CN108531446A - 一种精子梯度离心液及其配制方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于辅助生殖领域，具体涉及一种精子梯度离心液及其配制方法。本发明的精子梯度离心液采用HEPES+MOPS双缓冲体系调控精子梯度离心液的pH，pH更稳定；精子梯度离心液中添加关键原料卵磷脂，激发精子活力，修复和减小精子损伤。本发明的精子梯度离心液筛选的精子活力强，正常形态率更高，为后续的体外受精做好充分准备。

Description

一种精子梯度离心液及其配制方法

技术领域

本发明属于辅助生殖领域，具体涉及一种精子梯度离心液及其配制方法。

背景技术

体外受精(In Vitro Fertilization)是指人的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为IVF。有很大一部分人由于身体条件的原因无法自然受孕，这就需要借助体外受精-胚胎移植，即俗称的试管婴儿技术来进行生殖。一项调查数据显示，我国的不孕不育率从20年前的2.5％-3％攀升到12.5％-15％。我国每年出生的新生儿数量约为1600万，按12.5％-15％的不孕不育率计算，理论上每年有200-240万新生儿因为不孕不育无法出生，随着二胎政策的放开，我国的辅助生殖将会是一个规模在1000亿左右的市场。不孕不育的原因有很多，男性不育主要是由于精子活力下降引起。现代辅助生殖技术实践证明通过精子梯度离心优选活力更强的精子可提高生殖能力。

密度梯度离心借助活动精子的运动能力和各类细胞的密度差异来分离精子，使精子在试管底部形成松软的沉淀，可得到质量良好的精子，没有白细胞、不成熟生殖细胞等污染，常用于IVF(体外受精)/ICSI(卵胞浆内单精子显微注射技术)精液标本的制备。最常用的是由40％的上层和80％的下层组成的两层密度梯度离心方法。首先，将取得的富集活动精子尽快用洗涤液稀释，在精液刚射出时，迅速稀释、去除尽可能多的不必要的甚至是有害的成分，包括精浆、死的精子、炎症细胞、抗精子抗体和微生物。接着将稀释的精液以1000-2000转/分离心10分钟，使精子沉淀于试管底部，移去上清液，剩余0.5-1ml；最后加入少许加精子洗涤液调节精子浓度。此即可作受精之用。

Perecoll梯度离心精子洗涤技术是根据精液不液化、抗体分布程度，针对病症进行治疗。该技术采用目前世界上最为先进的Perecoll超能精子洗涤液，避免了以往使用的洗涤液会有杀灭精子的弊端。然而，一方面，精子梯度离心液的pH对精子活力有着重要的影响。大多数精子梯度离心液使用的缓冲液为HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，单一缓冲体系pH缓冲能力有限，pH波动较大；另一方面，一般精子梯度离心液依靠添加葡萄糖使精子获能，但并不能降低离心对精子造成的物理损伤。受精过程中，精子需靠顶体穿过卵细胞的透明带进行受精，因此优选精子的完整性显得至关重要。

因此开发一种减少梯度离心过程对精子损伤的精子梯度离心液，保持筛选获得精子的完整性及活力程度。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种精子梯度离心液的保护体系，其能够减小精子在离心过程中受到的物理损伤，保持精子的完整性。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种精子梯度离心液的保护体系，其包含卵磷脂。

一般精子梯度离心液依靠添加葡萄糖使精子获能，但并不能降低离心对精子造成的物理损伤。受精过程中，精子需考顶体穿过卵细胞的透明带进行受精。优选精子的完整性显得至关重要。

针对此问题，本发明在精子梯度离心液中添加关键原料卵磷脂，激发精子活力，修复和减小精子损伤。

作为优选的方案，上述保护体系中卵磷脂浓度为30-100mg/L。

本发明的目的之二在于提供一种精子梯度离心液的缓冲体系，其能够提供更为稳定的pH值，减小pH的波动范围。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种精子梯度离心液的缓冲体系，其同时包含MOPS(3-(N-吗啉)丙磺酸)和HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)。

