CN104782616A - 多孔金属材料在生物样品冷冻中的应用及冷冻方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了多孔金属材料在生物样品冷冻中的应用及冷冻方法，属于生物低温冷冻保存技术领域。本发明公开了的冷冻方法所采用的技术方案为：将多孔金属材料按规格切割后，置于冻存管中，再将混有冷冻保护剂的生物样品悬液加入已放入多孔金属材料的冻存管中，进行低温冷冻。本发明方法能够加快所冷冻样品的冷冻速率，避免较大体积的冰晶形成；同时使得在快速冷冻以及复温过程中，生物样品内部的传热更为均匀，避免造成较大热应力，保证较高的生物组织存活率。所需的实验装置制作简单，易实现，冷冻流程操作便捷，可冷冻细胞或细胞团等其他生物组织，以及大体积的生物溶液(如血液)，且不受所含生物组织种类的限制。

Description

多孔金属材料在生物样品冷冻中的应用及冷冻方法

技术领域

本发明属于生物低温冷冻保存技术领域，具体涉及多孔金属材料在生物样品冷冻中的应用及冷冻方法。

背景技术

低温冷冻，是指将生物组织在加有冷冻保护剂的溶液中，冷冻至某一低温并对其长期保存的过程，在生物研究、医学应用等方面都有广泛的使用与需求。其常用的方式有常规冷冻和玻璃化冷冻。其中，常规冷冻是将含有冷冻保护剂的生物样品先在低温冰箱中冷冻至-80℃，再将其在液氮中冷冻至-196℃并在液氮中长期保存的冷冻方法。玻璃化冷冻是指直接将含有冷冻保护剂的生物样品在液氮中冷冻至-196℃的低温冷冻方法。二者均对冷冻时的降温速率有着较高的要求。然而，对于较大尺寸的生物组织，例如细胞团，组织，甚至整个器官；以及较大体积的生物溶液，如血液，含生物微组织的悬液等。因其特征尺寸大，传热热阻大，导致冷冻速率低，会在生物组织中形成较大的冰晶，对其造成机械性的损伤，使得现有的冷冻技术很难将其有效的保存。

同时，样品的体积变大，会导致传热的不均匀性增加，使得其在复温过程中，会存在较大的热应力，这对生物样品存活造成了极大的威胁。因此，寻找能改善大体积的生物组织冷冻时的换热方法，降低冷冻时的热阻，对于解决较大体积生物样品的冷冻、推进低温冷冻保存技术的进一步发展，至关重要。

多孔金属材料，作为一种新型的功能性材料，因其密度小，比表面积大，力学承载好，热分散能力强等优势，被广泛用于航天，能源，建筑等领域。尤其是开孔的金属多孔泡沫材料，其基体成分为铜铝等高导热金属，孔间空隙为空气填充，使得流体可以通过孔隙流动，从而被广泛用于加强流体换热，相变储热，均匀导热和散热等领域。目前，还未曾见过利用多孔金属材料冷冻保存生物样品的报道。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供多孔金属材料在生物样品冷冻中的应用及冷冻方法，该方法使用材料简单，操作方便，易于实现，能够加快冷冻速率，保证较高的生物组织存活率。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了多孔金属材料在生物样品冷冻中的应用。

所述多孔金属材料的孔与孔之间连通，流体能够通过多孔金属材料中的孔隙；多孔金属材料的孔隙率、孔径、直径以及体积参数，能够根据所冷冻生物样品的大小和体积进行选择。

所述多孔金属材料的孔隙率为0.5～0.99；多孔金属材料的孔径为100～5000μm。

所述多孔金属材料由导热系数大于20W/m·℃的高导热材料制成。

所述高导热材料为铜、铝、铁、镍等其他高导热系数固体材料。

所述生物样品为细胞、细胞团、血液、微生物组织或含生物组织的溶液。

本发明还公开了一种基于多孔金属材料的生物样品冷冻方法，将多孔金属材料切割成与冻存管及生物样品体积适应的形状，再将混有冷冻保护剂的生物样品悬液加入已放入多孔金属材料的冻存管中，进行低温冷冻处理。

