CN101720753A

CN101720753A - 组织工程产品的低温保存液及其使用方法

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Publication number: CN101720753A
Application number: CN200910219402A
Authority: CN
Inventors: 金岩; 罗海浪; 张勇杰
Original assignee: XI'AN TISSUE ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER; Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: XI'AN TISSUE ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER; Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2009-12-09
Filing date: 2009-12-09
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2029-12-09
Also published as: CN101720753B

Abstract

一种组织工程产品的低温保存液，本发明是以DMEM培养液为基础溶剂，添加有维生素B，维生素C，硫酸软骨素，β-整合素，色甘酸钠，细胞松弛素B，L-谷氨酰胺，牛血清白蛋白，胎牛血清，海藻糖，Na₂CO₃，聚蔗糖-70，以及在冻存中添加的二甲基亚砜。本发明对细胞的毒性小、保存时间长，在-80℃下可保存6个月，在液氮中可保存12～18个月，且复苏后的细胞活性可以达到60％以上；所保存的组织在复苏使用时简单方便，只需在37℃水浴中复苏3～5分钟，并用无菌生理盐水涮洗即可。本发明的应用范围广，适用于组织工程皮肤、组织工程角膜、组织工程血管、组织工程神经等，也适用于正常组织的低温保存。

Description

组织工程产品的低温保存液及其使用方法

技术领域

本发明属于生物医学材料组织工程技术领域，具体涉及一种组织工程产品的低温保存方法。

背景技术

组织工程产品是由细胞和三维支架构建的人造组织或器官，如体外构建的组织工程皮肤就是应用组织工程学方法，将种子细胞与支架材料结合构建的功能性皮肤替代物，再将其种植于创面，在支架材料逐渐降解吸收的过程中，使细胞正常生长、分化并形成具有一定功能的组织，达到替代、修复、再生受损组织或器官的目的。组织工程的最终目标是实现规模产业化，因此组织工程产品的长期保存是不可或缺的重要环节。

由于组织工程产品含有活细胞，因此在保存时选用低温冻存法较为适宜。低温冻存是一种完全抑制细胞能量代谢，使之处于休眠状态从而长期保存的方法。按降温速率分类，低温冻存通常分为慢速降温和快速降温二类。

快速降温法是以易形成玻璃化态的低温保存液为介质，利用快速降温的方法(通常为直接浸入液氮)保存细胞或组织。玻璃化冻存保存液主要由易于形成玻璃化态的渗透性试剂(通常采用乙二醇、二甲基亚砜、甘油、甲酰胺等)和使细胞脱水的非渗透性试剂(通常采用低分子量的果糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、密三糖，和高分子量的聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、羟乙基淀粉等)组成。通常玻璃化低温保存液的试剂浓度非常高，总浓度通常达到50％以上。

采用二甲基亚砜、去离子甲酰胺和丙二醇配制的玻璃化低温保存液在冻存大鼠的软骨时，可以达到80％的冻存效率(Song YC，Lightfoot FG，Chen Z，Taylor MJ，Brockbank KGM.Vitreous preservation of rabbit articularcartilage.Cell Preserv Technol 2004；2：67-74.)。由于组织工程法构建的组织不同于天然组织，所采用的种子细胞是在体外培养后再与支架复合，因此细胞的状态、活性通常不如天然组织中的细胞，这就导致该类细胞对冷冻过程中的损伤(由胞内外冰晶造成)更加敏感，而且高浓度的渗透性试剂本身对细胞活性就有较大影响。如利用上述冻存大鼠软骨的方法对组织工程血管(牛胶原复合大鼠动脉平滑肌细胞)进行低温冻存，复苏后的细胞活性只有39％(Elder E，Chen Z，Ensley A，Nerem R，Brockbank K，Song Y.Enhancedtissue strength in cryopreserved，collagen-based blood vesselconstructs.Transplant Proc 2005；37(10)：4625-46299.)。另外，有研究表明，在室温条件下，把组织工程真皮浸泡在含30％二甲基亚砜的玻璃化低温保存液中10分钟，细胞活性便降低了10％(Xin Wang，Tse-Chao Hua，Da-WenSun，Baolin Liu，Guanghui Yang，Yilin Cao.Cryopreservation oftissue-engineered dermal replacement in Me2SO：Toxicity study andeffects of concentration and cooling rates on cell viability.Cryobiology 2007；55：60-65)。再则，快速降温的玻璃化低温保存液试剂的高浓度，导致细胞脱水量非常大，在组织复苏时，需按梯度法逐渐稀释，否者极易导致细胞死亡，给临床应用带来极大的不便；且因高浓度试剂极易在组织中残留，对应用于人体的组织工程产品则具有潜在危险。