MOPS和HEPES均为以胺基磺酸为基础的两性离子，作为两性电解质，能够提供较为稳定的pH梯度。传统的精子梯度离心液中多采用HEPES缓冲对。

本发明人员发现MOPS和HEPES结合使用，能控制pH在更窄的范围内，同等浓度下比单一的缓冲对有更强的缓冲能力。因此使用MOPS和HEPES缓冲体系，能够为精子提供更为稳定的环境，减小精子的应激效应，为后续的IVF做好准备。

作为优选的方案，上述缓冲体系中MOPS、HEPES浓度分别为3.85-4.30mmol/L、8-12mmol/L。

本发明的目的之三在于提供一种精子梯度离心液的缓冲保护体系，其能够保持pH稳定，同时减小精子在离心过程中受到的物理损伤，保持精子的活力和完整性。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种精子梯度离心液的缓冲保护体系，其包含缓冲体系和卵磷脂，其中缓冲体系同时包含MOPS和HEPES。

作为优选的方案，上述体系中卵磷脂浓度为30-100mg/L。

作为优选的方案，上述缓冲体系中MOPS、HEPES浓度分别为3.85-4.30mmol/L、8-12mmol/L。

本发明的缓冲保护体系采用HEPES+MOPS双缓冲液调控精子梯度离心液的pH，pH更稳定；并添加关键原料卵磷脂，激发精子活力，修复和减小精子损伤。

本发明的目的之四在于提供一种精子梯度离心液，其具有优于传统精子梯度离心液的特性，获得的精子活力更强，完整性更好。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

目的一～三任一项的体系用于制备的精子梯度离心液。

作为优选的方案，除目的一～三任一项的体系外，上述精子梯度离心液还包含基础体系和Percoll，按Percoll质量分数，上述精子梯度离心液分为两种溶液，分别为Percoll 40％-45％溶液和Percoll 80％-90％溶液；

其中Percoll为体表裹以聚乙烯吡咯烷酮的二氧化硅悬浮体；

其中基础体系包含钠、钾、钙、镁离子，以及葡萄糖、丙酮酸钠、甘氨酸和谷氨酰胺。

进一步，优选地，上述基础体系成分为：以水为基质，丙酮酸钠10.51mmol/L，葡萄糖1mmol/L，丙氨酰谷氨酰胺27.49mmol/L，硫酸镁1mmol/L，庆大霉素50mg/L，碳酸氢钠0.64mmol/L，氯化钠99.93mmol/L，牛磺酸0.48mmol/L，氯化钾5.53mmol/L，磷酸钾0.15mmol/L，甘氨酸0.25mmol/L,谷氨酰胺0.73mmol/L，乳酸钙0.51mmol/L。

本发明的目的之五在于提供一种上述Percoll精子梯度离心液的制备方法，其添加了目的一～三任一项的体系。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

精子梯度离心液的制备方法，包含以下步骤：

1)配制基础体系；

2)在基础体系中添加目的一～三任一项的体系，并均分为两等份，标记为溶液1和溶液2；

3)在溶液1中添加Percoll，使Percoll质量分数达到40-45％；在溶液2中添加Percoll，使Percoll质量分数达到80-90％。

本发明的有益效果在于：本发明提供的精子梯度离心液，能够保持筛选获得精子的完整性及活力程度，获得的精子为后续受精做好准备。具体为：

1)采用HEPES+MOPS双缓冲液调控精子梯度离心液的pH，具有更强的缓冲能力，pH更稳定；

2)精子梯度离心液种添加关键原料卵磷脂，激发精子活力，修复和减小精子损伤。

具体实施方式

以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

精子梯度离心液基础体系配方：丙酮酸钠10.51mmol/L，葡萄糖1mmol/L，丙氨酰谷氨酰胺27.49mmol/L，硫酸镁1mmol/L，庆大霉素50mg/L，碳酸氢钠0.64mmol/L，氯化钠99.93mmol/L，牛磺酸0.48mmol/L，氯化钾5.53mmol/L，磷酸钾0.15mmol/L，甘氨酸0.25mmol/L,谷氨酰胺0.73mmol/L，乳酸钙0.51mmol/L。

