CN109566601A - 一种软骨保存液及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种软骨保存液及其使用方法，软骨保存液包括磷酸二氢钾、组氨酸或组氨酸盐、乳糖醛酸、蔗糖、别嘌呤醇、低分子右旋糖酐‑40、NaCl、KCl、硫酸镁、青霉素、还原型谷胱苷肽、腺苷、海藻糖、儿茶素、维生素E和硫酸软骨素，溶剂为去离子水，pH值为7.35‑7.52，用于0‑4℃保存保存软骨。该软骨保存液及其使用方法能够保持关节软骨细胞的生物学活性并延缓关节软骨的退行性病变，为临床治疗大面积关节软骨缺损、进行软骨组织移植提供更多帮助。

Description

一种软骨保存液及其使用方法

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种软骨保存液及其使用方法。

背景技术

膝关节软骨组织作为一复合结构，其保存后移植的生物活性受到诸多因素的影响，因运动、创伤、肿瘤或其它病因引起的关节缺损是医学中治疗的难题。诸多学者都在探索一种简易安全的能够中长期保存软骨关节的方法，以使保存后膝关节软骨组织的生物力学影响、软骨细胞和血管内皮细胞超微结构变化达到更好的状况和生物活性。

运动损伤和骨性关节炎(是一种以关节软骨退行性变和关节周围骨质增生为病理性特征的慢性进行性骨关节病)极易导致膝关节软骨损伤，临床表现以关节的疼痛、僵硬、肿胀、畸形等功能障碍为主，易导致青少年和老年人疼痛和伤残，进而严重影响日常工作和生活。膝关节软骨损伤带来的持续软骨细胞凋亡、滑膜炎和骨破坏等致使患者病情进行性加重，随着医疗技术的发展和全民医保的覆盖，我国此类软骨损伤患者的生活和生存状况愈加受到重视。随着越来越多年轻的人口在竞技体育和休闲活动中的参与，所有年龄段的男人和女人都可能产生软骨病变，并会比以往更频繁的出现软骨病变导致的创伤后关节炎。如果针对这种情况不及时治疗，可能会导致到一个非常年轻患者的关节发生退化。关节损伤及所造成的关节损害在老年人中往往更严重，患者会常常抱怨疼痛、肿胀、无法进行日常生活活动等等。美国医学研究发现，损害身体的关节软骨正在成为美国人丧失运动能力的重大问题，包括五大体育联盟的职业运动员在内。即使现代社会的进步使人类的寿命更长，但也会同时造成更长久时间的痛苦。关节软骨损伤患者显著增多，然而关节软骨无神经和血管，其营养主要来源于滑液和滑膜血管的渗透作用，自身修复能力有限，因而如何好的修复关节软骨损伤成为亟待解决的医学难题。目前，临床上治疗关节软骨缺损的方法主要有微骨折法、组织工程治疗法、自体软骨细胞移植、关节置换、关节软骨移植法。

人工膝关节假体表明置换术是修复关节缺损的有效手段，但不适合于运动张力较大的青少年患者，采用同种异体骨与关节软骨移植进行重建已经是骨科学界较为常用的方法之一。但实施软骨组织保存后进行移植手术后同种关节软骨的退行性变仍是一个不可避免的问题。自体骨软骨移植因来源受限且进行二次手术而限制了此方法的临床应用。自体软骨细胞移植术因其软骨细胞培养费用高，难以在临床推广使用。而异体软骨移植因取材相对容易且不用二次手术的特点值得探究以及临床应用。而如何将从供体取下的异体骨软骨体外进行更长时间的保存，且仍具有良好的保存效果，成为众学者争相研究的焦点。

