CN113575572A - 一种血管玻璃化保存的超快速复温方法 - Google Patents

Abstract

一种血管玻璃化保存的超快速复温方法，将离体的血管预处理后，加载低温保护剂，在血管的内外壁分别设置有第一层和第二层金属薄膜，在所述血管的内腔或者冻存管的内壁和第二层金属薄膜之间还设置有第三层金属薄膜，第三层金属薄膜呈圆柱状置于冻存管中，然后在液氮中退火冷冻至玻璃化转变温度以下保存；复温时，将冻存管从液氮中取出，置于交变磁场中，利用磁场射频激励金属薄膜感应加热，在温度达到低温保护剂熔融温度时，关闭磁场，等待样本自然复温至常温。血管通过本发明的方法可以快速复温，同时获得较好的血管组织结构和良好的力学特性。

Description

一种血管玻璃化保存的超快速复温方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及保存血管的方法，具体来说是一种血管玻璃化保存的超快速复温方法。

背景技术

血管移植是心血管疾病的关键技术，为了提高供体血管的利用率，治疗前对血管进行有效的低温保存至关重要。

目前，低温保存血管最有效的方法是玻璃化保存，为了实现玻璃化，生物材料必须加载高浓度的低温保护剂(CPA)，使血管能在冰晶成核之前玻璃化转变，缓解冰晶损伤的动力学，减小血管结构的冰晶损伤。

使用高浓度的低温保护剂意味着血管受到的低温保护剂的毒性和渗透损伤越大，为了避免CPA的毒性损伤，通常使用较低浓度的CPA，但也意味着需要更高的临界升温速率(CWR)以避免复温过程中的反玻璃化。

同样，随着血管厚度的增加，CPA在血管中短时间内加载不均匀，血管壁中心CPA浓度最低，在复温过程中容易反玻璃化，从而对血管中心结构和力学特性造成损伤。再加上血管内外壁温度梯度增大，产生热应力容易引发血管组织损伤。

为了提高血管组织玻璃化保存复温后的结构完整性，本发明提供了一种血管玻璃化保存的超快速复温方法，了解其对不同尺寸的血管复温方法，保持血管结构和生物力学性能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血管玻璃化保存的超快速复温方法，所述的这种血管玻璃化保存的超快速复温方法要解决现有技术中大体积生物组织复温时反玻璃化以及温度梯度的技术问题。

本发明提供了一种血管玻璃化保存的超快速复温方法，包括如下步骤：

1)将离体的血管预处理后，4℃加载低温保护剂，然后在离体的血管的内外壁分别设置第一层和第二层金属薄膜，在所述的包裹的血管的内腔或者或者冻存管的内壁和第二层金属薄膜之间还设置有第三层金属薄膜，所述的第三层金属薄膜呈圆柱状置于冻存管中，然后在液氮中退火冷冻至低温保护剂玻璃化转变温度以下；

2)复温时，将步骤1)的冻存管从液氮中取出，置于交变磁场中，利用磁场射频激励金属薄膜感应加热，在温度达到低温保护剂熔融温度时关闭磁场，等待样本自然复温至常温，从而实现超快速复温血管。

进一步的，在步骤1)中，所述低温保护剂为DP6，所述的DP6为含有3M/L 二甲亚砜和3M/L 1，2-丙二醇的柯林溶液(EuroCollins)。(此为市售产品)所述低温保护剂的加载方式为分步加载浸泡15分钟，浓度梯度依次为12.5％、25％、 50％、75％、100％；

进一步的，在步骤1)中，所述离体的血管的壁厚在3mm以下，所述金属薄膜为高磁导率金属。

进一步的，在步骤1)中，所述的高磁导率金属薄膜为铝片、铜片、镍钛合金或铁。

进一步的，在步骤1)中，所述第一层和第二层金属薄膜的加载方式为三明治结构，选择合适厚度的两片金属薄膜紧贴加载完低温保护剂的血管内外壁，置于冻存管中，第三片金属薄膜呈圆柱状置于冻存管内复温其余低温保护剂，降低溶液体系复温时的温度梯度。金属在磁场中存在趋肤效应，在交变磁场中，能在短时间内快速升温。

进一步的，在步骤1)中，所述玻璃化保存的退火方式为：降温过程中在冻存管中心和外壁放置两个光纤温度探头分别检测内外的实时温度，在低温保护剂 DP6玻璃化转变温度之前退火，当冻存管中心温度达到玻璃化转变温度之前时，将冻存管拿出在常温环境中退火至血管中心和外壁温差接近，后置于液氮上方冷冻至玻璃化转变温度以下，后至于液氮中冷却，成功玻璃化保存。