关键原料包括A、B、C、D四种，其中：

A成分，Percoll，GE公司，货号17-0891-01

B成分，卵磷脂

C成分，HEPES(游离酸)

D成分，MOPS

对比实施例1精子梯度离心液1

1)以水为基质，根据基础配方配制基础液；

2)添加C成分10mmol/L，将溶液均分为2等份，标记为溶液1和溶液2；

3)在溶液1中添加A成分使其终浓度达到40％，标记为a1,在溶液2中添加A成分使其终浓度达到80％,标记为a2；

4)a1和a2分别进行过滤膜除菌。

对比实施例2精子梯度离心液2

1)以水为基质，根据基础配方配制基础液；

2)添加D组分4.10mmol/L，将溶液均分为2等份，标记为溶液1和溶液2；

3)在溶液1中添加A成分使其终浓度达到40％，标记为a1，在溶液2中添加A成分使其终浓度达到80％，标记为a2；

4)a1和a2分别进行过滤膜除菌。

实施例1精子梯度离心液3

1)以水为基质，根据基础配方配制基础液；

2)添加C成分10mmol/L和D组分4.10mmol/L，将溶液均分为2等份，标记为溶液1和溶液2；

3)在溶液1中添加A成分使其终浓度达到40％，标记为a1，在溶液2中添加A成分使其终浓度达到80％，标记为a2；

4)a1和a2分别进行过滤膜除菌。

实施例2精子梯度离心液4

1)以水为基质，根据基础配方配制基础液；

2)添加C成分10mmol/L和D组分4.10mmol/L，添加B组分30mg/L将溶液均分为2等份，标记为溶液1和溶液2，

3)在溶液1中添加A成分使其终浓度达到40％，标记为a1，在溶液2中添加A成分使其终浓度达到80％，标记为a2；

4)a1和a2分别进行过滤膜除菌。

实施例3精子梯度离心液5

1)以水为基质，根据基础配方配制基础液；

2)添加C成分10mmol/L和D组分4.10mmol/L，添加B组分100mg/L将溶液均分为2等份，标记为溶液1和溶液2，

3)在溶液1中添加A成分使其终浓度达到40％，标记为a1，在溶液2中添加A成分使其终浓度达到80％，标记为a2；

4)a1和a2分别进行过滤膜除菌。

实施例4精子梯度离心液6

1)以水为基质，根据基础配方配制基础液；

2)添加C成分10mmol/L和D组分4.10mmol/L，添加B组分60mg/L将溶液均分为2等份，标记为溶液1和溶液2，

3)在溶液1中添加A成分使其终浓度达到40％，标记为a1，在溶液2中添加A成分使其终浓度达到80％，标记为a2；

4)a1和a2分别进行过滤膜除菌。

实施例5精子梯度离心液指标检测

对实施例1、2和对比实施例1、2的精子梯度离心液进行理化及生物指标检测，结果见表1：

表1.精子梯度离心液理化及生物指标检测结果

从表1结果可知，HEPES+MOPS双缓冲体系较HEPES和MOPS缓冲液提供更为稳定的pH值，表明其缓冲能力更强，能为精子提供更为稳定的环境。

实施例4精子梯度离心液获得精子的功能指标分析

以CooperSage公司的精子分离液为对照组，其批号为17460208，成分包括：氯化钙、硫酸庆大霉素、葡萄糖、HEPES、人血清白蛋白、硫酸镁、酚红、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸钠、丙酮酸钠、血清替代物。

将对照组和实施例1～4、对比实施例1～2的精子梯度离心液用于离心精子，对筛选获得的精子进行功能指标的分析，具体如下：

1)在14ml试管中先加2ml a2，然后在其上方小心加入2ml a1,形成两层Percoll密度梯度分离柱；

2)将2ml液化精液加入分离柱上层,每层交界处均可见清晰的分界面；

3)300×g离心20min,将精液层和a1层吸去；

4)a2与4ml精子培养液混匀,300×g离心10min；

5)将上清液吸去,沉淀用2ml精子培养液混悬后用于精子功能指标的分析。

其中的a+b级：a级是快速向前运动的精子，b级是运动稍微缓慢一点的精子。

分析结果见表2：

表2精子密度，a+b级，正常形态率，绿色荧光精子率的结果(X±SD)(n＝31)

