CN110892890A - 一种血管的低温保存方法及复温方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血管的低温保存方法：分离获得新鲜血管组织，将冷冻保护剂灌流至血管内部，然后将血管置于冷冻保护剂或含磁纳米颗粒的冷冻保护剂中，然后置于冻存管或冻存袋中，封口，程序化降温；所述冷冻保护剂为：羟乙基淀粉5％～8％，二甲基亚砜10％～15％，表面活性剂0.01％～0.02％，余量为培养基。本发明还公开了一种血管的复温方法：将利用含有磁纳米颗粒的冷冻保护剂冷冻保存的血管样品从液氮中取出，置于交变磁场区域，进行磁热复温，参数为：磁场频率为764.8kHz,磁场强度为250～300Gs，时间40～60s。本发明的血管冷冻保存方法，不会因血管内外温度降温速率不同而导致血管断裂或空间结构遭破坏，可最大限度地使血管的力学性能不受影响，操作简单，效率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种血管的低温保存方法及复温方法，具体涉及血管组织的深低温保存溶液、降温方法及复温方式，属于低温医学领域。
背景技术
血管组织疾病是一类临床上较为常见的疾病，如脉管炎，静脉炎和动脉硬化等。在一定条件下需要进行血管的再通，必要时须进行血管移植。目前，世界上每年大约有几千万人需要通过组织或器官移植来治疗心血管疾病，其中只有15％的患者可以通过自身血管的修复得以治愈，而绝大多数患者只能通过移植他人的正常血管才能治愈疾病，恢复健康。近年来的血管外科发展表明：制约血管移植外科发展的各因素中，以材料科学的因素最为明显。目前人们所普遍应用的血管材料大致可分为两种主要类型：一是生物材料，二是人工合成材料。人工材料有破裂的可能性和远期栓塞发生率高的缺点，其治疗效果并不十分令人满意。生物材料优点是与宿主具有相同组织结构和功能，而这些结构和功能又是保证宿主所获疗效的必要因素。
与庞大的需求量相比，新鲜血管供体不足，来源有限，使得通过血管移植来救治某些心血管疾病的这种有效疗法受到很大限制。为进一步拓宽材料来源，解决供需矛盾，提高有限供体的利用率，血管组织的低温保存成为人们研究的热点问题。
目前，临床为了解决可供移植组织、器官供体不足问题，充分利用临床捐赠及遗弃的遗传资源，逐渐开始探究组织器官最优的保存方式，传统的组织、器官保存液保存只能在有限的时间保证细胞的活性。细胞水平的液氮低温保存技术已很成熟，冷冻保存复苏后细胞的活率普遍达到95％以上。而对于较大组织或者器官的保存，存在冷冻保护剂渗透不均匀、降温过程中内外温差较大、复温过程中温差造成热应力，导致血管断裂等问题。良好的可供移植的血管组织，要求血管内皮未产生破裂；血管空间结构紧密，无断裂。相对于传统的血管保存方法，本发明旨在探究一种降温均匀的程序化降温方式，及利用磁热复温的方式来均一的对血管进行复温，避免血管产生裂纹，保持血管力学性能。
发明内容
针对上述现有技术，为解决大体积组织、器官降温内外存在温差的问题，本发明提供了一种血管的低温保存方法及复温方法，还提供了一种血管冷冻保护剂。本发明针对目前已有的血管冷冻保护剂进行优化与改进，引入程序降温的方式，确定最优的程序降温曲线；另外，运用磁热复温技术，对冷冻保存血管实现温度均一化复温。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种血管的低温保存方法：分离获得新鲜血管组织，在20～25℃下，采用清洗液冲洗血管内外(去除血液残留)；在4℃条件下，将冷冻保护剂灌流至血管内部(以保证血管内部含有充足的冷冻保护剂)，然后将血管置于冷冻保护剂或含磁纳米颗粒的冷冻保护剂中，然后置于冻存管或冻存袋中(视血管长度及粗细而定)，封口，进行降温，降温方式采用程序化降温：在常温～-40℃温区以-1～-2℃/min降温，在-40℃～-100℃温区以-5～-7℃/min降温，之后置于液氮中进行保存；
所述冷冻保护剂(血管冷冻保护剂)，由以下质量百分数的组分组成：保护剂羟乙基淀粉(HES)5％～8％，渗透剂二甲基亚砜(DMSO)10％～15％，表面活性剂0.01％～0.02％，余量为培养基。
