CN105532644A - 淋巴细胞的冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种淋巴细胞的冻存方法，属于生物技术领域。本发明的冻存方法包括如下步骤：将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵的分离液加入到离心管中；将抗凝剂处理过的外周血或脐带血中加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释后平铺在所述分离液上，离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；配制冻存液：将12％DMSO+10％右旋糖酐+18％所述上层血浆+1％海藻糖+59％注射用生理盐水混合作为冻存液；将所述淋巴细胞与所述冻存液按0.9～1.1:1的比例混匀，分装于细胞冻存管中。本发明的分离液的组分与冻存液组分部分接近，减少外源物质对细胞的伤害，提高安全性。

Description

淋巴细胞的冻存方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于外周血或脐带血分离的淋巴细胞的冻存方法。
背景技术
淋巴细胞作为一种效应细胞，广泛存在于人外周血液、骨髓或人脐带血中。高纯度的淋巴细胞的获取对于疾病的细胞学诊断、成分输血、治疗用细胞产品的制备等具有非常重要的意义。在临床应用过程中，常见的问题是很难保证提供足够数量的淋巴细胞。针对该问题目前常用的做法是，利用低温冻存技术保存外周血或脐带血个细胞，在需要时复苏并诱导培养为各种免疫细胞。但冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。
为了将冻存过程中细胞的损伤降至最低，使细胞复苏时存活率最高，最佳的冷冻条件是尽可能地降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤。因此需要采取缓慢冷冻、加入冷冻保护剂排除水分、在尽可能低的温度下保存细胞、快速复苏等方法来达到对细胞产生最低损伤的目的，其中冷冻保护剂的作用十分重要。常用的冷冻保护剂主要有甘油、二甲基亚砜(DMSO)等渗透性试剂，以及羟乙基淀粉(HES)、白蛋白和聚乙二醇(PEG)等非渗透性试剂，目前常用的是DMSO。
现有技术中，细胞冻存复苏后的存活率通常在70％-90％之间。细胞冻存复苏后的存活率可能会受到细胞采集、分离、冻存等过程的影响。因此，为提供足够量的淋巴细胞，现有技术中细胞冻存复苏后的存活率仍需进一步提高，同时也应避免回输给患者时出现恶心、呕吐或过敏等不良反应，提高安全性。
因此，有必要提供一种能够有效提高细胞冻存复苏后的存活率、提高回输到患者的细胞的安全性的冻存方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够有效提高细胞冻存复苏后的存活率、提高回输到患者的细胞的安全性的淋巴细胞的冻存方法。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
一方面，提供一种淋巴细胞的冻存方法，包括如下步骤：
1)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵的分离液加入到离心管中；
2)将抗凝剂处理过的外周血或脐带血中加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释后平铺在所述分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)配制冻存液：将12％DMSO+10％右旋糖酐+18％所述上层血浆+1％海藻糖+59％注射用生理盐水混合作为冻存液；
4)将所述淋巴细胞与所述冻存液按0.9～1.1:1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；
5)将所述细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
本发明中涉及的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高；本发明使用的分离液包含海藻糖、超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵，海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于红细胞的沉淀；利用本发明的分离液对血液样品进行离心处理后，淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离心力及本发明组合物的作用下分布在离心管底和分离介质层；本发明使用的分离液冻存方法首先从分离单个细胞开始，并将上层血浆作为冻存液的一部分，右旋糖酐作为替代血浆，减少免疫反应，使用DMSO、海藻糖降低低温对细胞的伤害，而且分离液的组分与冻存液组分部分接近，进一步减少外源物质对细胞的伤害，提高安全性。
进一步地，所述淋巴细胞与所述冻存液的按1:1的比例混匀。
进一步地，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐2～4重量份，海藻糖5～7重量份，超低粘度海藻酸钠0.5～1重量份，泛影葡胺3～5重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.04～0.1重量份，L-缬氨酸0.008-0.01重量份和L-亮氨酸0.009-0.012重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
本发明分离液中的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于红细胞的沉淀；L-缬氨酸、L-亮氨酸在保持淋巴细胞活性的基础上对提高分离淋巴细胞分离率也具有一定的帮助；本发明的分离液对于获得高纯度的淋巴细胞具有重要意义；本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高。
进一步地，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐2.5～3.5重量份，海藻糖5.5～6.5重量份，超低粘度海藻酸钠0.6～0.9重量份，泛影葡胺3.5～4.5重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.06～0.09重量份，L-缬氨酸0.008-0.01重量份和L-亮氨酸0.009-0.012重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
优选地，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐3重量份，海藻糖6重量份，超低粘度海藻酸钠0.8重量份，泛影葡胺4重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.08重量份，L-缬氨酸0.009重量份和L-亮氨酸0.011重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
进一步地，所述右旋糖酐为Dextran70。
