CN110896946A - 一种造血干细胞冻存液及造血干细胞冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种造血干细胞冻存液及造血干细胞冻存方法，所述冻存液由冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白组成，所述冷冻保护剂由以下成分组成：二甲基亚砜、羟乙基淀粉、生理盐水、聚乙烯吡咯烷酮；所述培养基由以下成分组成：萝卜糖、氨基酸、胎羊血清，所述冷冻保护剂包括以下重量份成分：二甲基亚砜25ml、羟乙基淀粉5g、生理盐水15ml、聚乙烯吡咯烷酮5g；所述培养基包括以下重量份成分：萝卜糖1.5g、氨基酸25g、胎羊血清20g。本发明中，冻存方法操作简单，技术要求低，可以及时进行冻存，解决了传统的造血干细胞需经数天的培养观察才可进行冻存，为造血干细胞的储存应用以及移植提供可靠保障。

Description

一种造血干细胞冻存液及造血干细胞冻存方法
技术领域
本发明属于细胞冻存技术领域，具体为一种造血干细胞冻存液及造血干细胞冻存方法。
背景技术
造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞，包括肿瘤干细胞，具有重要指导意义。血液系统中的成熟细胞寿命极短，因此在人的一生中，造血干细胞需要根据机体的生理需求适时的补充血液系统各个成熟细胞组分。同时在损伤、炎症等应激状态下，造血干细胞也扮演着调节和维持体内血液系统各个细胞组分的生理平衡的角色。
造血干细胞在临床上应用极为广泛，造血干细胞冻存是保证造血干细胞移植成功的关键技术之一，故其冻存方式尤为重要。目前临床造血干细胞冻存有-196°C液氮程控降温保存和-80°C非程控降温保存，前者能长期保存且细胞损伤少，一般可保存23～25年，但操作复杂、设备昂贵，解冻后有细胞凝集现象，后者可保存干细胞1～2年，其操作相对简便、费用低，但保存细胞时间及细胞活性受限。
探索一种操作简便、快速、成本低廉及保存时间更长的干细胞冻存方法，对于临床造血干细胞的储存、应用及造血干细胞移植成功具有重要意义。在造血干细胞的冻存中，使用的冻存剂及方法均非常重要。目前应用于-80°C低温保存干细胞的保护剂有二甲基亚砜、CP-1、羟乙基淀粉、RPMI1640培养基、人血白蛋白等，不同的保护剂的配方及使用方法差异较大，对干细胞的保存效果与保存时间也存在差异，多数保存细胞的存活率为80％左右，干细胞安全难以保证，一些冻存方法还存在操作复杂缺点。
发明内容
本发明的目的在于：为了以减少冻存液对造血干细胞的损伤和优化冻存方法，提供一种造血干细胞冻存液及造血干细胞冻存方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种造血干细胞冻存液，所述冻存液由冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白组成，所述冷冻保护剂由以下成分组成：二甲基亚砜、羟乙基淀粉、生理盐水、聚乙烯吡咯烷酮；所述培养基由以下成分组成：萝卜糖、氨基酸、胎羊血清。
其中，所述冷冻保护剂包括以下重量份成分：二甲基亚砜25ml、羟乙基淀粉5g、生理盐水15ml、聚乙烯吡咯烷酮5g；
其中，所述培养基包括以下重量份成分：萝卜糖1.5g、氨基酸25g、胎羊血清20g。
其中，所述造血干细胞冻存方法包括以下步骤：
步骤1：按比例1:4:1.2分别称得各比例的冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白；
步骤2：准备一个消毒过的注射器，抽取步骤1称得的组成成分，注入密封容器内，摇晃容器2～3min，使各成分相互混合，形成细胞悬液；
步骤3：将步骤:2中含有的细胞悬液的密封容器至于冷冻袋内，袋口密封；
步骤4：将冷冻带程序性降温至-80℃后，按储存要求放入液氮罐中进行冻存。
其中，所述培养基内还有如下重量份成分：运铁蛋白5g。
其中，按比例1:4:1分别称得各比例的冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白。
其中，按比例1.2:4:1.2分别称得各比例的冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白。
其中，一种造血干细胞冻存液，所述冻存液由冷冻保护剂、培养基和胎牛血清组成，所述冷冻保护剂由以下成分组成：二甲基亚砜、羟乙基淀粉、生理盐水、聚乙烯吡咯烷酮；所述冷冻保护剂包括以下重量份成分：二甲基亚砜25ml、羟乙基淀粉5g、生理盐水15ml、聚乙烯吡咯烷酮5g；所述培养基由以下成分组成：萝卜糖、氨基酸、人血清白蛋白；所述培养基包括以下重量份成分：萝卜糖0.5g、氨基酸25g、人血清白蛋白25g。
其中，所述冻存方法包括以下步骤：
