CN105219700B

CN105219700B - 一种凝胶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105219700B
Application number: CN201510697887.9A
Authority: CN
Inventors: 刘维; 凡孝菊; 张春燕; 张爱兵
Original assignee: Shaanxi Aierfu ActivTissue Engineering Co Ltd
Current assignee: Shaanxi Aierfu ActivTissue Engineering Co Ltd
Priority date: 2015-10-23
Filing date: 2015-10-23
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2035-10-23
Also published as: CN105219700A

Abstract

本发明涉及组织工程皮肤保存领域，尤其涉及一种凝胶及其制备方法和应用。在采用该凝胶对组织工程皮肤进行保存时，能够保持组织工程皮肤的细胞活力，延长组织工程皮肤的保存时间。本发明实施例提供一种凝胶，包括：液体培养基以及凝固剂；其中，所述液体培养基包括质量浓度为18.4‑20.6g/L的基础培养基、质量浓度为0.2‑1.0mg/L的谷胱甘肽、质量浓度为0.4‑1.0g/L的色氨酸和质量浓度为0.1‑0.3g/L的α‑酮戊二酸；所述凝固剂为质量浓度为1.0‑1.5％的琼脂溶液。

Description

一种凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及组织工程皮肤保存领域，尤其涉及一种凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，随着组织工程皮肤的研究和开发，组织工程皮肤的保存方法层出不穷，目前组织工程皮肤的保存主要包括冷藏保存与冷冻保存两种，由于冷冻保存过程中容易产生冰晶，对组织工程皮肤的细胞和组织容易造成损伤，因此，组织工程皮肤最优选的保存方法为冷藏保存。目前用于保存组织工程皮肤的培养基也具有多种形式，例如，用于保存组织工程皮肤的培养基可以为液态培养基，也可以为固态培养基，其中，在采用液态培养基对所述组织工程皮肤进行冷藏保存时，所述组织工程皮肤受到所述液态培养基的冲刷容易使细胞、组织发生损伤，当所述组织工程皮肤具有表皮层与真皮层时，容易使所述组织工程皮肤的表皮层和真皮层发生脱落分离，从而影响组织工程皮肤的细胞活力。因此，固态培养基更合适于组织工程皮肤的冷藏保存。

在现有技术中，已有的固态培养基在用于组织工程皮肤保存时，尚没有任何突破性进展，组织工程皮肤的保存时间仍然为组织工程皮肤应用的主要限制因素。

发明内容

本发明的主要目的在于，提供一种凝胶及其制备方法和应用。在采用该凝胶对组织工程皮肤进行保存时，能够保持组织工程皮肤的细胞活力，延长组织工程皮肤的保存时间。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供一种凝胶，包括：液体培养基以及凝固剂；其中，所述液体培养基包括质量浓度为5-10g/L的基础培养基、质量浓度为0.2-1.0mg/L的谷胱甘肽、质量浓度为0.4-1.0g/L的色氨酸和质量浓度为0.1-0.3g/L的α-酮戊二酸；

所述凝固剂为质量浓度为1.0-1.5％的琼脂溶液。

可选的，所述液体培养基还包括：质量浓度为0.5-1.0g/L的L-谷氨酰胺、体积浓度为5％-15％的胎牛血清和摩尔浓度为30-50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

优选的，所述液体培养基还包括：质量浓度为5.0-7.0g/L碳酸氢钠、质量浓度为0.6-6.0ng/L的碱性成纤维生长因子bFGF和质量浓度为4-16μg/L的胰岛素。

可选的，所述液体培养基还包括：质量浓度为10-30mg/L的维生素C、质量浓度为0.1-0.3mg/L的氢化的可松、质量浓度为6-20mg/L的转铁蛋白、质量浓度为20-40mg/L的腺嘌呤和质量浓度为0.1-1.0ng/L的表皮生长因子EGF。