进一步地，考虑到高浓度的有机溶剂存在一定的毒性，温度越低，毒性越高，为了尽量降低血管组织与高浓度有机溶剂的接触时间，保证渗透性冷冻保护剂成分充分进入血管，冷冻保护剂采用梯度灌流、浸泡的方式，具体为：将10％～15％冷冻保护剂灌流至血管内部，将血管置于相同浓度的冷冻保护剂中，浸泡5～18min；然后依次灌流、浸泡22％～28％冷冻保护剂、45％～55％冷冻保护剂、70％～80％冷冻保护剂、冷冻保护剂，浸泡时间各为5～18min；最后，在冷冻保护剂中浸泡12～18min，或：灌流含磁纳米颗粒(MNPs)的冷冻保护剂，并在含磁纳米颗粒(MNPs)的冷冻保护剂中浸泡12～18min。
优选的，将12.5％冷冻保护剂灌流至血管内部，将血管置于相同浓度的冷冻保护剂中，浸泡15min；然后依次灌流、浸泡22％～25％冷冻保护剂、50％冷冻保护剂、75％冷冻保护剂、冷冻保护剂，浸泡时间各为15min；最后，灌流含8～10mg/ml磁纳米颗粒的冷冻保护剂，并在含8～10mg/ml磁纳米颗粒的冷冻保护剂中浸泡15min。
所述10％～15％冷冻保护剂，是指冷冻保护剂中羟乙基淀粉、二甲基亚砜、表面活性剂的浓度均为终浓度的10％～15％，比如：12.5％冷冻保护剂中，HES的浓度为(5％～8％)×12.5％，DMSO的浓度为(10％～15％)×12.5％，表面活性剂的浓度为(0.01％～0.02％)×12.5％。其它类似的描述(22％～28％冷冻保护剂、45％～55％冷冻保护剂、70％～80％冷冻保护剂)，含义相同。
所述含磁纳米颗粒的冷冻保护剂中，磁纳米颗粒的浓度为8～10mg/ml。
所述清洗液为含体积分数为8％～12％胎牛血清的RPMI 1640培养基。
所述表面活性剂，为阴离子表面活性剂，选自月桂醇硫酸钠，十二烷基羧酸钠，低浓度无毒表面活性剂的加入能够促进渗透性冷冻保护剂成分的渗入，保护细胞膜结构。
所述培养基，选用RPMI1640培养基，该培养基主要成分为葡萄糖、HEPES、非必须氨基酸等，广泛用于哺乳动物细胞培养，为常用的内皮细胞培养基。
一种血管的复温方法：将利用含有磁纳米颗粒的冷冻保护剂冷冻保存的血管样品从液氮中取出，置于交变磁场区域，进行磁热复温，参数为：磁场频率为764.8kHz,，磁场强度为250～300Gs，时间40～60s。
本发明的血管的冷冻保存方法、复温方法，采用低浓度时化学毒性较小，渗透性高的二甲基亚砜为保护剂渗透性保护剂组分，能够抑制冰晶的形成；采用无毒大分子物质羟乙基淀粉为保护剂非渗透性主要成分，降低由于冰的形成而造成的细胞内外渗透压差异，降低冷冻保存过程中溶质损伤；借助低浓度RPMI1640培养基，为降温过程中细胞的部分代谢提供能量及相关电解质。降温时采用程序降温，根据保护剂的性能，本发明筛选得到了最佳的降温方式。为实现血管均一的复温，在冷冻保护剂中加载磁纳米纳米颗粒，复温时采用磁热复温(确定合适的频率与强度)，实现了均一化复温，复温之后，血管能够保持良好的力学性能与空间结构，与新鲜血管比较相近。
本发明的血管冷冻保存方法，不会因血管内外温度降温速率不同而导致血管断裂或空间结构遭破坏，可最大限度地使血管的力学性能不受影响，操作简单，成本低，效率高。传统的血管玻璃化保存方法由于具有较高的冷冻保护剂浓度，在玻璃化保存过程中，由于血管组织的大小，会造成血管内外温度降温速率不同，造成血管断裂及空间结构的破坏，致使血管力学性能不足，而复温后不能使用。另外，相对于传统的水溶复温复温方式，磁热复温的引入，能够在血管的复温过程中有效地降低热应力，而保持血管的力学性能及空间结构，同时，考虑到新型磁纳米颗粒较低的细胞毒性，磁热复温更适用于大组织的冷冻后复温过程。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
图1：冷冻复温血管应力与应变关系曲线。
图2：冷冻复温血管极限应力及弹性模量统计图。
图3：HE染色结果示意图，其中，a为新鲜血管组织，b为本发明的冷冻保护剂保存的血管，c为LAI组，d为RPMI1640组，e为未加保护剂组。