进一步的，根据金属在磁场中趋肤效应，选择最佳的磁场参数，在磁场中射频复温。

进一步的，低温保护剂的去除也是分步去除，浓度梯度依次为50％、25％、12.5％，最后置于PBS中等待检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：金属导体在交变磁场产生涡流，在高频率下，大部分电荷集中分布在金属表面产生电阻损耗，升温速率能达到≥1000℃/min。复温步骤简单，容易操作。用此方法复温后，与传统的水浴复温方式相比，射频激励金属薄膜快速复温能显著的改善脐动脉与猪颈动脉等较大尺寸血管的组织结构和力学特性，同时能降低低温保护剂对血管的渗透损伤并能满足低浓度低温保护剂复温时的临界降温速率，能实现大体积血管快速复温。

本发明所述的复温方法成功实现了低浓度低温保护剂玻璃化保存血管，是一种实验中长期安全、稳定、有效的复温方法。脐带血管和猪颈动脉通过该方法可以获得较好的血管组织结构和良好的力学特性。

附图说明

图1为铝片加载脐动脉图，金属薄膜P1、P2紧贴血管内外壁，金属薄膜 P3加热低温保护剂。图A为方案A金属的加载方式，B为方案B金属加载方式。

图2为本发明的血管玻璃化保存过程中降温、复温过程中的温度变化。

图3为方案A、B加载方式复温的脐动脉组织染色图。

图4为射频激励金属薄膜快速复温血管装配示意图。

图5为不同保存方案血管的弹性模量。

图6为不同复温方式脐动脉HE、Masson、Weigert染色。

图7为脐动脉力学特性；弹性模量、极限应力、归一化应力松弛率、归一化蠕变率。

图8为不同复温方式猪颈动脉HE、Masson、Weigert染色。

图9为猪颈动脉力学特性；弹性模量、极限应力、归一化应力松弛率、归一化蠕变率。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例对本发明的技术方案进行完整的展示。显然，所描述的实施实施例仅仅是本发明的一部分实施例，并非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明对实验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性或具体性描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法都是本领域公知的，但本发明尽可能详细描述。

下述实施中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中以有的常规仪器、试剂、材料等。可通过正规商业途径获得。下述实验方法，检测方法，若无特别说明均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1：采用0.1mm厚的金属薄膜，以脐动脉血管为例，优化金属薄膜加载方式对血管组织复温效果的影响。

1.样本处理：将脐带用手术镊除去脐静脉和华通胶，每根脐带可以剥离出两根脐动脉，用PBS洗涤后浸泡，加入质量百分浓度为1％的青霉素和链霉素， 4℃冷藏保存试验备用。

2.低温保护剂和金属薄膜加载：金属薄膜厚度为0.1mm，分步加载低温保护剂，金属薄膜加载方式如下所示：

方案1：金属薄膜加载方式为三明治结构，金属薄膜P1、金属薄膜P2紧贴加载完低温保护剂的血管内外壁，置于冻存管中。如图1A所示；

方案2：在1方案的基础上，两片金属薄膜三明治结构紧贴包裹血管内外壁，另外加一片金属薄膜P3用于复温低温保护剂溶液，呈圆柱状，设置在金属薄膜 P1和冻存管的内壁之间，金属薄膜P1、金属薄膜P2紧贴血管内外壁，金属薄膜P3加热低温保护剂，降低溶液体系复温时的温度梯度。如图1B所示。

3.玻璃化保存：降温过程中，在冻存管中心和外壁放置两个光纤温度探头分别检测内外的实时温度。在降温过程中，为实现玻璃化且减小溶液系统内部储存的热应力，在低温保护剂DP6玻璃化转变温度-120℃之前退火。在冷却过程中，对于脐动脉，选择中心温度在-110℃退火20s左右置于液氮上方继续冷却-140℃。

4.金属射频复温：所述复温方式是将加载金属薄膜的样本从液氮中取出，放置在磁场参数为频率497.9KHz，磁场强度为20KA/m。为了避免过热对组织的损伤，在温度达到DP6相变温度-20℃左右时关闭磁场，等待样本自然复温至常温，再去除低温保护剂。