优选地，将多孔金属材料切割成圆柱状，置于冻存管中，再将混有冷冻保护剂的生物样品悬液加入已放入圆柱状多孔金属材料的冻存管中，进行低温冷冻处理；其中，圆柱状多孔金属材料的外径与冻存管的内径相同。

优选地，所述多孔金属材料的孔与孔之间连通，流体能够通过多孔金属材料中的孔隙；多孔金属材料的孔隙率、孔径、直径以及体积参数，能够根据所冷冻生物样品的大小和体积调节。

所述多孔金属材料的孔隙率为0.5～0.99；多孔金属材料的孔径为100～5000μm。所述多孔材料由导热系数大于20W/m·℃的高导热材料制成，高导热材料为铜、铝、铁、镍等其他高导热系数固体材料。。

低温冷冻处理后还包括复温处理，具体操作为：

将多孔金属材料冻存管于37℃下水浴复温解冻，直至冻存管中成为冰水混合物时，移出水浴；将冻存管中溶解后的溶液转移到试管内后，去除冷冻保护剂，加入培养液，得到解冻后的生物样品组织溶液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开了多孔金属材料在生物样品冷冻中的应用，由于多孔金属材料的孔与孔之间连通，流体能够通过多孔金属材料中的孔隙，因此以多孔金属材料作为传热媒介，能够有效提高冷冻速率，且冷冻过程中由于多孔材料存在孔隙，不易形成较大体积的冰晶，从而尽可能避免冷冻过程中生物组织的损伤。生物样品内部的传热更为均匀，能够避免造成较大热应力，从而保证生物样品的存活。同时，在冷冻过程中冷冻生物组织不与液氮直接接触，不会造成生物污染。多孔金属材料的孔隙率、孔径、直径以及体积参数，能够根据所冷冻生物样品的大小和体积进行选择。

本发明还公开了基于多孔金属材料的生物样品冷冻方法，该方法所需的实验装置制作简单，易实现，冷冻流程操作便捷，可冷冻细胞或细胞团等其他生物组织，以及大体积的生物溶液(如血液)，不受所含生物组织种类的限制。根据所冷冻生物样品的大小和体积选择相应孔隙率、孔径、直径以及体积参数，的多孔金属材料。

进一步地，通过本方法冷冻后的生物样品在复温时速度快，能够有效避免复温时的再结晶对生物组织造成的损伤。

附图说明

图1为本发明所述冷冻方法的示意图；

图2为使用本发明的常规冷冻方法流程图；

图3为使用本发明的常规冷冻方法实验结果图；

其中图3(a)为常规冷冻方法在低温冰箱中实验结果图；图3(b)为常规冷冻方法在液氮中实验结果图；图3(c)是其前1200s的冷冻曲线放大图；图3(d)是其前40s的冷冻曲线放大图；

图4为使用本发明的玻璃化冷冻方法装置图；

图5为使用本发明的玻璃化冷冻方法实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

参照图1，本发明的基于多孔金属材料的生物样品冷冻方法所用装置包括冻存管和多孔金属材料；将多孔金属材料切割成圆柱状，置于冻存管中。多孔金属材料为开孔的金属材料，孔与孔之间连通，可允许流体流动。多孔金属材料的外直径与冻存管的内径相同。

所述多孔金属材料的孔隙率为0.5～0.99；多孔金属材料的孔径为100～5000μm，多孔金属材料的孔隙率，孔径，直径，体积等参数，可根据所冷冻样品大小和体积，相应选择和调节。

所述冻存管由耐低温材料构成，耐低温材料包括聚丙烯材料。

所述多孔金属材料由高导热材料构成，导热系数大于20W/(m·℃)，高导热材料包括铜、铝、铁、镍等其他高导热系数固体材料。。

所述的冷冻装置能够冷冻细胞、细胞团或其他生物组织以及大体积的生物溶液(如血液)。

冷冻方法为：在配制细胞、细胞团或微生物组织溶液后，在其中加入冷冻保护剂，用于在冷冻过程中将抑制细胞内冰晶的长大。

参见图2，冷冻过程中，先旋开冻存管旋盖，然后将混有冷冻保护剂的生物组织溶液缓缓倒入已放有多孔金属材料的冻存管中。之后，旋紧冻存管旋盖。常规冷冻时，将冻存管放入倒有异丙醇的程序降温盒中。将程序降温盒转移至低温冰箱(-80℃)中缓慢冷冻12小时后，从低温冰箱中取出程序降温盒，迅速将冻存管浸没至液氮中进行冷冻。

