CN102258008B - 一种从有效保存苦荞麦愈伤组织的玻璃化超低温保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种有效保存苦荞麦愈伤组织的玻璃化超低温保存方法，该方法首次将玻璃化法超低温保存技术应用于苦荞麦愈伤组织的保存，并提供了的一种新型玻璃化保护剂(按每升计)：蔗糖1.0mol+山梨醇0.2mol+聚乙二醇100g+1，2-丙二醇溶液100mL，同时在洗涤方式做了改进，将三步梯度洗脱首次运用到了植物的玻璃化法超低温保存上，所采用的三步梯度洗涤液依次为(按每升计)：牛血清蛋白30g+蔗糖1.0mol+山梨醇0.5mol、牛血清蛋白30g+蔗糖0.5mol+山梨醇1.0mol、牛血清蛋白30g+蔗糖0.5mol。本发明能使超低温保存材料的存活率得到显著地提高，最高可达90.02％。

Description

一种从有效保存苦荞麦愈伤组织的玻璃化超低温保存方法
技术领域
本发明涉及一种植物种质资源的超低温保存技术，特别是涉及一种有效保存苦荞麦愈伤组织的玻璃化超低温保存方法。
背景技术
苦荞麦是集营养、保健、医疗于一体的天然功能食品，加工后经济效益增值很高。目前，苦荞麦的种植主要是通过苦荞麦种子萌发后进行栽种，然而长期的研究发现，苦荞麦种子在保存过程中存在着种子老化的问题，表现为发芽率逐年降低，对苦荞育种十分不利，也对其种质资源的保存相当不利。
超低温保存是现代生物技术的一项主要内容，同时也是植物种质保存技术中较为理想的方法，利用植物的某些组织部位进行的超低温保存及其种质库的建立日益受到人们的重视。超低温保存可长期保存植物的种质资源，特别是对一些稀有、珍贵和频危植物资源的保存具有极其重要的意义。
目前运用最多的超低温保存方法是玻璃化法超低温保存，所谓“玻璃化”就是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的高浓度的玻璃化溶液中，使细胞及其高浓度玻璃化溶液在足够快的降温速率下过冷到玻璃化转变温度，从而被固化成玻璃态(或非晶态) ，并以这种玻璃态在超低温下保存。在玻璃化法超低温保存中起关键作用的是玻璃化保护剂的运用，玻璃化保护剂的浓度和种类对种质资源的保存有着直接的影响，如果保护剂浓度过高，在装载和脱水过程中细胞可能会由于严重的脱水造成细胞的存活率降低甚至细胞死亡；如保护剂浓度过低，植物细胞可能会脱水不充分，含水量较高，同时进入细胞内的保护剂较少，细胞内液浓度较低，在超低温保存过程中细胞内溶液很难形成玻璃态，大部分形成冰晶，对细胞内部结构造成严重的伤害，造成细胞存活率较低。同时，选择适当种类的保护剂也相当重要，不同保护剂的渗透力和对保存细胞的毒性存在较大的差异。
材料的洗涤是决定保存后材料成活率高低的直接因素，洗涤是为了除去高浓度的冰冻保护剂对材料的进一步伤害，因此采用适当的浓度及种类是至关重要的。传统的洗涤方式常采用MS+蔗糖1.2 mol/L溶液对保存后的材料进行洗涤，通常分三步洗涤，每步10分钟，但大量试验研究结果显示，此种方法对苦荞麦愈伤组织的保存效果不佳，保存后细胞的存活率不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有效保存苦荞麦愈伤组织的玻璃化超低温保存方法，该方法对所保存的愈伤组织伤害较小，能明显提高愈伤组织的存活率。
为达到上述目的，本发明采用的解决方法包括如下步骤：
（1）预培养：取苦荞麦的愈伤组织，置于装有培养液的冷冻管中，在常温下预培养1天，所述培养液按每升计含：二甲基亚砜5 0ml+ 山梨醇0.4 mol；
