CN103355285B - 一种烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法 - Google Patents
一种烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103355285B CN103355285B CN201310315546.1A CN201310315546A CN103355285B CN 103355285 B CN103355285 B CN 103355285B CN 201310315546 A CN201310315546 A CN 201310315546A CN 103355285 B CN103355285 B CN 103355285B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- freezing
- freezing pipe
- enchylema
- tobacco leaf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明提供了一种烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法，包括以下步骤：将烟草叶片愈伤组织细胞在培养基中培养，制得细胞悬浮液；将细胞悬浮液离心并去上清液后，制得细胞液，将细胞液转移至冷冻保藏管中并在其中加入冷冻保护剂后密封；将冷冻保藏管降温至4℃并在此条件下静置20-40分钟，然后继续降温至-20℃并在此温度下静置30-40分钟，继续降温至-40℃并在此温度下静置3-4小时，最后将冷冻保藏管在-80℃的温度下保存。本发明所提供的方法简单易行，冻存后的细胞有较高的存活率，且本方法不需要消耗大量的人力物力，成本低。
Description
技术领域
本发明提供了一种细胞保存的方法，具体涉及一种烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法，属于生物技术领域。
背景技术
烟草(tobacco)是茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana tabacum)一年生草本植物，大约有60多种。烟草的特点是易于进行组织培养、容易得到转化植株而成为典型的模式植物，与拟南芥同被誉为植物界的“果蝇”，在技术应用中，其可作为生物反应器，生产抗癌的基因产物，然后利用生物技术予以提取，用于医学治疗。另外，烟草在开发食品和药物资源方面的诸多潜在用途将会不断地被发现、利用。因此，通过组织培养得到烟草细胞具有重要医学研究价值。但是，科学研究中种质资源的保存和保护是科研人员所面临的一个重要难题。这是因为细胞的传代是有限制的，长期连续传代的细胞不仅消耗大量的人力和物力，而且细胞的生长于形态等会有一定退变或转化，因而细胞失去原有的遗传特性，有时还会由于细胞污染而造成传代中断，种质丢失。因此，在实际工作中常需要冻存一定数量的细胞，以备替换备用。关于烟草愈伤组织的冷冻保存方法尚未见报道，因此找到一种简单易行且高效率的冷冻保存方法显得十分重要。
发明内容
本发明提供了一种烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法，解决了背景技术中的不足，该保存方法简单易行，冻存后的细胞有较高的存活率。本发明所提供的技术方案丰富了超低温保存的方法，对其他植物种类的愈伤组织细胞的超低温保存也提供了一定的参考。
实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
一种烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法，包括以下步骤：（1）、将烟草叶片愈伤组织细胞在培养基中培养，制得细胞悬浮液；
（2）、将细胞悬浮液离心并去上清液后，制得细胞液，将细胞液转移至冷冻保藏管中并在其中加入冷冻保护剂后密封；
（3）、将冷冻保藏管降温至4℃并在此条件下静置20-40分钟，然后继续降温至-20℃并在此温度下静置30-40分钟，继续降温至-40℃并在此温度下静置3-4小时，最后将冷冻保藏管在-80℃的温度下保存。
步骤（1）中的培养基为浓度8%的蔗糖液体培养基，培养时间为5天。
步骤（2）中将细胞悬浮液在4℃的条件下以800-1000 rpm的速度离心5-10分钟。
所述的冷冻保护剂为灭菌后的山梨醇和二甲基亚砜，两者的体积比为2：0.9～1.1，细胞液中所加入的冷冻保护剂的量占细胞液的体积比为40%～50%。
在步骤（3）冷冻保藏完成后，细胞复苏的培养步骤为：
a取出冷冻保藏管，检查冷冻保藏管是否密封；
b将冷冻保藏管立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在0.5-1.5分钟内全部融化，用酒精擦拭冷冻保藏管外部，然后将冷冻保藏管移入无菌操作台内；
c 将解冻的细胞液缓慢加入盛有培养基的培养容器内，稀释比例为1：10，混合均匀后将培养容器放入培养箱中培养；
d在培养后的隔日更换培养液即可完成细胞复苏。
本发明所用的二甲基亚砜（DMSO）是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减少自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。保护剂一般使用甘油或二甲基亚砜，该物质分子量小，溶解度大，容易穿透细胞，其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而使冰点下降和保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩，且对细胞无明显毒性。目前DMSO的应用比甘油更为广泛，但要注意的是，DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大，而在4℃时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。
本发明所用的山梨醇作为冷冻保护剂中的填充剂，能防止有效组分随水蒸气一起升华逸散，并使有效组分成形，可以防止细胞蛋白在冷藏过程发生变性。 细胞内含有的水分，在冷冻储存过程中，由于水的冻结及无机物对蛋白质的盐析作用，导致蛋白质发生变性。因此在冷冻之前加入糖或糖醇（如蔗糖、葡萄糖、山梨醇）可以有效妨止蛋白质的冷冻变性。这一类物质的水合物难于结晶，它们在没有被冻结的溶液中对无机物起到一定的稀释作用，从而降低了蛋白质的盐析作用。 同糖类相比，山梨醇作为冷冻干燥的填充剂有诸多优良性质：①稳定性好：山梨醇不会发生水解，而且不具有还原性，不发生象还原糖一样的褐变反应。②溶解速度快：微晶结构的山梨醇的溶解速度比蔗糖要快得多。
本发明的冷冻程序采用非玻璃化冻存法，,冰箱在一定降温速度下分步降温至-80℃，不同的冷冻速度即降温的速度可以对细胞产生不同的损伤。当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶，造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。最适冷冻速率的选择可以获得最高的冷冻存活率。