5.温度测量：将两根光纤温度探头分别至于冻存管的中心和外壁，实时测量降温和复温时冻存管中心和外壁的温度。结果如图2A、B所示，发现用1方案加载金属薄膜时，在磁场关闭后，由于金属薄膜复温效果过快，冻存管内血管和低温保护剂复温不均匀，复温时间过快，由于导热系数低来不及升温，低温保护剂仍处于较低温状态，大量的低温保护剂导致冻存管中心出现二次降温，最低温度达到-87℃，容易对血管组织造成二次损伤。基于此，利用金属薄膜在磁场中快速升温的效果，增加一层金属薄膜复温低温保护剂，使冻存管内血管和低温保护剂同步升温，实现均匀复温。复温速率从图2B可以看出，二次降温得到明显的改善，不会造成血管二次冷冻造成的损伤。

6.组织染色分析：制片(HE染色、Masson染色、Weigert染色)，通过光学显微镜观察脐动脉细胞外基质、胶原纤维以及弹性纤维的形态变化，方案1、2加载方式复温的脐动脉通过与新鲜组比较的染色图如图3所示，可以发现通过方案 A复温的血管外壁损伤严重，弹性纤维和胶原纤维有不同程度的损伤。而方案2 复温的血管组织结构较好保存。

实施例2：采用人脐动脉为例，考察这种射频激励铝膜快速复温方法对血管组织复温效果的影响。

1.样本处理：将脐带用手术镊除去脐静脉和华通胶，每根脐带可以剥离出两根脐动脉，用PBS洗涤后浸泡，加入质量百分浓度为1％的青霉素和链霉素， 4℃冷藏保存试验备用。

2.低温保护剂和金属薄膜加载：金属薄膜厚度为0.1mm，分步加载低温保护剂后加载金属薄膜，根据金属在磁场中趋肤效应，选择最佳的磁场参数和金属薄膜的厚度，选择适当大小金属薄膜，其中两片金属薄膜三明治结构紧贴包裹血管内外壁，另外一片金属薄膜用于复温低温保护剂溶液，呈圆柱状，设置在在金属薄膜P1和冻存管的内壁之间，降低溶液体系复温时的温度梯度。如图1所示为铝片加载脐动脉图，金属薄膜P1、金属薄膜P2紧贴血管内外壁，金属薄膜 P3加热低温保护剂。其中，交流磁场的参数为：497.9KHz，磁场强度为20KA/m，纯溶液体系下复温速率为900℃/min左右。

图4为射频激励金属薄膜快速复温血管装配示意图。

3.玻璃化保存：降温过程中，在冻存管中心和外壁放置两个光纤温度探头分别检测内外的实时温度。在降温过程中，为实现玻璃化且减小溶液系统内部储存的热应力，在低温保护剂DP6玻璃化转变温度-120℃之前退火。在冷却过程中，对于脐动脉，选择中心温度在-110℃退火20s左右置于液氮上方继续冷却至-140℃。

表1以脐动脉为例，不同退火温度和退火时间对玻璃化保存的影响，图5 为对应保存方案正常复温后的弹性模量比较，可以看出成功玻璃化的方案A和C 血管结构保持良好，与更接近新鲜组，玻璃化失败组，特别在低温保护剂玻璃化转变温度之后退火的血管，热应力对血管的损伤严重。在玻璃化保存过程中，合适的退火方案对血管结构的保存很重要。

表1 脐动脉不同退火温度和退火时间对玻璃化保存的影响

4.金属射频复温：所述复温方式是将加载金属薄膜的样本从液氮中取出，放置在磁场参数为频率497.9KHz，磁场强度为20KA/m。为了避免过热对组织的损伤，在温度达到0℃左右时关闭磁场，等待样本自然复温至常温，再去除低温保护剂。

5.组织染色分析：制片(HE染色、Masson染色、Weigert染色)，通过光学显微镜观察脐动脉细胞外基质、胶原纤维以及弹性纤维的形态变化，与新鲜组和水浴复温组作比较，结果如图6所示。可以发现新鲜的脐动脉细胞基质分布均匀，胶原纤维和弹性纤维排列均匀。对脐动脉，水浴复温后的组织结构有些紊乱，组织结构分布不匀，结构有明显的裂纹。金属射频复温组的微观结构与新鲜组的较为相似，无明显损害现象。

6.血管是粘弹性材料，力学特性是其重要评价指标，本文利用力学分析仪分别做单向拉伸测试、应力松弛测试以及蠕变测试，结果如图7所示。

与新鲜组脐动脉相比，金属射频复温和水浴复温血管的弹性模量都无显著性差异，接近新鲜组脐动脉。通过分析应力松弛和蠕变松弛可以发现，金属射频复温和水浴复温后血管的粘弹性保持良好。