（2）装载： 取预培养1天后的愈伤组织置于装有装载液的冷冻管中，在4 ℃装载处理20～60 分钟, 所述装载液由浓度为0.5 mol/L的蔗糖溶液与玻璃化溶液按体积比40：60配制而成，所述玻璃化溶液按每升计含：蔗糖1.0 mol + 山梨醇0.2 mol + 聚乙二醇100g+ 1,2-丙二醇溶液100ml；
（3）脱水：取装载后的愈伤组织置于装有玻璃化溶液的冷冻管中，在0 ℃脱水处理40～80 分钟，所述玻璃化溶液按每升计含：蔗糖1.0mol+ 山梨醇0.2 mol + 聚乙二醇100g+ 1,2-丙二醇溶液100ml；
（4）冷冻保存：将脱水处理后的上述冷冻管迅速投入液氮中进行超低温保存；
（5）解冻及洗涤：当需要使用愈伤组织时，将冷冻管从液氮中取出，将其迅速放入30～50 ℃的水浴中进行解冻处理，解冻完成后迅速去掉玻璃化溶液，并采用三步梯度洗涤法进行洗涤，首先采用每升含：牛血清蛋白
30g+蔗糖1.0 mol +山梨醇0.5 mol的洗涤液洗涤10 分钟，再用每升含：牛血清蛋白30g+ 蔗糖0.5 mol+山梨醇1.0 mol的洗涤液洗涤10 分钟，最后使用每升含：牛血清蛋白30g+蔗糖0.5 mol的洗涤液洗涤10 分钟。
解冻后的愈伤组织细胞的存活率可通过如下方法进行检测：将洗涤后的愈伤组织放入烧杯中，加入适量的2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液，即TTC溶液，于25 ℃恒温暗处染色18 小时后，吸去TTC溶液，加入95 %（浓度）的乙醇于40 ℃恒温水浴锅中进行三苯基甲月替的提取直至材料显示无色，取其提取的上清液用UV-1100型紫外/可见分光光度计在485 nm处测定其吸光值，并计算冻后材料细胞相对存活率，细胞相对存活率%=处理后材料的吸光值／未处理材料的吸光值 X 100% 。所采用的TTC溶液是用TTC物质在pH为7.0的磷酸缓冲溶液中配制而成的，配制浓度为0.4 %。
本发明所采用的玻璃化溶液是由蔗糖、山梨醇、聚乙二醇、1,2-丙二醇四种渗透性物质和非渗透性物质按一定比例混合而成的，兼顾了渗透性和玻璃化形成能力，使之既能较好地达到玻璃化效果，又能最大限度地降低高浓度保护剂本身可能导致的对组织、细胞的毒性损伤。另外本发明打破了原有的等浓度洗涤方式，采用了三步梯度洗涤方式，通过逐步地降低洗涤液的浓度，有效地避免了因细胞内外溶液浓度差过大而造成的胞外的自由水借助梯度差快速进入细胞，造成细胞过度吸水膨胀甚至破裂的情况。此外洗涤液中所采用的高渗透物质—牛血清蛋白，可使细胞内保护剂能更快地被置换出来，提高洗涤效率。因此综上所述，本发明具有能有效减少保护剂在细胞中的残留，减轻毒性物质对细胞的损伤，大大提高保存后细胞的存活率（存活率最高可达90.02 ）等优点。
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明的内容并不仅限于此。
具体实施方式
实施例1
（1）预培养：取苦荞麦的愈伤组织，置于装有培养液的冷冻管中，在常温下预培养1天，所述培养液按每升计含：二甲基亚砜50ml+ 山梨醇0.4 mol；
（2）装载： 取预培养1天后的愈伤组织置于装有装载液的冷冻管中，在4 ℃装载处理20分钟, 所述装载液由浓度为0.5 mol/L的蔗糖溶液与玻璃化溶液按体积比40：60配制而成，所述玻璃化溶液按每升计含：蔗糖1.0 mol + 山梨醇0.2 mol + 聚乙二醇100g+ 1,2-丙二醇溶液100ml；
（3）脱水：取装载后的愈伤组织置于装有玻璃化溶液的冷冻管中，在0 ℃脱水处理60 分钟，所述玻璃化溶液按每升计含：蔗糖1.0 mol+ 山梨醇0.2 mol + 聚乙二醇100g+ 1,2-丙二醇溶液100ml；