玻璃化冷冻时，参见图4，将冻存管直接浸没至液氮中冷冻。

复温时，将冷冻的多孔金属材料的冻存管直接放入水浴锅中加热至冰水混合物，之后将生物组织溶液移出。

下面以冷冻细胞为例，对本发明的冷冻方法进行详细使用说明。

一种基于多孔金属材料的冷冻方法，包括以下步骤：

1、细胞冷冻

1)配置细胞悬液，使其浓度为1×10⁴～1×10⁶个/mL；

2)将多孔金属材料和冻存管消毒后，将多孔金属材料放入冻存管内，等待加入细胞悬液；

3)配置冷冻保护溶液，成分为：90％(v/v)细胞培养液+10％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)(或35％(v/v)1,2-丙二醇溶液)；

4)取2mL上述制备好的细胞悬液，离心后弃上清液，加入冷冻保护液2ml，震荡使其混合均匀，配置成冷冻细胞悬液；

5)旋开冻存管旋盖，并使冻存管旋盖口向上放置；

6)用移液枪将1.5mL冷冻细胞悬液缓缓加在冻存管内；

7)旋紧冻存管旋盖口，将冻存管浸没至液氮内，使其在液氮中完成细胞冷冻。

2、细胞复苏

1)从液氮中取出冻存管；

2)将冻存管置于水浴锅内，在37℃温水中将含有细胞的溶液解冻，待其成为冰水混合物时，移出水浴锅；

3)将冻存管中溶解后的溶液用移液枪转移到试管内，同时试管内加入1.5mL培养液，震荡以稀释冷冻保护剂；

4)将装有细胞溶液试管离心，弃上清液后，加入1.5mL培养液，得到解冻后的细胞悬液。

为了进一步证明所述冷冻方法的优势，以冷冻35％的1,2-丙二醇溶液(一种常用的冷冻保护剂)为例，通过实验测量本发明所述冷冻方法的温度变化曲线，检验本发明的冷冻速率。并与传统的冷冻方法对比，分析本发明中涉及的基于多孔金属材料的冷冻方法的有效性，具体实验的实施步骤如下：

1、实验准备

1)配置浓度为35％的1,2-丙二醇溶液。

2)将加工好的多孔金属材料放入冻存管中。

3)设置相同含量溶液的未加多孔金属材料的实验对照组。

4)在冻存管顶盖开出直径为1mm的孔。将热电偶测量端放进冻存管内，移动至冻存管中心，距冻存管顶端30mm处。热电偶另一端连接在测温仪上，用于实验时温度的记录。

5)将冻存管顶盖开孔处使用速干胶水使热电偶定位，并将冻存管密封。

2、冷冻

多孔金属材料强化常规冷冻实验：

1)分别将含有多孔金属材料及不含多孔金属材料的冻存管放入程序降温盒中。

2)将程序降温盒转移至低温冰箱(-80℃)中缓慢冷冻，直至测温仪显示冻存管内的温度达到稳态。

3)从低温冰箱取出程序降温盒，迅速将两只冻存管直接浸没入液氮中。

4)待测温仪显示冻存管内的温度都达到稳态后，取出冻存管，并保存温度仪数据。

多孔金属材料强化玻璃化冷冻实验：

1)分别往含有多孔金属材料及不含多孔金属材料的冻存管中加入等量的35％的1,2-丙二醇溶液。

2)在室温条件下，分别将两只冻存管直接浸没在液氮中，通过测温仪观察冷冻保护剂温度变化。

3)待测温仪显示冻存管内的温度达到稳态后，取出冻存管，并保存测温仪数据。

3、实验结果

常规冷冻方法的实验结果图为图3，玻璃化冷冻方法的实验结果图为图5。

其中，图3(a)为常规冷冻方法在低温冰箱中实验结果图，图3(c)是其前1200s的冷冻曲线放大图；图3(b)为常规冷冻方法在液氮中实验结果图，图3(d)是其前40s的冷冻曲线放大图。图5给出了玻璃化冷冻方法的冷冻速率图。在图3和图5中，灰色曲线为本发明所述的冷冻方法的降温曲线，黑色曲线为传统冷冻方法的降温曲线。