慢速降温法是利用低温保存液和程序性降温设备，以一定的速率把需要冻存的组织和器官降至所需低温(通常为-80℃左右)，再于恒定温度的冰柜或液氮中长期保存。通常慢速降温法所用的保存液为培养液与渗透性保存液的简单组合，这虽然对一些悬浮的、状态较好的细胞保存效果较好，但对于状态较差或是贴附于组织支架上的细胞则有较强的破坏作用；在冷冻过程中，组织的损伤主要来自细胞内高渗透压导致的溶质性损伤，以及由胞内冰晶造成的机械性损伤；传统的低温保存液很难避免这二点对细胞的损害。由此开始对传统的低温保存液进行改良，在培养体系中加入各种辅助试剂，以帮助减弱水的固化、转运胞内溶质、降低细胞外电解质浓度、平衡胞内外渗透压。其中具有代表性的是Orcel的低温保存液(美国专利6638709)，其是向保存液体系中加入了非渗透性试剂硫酸软骨素、葡萄糖以平衡溶液的渗透压，降低胞外电解质；采用其保存的天然组织的细胞存活率可达到50％左右，保存期为一年。但这样的冻存效率还是较低，而且应用于结构相对不稳定的组织工程产品其效果将进一步下降。

由于组织工程产品是在体外构建的人工组织，以现有的技术水平还不能达到天然组织的稳定性，因此在选择和实施冻存方案时不但要降低细胞的损伤，还要进一步保护组织结构的稳定性(降温过程中组织的结构会受到一定程度破坏)，这样才能达到更好的冻存效果。

发明内容

针对现有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种组织工程产品的低温保存液及其使用方法，使组织工程产品在低温下可以长久、高效的保存。

本发明所提出的低温保存液是以DMEM培养液为基础溶剂，按重量体积比添加的组分包括：维生素B 5～25μg/ml，维生素C 5～25μg/ml，硫酸软骨素2～6％，β-整合素0.1～0.5％，色甘酸钠2～5μg/ml，细胞松弛素B 2～5μg/ml，L-谷氨酰胺2～8mM，牛血清白蛋白1～3％，胎牛血清5～10％，海藻糖3～10％，Na₂CO₃ 0.2～0.3％，聚蔗糖-70 2～5％，二甲基亚砜5％～15％；其中二甲基亚砜是在冻存过程中添加。

由以上可以看出，本发明的低温保存液除了基本的渗透性(二甲基亚砜)和非渗透性(如海藻糖，聚蔗糖)的试剂保护外，充分考虑了组织产品在冷冻过程中的各种损伤机制，在保存液中加有适宜的保护试剂，如在降温过程中，细胞膜的流动性下降，导致细胞通透性的降低，从而影响胞外保护剂与水分的交换，因此本发明首次在保存液中加有细胞松弛素B，使细胞膜的渗透能力提高；本发明采用色甘酸来稳定细胞膜，减少低温下细胞的皱缩。冷冻过程中胞内自由基的增加可破坏胞质成分，本发明利用具有抗氧化作用的维生素B和维生素C来缓解该不利影响。胎牛血清和牛血清白蛋白可以缓冲溶液中pH值的变化、调节渗透压、阻抑冰晶的形成，从而保持细胞的活性。在考虑到冷冻过程中保护组织支架的结构稳定，本发明采用β-整合素联合硫酸软骨素加强组织结构的稳定以及对细胞的粘附能力。