（4）冷冻保存：将脱水处理后的上述冷冻管迅速投入-196 ℃的液氮中进行超低温保存；
（5）解冻及洗涤：当需要使用愈伤组织时，将冷冻管从液氮中取出，将其迅速放入40 ℃的恒温水浴锅中进行解冻处理，解冻完成后迅速去掉玻璃化溶液，并采用三步梯度洗涤法进行洗涤，首先采用每升含：牛血清蛋白30g+蔗糖1.0 mol +山梨醇0.5mol的洗涤液洗涤10 分钟，再用每升含：牛血清蛋白30g+ 蔗糖0.5 mol+山梨醇1.0 mol的洗涤液洗涤10 分钟，最后使用每升含：牛血清蛋白30g+蔗糖0.5 mol的洗涤液洗涤10 分钟，共洗涤30分钟；
（6）冻后材料细胞存活率的检测：将洗涤后的愈伤组织放入洁净的小烧杯中，加入适量的用pH为7.0的磷酸缓冲溶液配制的0.4 %TTC溶液于25 ℃恒温暗处染色18小时，然后吸去TTC溶液，加入95 %（浓度）乙醇于40 ℃恒温水浴锅中进行TF的提取直至无色，取其提取的上清液用UV-1100型紫外/可见分光光度计在485 nm处测定其吸光值，计算冻后材料细胞相对存活率90.02 %。
比较实施例1
该实施例的步骤与实施例1相同，只是将实施例1中的步骤（2）和步骤（3）中的玻璃化溶液的组份及含量改为（按每升计）：甘油300ml+1,2-丙二醇100ml+聚乙二醇50g+蔗糖0.5 mol+甘露醇150g。经测定冻后材料细胞的相对存活率为72.59 %，明显低于实施例1,说明玻璃化溶液的浓度和种类对材料的保存有着直接的影响。
比较实施例2
该实施例的步骤与实施例1相同, 只是将实例1中的步骤（2）和步骤（3）中的玻璃化溶液的组份及含量改为（按每升计）：甘油300ml+乙二醇200ml+1,2-丙二醇100ml+蔗糖0.5 mol，将步骤（5）中的洗涤液的组份及含量改为：MS+蔗糖1.2 mol/L。经测定冻后材料细胞的相对存活率仅为20.89 %，说明同时改变玻璃化溶液和洗涤液的浓度、种类对细胞的相对存活率影响较大。

Claims (1)

1.一种有效保存苦荞麦愈伤组织的玻璃化超低温保存方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）预培养：取苦荞麦的愈伤组织，置于装有培养液的冷冻管中，在常温下预培养1天，所述培养液按每升计含：二甲基亚砜5 0ml+ 山梨醇0.4 mol；
（2）装载： 取预培养1天后的愈伤组织置于装有装载液的冷冻管中，在4 ℃装载处理20～60 分钟, 所述装载液由浓度为0.5 mol/L的蔗糖溶液与玻璃化溶液按体积比40：60配制而成，所述玻璃化溶液按每升计含：蔗糖1.0 mol + 山梨醇0.2 mol + 聚乙二醇100g+ 1,2-丙二醇溶液100ml；
（3）脱水：取装载后的愈伤组织置于装有玻璃化溶液的冷冻管中，在0 ℃脱水处理40～80 分钟，所述玻璃化溶液按每升计含：蔗糖1.0mol+ 山梨醇0.2 mol + 聚乙二醇100g+ 1,2-丙二醇溶液100ml；
（4）冷冻保存：将脱水处理后的上述冷冻管迅速投入液氮中进行超低温保存；
（5）解冻及洗涤：当需要使用愈伤组织时，将冷冻管从液氮中取出，将其迅速放入30～50 ℃的水浴中进行解冻处理，解冻完成后迅速去掉玻璃化溶液，并采用三步梯度洗涤法进行洗涤，首先采用每升含：牛血清蛋白
30g+蔗糖1.0 mol +山梨醇0.5 mol的洗涤液洗涤10 分钟，再用每升含：牛血清蛋白30g+ 蔗糖0.5 mol+山梨醇1.0 mol的洗涤液洗涤10 分钟，最后使用每升含：牛血清蛋白30g+蔗糖0.5 mol的洗涤液洗涤10 分钟。
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