图4：不同DMSO浓度冷冻保护剂血管复温后蠕变性能及应力松弛性能分析图，其中，a为蠕变性能，b为应力松弛性能。
图5：不同程序化降温方式保存血管复温后应力应变关系图。
图6：不同程序化降温方式保存血管复温后极限应力及弹性模量统计图，其中，a为极限应力统计图；b为弹性模量统计图。
图7：VS55与磁纳米颗粒的加载与去除过程。
图8：不同复温方式血管HE染色、Masson染色、Weigert染色结果图。
图9：不同复温血管力学性能检测图，a图为弹性模量；b图为极限应力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1冷冻保护剂的筛选
分离获得新鲜血管组织，在20～25℃下，采用清洗液(含10％胎牛血清的RPMI1640培养基)冲洗血管内外(去除血液残留)；在4℃条件下，按梯度(12.5％,25％，50％，75％，100％)将冷冻保护剂灌流至血管内部(以保证血管内部含有充足的冷冻保护剂)，然后将血管置于相同浓度梯度的冷冻保护剂中浸泡3min，终浓度灌流结束后置于冻存管或冻存袋中(视血管长度及粗细而定)，封口，进行降温，降温方式采用程序化降温，以-2℃/min连续降温到-100摄氏度，投入液氮中进行保存；玻璃化溶液采用直接投入液氮中的方式进行冷冻保存。
复温采用水浴复温的方式进行：将冷冻保存的血管样品从液氮中取出并去除外层套管，快速置于37℃水浴锅中进行复温。
本发明配制了6种冷冻保护剂，分别如下(各百分数为质量百分数)：
HES(即本发明的冷冻保护剂)：由以下质量百分数的组分组成：羟乙基淀粉6％，二甲基亚砜10％，月桂醇硫酸钠0.01％，余量为RPMI 1640培养基。
LAI：由以下组分组成：胎牛血清10％，赖氨酸2mol/L，余量为RPMI 1640培养基。
M199：由以下组分组成：二甲基亚砜10％，海藻糖0.5mol/L，余量为M199培养基。
RPMI1640：由以下组分组成：胎牛血清20％，海藻糖0.2mol/L，二甲基亚砜1.5mol/L，余量为RPMI 1640培养基。
未加保护剂：RPMI 1640培养基。
玻璃化溶液：由以下组分组成：1-2丙二醇1.3mol/L，乙二醇2.67mol/L，二甲基亚砜2.67mol/L，聚乙二醇60g/L，余量为RPMI 1640培养基。
复温初步采用水浴复温的方式与传统的玻璃化冷冻及其它种类血管保存冷冻保护剂进行对比，
利用力学分析仪，分析不同冷冻保护剂冷冻保存血管并复温之后单向拉伸测试血管所能承受极限应力的变化，以新鲜血管组织为对照，结果如图1应力与应变关系曲线，HES冷冻保护剂组关系曲线与新鲜对照组最为接近。图2极限应力与弹性模量统计图所示,HES冷冻保护剂组极限应力达到0.46MPa，平均值接近并优于新鲜对照组，而玻璃化冷冻保护剂组平均极限应力与弹性模量与新鲜对照组也相近，但是玻璃化冷冻保存组在冷冻保存及复温过程中较易产生血管的断裂。由图可知，经本发明的冷冻保护剂冷冻保存并复温的血管组织，血管力学性能与新鲜血管最相近，效果明显优于其它的冷冻保护剂。病理切片分析不同冷冻保护剂所对应血管的空间结构变化，结果如图3所示，经本发明的冷冻保护剂冷冻保存并复温的血管组织，空间结构保存较好，细胞外胶原纤维及弹性纤维部分未见明显裂缝，与新鲜血管相近。
确定非渗透性组分为HES时保存效果最佳，为确定一个合适的DMSO浓度，分别以主要成分为HES+5％DMSO；HES+10％DMSO；HES+15％DMSO；HES+20％DMSO进行血管的冷冻保存及复温检测试验。
如图4所示，采用不同浓度的DMSO冷冻保存血管，进行复温之后，对血管的蠕变性能及应力松弛性能进行检测分析，从结果曲线可以得到，10％DMSO组血管的力学性能曲线与新鲜血管最为接近。
实施例2程序化降温方式降温速率的确定
对于血管这一类稍大一些的组织，传统的玻璃化降温的方式，由于其较复杂的冷冻保护剂成分，及玻璃化快速降温过程中内外传热不均匀而造成血管内外部降温不均匀，一定程度上增大血管断裂及空间结构破坏的可能性。而程序化降温的引入，能够很大程度上解决玻璃化降温所造成的一系列问题。在实施例1确定最优的冷冻保护剂的基础上，探究不同的降温方式，尤其是确定程序化降温和玻璃化降温之间的差别。