优选的，所述基础培养基包括质量浓度为14.4-15.0g/L的DMEM和质量浓度为4.0-5.6g/L的F12。

另一方面，本发明实施例提供一种如上述所述的凝胶的制备方法，包括：

步骤1)分别配制液体培养基以及凝固剂；其中，所述凝固剂为质量浓度为1.0-1.5％的琼脂溶液；

步骤2)将所述液体培养基与所述凝固剂混合、静置，使所述液体培养基与所述凝固剂的混合液凝固，获得凝胶。

优选的，在将所述液体培养基与所述凝固剂混合时，所述液体培养基的温度为4-8℃，所述凝固剂的温度为60-68℃。

再一方面，本发明实施例提供一种上述所述的凝胶在保存组织工程皮肤中的应用。

优选的，所述组织工程皮肤包括真皮层与表皮层，所述应用包括：

S1)将组织工程皮肤的表皮层朝上置于培养皿中；

S2)将所述液体培养基以及凝固剂的混合液注入所述培养皿中，静置，使所述液体培养基与所述凝固剂的混合液凝固成凝胶，所述组织工程皮肤的真皮层包裹在所述凝胶中，表皮层裸露在外。

优选的，在S2)之前还包括将所述液体培养基与所述凝固剂混合，其中，所述液体培养基的温度为4-8℃，所述凝固剂的温度为60-68℃。

可选的，S1)具体为：将组织工程皮肤放置于底部具有通孔的容器中，并将所述容器放置于所述培养皿中，其中，所述容器的边缘与所述培养皿的侧壁之间具有空隙。

本发明实施例提供一种凝胶及其制备方法和应用。在通过所述凝胶对组织工程皮肤进行保存时，能够防止液体培养基冲刷所述组织工程皮肤，使组织工程皮肤的细胞与组织造成损伤，从而能够保持所述组织工程皮肤的细胞活力，且所述凝胶的各个组分能够为组织工程皮肤提供营养，并保护组织工程皮肤免受低温缺氧损伤，进一步保持所述组织工程皮肤的细胞活力，使得组织工程皮肤的保存时间大大延长。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例提供的一种凝胶的制备方法流程图；

图2为本发明实施例提供的一种凝胶的应用的方法流程图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例所涉及的材料均可以通过商业途径或通过申请人获取。

一方面，本发明实施例提供一种凝胶，包括：液体培养基以及凝固剂；其中，所述液体培养基包括质量浓度为18.4-20.6g/L的基础培养基、质量浓度为0.2-1.0mg/L的谷胱甘肽、质量浓度为0.4-1.0g/L的色氨酸和质量浓度为0.1-0.3g/L的α-酮戊二酸；

所述凝固剂为质量浓度为1.0-1.5％的琼脂溶液。

其中，凝胶是指具有弹性的处于半固体状态且失去流动性的稠厚物质，该凝胶中的凝固剂为琼脂溶液，琼脂溶液在用于制备固体培养基时，能够提高固体培养基的凝固型与稳定性，该凝胶中的谷胱甘肽具有保护组织工程皮肤免受低温损伤的作用，所述色氨酸能够为组织工程皮肤提供营养物质且避免组织工程皮肤低温缺氧而造成损伤，所述α-酮戊二酸能够保护组织工程皮肤免受低温损伤。

本发明实施例提供一种凝胶。在通过所述凝胶对组织工程皮肤进行保存时，能够防止液体培养基冲刷所述组织工程皮肤，使组织工程皮肤的细胞与组织造成损伤，从而能够保持所述组织工程皮肤的细胞活力，且所述凝胶的各个组分能够为组织工程皮肤提供营养，并保护组织工程皮肤免受低温缺氧损伤，能够进一步保持所述组织工程皮肤的细胞活力，使得组织工程皮肤的保存时间大大延长。