简易安全的中长期保存软骨液从基础理论及动物实验都取得了较大进步，通过一定比例的液体配制，针对软骨组织保存中细胞、纤维及组织损伤的基本机制有了更深入的了解和解决方法，在减少细胞水肿、减慢细胞间酶的反应和死亡速度、防止细胞酸化、防止细胞间隙膨胀、防止或减轻再灌注损伤方面都进行试验研究，并取得较好的效果。在临床上骨科医生现在可以为病人提供新的选择—软骨缺损的植入修复，为此类病人带来福音。但在软骨组织保存液的保存温度上仍存在低温的保存效果远远大于常温的保存效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种软骨保存液及其使用方法，能够保持关节软骨细胞的生物学活性并延缓关节软骨的退行性病变，为临床治疗大面积关节软骨缺损、进行软骨组织移植提供更多帮助。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种软骨保存液，包括磷酸二氢钾20-30mmol/L、组氨酸70～90mmol/L或组氨酸盐10～20mmol/L、乳糖醛酸75-95mmol/L、蔗糖50-70mmol/L、别嘌呤醇0.8-l.2mmol/L、低分子右旋糖酐40 45-55g/L、NaCl 45-55mmol/L、KCl25-35mmol/L、硫酸镁3-7mmol/L、青霉素70-90U/L、还原型谷胱苷肽2-4mmol/L、腺苷3-7mmol/L、海藻糖2-5g/L、儿茶素0.9-1.1mL/L、维生素E 190-210μg/L和硫酸软骨素90-110mg/L，溶剂为去离子水。

作为本发明的进一步改进，所述软骨保存液的pH值为7.35-7.52。

作为本发明的进一步改进，儿茶素含量为1mL/L，维生素E含量为200μg/L，硫酸软骨素含量为100mg/L。

作为本发明的进一步改进，组氨酸的含量为80mmol/L或组氨酸盐的含量为15mmol/L。

作为本发明的进一步改进，所述软骨保存液用于保存膝关节。

作为本发明的进一步改进，组氨酸盐为组氨酸盐酸盐。

所述的软骨保存液的使用方法，将软骨浸入软骨保存液，密封后在0-4℃保存。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的软骨保存液中，磷酸二氢钾、组氨酸或组氨酸盐酸盐作为有效的缓冲对，以防止细胞酸化；别嘌呤醇和低分子右旋糖酐-40防止细胞间隙膨胀，有效地减少从毛细血管到细胞外间隙之间的过多旁路，从而保证了保存液的成分运输；NaCl、KCl和硫酸镁减少细胞水肿减低细胞死亡率；还原型谷胱苷肽和腺苷用于钠泵活性的快速恢复及抗氧化以及细胞提供能量(ATP)的底物，为再灌注损伤的修复和激活能量利用进行反应；海藻糖对肌肉韧带提供更好保护，利于手术移植。加入1％硫酸软骨素使得保存的软骨细胞密度及存活率最高,且复温后厚度恢复最快。200μg/L维生素E能够使骨软骨块的弹性性能、承受剪应力的能力和时间依赖性变形率方面维持在新鲜骨软骨块的水平，在生化代谢活性及组织形态的维持上也更好。加入1mL/L儿茶酚能够提高4℃下保存2周以及进行动物移植4周移植物的细胞存活率、软骨基质的含量以及移植后的功能恢复。使用时，基质中蛋白多糖的含量显著增加，提高了骨软骨组织的细胞活性，软骨细胞多由G0期进入G1期，软骨细胞活性显著增加，碱性成纤维细胞生长因子能够促进关节软骨细胞的增殖和基质的代谢，从而缩短细胞周期，达到促进细胞分裂增殖的目的。本发明提供的软骨保存液，解决了关节软骨保存中的生物力学影响、软骨细胞和血管内皮细胞超微结构变化以及生物活性下降的难题，适用于所有年龄段人群可能产生的软骨病变、并会比以往更频繁的出现软骨病变导致的创伤后关节炎、进而发展为关节退化或缺损的情况。该软骨保存液可以较好的解决软骨组织保存后进行移植手术后同种关节软骨的退行性变的问题。