步骤1：按比例1:4:1分别称得各比例的冷冻保护剂、培养基和胎牛血清；
步骤2：准备一个消毒过的注射器，抽取步骤1称得的组成成分，注入容器内，轻度吹打2～2.5min，使各成分相互混合，形成细胞悬液；
步骤3：将步骤2中的细胞悬液的分装至2ml的冻存管中；
步骤4：将冻存管程序性降温至-80℃后，按储存要求放入-196℃液氮罐中进行冻存。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明中，造血干细胞冻存液严格控制各原料的配比，能有效保护造血干细胞，减少细胞冰晶损伤，安全性高，显著提高造血干细胞的复苏活率，达到94％以上，同时复苏后的细胞增殖数量大、增殖能力强，并且维持了造血干细胞复苏后的生理功能和生物学特性，延长了造血干细胞的保存时间。
2、本发明中，在培养基内加入微量糖类，糖分子富于弹性，对细胞膜的稳定性具有促进作用。
3、本发明中，冻存方法操作简单，技术要求低，可以及时进行冻存，解决了传统的造血干细胞需经数天的培养观察才可进行冻存，为造血干细胞的储存应用以及移植提供可靠保障。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一，一种造血干细胞冻存液及造血干细胞冻存方法，所述冻存液由冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白组成，所述冷冻保护剂由以下成分组成：
二甲基亚砜、羟乙基淀粉、生理盐水、聚乙烯吡咯烷酮；
所述培养基由以下成分组成：萝卜糖、氨基酸、胎羊血清；
所述冷冻保护剂包括以下重量份成分：二甲基亚砜25ml、羟乙基淀粉5g、生理盐水15ml、聚乙烯吡咯烷酮5g；
所述培养基包括以下重量份成分：萝卜糖1.5g、氨基酸25g、胎羊血清20g。
所述冻存方法包括以下步骤：
步骤1：按比例1:4:1.2分别称得各比例的冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白；
步骤2：准备一个消毒过的注射器，抽取步骤1称得的组成成分，注入密封容器内，摇晃容器2～3min，使各成分相互混合，形成细胞悬液；
步骤3：将步骤2中含有的细胞悬液的密封容器至于冷冻袋内，袋口密封；
步骤4：将冷冻带程序性降温至-80℃后，按储存要求放入液氮罐中进行冻存。
实施例二，一种造血干细胞冻存液及造血干细胞冻存方法，所述冻存液由冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白组成，所述冷冻保护剂由以下成分组成：
二甲基亚砜、羟乙基淀粉、生理盐水、聚乙烯吡咯烷酮；
所述培养基由以下成分组成：萝卜糖、氨基酸、胎羊血清和运铁蛋白；
所述冷冻保护剂包括以下重量份成分：二甲基亚砜25ml、羟乙基淀粉5g、生理盐水15ml、聚乙烯吡咯烷酮5g；
所述培养基包括以下重量份成分：萝卜糖1.5g、氨基酸25g、胎羊血清20g、运铁蛋白5g。
所述冻存方法包括以下步骤：
步骤1：按比例1:4:1.2分别称得各比例的冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白；
步骤2：准备一个消毒过的注射器，抽取步骤1称得的组成成分，注入密封容器内，摇晃容器2～3min，使各成分相互混合，形成细胞悬液；
步骤3：将步骤2中含有的细胞悬液的密封容器至于冷冻袋内，袋口密封；
步骤4：将冷冻带程序性降温至-80℃后，按储存要求放入液氮罐中进行冻存。
实施例三，一种造血干细胞冻存液及造血干细胞冻存方法，所述冻存液由冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白组成，所述冷冻保护剂由以下成分组成：
二甲基亚砜、羟乙基淀粉、生理盐水、聚乙烯吡咯烷酮；
所述培养基由以下成分组成：萝卜糖、氨基酸、胎羊血清；
所述冷冻保护剂包括以下重量份成分：二甲基亚砜20ml、羟乙基淀粉7g、生理盐水15ml、聚乙烯吡咯烷酮5g；
所述培养基包括以下重量份成分：萝卜糖0.8g、氨基酸20g、胎羊血清25g。
所述冻存方法包括以下步骤：
步骤1：按比例1:4:1分别称得各比例的冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白；
步骤2：准备一个消毒过的注射器，抽取步骤1称得的组成成分，注入密封容器内，摇晃容器2～3min，使各成分相互混合，形成细胞悬液；
步骤3：将步骤:2中含有的细胞悬液的密封容器至于冷冻袋内，袋口密封；
步骤4：将冷冻带程序性降温至-80℃后，按储存要求放入液氮罐中进行冻存。
实施例四，一种造血干细胞冻存液及造血干细胞冻存方法，所述冻存液由冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白组成，所述冷冻保护剂由以下成分组成：