其中，对所述基础培养基的具体组分不做限定，所述基础培养基可以为DMEM，也可以为F12。

本发明的一实施例中，所述基础培养基包括质量浓度为14.4-15.0g/L的DMEM和质量浓度为4.0-5.6g/L的F12。其中，所述DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，F12含有较丰富的成分，这两种培养基能够为成纤维细胞和表皮细胞生长提供多种营养成分。

其中，对所述基础培养基的获取方式不做限定，所述基础培养基可以通过商业途径获取，也可以通过自制获得。

其中，对所获取的基础培养基形态不做限定，所述DMEM与F12可以为粉末，也可以为溶液，当所述DMEM与F12为液态时，可以根据所述DMEM与F12的浓度计算所述DMEM与F12的添加量，当所述DMEM与F12为粉末时，可以根据所述DMEM与F12的浓度进行配制。

优选的，所述液体培养基还包括：质量浓度为0.5-1.0g/L的L-谷氨酰胺、体积浓度为5％-15％的胎牛血清和摩尔浓度为30-50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸。其中，所述L-谷氨酰胺的降解产物为组织工程皮肤提供营养物质，4-羟乙基哌嗪乙磺酸为一种生物缓冲剂，具有比较强的缓冲能力，能够使所述基础培养液的pH值长时间保持在恒定的范围内。

进一步优选的，所述液体培养基还包括：质量浓度为5.0-7.0g/L碳酸氢钠、质量浓度为0.6-6.0ng/L的碱性成纤维生长因子bFGF和质量浓度为4-16μg/L的胰岛素。其中，所述碳酸氢钠具有缓冲作用，能够维持组织工程皮肤在保存过程中的pH值恒定，所述碱性成纤维生长因子具有促进组织工程皮肤中的真皮层细胞生长的作用，所述胰岛素能够加快组织工程皮肤的葡萄糖利用率。

更进一步地，所述液体培养基还包括：质量浓度为10-30mg/L的维生素C、质量浓度为0.1-0.3mg/L的氢化的可松、质量浓度为6-20mg/L的转铁蛋白、质量浓度为20-40mg/L的腺嘌呤和质量浓度为0.1-1.0ng/L的表皮生长因子EGF。其中，所述维生素C具有抗氧化作用与消除自由基的作用，在用于组织工程皮肤的保存时能够保护组织工程皮肤免受低温损伤的作用，消除组织工程皮肤在保存过程中产生的自由基的作用；所述氢化的可松具有保持组织工程皮肤的渗透压在正常范围内，从而避免组织工程皮肤由于细胞内的高渗透压而导致溶质性损伤，所述转铁蛋白具有修复细胞的作用，降低细胞的坏死比例；所述腺嘌呤为一种DNA合成物，具有为组织工程皮肤提供能量的作用，所述表皮生长因子具有促进表皮细胞生长的作用。

另一方面，参见图1，为本发明实施例提供的一种如上述所述的凝胶的制备方法的流程图，包括：

其中，凝胶是指具有弹性的处于半固体状态且失去流动性的稠厚物质。

本发明实施例提供一种如上述所述的凝胶的制备方法。该方法通过琼脂作为凝固剂与所述液体培养基混合，所获得的混合液通过静置凝固而获得凝胶，所获得的凝胶中具有丰富的营养物质，能够为组织工程皮肤提供营养，并保护组织工程皮肤免受低温缺氧损伤，能够进一步保持所述组织工程皮肤的细胞活力，使得组织工程皮肤的保存时间大大延长。

本发明的一实施例中，在将所述液体培养基与所述凝固剂混合时，所述液体培养基的温度为4-8℃，所述凝固剂的温度为60-68℃。由于液体培养液中具有多种活性成分，因此，在将所述液体培养液与琼脂溶液混合时，若琼脂溶液的温度过高会使得液体培养液中的活性成分发生失活，若琼脂溶液的温度过低，在将所述琼脂溶液与液体培养液混合时，会由于温度低于30℃而发生凝固，不利于均匀混合，在本发明实施例中，将所述基础培养液与所述琼脂溶液进行混合时，能够保持基础培养液中活性成分的活性，并使得所述基础培养液与所述琼脂溶液混合均匀。