进一步地，所述分离液的密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。
综上所述，本发明的有益效果表现为：
本发明中涉及的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高；本发明使用的分离液包含海藻糖、超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵，海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于红细胞的沉淀；利用本发明的分离液对血液样品进行离心处理后，淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离心力及本发明组合物的作用下分布在离心管底和分离介质层；本发明使用的分离液冻存方法首先从分离单个细胞开始，并将上层血浆作为冻存液的一部分，右旋糖酐作为替代血浆，减少免疫反应，使用DMSO、海藻糖降低低温对细胞的伤害，而且分离液的组分与冻存液组分部分接近，进一步减少外源物质对细胞的伤害，提高安全性。
具体实施方式
为使本发明的实施例要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。但本发明绝非限于这些例子。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用以解释本发明，并不能因此而理解为本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
实施例一
1)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵的分离液加入到离心管中；
2)将抗凝剂处理过的外周血或脐带血中加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释后平铺在分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)配制冻存液：将12％DMSO+10％右旋糖酐+18％上层血浆+1％海藻糖+59％注射用生理盐水混合作为冻存液；
4)将淋巴细胞与冻存液按0.9～1.1:1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；
5)将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐4g，海藻糖5g，超低粘度海藻酸钠0.5g，泛影葡胺5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1g，L-缬氨酸0.01g和L-亮氨酸0.009g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例二
1)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵的分离液加入到离心管中；
2)将抗凝剂处理过的外周血或脐带血中加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释后平铺在分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)配制冻存液：将12％DMSO+10％右旋糖酐+18％上层血浆+1％海藻糖+59％注射用生理盐水混合作为冻存液；
4)将淋巴细胞与冻存液按0.9～1.1:1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；
5)将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐2.5g，海藻糖7g，超低粘度海藻酸钠1g，泛影葡胺3g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.04g，L-缬氨酸0.009g和L-亮氨酸0.012g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例三
1)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵的分离液加入到离心管中；
2)将抗凝剂处理过的外周血或脐带血中加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释后平铺在分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)配制冻存液：将12％DMSO+10％右旋糖酐+18％上层血浆+1％海藻糖+59％注射用生理盐水混合作为冻存液；
4)将淋巴细胞与冻存液按0.9～1.1:1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；
5)将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐2g，海藻糖5.5g，超低粘度海藻酸钠0.6g，泛影葡胺4.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.09g，L-缬氨酸0.01g和L-亮氨酸0.011g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例四
1)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵的分离液加入到离心管中；
2)将抗凝剂处理过的外周血或脐带血中加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释后平铺在分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)配制冻存液：将12％DMSO+10％右旋糖酐+18％上层血浆+1％海藻糖+59％注射用生理盐水混合作为冻存液；
4)将淋巴细胞与冻存液按0.9～1.1:1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；
5)将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.5g，海藻糖6.5g，超低粘度海藻酸钠0.9g，泛影葡胺3.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.06g，L-缬氨酸0.009g和L-亮氨酸0.01g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例五
1)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵的分离液加入到离心管中；
2)将抗凝剂处理过的外周血或脐带血中加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释后平铺在分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)配制冻存液：将12％DMSO+10％右旋糖酐+18％上层血浆+1％海藻糖+59％注射用生理盐水混合作为冻存液；