二甲基亚砜、羟乙基淀粉、生理盐水、聚乙烯吡咯烷酮；
所述培养基由以下成分组成：萝卜糖、氨基酸、胎羊血清；
所述冷冻保护剂包括以下重量份成分：二甲基亚砜25ml、羟乙基淀粉7g、生理盐水15ml、聚乙烯吡咯烷酮5g；
所述培养基包括以下重量份成分：萝卜糖1g、氨基酸25g、胎羊血清20g。
所述冻存方法包括以下步骤：
步骤1：按比例1.2:4:1.2分别称得各比例的冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白；
步骤2：准备一个消毒过的注射器，抽取步骤1称得的组成成分，注入密封容器内，摇晃容器2～3min，使各成分相互混合，形成细胞悬液；
步骤3：将步骤:2中含有的细胞悬液的密封容器至于冷冻袋内，袋口密封；
步骤4：将冷冻带程序性降温至-80℃后，按储存要求放入液氮罐中进行冻存。
实施例五，一种造血干细胞冻存液及造血干细胞冻存方法，所述冻存液由冷冻保护剂、培养基和胎牛血清组成，所述冷冻保护剂由以下成分组成：
二甲基亚砜、羟乙基淀粉、生理盐水、聚乙烯吡咯烷酮；
所述培养基由以下成分组成：萝卜糖、氨基酸、人血清白蛋白；
所述冷冻保护剂包括以下重量份成分：二甲基亚砜25ml、羟乙基淀粉5g、生理盐水15ml、聚乙烯吡咯烷酮5g；
所述培养基包括以下重量份成分：萝卜糖0.5g、氨基酸25g、人血清白蛋白25g。
所述冻存方法包括以下步骤：
步骤1：按比例1:4:1分别称得各比例的冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白；
步骤2：准备一个消毒过的注射器，抽取步骤1称得的组成成分，注入容器内，轻度吹打2～2.5min，使各成分相互混合，形成细胞悬液；
步骤3：将步骤2中的细胞悬液的分装至2ml的冻存管中；
步骤4：将冻存管程序性降温至-80℃后，按储存要求放入-196℃液氮罐中进行冻存。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种造血干细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液由冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白组成，所述冷冻保护剂由以下成分组成：二甲基亚砜、羟乙基淀粉、生理盐水、聚乙烯吡咯烷酮；所述培养基由以下成分组成：萝卜糖、氨基酸、胎羊血清。
2.如权利要求1所述的一种造血干细胞冻存液，其特征在于，所述冷冻保护剂包括以下重量份成分：二甲基亚砜25ml、羟乙基淀粉5g、生理盐水15ml、聚乙烯吡咯烷酮5g。
3.如权利要求2所述的一种造血干细胞冻存液，其特征在于，所述培养基包括以下重量份成分：萝卜糖1.5g、氨基酸25g、胎羊血清20g。
4.如权利要求1～3任一所述的一种造血干细胞冻存液，其特征在于，所述造血干细胞冻存方法包括以下步骤：
步骤1：按比例1:4:1.2分别称得各比例的冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白；
步骤2：准备一个消毒过的注射器，抽取步骤1称得的组成成分，注入密封容器内，摇晃容器2～3min，使各成分相互混合，形成细胞悬液；
步骤3：将步骤:2中含有的细胞悬液的密封容器至于冷冻袋内，袋口密封；
步骤4：将冷冻带程序性降温至-80℃后，按储存要求放入液氮罐中进行冻存。
5.如权利要求3所述的一种造血干细胞冻存液，其特征在于，所述培养基内还有如下重量份成分：运铁蛋白5g。
6.如权利要求4所述的一种造血干细胞冻存液，其特征在于，按比例1:4:1分别称得各比例的冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白。
7.如权利要求4所述的一种造血干细胞冻存液，其特征在于，按比例1.2:4:1.2分别称得各比例的冷冻保护剂、培养基和人血清白蛋白。
8.如权利要求1所述的一种造血干细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液由冷冻保护剂、培养基和胎牛血清组成，所述培养基内的胎羊血清替换成人血清白蛋白，人血清白蛋白为以下重量份成分：人血清白蛋白25g。
9.如权利要求8所述的一种造血干细胞冻存液，其特征在于，所述冻存方法包括以下步骤：
步骤1：按比例1:4:1分别称得各比例的冷冻保护剂、培养基和胎牛血清；
步骤2：准备一个消毒过的注射器，抽取步骤1称得的组成成分，注入容器内，轻度吹打2～2.5min，使各成分相互混合，形成细胞悬液；
步骤3：将步骤2中的细胞悬液的分装至2ml的冻存管中；
步骤4：将冻存管程序性降温至-80℃后，按储存要求放入-196℃液氮罐中进行冻存。
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