再一方面，本发明实施例提供的一种上述所述的凝胶在保存组织工程皮肤中的应用。

本发明实施例提供的一种上述所述的凝胶在保存组织工程皮肤中的应用。将所述凝胶用于保存组织工程皮肤，与液体培养基相比能够防止液体培养基对所述组织工程皮肤造成冲刷，使得组织工程皮肤的细胞、组织容易发生损坏，从而能够提高所述组织工程皮肤中的细胞活力，且由于所述凝胶中含有丰富的营养物质，能够为所述组织工程皮肤的保存提供营养，并保护组织工程皮肤免受低温缺氧损伤，能够进一步保持组织工程皮肤的细胞活力，使得组织工程皮肤的保存时间大大延长。

其中，对所述凝胶在保存组织工程皮肤中的应用的具体方法不做限定。可以将制备好的组织工程皮肤嵌在所述凝胶中进行保存。

本发明的一实施例中，所述组织工程皮肤包括真皮层与表皮层，参见图2，所述应用包括：

S1)将组织工程皮肤的表皮层朝上置于培养皿中；

在本发明实施例中，通过将具有表皮层和真皮层的组织工程皮肤的表皮层朝上放置在培养皿中，并将琼脂溶液与基础培养液的混合液注入所述培养皿中，静置，使所述液体培养基与所述凝固剂的混合液凝固成凝胶，将组织工程皮肤的表皮层裸露在外，真皮层包裹在所述凝胶中，在对该组织工程皮肤进行保存时，由于所述组织工程皮肤被半包埋在凝胶中，所述组织工程皮肤的表皮层能够与空气直接接触，从而能够避免表皮层坏死，促进表皮层生长，而真皮层保存在所述凝胶中，能够吸取凝胶中的营养物质，因此，采用该方法对所述组织工程皮肤进行保存时，能够保持组织工程皮肤中表皮层与真皮层的细胞活力，从而能够进一步延长组织工程皮肤的保存时间。

本发明的一实施例中，在S2)之前还包括将所述液体培养基与所述凝固剂混合，其中，所述液体培养基的温度为4-8℃，所述凝固剂的温度为60-68℃。由于液体培养液中具有多种活性成分，因此，在将所述液体培养液与琼脂溶液混合时，若琼脂溶液的温度过高会使得液体培养液中的活性成分发生失活，若琼脂溶液的温度过低，在将所述琼脂溶液与液体培养液混合时，会由于温度低于30℃而很快发生凝固，不利于后续操作，在本发明实施例中，将所述液体培养液与所述琼脂溶液进行混合时，能够保持液体培养液中活性成分的活性，并保持混合之后的混合液处于流动状态，便于后续操作。

其中，对所述琼脂溶液的获取不做限定，琼脂为在水中需加热至95℃才开始融化，融化后的溶液温度需降至30℃才开始凝固的一种物质，利用琼脂的这一特性，可以将琼脂在水中加热至95℃来获取琼脂溶液。

其中，对所述琼脂溶液的浓度不做限定，优选的，所述琼脂溶液的浓度为1.0-1.5％。

为了提高组织工程皮肤的保存时间，在对组织工程皮肤进行保存时需要严格无菌，在将所述琼脂溶液用于配制凝胶时，可以对琼脂溶液进行灭菌处理。其中，对所述琼脂溶液的灭菌条件不做限定，优选的，将所述琼脂溶液在5.0-10.0MPa的条件下灭菌。