本发明提供的软骨保存液的使用方法，加入软骨后无需冷冻保藏，仅需0-4℃保存软骨，有利于减轻组织再灌注损伤。

附图说明

图1-1为保存液组用甲苯胺蓝染色观察软骨细胞细胞质和细胞外基质结果图。

图1-2为冷冻保存组用甲苯胺蓝染色观察软骨细胞细胞质和细胞外基质结果图。

图1-3为UW液组用甲苯胺蓝染色观察软骨细胞细胞质和细胞外基质结果图。

图1-4为对照组用甲苯胺蓝染色观察软骨细胞细胞质和细胞外基质结果图。

图2-1为保存液组用苏木精-伊红染色法染色观察结果图。

图2-2为冷冻保存组用苏木精-伊红染色法染色观察结果图。

图2-3为UW液组用苏木精-伊红染色法染色观察结果图。

图2-4为对照组用苏木精-伊红染色法染色观察结果图。

图3-1为保存液组用番红O染色观察结果图。

图3-2为冷冻保存组用番红O染色观察结果图。

图3-3为UW液组用番红O染色观察结果图。

图3-4为对照组用番红O染色观察结果图。

图4-1为保存液组在电镜下观察的软骨组织超微结构。

图4-2为冷冻保存组在电镜下观察的软骨组织超微结构。

图4-3为UW液组在电镜下观察的软骨组织超微结构。

图4-4为对照组在电镜下观察的软骨组织超微结构。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

每1000mL的膝关节软骨保存液含磷酸二氢钾20mmol、组氨酸80mmol、乳糖醛酸75mmol、蔗糖50mmol、别嘌呤醇0.8mmol、低分子右旋糖酐-40：45g、NaCl 45mmol、KCl25mmol、硫酸镁3mmol、青霉素70U、还原型谷胱苷肽2mmol、腺苷7mmol、海藻糖5g、儿茶素1mL、维生素E200μg、硫酸软骨素100mg、余量为去离子水，该膝关节软骨保存液的pH值为7.32-7.51。分装，封口，0-4℃保存。

实施例2

每1000mL的膝关节软骨保存液含磷酸二氢钾30mmol、组氨酸盐15mmol、乳糖醛酸95mmol、蔗糖7Ommol、别嘌呤醇l.2mmol、低分子右旋糖酐-40：55g、NaCl 55mmol、KCl35mmol、硫酸镁7mmol、青霉素90U、还原型谷胱苷肽4mmol、腺苷3mmol、海藻糖2g、儿茶素1mL、维生素E200μg、硫酸软骨素100mg、余量为去离子水，该膝关节软骨保存液的pH值为7.33-7.53。分装，封口，0-4℃保存。

实施例3

每1000mL的膝关节软骨保存液含磷酸二氢钾25mmol、组氨酸80mmol、乳糖醛酸80mmol、蔗糖60mmol、别嘌呤醇1mmol、低分子右旋糖酐-40：50g、NaCl 50mmol、KCl 30mmol、硫酸镁5mmol、青霉素80U、还原型谷胱苷肽3mmol、腺苷5mmol、海藻糖4g、儿茶素1mL、维生素E200μg、硫酸软骨素100mg、余量为去离子水，该膝关节软骨保存液的pH值为7.35-7.53。分装，封口，0-4℃保存。

实施例4

每1000mL的膝关节软骨保存液含磷酸二氢钾25mmol、组氨酸盐15mmol、乳糖醛酸85mmol、蔗糖65mmol、别嘌呤醇1mmol、低分子右旋糖酐-40：45g、NaCl 45mmol、KCl 25mmol、硫酸镁3mmol、青霉素70U、还原型谷胱苷肽2mmol、腺苷3mmol、海藻糖5g、儿茶素1mL、维生素E200μg、硫酸软骨素100mg、余量为去离子水，该膝关节软骨保存液的pH值为7.34-7.54。分装，封口，0-4℃保存。

实施例5

每1000mL的膝关节软骨保存液含磷酸二氢钾28mmol、组氨酸盐15mmol、乳糖醛酸85mmol、蔗糖65mmol、别嘌呤醇1.1mmol、低分子右旋糖酐-40：50g、NaCl 55mmol、KCl35mmol、硫酸镁7mmol、青霉素70U、还原型谷胱苷肽2mmol、腺苷3mmol、海藻糖2g、儿茶素1mL、维生素E200μg、硫酸软骨素100mg、余量为去离子水，该膝关节软骨保存液的pH值为7.35-7.55。分装，封口，0-4℃保存。

实施例6

每1000mL的膝关节软骨保存液含磷酸二氢钾27mmol、组氨酸80mmol、乳糖醛酸82mmol、蔗糖55mmol、别嘌呤醇0.9mmol、低分子右旋糖酐-40：50g、NaCl 51mmol、KCl28mmol、硫酸镁6mmol、青霉素90U、还原型谷胱苷肽4mmol、腺苷7mmol、海藻糖2g、儿茶素1mL、维生素E200μg、硫酸软骨素100mg、余量为去离子水，该膝关节软骨保存液的pH值为7.32-7.53。分装，封口，0-4℃保存。