本发明与现有技术相比的有益效果为：
1、使用50 %山梨醇和二甲基亚砜组合的混合液作为冷冻保护剂，可以保护细胞免受冷冻损伤，保护效果比较好。
2、本发明的关键技术在于在冷冻保护剂存在时，使用分阶段降温保存方法对愈伤组织细胞液进行冷冻保存，能够使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤，同时又利用低温的作用使细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但经过长期保存，在复苏后仍能保持细胞正常的结构和功能；
3、本发明中以-80℃作为保存细胞的超低温度，保存得到细胞的存活率与用液氮温度（-196℃）保存得到的细胞存活率没有显著性差别，又因为实验室保存愈伤组织细胞一般不会超过一年，且液氮贮存器一般两周需充液氮一次，或至少一个月充氮一次，比较费人力和物力。从实际和效益的观点出发，选择本发明所提供的保存方法比较合适。
附图说明
图1是本发明的实施例中不同浓度的蔗糖培养基培养并冷冻处理后细胞的存活率图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明做详细具体的说明。
本实施例中首先将烟草叶片愈伤组织细胞在培养基中培养5天，制得细胞悬浮液。分为三组培养，三组中分别在浓度为3%、4%和8%的蔗糖液体培养基中培养。
然后将细胞悬浮液在4℃的条件下以800 rpm的速度离心5分钟并去上清液后，制得细胞液，分别选取2mL细胞液转移至冷冻保藏管中，并加入0.858mL的冷冻保护剂后旋紧盖子密封。所述的冷冻保护剂为灭菌后的山梨醇和二甲基亚砜的混合液，其中两者的体积比为2：1。
将冷冻保藏管降温至4℃并在此条件下静置30分钟，然后继续降温至-20℃并在此温度下静置30分钟，继续降温至-40℃并在此温度下静置3小时，最后将冷冻保藏管在-80℃的温度下保存。
在冷冻保藏完成后，细胞复苏的培养步骤为：
a取出冷冻保藏管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
b将冷冻保藏管立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，用酒精擦拭冷冻保藏管外部，然后将冷冻保藏管移入无菌操作台内；
c 将解冻的细胞液缓慢加入盛有培养基的培养容器内，稀释比例为1：10，混合均匀后将培养容器放入培养箱中培养；
e在培养后的隔日更换培养液即可完成细胞复苏。
目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，在-196℃时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-196℃下均可保存十年以上。
细胞损伤或死亡时，伊凡蓝染液可穿透变性的细胞膜，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。 将0.1 ％伊凡蓝染液与复苏细胞液混合（1：20）染色5分钟，用显微镜观察，并统计细胞存活率。普通光学显微镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。根据下式求细胞存活率：活细胞率(%)= 活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。
将本实施例中所保存的三组细胞与相同条件下采用液氮保存的细胞的存活率进行对比，其结果如图1所示，从图1中可以看出，采用本发明中所提供的冷冻保存方法在短期保存后细胞的存活率相对于液氮保存并无明显降低。
由于实验室的细胞冷冻保存期限一般为短期，且液氮贮存器的使用会消耗大量人力和物力，而本发明中所提供的冷冻保藏方法中，结合适宜的冷冻速率、合适的冷冻保护剂，短期保存后内对细胞的活性与用液氮相比无明显影响，同时，本发明所提供的方法操作步骤简单易行，重要的是可以大量节约人力物力资源。
Claims (1)
1.一种烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法，其特征在于包括以下步骤：(1)、将烟草叶片愈伤组织细胞在培养基中培养，制得细胞悬浮液；培养基为浓度3％或4％的蔗糖液体培养基，培养时间为5天；
(2)、将细胞悬浮液在4℃的条件下以800-1000rpm的速度离心5-10分钟，并去上清液后，制得细胞液，将细胞液转移至冷冻保藏管中并在其中加入冷冻保护剂后密封；所述的冷冻保护剂为灭菌后的山梨醇和二甲基亚砜，两者的体积比为2：0.9～1.1，细胞液中所加入的冷冻保护剂的量占细胞液的体积比为40％～50％；
(3)、将冷冻保藏管降温至4℃并在此条件下静置20-40分钟，然后继续降温至-20℃并在此温度下静置30-40分钟，继续降温至-40℃并在此温度下静置3-4小时，最后将冷冻保藏管在-80℃的温度下保存；
在步骤(3)冷冻保藏完成后，细胞复苏的培养步骤为：
a取出冷冻保藏管，检查冷冻保藏管是否密封；
b将冷冻保藏管立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在0.5-1.5分钟内全部融化，用酒精擦拭冷冻保藏管外部，然后将冷冻保藏管移入无菌操作台内；
c将解冻的细胞液缓慢加入盛有培养基的培养容器内，稀释比例为1：10，混合均匀后将培养容器放入培养箱中培养；
d在培养后的隔日更换培养液即可完成细胞复苏。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310315546.1A CN103355285B (zh) | 2013-07-24 | 2013-07-24 | 一种烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310315546.1A CN103355285B (zh) | 2013-07-24 | 2013-07-24 | 一种烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103355285A CN103355285A (zh) | 2013-10-23 |
| CN103355285B true CN103355285B (zh) | 2015-04-15 |
Family
ID=49358239
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310315546.1A Expired - Fee Related CN103355285B (zh) | 2013-07-24 | 2013-07-24 | 一种烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103355285B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110050784A (zh) * | 2019-05-23 | 2019-07-26 | 南京林业大学 | 抗松材线虫病马尾松胚性愈伤组织超低温保存方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102258008A (zh) * | 2011-05-31 | 2011-11-30 | 成都大学 | 一种有效保存苦荞麦愈伤组织的玻璃化超低温保存方法 |