其中，对所述组织工程皮肤的半包埋在凝胶中的具体方法不做限定，只要在形成凝胶之后，能够将所述组织工程皮肤的真皮层包裹在内，而表皮层裸露在外即可。

本发明的一优选实施例中，S1)具体为：将组织工程皮肤放置于底部具有通孔的容器中，并将所述容器放置于所述培养皿中，其中，所述容器的边缘与所述培养皿的侧壁之间具有空隙。此过程简单方便，同时，在将所述组织工程皮肤放置于所述培养皿中时，能够避免采用镊子夹取而对组织工程皮肤造成损伤，以及采用其他方式(例如：手工夹取组织工程皮肤对其进行放置)而对组织工程皮肤造成污染，进一步地，所述容器的底部具有通孔，在向所述培养皿中注入混合液后凝固形成凝胶后，所述组织工程皮肤的真皮层通过所述通孔与所述凝胶接触，从而能够促进对真皮层的营养供应，延长组织工程皮肤的保存时间。

在将混合液注入所述培养皿中时，为了避免在操作过程中将混合液注入到所述组织工程皮肤的表皮层上而形成凝胶，影响所述表皮层与空气的接触，优选的，S2)具体为：将预设体积的混合液沿所述培养皿的边沿注入所述空隙中。

其中，对所述预设体积不做限定，可以根据所采用的培养皿的体积与放置组织工程皮肤的容器体积来进行灵活确定。

具体的，所述混合液的预设体积根据所述空隙的大小确定。

其中，所述混合液的预设体积可以在向所述空隙中注入时通过目测所述空隙的大小来进行确定，也可以事先通过计算空隙的大小来确定，在此不做限定。

其中，对所述底部具有通孔的容器不做限定，优选的，底部具有通孔的容器为皮托。在制备组织工程皮肤时，采用皮托作为模具能够使组织工程皮肤更接近于天然皮肤，而且，在将组织工程皮肤制备好之后，不需要转移制备好的组织工程皮肤，直接将皮托连同组织工程皮肤一同放入所述培养皿中，能够避免对组织工程皮肤造成污染甚至破坏。

本发明的一实施例中，在所述S2)之后还包括：将所述组织工程皮肤于2-8℃的环境下保存。由于琼脂溶液与所述基础培养液混合后，在温度低于30℃时琼脂溶液就开始凝固，因此，将琼脂溶液与所述基础培养液凝固获得凝胶之后，使得组织工程皮肤半包埋在所述凝胶中，在2-8℃进行冷藏保存时，能够最大程度上延长所述组织工程皮肤的保存时间。

具体实施方式

以下，将参照本发明的实施例、对照例以及试验例详述本发明。这些实施例仅是为了具体说明本发明而提出的示例，本领域技术人员可以知道的是本发明的范围不受这些实施例、对照例以及试验例的限制。

对照例：

为了方便起见，将对照例所采用的固体培养基记为G配方。

G配方的配制：

具体为：

向DMEM粉末加入无菌超纯水，溶解定容，充分溶解后，获得500ml的基础培养液，用0.22微米的滤膜进行过滤，再向基础培养液中添加10％胎牛血清和10mg/L Vc，获得液体培养基，放置于4℃冰箱中保温。

配制质量浓度为1.0％的琼脂溶液，在65℃水浴锅中保温。

将所述液体培养基与所述琼脂溶液混合、静置、凝固、封装，获得G配方。

实施例1

为了方便起见，将实施例1所采用的凝胶记为A配方。

A配方的配制：

具体为：

向DMEM粉末加入无菌超纯水，并添加因子组合，溶解定容，用0.22微米的滤膜进行过滤，获得液体培养基，放置于4℃冰箱中保温。

配制质量浓度为1.0％的琼脂溶液，在65℃水浴锅中保温。

将所述液体培养基与所述琼脂溶液混合、静置、凝固、封装，获得A配方。其中，A配方参见表1所示。

表1

实施例2

为了方便起见，将实施例2所采用的凝胶记为B配方。

B配方的配制：

具体为：

向DMEM粉末加入无菌超纯水，并添加因子组合，溶解定容，用0.22微米的滤膜进行过滤，获得液体培养基，放置于6℃冰箱中保温。

配制质量浓度为1.5％的琼脂溶液，在60℃水浴锅中保温。

将所述液体培养基与所述琼脂溶液混合、静置、凝固、封装，获得B配方。其中，B配方参见表2所示。

表2

名称	含量
		DMEM	15.0g/L
F12	5.6g/L
		胎牛血清	15％
4-羟乙基哌嗪乙磺酸	50mM
		维生素C	30mg/L
谷胱甘肽	0.5mg/L
		色氨酸	1.0g/L
α-酮戊二酸	0.3g/L