4)将淋巴细胞与冻存液按0.9～1.1:1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；
5)将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐2.8g，海藻糖6.2g，超低粘度海藻酸钠0.9g，泛影葡胺4.2g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.07g，L-缬氨酸0.009g和L-亮氨酸0.011g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例六
1)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵的分离液加入到离心管中；
2)将抗凝剂处理过的外周血或脐带血中加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释后平铺在分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)配制冻存液：将12％DMSO+10％右旋糖酐+18％上层血浆+1％海藻糖+59％注射用生理盐水混合作为冻存液；
4)将淋巴细胞与冻存液按0.9～1.1:1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；
5)将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.3g，海藻糖5.8g，超低粘度海藻酸钠0.76g，泛影葡胺3.8g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.09g，L-缬氨酸0.01g和L-亮氨酸0.01g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例七
1)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵的分离液加入到离心管中；
2)将抗凝剂处理过的外周血或脐带血中加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释后平铺在分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)配制冻存液：将12％DMSO+10％右旋糖酐+18％上层血浆+1％海藻糖+59％注射用生理盐水混合作为冻存液；
4)将淋巴细胞与冻存液按0.9～1.1:1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；
5)将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐2.5g，海藻糖5.4g，超低粘度海藻酸钠0.8g，泛影葡胺3.7g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.05g，L-缬氨酸0.01g和L-亮氨酸0.012g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例八
1)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵的分离液加入到离心管中；
2)将抗凝剂处理过的外周血或脐带血中加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释后平铺在分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)配制冻存液：将12％DMSO+10％右旋糖酐+18％上层血浆+1％海藻糖+59％注射用生理盐水混合作为冻存液；
4)将淋巴细胞与冻存液按0.9～1.1:1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；
5)将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3g，海藻糖6g，超低粘度海藻酸钠0.8g，泛影葡胺4g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.08g，L-缬氨酸0.009g和L-亮氨酸0.011g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例一
1)将分离液加入到离心管中；
2)将抗凝剂处理过的外周血或脐带血中加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释后平铺在分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)配制冻存液：将12％DMSO+10％右旋糖酐+18％上层血浆+60％注射用生理盐水混合作为冻存液；
4)将淋巴细胞与冻存液按0.9～1.1:1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；
5)将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.6g，羟乙基淀粉1.3g和泛影葡胺9g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例二
1)将分离液加入到离心管中；
2)将抗凝剂处理过的外周血或脐带血中加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释后平铺在分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)配制冻存液：将12％DMSO+10％右旋糖酐+18％上层血浆+60％注射用生理盐水混合作为冻存液；
4)将淋巴细胞与冻存液按0.9～1.1:1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；
5)将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.6g，超低粘度海藻酸钠1.3g和泛影葡胺9g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例三
1)将分离液加入到离心管中；
2)将抗凝剂处理过的外周血或脐带血中加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释后平铺在分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)配制冻存液：将12％DMSO+10％右旋糖酐+18％上层血浆+60％注射用生理盐水混合作为冻存液；
4)将淋巴细胞与冻存液按0.9～1.1:1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；
5)将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的葡聚糖T50020g，羟乙基淀粉2g，泛影葡胺2.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1g和聚乙烯吡咯烷酮2.5g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例四