实施例3：采用猪颈动脉，考察这种射频激励金属薄膜快速复温方法对血管组织复温效果的影响。

1.样本处理：用手术剪和镊子小心除去猪颈动脉多余的脂肪和结缔组织，用PBS洗涤后浸泡，加入质量百分比浓度为1％的青霉素和链霉素，4℃冷藏保存试验备用。

2.低温保护剂和金属薄膜加载：与脐动脉加载方式类似，不同的是复温低温保护剂的金属薄膜在最猪颈动脉内腔中。

3.玻璃化保存：在低温保护剂DP6玻璃化转变温度-120℃之前退火。在冷却过程中，对于猪颈动脉动脉，选择中心温度在-110℃退火至中心和外壁温差在 3℃左右，然后置于液氮上方继续冷却至-140℃。

4.金属射频复温：所述复温方式与脐动脉复温方式类似。

5.组织染色分析：制片(HE染色、Masson染色、Weigert染色)，通过光学显微镜观察猪颈动脉细胞外基质、胶原纤维以及弹性纤维的形态变化，与新鲜组和水浴复温组作比较，结果如图8所示。水浴复温组织结构损伤严重，金属射频复温血管组织结构与新鲜组相似。

6.血管是粘弹性材料，力学特性是其重要评价指标，本文利用力学分析仪分别做单向拉伸测试、应力松弛测试以及蠕变测试，结果如图9所示。金属射频复温和水浴复温的效果与新鲜组相比，极限应力有显著性差异，但结合组织染色分析，发现金属射频复温的效果总体上还是比水浴复温效果好。而且可以发现金属射频复温猪颈动脉后效果较脐动脉来说改善效果不显著，原因是猪颈动脉血管壁较厚，影响血管内外壁的传热，热应力增大。

总结

本发明提出了一种新的复温方式，利用铝片射频复温玻璃化保存血管，操作简单。发现与水浴复温比较，复温后脐动脉和猪颈动脉的组织结构和力学特性得到改善。金属射频复温时，溶液体系内温度均匀分布，血管内外温差小。可以实现更加均匀、快速的加热，减少热应力损伤。因此，金属射频复温能有效缓解血管复温时对组织结构，包括弹性纤维、胶原蛋白的损伤。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种血管玻璃化保存的超快速复温方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将离体的血管预处理后，4℃加载低温保护剂，然后在离体的血管的内外壁分别设置第一层和第二层金属薄膜，在所述的包裹的血管的内腔或者或者冻存管的内壁和第二层金属薄膜之间还设置有第三层金属薄膜，所述的第三层金属薄膜呈圆柱状置于冻存管中，然后在液氮中退火冷冻至低温保护剂玻璃化转变温度以下；

2)复温时，将步骤1)的冻存管从液氮中取出，置于交变磁场中，利用磁场射频激励金属薄膜感应加热，在温度达到低温保护剂熔融温度时关闭磁场，等待样本自然复温至常温，从而实现超快速复温血管。

2.根据权利要求1所述的一种血管玻璃化保存的超快速复温方法，其特征在于：所述低温保护剂为DP6，所述的DP6为含有3M/L二甲亚砜和3M/L 1，2-丙二醇的柯林溶液，所述低温保护剂的加载方式为分布加载浸泡15分钟；低温保护剂的去除也是分布去除，最后置于PBS中等待检测。

3.根据权利要求1所述的一种血管玻璃化保存的超快速复温方法，其特征在于：在步骤1)中，所述第一层和第二层金属薄膜的加载方式为三明治结构，两片金属薄膜紧贴加载完低温保护剂的血管内外壁，置于冻存管中。

4.根据权利要求1所述的一种血管玻璃化保存的超快速复温方法，其特征在于：所述离体的血管的壁厚在3mm以下，所述金属薄膜为高磁导率金属。

5.根据权利要求4所述的一种血管玻璃化保存的超快速复温方法，其特征在于：所述的高磁导率金属为铝片、铜片、镍钛合金或铁。

6.根据权利要求1所述的一种血管玻璃化保存的超快速复温方法，其特征在于：在步骤1)中，所述玻璃化保存的退火方式为：降温过程中在冻存管中心和外壁放置两个光纤温度探头分别检测内外的实时温度，在低温保护剂玻璃化转变温度之前退火，当冻存管中心温度达到玻璃化转变温度之前时，将冻存管拿出至常温退火至血管中心和外壁温差接近后置于液氮上方，冷冻至玻璃化转变温度以下，后至于液氮中冷却，成功玻璃化保存。

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