应用
JP2022526542A (ja) 液体組成物中の生モリクテス綱細菌の安定化
CN113564132B (zh) 柯萨奇病毒a16型毒株及其应用
CN105031636B (zh) 一种嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌二联灭活疫苗及制备方法
CN111057683A (zh) 一种鸡胚接种用病毒稀释液及其制备方法和应用
JP5121230B2 (ja) Ｑ熱のワクチン製剤および該ワクチン製剤の製造方法
RU2741643C1 (ru) Ассоциированная вакцина против миксоматоза, пастереллёза и вирусной геморрагической болезни кроликов 1 и 2 типов
RU2445367C2 (ru) Способ стандартизации контрольно-производственного штамма бактерий pasteurella multocida
CN113430176B (zh) 一株稳定高效的烈性沙门氏菌噬菌体rdp-sa-21004及其应用
RU2098134C1 (ru) Способ инактивации инфекционной активности возбудителей кишечных инфекций и вакцина для иммунизации животных
Lapteva Development of submerged cultivation method for vaccine Mycoplasma mycoidessubsp. mycoidesstrain
CN117946979A (zh) 三株具有特异性分子靶标的烈性小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体及其应用
JP2023540453A (ja) 凍結乾燥生ボルデテラワクチン
RU2480238C1 (ru) Вакцина ассоциированная против ньюкаслской болезни, реовирусного теносиновита и метапневмовирусной инфекции птиц инактивированная эмульсионная
CN114668838A (zh) 防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎和鸭腺病毒3型的四联灭活疫苗
CN114806879A (zh) 一种高浓度菌影疫苗灭活方法
RU2404801C1 (ru) Способ изготовления вакцины против колибактериоза кроликов
BRPI0802934A2 (pt) processo para cultivo, isolamento e separação de bactérias corynebacterium pseudotuberculosis

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20180117