实施例7

每1000mL的膝关节软骨保存液含磷酸二氢钾29mmol、组氨酸盐15mmol、乳糖醛酸88mmol、蔗糖67mmol、别嘌呤醇1mmol、低分子右旋糖酐-40：52g、NaCl 52mmol、KCl 30mmol、硫酸镁6mmol、青霉素80U、还原型谷胱苷肽3mmol、腺苷5mmol、海藻糖4g、儿茶素1mL、维生素E200μg、硫酸软骨素100mg、余量为去离子水，该膝关节软骨保存液的pH值为7.35-7.54。分装，封口，0-4℃保存。

本发明中磷酸二氢钾、组氨酸或组氨酸盐酸作为有效的缓冲对，以防止细胞酸化；别嘌呤醇和低分子右旋糖酐-40防止细胞间隙膨胀，有效地减少从毛细血管到细胞外间隙之间的过多旁路，从而保证了保存液的成分运输；NaCl、KCl和硫酸镁减少细胞水肿减低细胞死亡率；还原型谷胱苷肽和腺苷用于钠泵活性的快速恢复及抗氧化以及细胞提供能量(ATP)的底物，为再灌注损伤的修复和激活能量利用进行反应；海藻糖对肌肉韧带提供更好保护，利于手术移植。调pH值到7.45±0.10使保存液呈弱碱性、0-4℃保存有利于减轻组织再灌注损伤。研究发现抗冻剂中含时1％硫酸软骨素时,保存的软骨细胞密度及存活率最高,且复温后厚度恢复最快。培养液(EMEM)中加入200μg维生素E，4℃条件下培养30d能够使骨软骨块的弹性性能、承受剪应力的能力和时间依赖性变形率方面维持在新鲜骨软骨块的水平，在生化代谢活性及组织形态的维持上较对照组也有更好的结果。加入1mL EGCE能够提高4℃下保存2周以及进行动物移植4周移植物的细胞存活率、软骨基质的含量以及移植后的功能恢复。基质中蛋白多糖的含量显著增加，提高了骨软骨组织的细胞活性，软骨细胞多由G0期进入G1期，软骨细胞活性显著增加，碱性成纤维细胞生长因子能够促进关节软骨细胞的增殖和基质的代谢，从而缩短细胞周期，达到促进细胞分裂增殖的目的。

实施例8

将新鲜羊膝关节软骨组织分别用本发明的保存液(保存液组)、传统的-80℃冷冻保存(冷冻保存组)、器官保存液(UW液组)及4℃常规保存(对照组)进行对照处理，再在第4周时间进行对照，采用软骨组织标本大体观察及免疫组织化学法观察、电子显微镜拍照得到的结果：

外在形态方面：保存液组关节无肿胀、充血，软骨组织标本呈白色，半透明状，光滑而有光泽；冷冻保存组关节轻微肿胀，无充血，软骨组织标本呈白色，关节面光滑度下降；UW液组关节软骨组织标本表面略有破坏，软骨细胞形态较规则，部分细胞染色质分布不均匀；对照组关节肿胀、充血明显，关节面粗糙，表面变薄、有轻度破损现象，部分软骨组织标本表面出现小裂隙。

免疫组织化学法观察结果：

参见图1-1(保存液组)、图1-2(冷冻保存组)、图1-3(UW液组)和图1-4(对照组)，甲苯胺蓝染色观察软骨细胞，观察细胞质和细胞外基质结果显示，与应用本发明的软骨保存液的保存液组比较，对照组软骨组织损伤严重，部分软骨细胞肿胀，软骨表面失去连续性，软骨细胞基质紊乱、破坏严重；冷冻保存组和UW液组软骨细胞形态完整、细胞质及细胞浆染色均一，两组在维持正常软骨表面形态、细胞质及细胞浆方面略好于对照组，较之保存液组效果略差。

