CN103283716B - 一种简便的植物by-2细胞冷冻保存方法 - Google Patents
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Abstract
一种简便的植物BY-2细胞冷冻保存方法，将BY-2细胞在8％蔗糖液体培养基中预培养，然后在冷冻保护剂(山梨醇、二甲基亚砜)的存在下，采用降温冷冻步骤，经过4℃，-20℃，-40℃分阶段降温处理，最后于-80℃保存备用。细胞复苏时采用快速融化法融化冷冻细胞液，离心去上清液后换入新鲜培养基进行培养即可使用。该方法简单易行，减少了液氮冷冻保存的损耗。冷冻保存后的细胞有较高的存活率，能够解决实验室在细胞的培养和使用中存在的人力、物力的消耗和细胞质量降低等问题，可以作为生物实验室的通用技术。
Description
技术领域
本发明属于植物细胞冷冻保存复苏技术领域，具体涉及一种模式植物烟草的愈伤组织的超低温冷冻保存方法。
背景技术
烟草(tobacco)是茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana tabacum)一年生草本植物，大约有60多种。烟草的特点是易于进行组织培养、容易得到转化植株而成为典型的模式植物，与拟南芥同被誉为植物界的“果蝇”，在技术应用中，其可作为生物反应器，生产抗癌的基因产物，然后利用生物技术予以提取，用于医学治疗。另外，烟草在开发食品和药物资源方面的诸多潜在用途将会不断地被发现、利用。因此，通过组织培养得到烟草细胞具有重要医学研究价值。其种质资源的保存和保护是科研人员所面临的一个重要难题。这是因为细胞的传代是有限制的，长期连续传代的细胞不仅消耗大量的人力和物力，而且细胞的生长于形态等会有一定退变或转化，因而细胞失去原有的遗传特性，有时还会由于细胞污染而造成传代中断，种质丢失。因此，在实际工作中常需要冻存一定数量的细胞，以备替换备用。关于烟草愈伤组织的冷冻保存方法尚未见报道，因此找到一种简单易行且高效率的冷冻保存方法显得十分重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烟草愈伤组织的冷冻保存方法，通过对冻存过程中影响细胞存活率的因素的分析和提高资源利用率等方面考虑，实验得出了一套超低温保存烟草愈伤组织的方法，该方法简单易行，冻存后的细胞有较高的存活率，丰富了超低温保存的方法，对其他植物种类的愈伤组织的超低温保存也提供了一定的参考。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
首先对取得的烟草叶片愈伤组织进行预培养使其获得良好的生长状况，然后在冷冻保护剂存在下，将烟草愈伤组织细胞液在4℃，-20℃，-40℃依次处理，最后于-80℃保存备用，取出时采用快速融化法37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1min内全部融化冷冻细胞液，离心去上清液后换入新鲜培养基进行培养即可使用。
具体步骤如下：
预培养：将烟草叶片的愈伤组织在含8％的蔗糖液体培养基中预培养5d；
冷冻保护剂的预处理：将预培养后的细胞悬浮液4℃800rpm离心5min，吸去上清液后保留2ml细胞液转移至冷冻保藏管中，然后在保留的细胞液中加入冷冻保护剂，密封；
加入冷冻保护剂的方式：50％山梨醇0.572ml、二甲基亚砜0.286ml、细胞悬浮液2ml，其中，山梨醇经过高压蒸汽灭菌，二甲基亚砜经过紫外灯灭菌；
降温冷冻程序：采用分步冷冻法：将预处理后的材料降温至4℃下静置预处理30min，再在-20℃，停留30min，再-40℃，静置3h，最后将处于冷冻保藏管中的细胞放置-80℃中保存；
冷冻保藏后的细胞复苏培养步骤：
(1)取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉；
(2)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70％酒精并擦拭容器以灭菌，移入无菌操作台内；
(3)取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1min内全部融化，以70％酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内；
(4)取出解冻的细胞悬浮液，缓缓加入有培养基的培养容器内，稀释比例为1∶10，混合均匀，放入培养箱培养；
(5)在解冻培养后隔日更换培养基。
本发明所用的二甲基亚砜(DMSO)是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减少自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。保护剂一般使用甘油或二甲基亚砜，该物质分子量小，溶解度大，容易穿透细胞，其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而使冰点下降和保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩，且对细胞无明显毒性。目前DMSO的应用比甘油更为广泛，但要注意的是，DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大，而在4℃时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。
本发明所用的山梨醇作为冷冻保护剂中的填充剂，能防止有效组分随水蒸气一起升华逸散，并使有效组分成形，可以防止细胞蛋白在冷藏过程发生变性。细胞内含有的水分，在冷冻储存过程中，由于水的冻结及无机物对蛋白质的盐析作用，导致蛋白质发生变性。因此在冷冻之前加入糖或糖醇(如蔗糖、葡萄糖、山梨醇)可以有效妨止蛋白质的冷冻变性。这一类物质的水合物难于结晶，它们在没有被冻结的溶液中对无机物起到一定的稀释作用，从而降低了蛋白质的盐析作用。同糖类相比，山梨醇作为冷冻干燥的填充剂有诸多优良性质：①稳定性好：山梨醇不会发生水解，而且不具有还原性，不发生象还原糖一样的褐变反应。溶解速度快：②微晶结构的山梨醇的溶解速度比蔗糖要快得多。