考虑到实施例1中所筛选得到的冷冻保护剂的成分及DSC分析，传统的血管冷冻保存过程中，在-100℃--150℃温区内，由于热应力，血管断裂的概率比较大。确定分温区程序化降温方式进行降温，分别尝试几组程序降温方式，如表1所示。
表1
| -1K/min | -1℃/min降到-100℃，投入液氮 |
| -2K/min | -2℃/min降到-100℃，投入液氮 |
| -5K/min | -5℃/min降到-100℃，投入液氮 |
| -10K/min | -10℃/min降到-100℃，投入液氮 |
| 1-5K/min | -1℃/min降到-40℃，-5℃/min降到-100℃，投入液氮 |
| 2-5K/min | -2℃/min降到-40℃，-5℃/min降到-100℃，投入液氮 |
| 1-10K/min | -1℃/min降到-40℃，-10℃/min降到-100℃，投入液氮 |
利用力学测定仪，测定不同的降温方式复温之后血管力学性能分析(复温方式同实施例1)，结果如图5、图6所示。整体上，应力应变方面，如图5所示，血管以-1℃/min降到-40℃，-5℃/min降到-100℃，之后投入液氮中的方式进行血管的保存，与对照组(新鲜血管组织)血管力学性能差距较小。如图6所示，冷冻保存血管传统方式复温后，血管所能承受的极限应力，本发明的程序降温方式保存的血管与新鲜血管最接近。结合图5、图6，筛选以-1℃/min降到-40℃，-5℃/min降到-100℃的方式进行血管的程序化降温。
实施例3冷冻血管的磁热复温
对于传统的细胞、组织等的深低温保存方法，尤其是针对于少量细胞的保存，玻璃化保存是一种很好的方式，但是玻璃化保存由于其冷冻保护剂的特殊性，当应用于大组织器官保存的时候，复温过程中较容易造成组织结构的破坏。
在实施例1、实施例2的基础上，确定在传统水浴复温的情况之下，利用本发明的冷冻保护剂，以-1℃/min降到-40℃，-5℃/min降到-100℃，之后投入液氮中降温的方式进行血管组织的降温，液氮中长期保存。而在血管的复温过程中，或多或少会产生内外复温不均匀的问题，纳米颗粒的引入，可以更好地实现复温的均一化。
磁纳米颗粒，磁纳米粒子为四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒子，此纳米粒子是在实验室条件下以FeCl3和FeSO4为原料反应合成，分别采用羧酸和聚乙二醇修饰，粒径均为10nm左右，使用前酒精过夜浸泡灭菌。磁纳米颗粒的加载与去除具体如下：
在4℃条件下，将新鲜的脐动脉，依次在12.5％冷冻保护剂(事先向血管内部灌注同浓度的冷冻保护剂，下同)、25％冷冻保护剂、50％冷冻保护剂、75％冷冻保护剂、冷冻保护剂中各浸泡15min，最后在含8mg/ml磁纳米颗粒的冷冻保护剂中浸泡15min。通过组织消化、离心并对吸光度检测，发现脐动脉中Fe3O4浓度为0.083mg/ml，MNPs主要存在于CPA(冷冻保护剂)中。CPA与MNPs的去除通过分步浸泡在浓度为50％、25％、12.5％的冷冻保护剂种各15min，最后置于4℃的PBS溶液中进行，如图7所示。
复温过程分别采用无套管水浴复温、套管水浴复温以及磁热复温方式。
无套管水浴复温方式：将样品从液氮中取出并去除外层套管，快速置于37℃水浴锅中进行复温。
套管水浴复温方式：将样品从液氮中取出直接置于37℃水浴锅中进行复温。
磁热复温：采用磁热疗效应分析仪，将样品从液氮中取出并置于交变磁场区域，磁场频率为764.8kHz,，磁场强度为300Gs。
脐动脉组织染色分析：先将脐动脉固定于中性福尔马林液中，再经过水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋及切片处理，最后制片(HE染色、Masson染色检测胶原纤维结构、Weigert染色检测弹性纤维结构)，通过光学显微镜观察脐动脉细胞、细胞外基质、胶原纤维以及弹性纤维的形态变化，结果如图8所示。由图可知，磁热复温组相对于水浴复温，细胞外基质、胶原纤维、弹性纤维等形态没有明显变化，结构保持较好。