从图3和图5的温度变化图中可以看出，无论是常规冷冻时，还是玻璃化冷冻时，本发明所述的基于多孔金属材料冷冻方法的冷冻速率(灰色曲线的斜率)都明显高于传统冷冻方法冷冻速率(黑色曲线的斜率)，也证明了本发明较传统冷冻方法，能够显著提高冷冻效率，更好地避免冷冻时较大冰晶的形成，有效地冷冻和保存生物组织及含有生物组织的溶液。

综上所述，本发明公开的多孔金属材料在生物制品低温冷冻中的应用及其冷冻方法，能够加快所冷冻样品在液氮中的冷冻速率，保证较高的生物组织存活率，同时使得在快速冷冻以及复温过程中，生物样品内部的传热更为均匀，避免造成较大热应力，从而进一步保证生物样品的存活。并且所设计采用的冷冻方法使用材料简单，操作流程简明，易于实现。

具有以下特点：

1、结构装置简单，容易实现，且冷冻流程操作简明。

2、采用多孔金属材料作为传热媒介，有效提高了冷冻速率，不易形成较大体积的冰晶，从而尽可能避免冷冻过程中生物组织的损伤。冷冻速度快。

3、提高了复温速度，避免了复温时的再结晶对生物组织造成的损伤。

4、冷冻和复温过程中，生物样品内部的传热更为均匀，能够避免造成较大热应力，从而进一步保证生物样品的存活。

5、冷冻过程中冷冻生物组织不与液氮直接接触，不会造成生物污染。

6、本冷冻装置可冷冻细胞或细胞团等其他生物组织，以及大体积的生物溶液(如血液)，且不受所含生物组织种类的限制。

Claims (10)

1.多孔金属材料在生物样品冷冻中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多孔金属材料的孔与孔之间连通，流体能够通过多孔金属材料中的孔隙。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多孔金属材料的孔隙率为0.5～0.99；多孔金属材料的孔径为100～5000μm。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多孔金属材料由导热系数大于20W/m·℃的高导热材料制成。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述高导热材料为铜、铝、铁或镍。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物样品为细胞、细胞团、血液、微生物组织或含生物组织的溶液。

7.一种基于多孔金属材料的生物样品冷冻方法，其特征在于，将多孔金属材料切割成与冻存管及生物样品体积适应的形状，再将混有冷冻保护剂的生物样品悬液加入已放入多孔金属材料的冻存管中，进行低温冷冻处理。

8.根据权利要求7所述的一种基于多孔金属材料的生物样品冷冻方法，其特征在于，将多孔金属材料切割成圆柱状，置于冻存管中，再将混有冷冻保护剂的生物样品悬液加入已放入圆柱状多孔金属材料的冻存管中，进行低温冷冻处理；其中，圆柱状多孔金属材料的外径与冻存管的内径相同。

9.根据权利要求7所述的一种基于多孔金属材料的生物样品冷冻方法，其特征在于，所述多孔金属材料的孔与孔之间连通，流体能够通过多孔金属材料中的孔隙；多孔金属材料的孔隙率为0.5～0.99，孔径为100～5000μm。

10.根据权利要求7所述的一种基于多孔金属材料的生物样品冷冻方法，其特征在于，低温冷冻处理后还包括复温处理，具体操作为：

将多孔金属材料冻存管于37℃下水浴复温解冻，直至冻存管中成为冰水混合物时，移出水浴；将冻存管中溶解后的溶液转移到试管内后，去除冷冻保护剂，加入培养液，得到解冻后的生物样品组织溶液。