本发明低温保存液用于组织工程产品的低温冻存方法，具体步骤包括：先将组织工程产品浸于低温保存液中，以50～100转/分钟振荡30～60分钟；向盛有产品的保存液中加入二甲基亚砜使其浓度达到1％～5％，混匀后静置10～20分钟；降温至2～8℃后，再次向其中加入二甲基亚砜使其浓度达到3％～10％，混匀后静置10～20分钟；再降温至0～-10℃后，加入二甲基亚砜使其浓度达到5％～15％，混匀后静置30～90分钟；将盛有产品的保存液在20～60分钟内降温至-20℃，再于10～20分钟内降温至-60℃，最后用10～20分钟降温至-80℃；此时保存液中的组织工程产品可在-80℃中长期保存，也可直接投入液氮中长期保存。

本发明为了降低二甲基亚砜对细胞的毒性，在冻存过程中采用了分批次、逐渐加入的方式，并随着浓度的升高逐渐降低温度，起到弱化二甲基亚砜毒性的作用；本发明中程序性降温则是在-20℃以上用较缓的降温速度(0.5℃/分钟)，为避免在-30～-60℃高危区间对细胞的损伤，这一区间采用较快的降温速度(2.5℃/分钟)突破该温度区间。

按本发明保存的组织工程产品对细胞的毒性小、保存时间长，在-80℃下可保存6个月，在液氮中可保存12～18个月，且复苏后的细胞活性可以达到60％以上；针对组织工程产品三维支架结构不稳定的特点，本发明保存的组织工程产品在冷冻复苏过程中支架材料的融解温度和玻璃化温度不会产生显著的变化，支架形态也不会产生明显变化；本发明保存的组织在复苏使用时简单方便，只需在37℃水浴中复苏3～5分钟，并用无菌的生理盐水涮洗3～5遍即可。本发明的应用范围广，适用于组织工程皮肤、组织工程角膜、组织工程血管、组织工程神经等，也适用于正常组织的低温保存。

附图及其说明

附图1为采用本发明在液氮中保存的组织工程皮肤在1、3、6、12、18个月后细胞活性与新制备皮肤细胞活性的比值图，图中柱状高度显示的是与新鲜皮肤的比值，T形线表示的是实验的标准差；附图2为新鲜组织工程皮肤的H&E染色结果(100倍放大)照片；附图3为新鲜组织工程皮肤的H&E染色结果(200倍放大)照片；附图4为采用本发明保存6个月后复苏的组织工程皮肤的H&E染色结果(100倍放大)照片；附图5为采用本发明保存6个月后复苏的组织工程皮肤的H&E染色结果(200倍放大)照片。由图中比较可以看出，低温保存6个月后的组织工程皮肤在支架结构、细胞形态上都与新制备的皮肤无显著差异。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的技术内容、使用、效果及检测方法作详细说明。

实例1.组织工程皮肤的冻存

1.低温保存液的配制和预处理：低温保存液以DMEM培养液为溶剂，其内添加有：维生素B 6μg/ml，维生素C 6μg/ml，硫酸软骨素3％w/v，β-整合素0.4％w/v，色甘酸钠4μg/ml，细胞松弛素B 3μg/ml，L-谷氨酰胺4mM，牛血清白蛋白2％w/v，胎牛血清10％w/v，Na₂CO₃ 0.3％w/v，海藻糖3％w/v，聚蔗糖-70 2％w/v；

把组织工程皮肤置入耐冻容器(如聚乙烯或聚丙烯塑料容器)中，加入保存液浸没皮肤，常温下以100转/分钟振荡50分钟；向保存液中加入二甲基亚砜，使其浓度达到5％，混匀后静置10分钟；把盛有皮肤的保存液降温到4℃，再次向保存液中加入二甲基亚砜，使其浓度达到10％，混匀后静置10分钟；再降温到-10℃后，向保存液中加入二甲基亚砜，使其浓度最终达到15％，并放置60分钟，使溶液平衡；

2.降温与复温：利用程序性降温设备把含有皮肤的保护液以0.5℃/分钟的速度降到-20℃，然后以2.5℃/分钟的速度降到-60℃，再以1℃/分钟的速度降到-80℃，最后放入-80℃的冰柜中长期保存，如要更长期保存可投入液氮。保存结束后，把盛有保护液和皮肤的容器直接放入37℃水浴中化冻复温，然后用无菌生理盐水清洗浸泡皮肤4次，每次5分钟。