实施例3

为了方便起见，将实施例1所采用的凝胶记为C配方。

C配方的配制：

具体为：

向DMEM粉末加入无菌超纯水，并添加因子组合，溶解定容，用0.22微米的滤膜进行过滤，获得液体培养基，放置于8℃冰箱中保温。

配制质量浓度为1.2％的琼脂溶液，在68℃水浴锅中保温。

将所述液体培养基与所述琼脂溶液混合、静置、凝固、封装，获得C配方。其中，C配方参见表3所示。

表3

实施例4

为了方便起见，将实施例4所获得的凝胶记为D配方。

D配方的配制：

具体为：

配制质量浓度为1.0％的琼脂溶液，在60℃水浴锅中保温。

将所述液体培养基与所述琼脂溶液混合、静置、凝固、封装，获得D配方。其中，D配方参见表4所示。

表4

名称	含量
		DMEM	14.4g/L
F12	4.0g/L
		胎牛血清	5％
4-羟乙基哌嗪乙磺酸	30mM
		维生素C	25mg/L
谷胱甘肽	0.4mg/L
		氢化的可松	0.2mg/L
转铁蛋白	10mg/L
		腺嘌呤	30mg/L
表皮生长因子EGF	0.5ng/L
		L-谷氨酰胺	1.0g/L
色氨酸	1.0g/L
		α-酮戊二酸	0.3g/L

实施例5

为了方便起见，将实施例2所采用的凝胶记为E配方。

E配方的配制：

具体为：向DMEM粉末加入无菌超纯水，并添加因子组合，用0.22微米的滤膜进行过滤，获得液体培养基，放置于6℃冰箱中保温。

配制质量浓度为1.2％的琼脂溶液，在65℃水浴锅中保温。

将所述液体培养基与所述琼脂溶液混合、静置、凝固、封装，获得E配方。其中，E配方参见表5所示。

表5

实施例6

为了方便起见，将将实施例6所采用的凝胶记为F配方。

F配方的配制：

具体为：

配制质量浓度为1.5％的琼脂溶液，在68℃水浴锅中保温。

将所述液体培养基与所述琼脂溶液混合、静置、凝固、封装，获得F配方。其中，F配方参见表6所示。

表6

实验例：

1、通过A-G配方对组织工程皮肤进行保存获得组织工程皮肤A-G：

将7份同一批制备的具有表皮层与真皮层的组织工程皮肤连同皮托一起放入7cm高的培养皿中，分别将所述培养皿标记为A-G；

将实施例1-6以及对照例分别配制好的A-G的液体培养基与琼脂溶液混匀，抽取混合液分别沿上述所述的每一个培养皿的边缘注入A-G培养皿中，静置、凝固，使得所述组织工程皮肤的表皮层裸露在外，真皮层包裹在凝胶中，获得组织工程皮肤A-G。

2、测试分析方法：

将组织工程皮肤A和D冷藏保存15天，组织工程皮肤B和E冷藏保存20天，组织工程皮肤C和F冷藏保存25天，对照例中组织工程皮肤G冷藏保存72小时后分别进行MTT法检测所述组织工程皮肤中的细胞活力。

检测原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490或560nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