参见图2-1(保存液组)、图2-2(冷冻保存组)、图2-3(UW液组)和图2-4(对照组)，苏木精-伊红染色法(HE染色)表明：保存液组软骨组织标本表面较完整，细胞膜完整，细胞质丰富而染色浅，细胞核呈椭圆形，染色质分布均匀；冷冻保存组软骨组织标本表面略有破坏，软骨细胞形态较规则，部分细胞染色质分布不均匀；UW液组软骨组织标本光滑度较好，凋亡细胞数量较少；对照组可见部分软骨细胞膜破裂，细胞排列稍紊乱，个别细胞呈多形性改变、细胞质少而染色质分布不均。

参见图3-1(保存液组)、图3-2(冷冻保存组)、图3-3(UW液组)和图3-4(对照组)，四组软骨细胞和基质被番红O均染成红色，番红O染色与多聚阴离子(硫酸软骨素和硫酸角质素)的浓度成正比。染色结果提示，在软骨组织蛋白聚糖的含量和分布方面，保存液组、冷冻组、UW液组及对照组所保留的软骨蛋白聚糖量呈逐渐降低趋势，其中保存液组最优，对照组所软骨组织蛋白聚糖分布不均匀且含量较另三组少。

参见图4-1(保存液组)、图4-2(冷冻保存组)、图4-3(UW液组)和图4-4(对照组)，电镜下观察各组软骨组织超微结构，200倍电镜下均显示保存液组标本组织表面完整度和其余三组差异大，200倍电镜下显示冷冻保存组、UW液组及对照组标本表面不同程度失去平整性，且部分区域暴露出胶原纤维束；保存液组软骨组织标本表面形态维持较完整；胶原纤维完整性及粗细均匀方面能得到更好的维持。

综上，参见图1-1、图2-1、图3-1和图4-1，保存液组软骨组织标本表面较完整，光滑度较好，软骨细胞形态规则，胞膜完整，胞质丰富，软骨细胞数量多，胞核呈椭圆形，染色质分布均匀；

参见图1-2、图2-2、图3-2和图4-2，冷冻保存组软骨细胞形态较规则，胞膜完整，细胞数量略减少；

参见图1-3、图2-3、图3-3和图4-3，UW组软骨组织标本表面略有破坏，软骨细胞形态较规则，部分细胞染色质分布不均匀；

参见图1-4、图2-4、图3-4和图4-4，对照组可见部分软骨细胞膜破裂，细胞排列稍紊乱，视野下可见核消失，染色不均匀。

由本发明保存液组的关节变化速度明显小于传统的冷冻保存组和UW液组。相对应的是，膝关节软骨组织的保存周期随之变长，对临床治疗中的膝关节软骨移植方面具有重要的意义。

Claims (7)

1.一种软骨保存液，其特征在于，包括磷酸二氢钾20-30mmol/L、组氨酸70～90mmol/L或组氨酸盐10～20mmol/L、乳糖醛酸75-95mmol/L、蔗糖50-70mmol/L、别嘌呤醇0.8-l.2mmol/L、低分子右旋糖酐40 45-55g/L、NaCl 45-55mmol/L、KCl 25-35mmol/L、硫酸镁3-7mmol/L、青霉素70-90U/L、还原型谷胱苷肽2-4mmol/L、腺苷3-7mmol/L、海藻糖2-5g/L、儿茶素0.9-1.1mL/L、维生素E 190-210μg/L和硫酸软骨素90-110mg/L，溶剂为去离子水。

2.如权利要求1所述的软骨保存液，其特征在于，所述软骨保存液的pH值为7.35-7.52。

3.如权利要求1所述的软骨保存液，其特征在于，儿茶素含量为1mL/L，维生素E含量为200μg/L，硫酸软骨素含量为100mg/L。

4.如权利要求1所述的软骨保存液，其特征在于，组氨酸的含量为80mmol/L或组氨酸盐的含量为15mmol/L。

5.如权利要求1所述的软骨保存液，其特征在于，所述软骨保存液用于保存膝关节。

6.如权利要求1所述的软骨保存液，其特征在于，组氨酸盐为组氨酸盐酸盐。

7.权利要求1～6任一项所述的软骨保存液的使用方法，其特征在于，将软骨浸入软骨保存液，密封后在0-4℃保存。