本发明的冷冻程序采用非玻璃化冻存法，利用系列不同温度的低温冰箱在一定降温速度下分步降温至-800C，具体为：将预处理后的材料降温至4℃下静置预处理30min，再在-20℃，停留30分钟，再-40℃，静置3h，最后放置-80℃中保存。不同的冷冻速度即降温的速度可以对细胞产生不同的损伤。当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶，造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。最适冷冻速率的选择可以获得最高的冷冻存活率。
本发明的有益效果：
1、使用50％山梨醇和二甲基亚砜组合的混合液作为冷冻保护剂，可以保护细胞免受冷冻损伤，保护效果比较好；
2、本发明的关键技术基于在冷冻保护剂存在时，使用分阶段降温保存方法对愈伤组织细胞液进行冷冻保存，用4℃处理30min，再在-20℃，停留30min，再-40℃，静置3h，最后放置-80℃中的降温速率处理细胞液，使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤，同时又利用低温的作用使细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但经过长期保存，在复苏后仍能保持细胞正常的结构和功能；
3、最后用-80℃作为保存细胞的超低温度，保存得到细胞的存活率与用液氮温度(-196℃)保存得到的细胞存活率没有显著性差别，又因为实验室保存愈伤组织细胞一般不会超过一年，且液氮贮存器一般两周需充液氮一次，或至少一个月充氮一次，比较费人力和物力。从实际和效益的观点出发，选择-80℃超低温冰箱保存比较合适。
附图说明
图1是本发明实施过程中不同蔗糖浓度预处理后两种冷冻处理程序对细胞存活率的比较
图2是在8％的蔗糖中预处理后并在-80℃保存后烟草细胞的伊凡蓝染色结果
图3是在8％的蔗糖中预处理后并在液氮冷冻保存后烟草细胞的伊凡蓝染色结果
具体实施方式
以下将对本发明的优选实施例进行详细的描述；应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。
烟草愈伤组织的冷冻保存方法，包括如下步骤：
预培养：将烟草叶片的愈伤组织在含8％的蔗糖液体培养基中预培养5d；冷冻保护剂的预处理：将预培养后的细胞悬浮液4℃800rpm离心5min，吸去上清液后保留2ml细胞液转移至冷冻保藏管中，然后在保留的细胞液中加入冷冻保护剂，密封；
加入冷冻保护剂的方式：50％山梨醇0.572ml、二甲基亚砜0.286ml、细胞悬浮液2ml，其中，山梨醇经过高压蒸汽灭菌，二甲基亚砜经过紫外灯灭菌；
降温冷冻程序：采用分步冷冻法：将预处理后的材料降温至4℃下静置预处理30min，再在-20℃，停留30分钟，再-40℃，静置3h，最后将处于冷冻保藏管中的细胞放置-80℃中保存；
冷冻保藏后的细胞复苏培养步骤：
(1)取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉；
(2)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70％酒精并擦拭之，移入无菌操作台内；
(3)取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70％酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内；
(4)取出解冻的细胞悬浮液，缓缓加入有培养基的培养容器内，稀释比例为1∶10，混合均匀，放入培养箱培养；
目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，在-196℃时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-196℃下均可保存十年以上。基于实验室的细胞冷冻保存期限一般为短期，且液氮贮存器的使用消耗人力和物力，本发明用-80℃保存细胞，结合适宜的冷冻速率、合适的冷冻保护剂，短期保存后内对细胞的活性与用液氮相比无明显影响(图1)，操作步骤简单易行，且可以节约资源。
细胞损伤或死亡时，伊凡蓝染液可穿透变性的细胞膜，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。将0.1％伊凡蓝染液与复苏细胞液混合(1∶20)染色5分钟，显微镜观察(图2；图3)。
结果统计：普通光学显微镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。根据下式求细胞活力：活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (1)
1.一种简便的植物BY-2细胞冷冻保存方法，其特征在于，它包括如下步骤：
A.预培养：将烟草叶片的愈伤组织在含8％的蔗糖液体培养基中预培养5天；
B.冷冻保护剂的预处理：将预培养后的细胞悬浮液4℃800rpm离心5min，吸去上清液后保留2ml细胞液转移至冷冻保藏管中，然后在保留的细胞液中加入冷冻保护剂，密封；
C.加入冷冻保护剂：冷冻保护剂包括50％山梨醇0.572ml、二甲基亚砜0.286ml、细胞悬浮液2ml，其中，山梨醇经过高压蒸汽灭菌，二甲基亚砜经过紫外灯灭菌；D.降温冷冻程序：采用分步冷冻法：将预处理后的材料降温至4℃下静置预处理30min，再在-20℃，停留30min，再-40℃，静置3h，最后将处于冷冻保藏管中的细胞放置-80℃中保存；
E.冷冻保藏后的细胞复苏的培养步骤：
(1)取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉；
(2)将新鲜培养液置于37℃水槽中回温，回温后喷以70％酒精并擦拭盛装培养液的容器，移入无菌操作台内；
(3)取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1min内全部融化，以70％酒精擦拭保藏管外部，移入无菌操作台内；
(4)取出解冻的细胞悬浮液，缓缓加入有培养基的培养容器内，稀释比例为1：10，混合均匀，放入培养箱培养；
(5)在解冻培养后隔日更换培养液。
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