具体为：将制备好的组织工程皮肤A-G在冷藏保存前通过MTT方法测量其在波长为490nm的光吸收值均稳定在1.0676，将所述组织工程皮肤A-G进行复苏，切取部分组织工程皮肤A-G作为实验样品，加入一定量的MTT溶液，将蓝紫色的皮肤切片用DMSO溶解，通过酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，分别获得A-F的光吸收值分别为0.9381、0.7253、0.6294、1.0520、0.8634、0.4753，获得组织工程皮肤A-F的细胞活力分别为87.8％，67.9％，58.9％，98.5％，80.8％，44.5％，而测得组织工程皮肤G中几乎没有活细胞存在。

3、实验结果：

所述组织工程皮肤A和D冷藏保存15天后的细胞活力分别为87.8％和98.5％，组织工程皮肤B和E冷藏保存20天后的细胞活力分别为67.9％和80.8％，组织工程皮肤C和F冷藏保存25天后的细胞活力分别为58.9％和44.5％，可见，采用本发明实施例提供的凝胶在对所获得的组织工程皮肤保存15天后的平均细胞活力在87.8-98.5％，保存20天后的平均细胞活力约为67.9-80.8％，保存25天后的平均细胞活力约为44.5-58.9％，而对照例中的组织工程皮肤G只能冷藏保存72小时就没有活细胞存在。

由上可知，在通过所述凝胶对组织工程皮肤进行保存时，能够防止液体培养基冲刷所述组织工程皮肤，使组织工程皮肤的细胞与组织造成损伤，从而能够保持所述组织工程皮肤的细胞活力，且所述凝胶的各个组分能够为组织工程皮肤提供营养，并保护组织工程皮肤免受低温缺氧损伤，进一步保持所述组织工程皮肤的细胞活力，使得组织工程皮肤的保存时间大大延长。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种凝胶在保存组织工程皮肤中的应用，其特征在于，包括：

S1)将组织工程皮肤的表皮层朝上置于培养皿中；

S2)将所述液体培养基以及凝固剂的混合液注入所述培养皿中，静置，使所述液体培养基与所述凝固剂的混合液凝固成凝胶，所述组织工程皮肤的真皮层包裹在所述凝胶中，表皮层裸露在外；

其中，所述凝胶包括液体培养基以及凝固剂；所述液体培养基包括质量浓度为5-10g/L的基础培养基、质量浓度为0.2-1.0mg/L的谷胱甘肽、质量浓度为0.4-1.0g/L的色氨酸和质量浓度为0.1-0.3g/L的α-酮戊二酸；所述凝固剂为质量浓度为1.0-1.5％的琼脂溶液。

2.根据权利要求1所述的凝胶在保存组织工程皮肤中的应用，其特征在于，所述液体培养基还包括：质量浓度为0.5-1.0g/L的L-谷氨酰胺、体积浓度为5％-15％的胎牛血清和摩尔浓度为30-50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

3.根据权利要求1所述的凝胶在保存组织工程皮肤中的应用，其特征在于，所述液体培养基还包括：质量浓度为5.0-7.0g/L碳酸氢钠、质量浓度为0.6-6.0ng/L的碱性成纤维生长因子bFGF和质量浓度为4-16μg/L的胰岛素。

4.根据权利要求1所述的凝胶在保存组织工程皮肤中的应用，其特征在于，所述液体培养基还包括：质量浓度为10-30mg/L的维生素C、质量浓度为0.1-0.3mg/L的氢化的可松、质量浓度为6-20mg/L的转铁蛋白、质量浓度为20-40mg/L的腺嘌呤和质量浓度为0.1-1.0ng/L的表皮生长因子EGF。

5.根据权利要求1所述的凝胶在保存组织工程皮肤中的应用，其特征在于，

在S2)之前还包括将所述液体培养基与所述凝固剂混合，其中，所述液体培养基的温度为4-8℃，所述凝固剂的温度为60-68℃。

6.根据权利要求1所述的凝胶在保存组织工程皮肤中的应用，其特征在于，S1)具体为：将组织工程皮肤放置于底部具有通孔的容器中，并将所述容器放置于所述培养皿中，其中，所述容器的边缘与所述培养皿的侧壁之间具有空隙。