实例2.组织工程血管的冻存

1.低温保存液的配制和预处理：低温保存液以DMEM培养液为溶剂，其内添加有：维生素B 15μg/ml，维生素C 15μg/ml，硫酸软骨素5％w/v，β-整合素0.4％w/v，色甘酸钠2μg/ml，细胞松弛素B 1.5μg/ml，L-谷氨酰胺4mM，牛血清白蛋白3％w/v，胎牛血清10％w/v，Na₂CO₃ 0.2％w/v，海藻糖3％w/v，聚蔗糖-70 2％w/v。

把血管置入耐冻容器中，加入保护液浸没血管，室温条件下以80转/分钟振荡30分钟；向保护液中加入二甲基亚砜，使其浓度达到3％，混匀后静置10分钟；降温到4℃，再向保护液中加入二甲基亚砜，使其浓度达到6％，混匀后静置10分钟；把保护液降温到0℃后，加入二甲基亚砜，使其浓度最终达到10％，平衡50分钟；

2.降温与复温：利用程序性降温设备把含有血管的保护液以0.5℃/分钟的速度降到-20℃，然后以2.5℃/分钟的速度降到-60℃，再以1℃/分钟的速度降到-80℃，最后置入-80℃的冰柜中长期保存，如要更长期保存可投入液氮。保存结束后，把盛有保护液和血管的容器置入37℃水浴中化冻复温，然后利用无菌生理盐水清洗浸泡血管3次，每次4分钟。

实例3.组织工程角膜的冻存

1.低温保存液的配制和预处理：低温保存液以DMEM培养液为溶剂，其内添加有：维生素B 10μg/ml，维生素C 10μg/ml，硫酸软骨素5％w/v，β-整合素0.4％w/v，色甘酸钠3μg/ml，细胞松弛素B 5μg/ml，L-谷氨酰胺4mM，牛血清白蛋白3％w/v，胎牛血清10％w/v，Na₂CO₃ 0.2％w/v，海藻糖6％w/v，聚蔗糖-70 3％w/v；

把组织工程角膜置入耐冻容器中，加入保护液浸没角膜，室温条件下以60转/分钟振荡40分钟；然后向保护液中加入二甲基亚砜，使其浓度达到2％，混匀后静置20分钟；降温到4℃，再次加入二甲基亚砜，使其浓度达到4％，混匀后静置10分钟；再降温到0℃后，加入二甲基亚砜，使其浓度最终达到6％，平衡80分钟。

2.降温与复温：利用程序性降温设备把含有角膜的保护液以0.5℃/分钟的速度降到-20℃，然后以2.5℃/分钟的速度降到-60℃，再以1℃/分钟的速度降到-80℃，最后置入-80℃的冰柜中长期保存，如要更长期保存可投入液氮。保存结束后，把盛有保护液和角膜的容器置入37℃水浴中化冻复温，然后利用无菌生理盐水清洗浸泡角膜3次，每次3分钟。

Claims

1.一种组织工程产品的低温保存液，其特征在于，所述的低温保存液以DMEM培养液为基础溶剂，按重量体积比添加的组分包括：维生素B 5～25μg/ml，维生素C 5～25μg/ml，硫酸软骨素2～6％，β-整合素0.1～0.5％，色甘酸钠2～5μg/ml，细胞松弛素B 2～5μg/ml，L-谷氨酰胺2～8mM，牛血清白蛋白1～3％，胎牛血清5～10％，海藻糖3～10％，Na₂CO₃ 0.2～0.3％，聚蔗糖-70 2～5％，二甲基亚砜5％～15％；其中二甲基亚砜是在冻存过程中添加。

2.按照权利要求1所述的低温保存液的冻存方法，其特征在于，具体步骤包括：先将组织工程产品浸于低温保存液中，以50～100转/分钟振荡30～60分钟；向盛有产品的保存液中加入二甲基亚砜使其浓度达到1％～5％，混匀后静置10～20分钟；降温至2～8℃后，再次向其中加入二甲基亚砜使其浓度达到3％～10％，混匀后静置10～20分钟；再降温至0～-10℃后，加入二甲基亚砜使其浓度达到5％～15％，混匀后静置30～90分钟；将盛有产品的保存液在20～60分钟内降温至-20℃，再于10～20分钟内降温至-60℃，最后用10～20分钟降温至-80℃中，长期保存，或是投入液氮中长期保存。