| CN102696579A (zh) * | 2012-06-05 | 2012-10-03 | 杭州师范大学 | 一种石斛原球茎包埋玻璃化法超低温保存方法 |
| CN103283716A (zh) * | 2013-06-08 | 2013-09-11 | 贺彬 | 一种简便的植物by-2细胞冷冻保存方法 |
-
2013
- 2013-07-24 CN CN201310315546.1A patent/CN103355285B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102258008A (zh) * | 2011-05-31 | 2011-11-30 | 成都大学 | 一种有效保存苦荞麦愈伤组织的玻璃化超低温保存方法 |
| CN102696579A (zh) * | 2012-06-05 | 2012-10-03 | 杭州师范大学 | 一种石斛原球茎包埋玻璃化法超低温保存方法 |
| CN103283716A (zh) * | 2013-06-08 | 2013-09-11 | 贺彬 | 一种简便的植物by-2细胞冷冻保存方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103355285A (zh) | 2013-10-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104145943B (zh) | 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用 | |
| US5736397A (en) | Method of use for semi-solid shipping medium for organ-derived cells | |
| CN107996558A (zh) | 细胞冻存液及其应用 | |
| Wang et al. | Cryopreservation of tissue-engineered dermal replacement in Me2SO: Toxicity study and effects of concentration and cooling rates on cell viability | |
| CN109744227A (zh) | 一种细胞冻存液及其应用 | |
| CN110432259A (zh) | 一种冷冻保护液和含有其的细胞冻存液及其在细胞冻存中的应用 | |
| Katkov et al. | Low-and high-temperature vitrification as a new approach to biostabilization of reproductive and progenitor cells | |
| Parihar et al. | Cryopreservation: a comprehensive overview, challenges, and future perspectives | |
| CN107306940A (zh) | 一种海水鱼类的精巢冷冻保存剂及精原细胞的制备方法 | |
| CN105211052B (zh) | 一种培养后的nkt细胞的冻存液及其制备方法 | |
| Nida et al. | Isochoric freezing and its emerging applications in food preservation | |
| CN113925049B (zh) | 一种保持细胞活性的细胞保存液及其制备方法和应用 | |
| Freitas-Ribeiro et al. | Long-term and short-term preservation strategies for tissue engineering and regenerative medicine products: state of the art and emerging trends | |
| CN106942200A (zh) | 一种冻存保护液及其应用 | |
| CN102763642A (zh) | 一种冷冻保护液以及冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法 | |
| Chen et al. | Cryopreservation of tissues and organs: present, bottlenecks, and future | |
| CN103355285B (zh) | 一种烟草叶片愈伤组织细胞的冷冻保存方法 | |
| CN103283716B (zh) | 一种简便的植物by-2细胞冷冻保存方法 | |
| EP3035798B1 (en) | Boron added cell cryopreservation medium | |
| Hyon | A non-frozen living tissue bank for allotransplantation using green tea polyphenols | |
| Wang et al. | Cryopreservation of cell/hydrogel constructs based on a new cell-assembling technique | |
| Zhuang et al. | Cryopreservation of filaments of Scytosiphon lomentaria by vitrification | |
| CN1986780A (zh) | 新型玻璃化液 | |
| Toner et al. | Storage and translational issues in reparative medicine | |
| KR20180070937A (ko) | 미세조류 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 미세조류 동결 보존 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20151231 Address after: 430075 Optics Valley biological city, No. 666, hi tech Avenue, East Lake New Technology Development Zone, Wuhan, Hubei, B8 Patentee after: WUHAN SHANGCHENG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 430074 No. 708 National Road, Hongshan District, Hubei, Wuhan Patentee before: SOUTH CENTRAL University FOR NATIONALITIES |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150415 |