1)将常规Ficoll400分离液加入到离心管中；
2)将抗凝剂处理过的外周血或脐带血中加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释后平铺在分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)配制冻存液：将12％DMSO+10％右旋糖酐+18％上层血浆+1％海藻糖+59％注射用生理盐水混合作为冻存液；
4)将淋巴细胞与冻存液按0.9～1.1:1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；
5)将细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
在上述实施例中，分离液的主要特征参数均在以下范围内：密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。对比例一至四的分离液的主要特征参数均在以下范围内：密度为1.065～1.090g/cm3，渗透压为275～320smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。可以将本发明配制的分离液贮藏于密闭的无菌玻璃或塑料容器内避光保存备用。
为了验证本发明的冻存的单个细胞复苏后的存活率，将冻存的单个细胞从液氮罐中取出一管已冻存的单个细胞，迅速置于37℃水浴中1min，使PBMC完全融化，取少量细胞检测单个细胞的存活率，结果表明实施例一至八获得的淋巴细胞存活率在95％以上，纯度在93％以上，而对比例一至四获得的淋巴细胞存活率均在82％以下，纯度低于85％。
将复苏后的淋巴细胞接种于6孔板(美国CELLSTAR公司)上，通过典型的CIK细胞培养流程进行培养，培养持续14至28天。期间，对培养过程中的细胞增殖、形态学(细胞形态、增殖团出现时间与大小)、表面标记物(CD3+CD56+双阳性细胞比例)及杀瘤活性测试四项指标进行测试，结果表明，本发明实施例一至八复苏后的淋巴细胞，在经过典型的CIK细胞培养后，在增殖、形态学(细胞形态、增殖团出现时间与大小)、表面标记物(CD3+CD56+双阳性细胞比例)及杀瘤活性测试四项指标中明显优于对比例一至四，尤其是杀瘤活性测试中，本发明冻存复苏后的免疫细胞的杀瘤活性与对比例获得的免疫细胞相比至少提高了15％，实施例八的效果尤其显著，提高了20％。
上述超低粘度海藻酸钠属低分子化合物，粘度较低，1％的水溶液的粘度与水接近，在医药领域具有降压、降脂的功效。
本发明中涉及的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高；本发明使用的分离液包含海藻糖、超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵，海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于红细胞的沉淀；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于红细胞的沉淀；利用本发明的分离液对血液样品进行离心处理后，淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离心力及本发明组合物的作用下分布在离心管底和分离介质层；本发明使用的分离液冻存方法首先从分离单个细胞开始，并将上层血浆作为冻存液的一部分，右旋糖酐作为替代血浆，减少免疫反应，使用DMSO、海藻糖降低低温对细胞的伤害，而且分离液的组分与冻存液组分部分接近，进一步减少外源物质对细胞的伤害，提高安全性。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种淋巴细胞的冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和聚二烯丙基二甲基氯化铵的分离液加入到离心管中；
2)将抗凝剂处理过的外周血或脐带血中加入等体积的生理盐水或无血清培养基稀释后平铺在所述分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取上层血浆备用，吸取白膜层细胞获得淋巴细胞；
3)配制冻存液：将12％DMSO+10％右旋糖酐+18％所述上层血浆+1％海藻糖+59％注射用生理盐水混合作为冻存液；
4)将所述淋巴细胞与所述冻存液按0.9～1.1:1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；
5)将所述细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。
2.根据权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，所述淋巴细胞与所述冻存液的按1:1的比例混匀。
3.根据权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐2～4重量份，海藻糖5～7重量份，超低粘度海藻酸钠0.5～1重量份，泛影葡胺3～5重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.04～0.1重量份，L-缬氨酸0.008-0.01重量份和L-亮氨酸0.009-0.012重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
4.根据权利要求3所述的冻存方法，其特征在于，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐2.5～3.5重量份，海藻糖5.5～6.5重量份，超低粘度海藻酸钠0.6～0.9重量份，泛影葡胺3.5～4.5重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.06～0.09重量份，L-缬氨酸0.008-0.01重量份和L-亮氨酸0.009-0.012份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
5.根据权利要求4所述的冻存方法，其特征在于，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐3重量份，海藻糖6重量份，超低粘度海藻酸钠0.8重量份，泛影葡胺4重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.08重量份，L-缬氨酸0.009重量份和L-亮氨酸0.011重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
6.根据权利要求1至5任一所述的冻存方法，其特征在于，所述右旋糖酐为Dextran70。
7.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，所述分离液的密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。
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