将实施例1与对照组数据对比分析，a+b级、正常形态率均具有显著性差异，表明本发明的HEPES+MOPS双缓冲体系用于精子梯度离心液，较传统精子梯度离心液，提高了精子活力程度以及筛选出更多正常形态的精子。

将实施例2与实施例1数据对比分析，a+b级、正常形态率均具有显著性差异，其中两组正常形态率的P值＜0.001。而实施例2与实施例1的精子梯度离心液比较，添加了卵磷脂，表明添加的卵磷脂对于精子正常形态的保持有较大贡献。

上述结果表明，采用HEPES+MOPS双缓冲体系调控的精子梯度离心液获得的精子较活力和完整度优于HEPES、MOPS缓冲体系和对照组的精子。当添加关键原料卵磷脂后，与不添加相比，获得精子活力和正常形态率更好的精子，用于后续的受精过程有更好效果。

因此，采用HEPES+MOPS双缓冲体系调控精子梯度离心液的pH，pH更稳定，精子梯度离心液种添加关键原料卵磷脂，激发精子活力，修复和减小精子损伤，获得活力和完整度更好的精子，为后续的受精过程做好准备。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种精子梯度离心液的保护体系，其特征在于，所述保护体系包含卵磷脂。

2.根据权利要求1所述的保护体系，其特征在于，所述保护体系中卵磷脂浓度为30-100mg/L。

3.一种精子梯度离心液的缓冲体系，其特征在于，所述缓冲体系同时包含MOPS和HEPES。

4.根据权利要求1所述的缓冲体系，其特征在于，所述缓冲体系中MOPS、HEPES浓度分别为3.85-4.30mmol/L、8-12mmol/L。

5.一种精子梯度离心液的缓冲保护体系，其特征在于，所述保护体系包含缓冲体系和卵磷脂，所述缓冲体系同时包含MOPS和HEPES。

6.根据权利要求5所述的缓冲保护体系，其特征在于，所述体系中MOPS、HEPES、卵磷脂浓度分别为3.85-4.30mmol/L、8-12mmol/L、30-100mg/L。

7.权利要求1-6任一项所述的体系用于制备的精子梯度离心液。

8.根据权利要求7所述的精子梯度离心液，其特征在于，所述精子梯度离心液还包含基础体系和Percoll，按Percoll的质量分数，所述精子梯度离心液分为两种溶液，分别为Percoll 40％-45％溶液和Percoll 80％-90％溶液；

所述Percoll为体表裹以聚乙烯吡咯烷酮的二氧化硅悬浮体；

所述基础体系包含钠、钾、钙、镁离子，以及葡萄糖、丙酮酸钠、甘氨酸和谷氨酰胺。

9.根据权利要求8所述的精子梯度离心液，其特征在于，所述基础体系成分为：以水为基质，丙酮酸钠10.51mmol/L，葡萄糖1mmol/L，丙氨酰谷氨酰胺27.49mmol/L，硫酸镁1mmol/L，庆大霉素50mg/L，碳酸氢钠0.64mmol/L，氯化钠99.93mmol/L，牛磺酸0.48mmol/L，氯化钾5.53mmol/L，磷酸钾0.15mmol/L，甘氨酸0.25mmol/L,谷氨酰胺0.73mmol/L，乳酸钙0.51mmol/L。

10.权利要求8所述的精子梯度离心液的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

1)配制基础体系；

2)在基础体系中添加权利要求1-6任一项所述的体系，并均分为两等份，标记为溶液1和溶液2；

3)在溶液1中添加Percoll，使Percoll质量分数达到40-45％；在溶液2中添加Percoll，使Percoll质量分数达到80-90％。