为确定不同复温方式后的血管力学性能的变化，采用动态热机械分析仪进行血管的单向拉伸试验，结果如图9所示。由图可知，磁热复温组相对于水浴复温组力学性能与新鲜血管最接近，也反映出磁热复温能够很好地维持血管的结构与性能。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。
Claims (10)
1.一种血管的低温保存方法，其特征在于：分离获得新鲜血管组织，在20～25℃下，采用清洗液冲洗血管内外；在4℃条件下，将冷冻保护剂灌流至血管内部，然后将血管置于冷冻保护剂或含磁纳米颗粒的冷冻保护剂中，然后置于冻存管或冻存袋中，封口，进行降温，降温方式采用程序化降温：在常温～-40℃温区以-1～-2℃/min降温，在-40℃～-100℃温区以-5～-7℃/min降温，之后置于液氮中进行保存；
所述冷冻保护剂，由以下质量百分数的组分组成：羟乙基淀粉5％～8％，二甲基亚砜10％～15％，表面活性剂0.01％～0.02％，余量为培养基。
2.根据权利要求1所述的血管的低温保存方法，其特征在于：冷冻保护剂采用梯度灌流、浸泡的方式进行灌流、浸泡，进一步地，具体方式为：将10％～15％冷冻保护剂灌流至血管内部，将血管置于相同浓度的冷冻保护剂中，浸泡5～18min；然后依次灌流、浸泡22％～28％冷冻保护剂、45％～55％冷冻保护剂、70％～80％冷冻保护剂、冷冻保护剂，浸泡时间各为5～18min；最后，在冷冻保护剂中浸泡12～18min，或：灌流含磁纳米颗粒的冷冻保护剂，并在含磁纳米颗粒的冷冻保护剂中浸泡12～18min。
3.根据权利要求2所述的血管的低温保存方法，其特征在于：所述含磁纳米颗粒的冷冻保护剂中，磁纳米颗粒的浓度为8～10mg/ml。
4.根据权利要求1或2或3所述的血管的低温保存方法，其特征在于：冷冻保护剂采用梯度灌流、浸泡的方式，具体为：将12.5％冷冻保护剂灌流至血管内部，将血管置于相同浓度的冷冻保护剂中，浸泡15min；然后依次灌流、浸泡22％～25％冷冻保护剂、50％冷冻保护剂、75％冷冻保护剂、冷冻保护剂，浸泡时间各为15min；最后，灌流含8～10mg/ml磁纳米颗粒的冷冻保护剂，并在含8～10mg/ml磁纳米颗粒的冷冻保护剂中浸泡15min。
5.根据权利要求1所述的血管的低温保存方法，其特征在于：所述清洗液为含体积分数为8％～12％胎牛血清的RPMI 1640培养基；
或/和：所述表面活性剂，为阴离子表面活性剂；
或/和：所述培养基，选用RPMI1640培养基。
6.根据权利要求5所述的血管的低温保存方法，其特征在于：所述清洗液为含体积分数为10％胎牛血清的RPMI 1640培养基；所述表面活性剂，选自月桂醇硫酸钠。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的血管的低温保存方法，其特征在于：所述冷冻保护剂，由以下质量百分数的组分组成：羟乙基淀粉6％，二甲基亚砜10％，月桂醇硫酸钠0.01％，余量为RPMI 1640培养基。
8.一种血管的复温方法，其特征在于：将利用含有磁纳米颗粒的冷冻保护剂冷冻保存的血管样品或利用权利要求1～7中任一项所述的血管的低温保存方法冷冻保存的血管样品从液氮中取出，置于交变磁场区域，进行磁热复温，参数为：磁场频率为764.8kHz,，磁场强度为250～300Gs，时间40～60s。
9.一种血管冷冻保护剂，其特征在于：由以下质量百分数的组分组成：羟乙基淀粉5％～8％，二甲基亚砜10％～15％，表面活性剂0.01％～0.02％，余量为培养基。
10.根据权利要求9所述的血管冷冻保护剂，其特征在于：由以下质量百分数的组分组成：羟乙基淀粉6％，二甲基亚砜10％，月桂醇硫酸钠0.01％，余量为RPMI 1640培养基。
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| GR01 | Patent grant | ||
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| TR01 | Transfer of patent right |