BRPI0816375B1 - Composição para separação de espermatozóides de uma amostra de sêmen, métodos para preparar espermatozóides de uma amostra de sêmen de um animal não-humano, e para separar uma subpopulação de espermatozóides de interesse de uma amostra de sêmen de um animal não humano. - Google Patents
Composição para separação de espermatozóides de uma amostra de sêmen, métodos para preparar espermatozóides de uma amostra de sêmen de um animal não-humano, e para separar uma subpopulação de espermatozóides de interesse de uma amostra de sêmen de um animal não humano. Download PDFInfo
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Abstract
composição para separação de espermatozóides de uma amostra de sêmen, métodos para preparar espermatozóides de uma amostra de sêmen de um animal não-humano, e para separar uma subpopulação de espermatozóides de interesse de uma amostra de sêmen de um animal não humano a presente invenção refere-se ao campo da medicina veterinária, mais especificamente às composições e aos métodos úteis para processar sêmen de animal para uso em reprodução assistida. a invenção refere-se a uma composição para separação de espermatozóides de uma amostra de sêmen, compreendendo pelo menos um sal de um metal alcalino e/ou um metal alcalino-terroso, edta, um tampão zuiteriônico, partículas de sílica revestidas com silano e água, dita composição tendo um ph de 7,0- 7,35 e uma osmolaridade de 300-345 mosm. ademais ela se refere a um método para preparar espermatozóides de uma amostra de sêmen de um animal nãohumano, compreendendo a etapa de separar os espermatozóides dos outros constituintes do sêmen por centrifugação através de uma camada única de uma formulação de colóide. preferivelmente, a formulação de colóide é uma composição de acordo com a invenção. a invenção também se refere a um método para separar uma subpopulação de espermatozóides de interesse de uma amostra de sêmen de um animal não-humano, compreendendo as etapas de proporcionar um gradiente de densidade compreendendo pelo menos duas camadas de uma composição da invenção, cada camada tendo uma densidade diferente; separar as subpopulações de espermatozóides na amostra de sêmen por centrifugação através do gradiente de densidade; e selecionar a subpopulação de espermatozóides de interesse. finalmente, a invenção referese aos espermatozóides preparados com os métodos da invenção e ao uso de tais espermatozóides em inseminação artificial, fertilização in vitro ou injeção de esperma intracitoplásmica.
Description
“COMPOSIÇÃO PARA SEPARAÇÃO DE ESPERMATOZÓIDES DE UMA AMOSTRA DE SÊMEN, MÉTODOS PARA PREPARAR ESPERMATOZÓIDES DE UMA AMOSTRA DE SÊMEN DE UM ANIMAL NÃO-HUMANO, E PARA SEPARAR UMA SUBPOPULAÇÃO 5 DE ESPERMATOZÓIDES DE INTERESSE DE UMA AMOSTRA DE SÊMEN DE UM ANIMAL NÃO HUMANO”
Campo da invenção
A presente invenção refere-se ao campo da medicina veterinária, mais especificamente às composições e aos métodos úteis para 10 processar sêmen de animal para uso em reprodução assistida.
Fundamentos da invenção
Inseminação artificial (AI) tem sido usada em porcos e gado bovino leiteiro há várias décadas. Contudo, métodos de aperfeiçoar a qualidade de esperma em doses de esperma usadas para AI são exigidos por 15 várias razões: (i) para remover os espermatozóides de fatores inibidores em plasma seminal, e.g. fatores incapacitantes; (ii) para selecionar os espermatozóides maduros, normais e viáveis da população de esperma inteira no ejaculado; (iii) para separar os espermatozóides de fontes de espécies de oxigênio reativas que são prejudiciais para a sobrevivência do esperma. Estas 20 funções são normalmente realizadas pelo trato reprodutivo feminino durante o acasalamento natural mas pode ser parcialmente deficiente quando os espermatozóides são artificialmente inseminados. Ademais, quando os espermatozóides são para serem usados em fertilização in vitro, estes mecanismos de seleção estão completamente ausentes e os espermatozóides 25 precisam ser separados do plasma seminal antes do uso.
Inseminação artificial (AI) tem sido usada em porcos e gado bovino leiteiro há várias décadas. Contudo, métodos de aperfeiçoar a qualidade de esperma em doses de esperma usadas para AI são exigidos por
Petição 870180147296, de 01/11/2018, pág. 9/15 várias razões: (i) para remover os espermatozóides de fatores inibidores em plasma seminal, e.g. fatores incapacitantes; (ii) para selecionar os espermatozóides maduros, normais e viáveis da população de esperma inteira no ejaculado; (iii) para separar os espermatozóides de fontes de espécies de 5 oxigênio reativas que são prejudiciais para a sobrevivência do esperma. Estas funções são normalmente realizadas pelo trato reprodutivo feminino durante o acasalamento natural mas pode ser parcialmente deficiente quando os espermatozóides são artificialmente inseminados. Ademais, quando os espermatozóides são para serem usados em fertilização in vitro, estes 10 mecanismos de seleção estão completamente ausentes e os espermatozóides precisam ser separados do plasma seminal antes do uso.
Durante os últimos 15 anos, a técnica de centrifugação sobre gradiente de densidade tem sido usada para preparar espermatozóides de humano para uso em reprodução assistida (WHO, 1999). Originalmente, 15 partículas de sílica revestidas com poli(vinil-pirrolidona) eram usadas, mas formulações mais recentes têm utilizado partículas de sílica revestidas com silano no gradiente de densidade.
As suspensões de esperma preparadas são usadas imediatamente para fertilização in vitro, injeção de esperma intracitoplásmica 20 ou deposição intrauterina.
Formulações coloidais comercialmente disponíveis para preparar espermatozóides de humano e.g. Puresperm, (Nidacon Intemational AB) para reprodução assistida têm uma osmolaridade de 300-310 mOsm, de acordo com o website da companhia e a literatura promocional. Até agora, os 25 únicos produtos de gradiente de densidade comercialmente disponíveis para espermatozóides de animal citados na literatura têm uma osmolaridade dentro da faixa de 300-310 mOsm, e.g. Equipure e Bovipure (ambos fabricados por Nidacon Intemational). Embora Bovipure seja relatado para dar bons resultados quando usado para preparar espermatozóides bovinos para IVF (4), o uso de Equipure como um gradiente de densidade para espermatozóides de garanhão não dá os mesmos efeitos benéficos sobre a qualidade do esperma (5) como têm sido relatados para os espermatozóides de humano (6).
Preparação de amostras de sêmen de humano é comumente realizada em alíquotas de 1,5 mL de sêmen. Embora a preparação de sêmen de animal em tais volumes pequenos seja adequada para preparar espermatozóides para IVF ou ICSI, números de esperma muito maiores são necessários para inseminação artificial em animais. Consequentemente, há uma necessidade de métodos simples e convenientes para preparação de espermatozóides de sêmen de animal no sítio de coleta e em quantidades adequadas para uso em inseminação artificial. Também há a necessidade de composições específicas para animal adequadas para uso em tais métodos. Sumário da invenção
Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição para separação de espermatozóides de uma amostra de sêmen, compreendendo pelo menos um sal de um metal alcalino e/ou um metal alcalino-terroso, EDTA, um tampão zuiteriônico, partículas de sílica revestidas com silano e água, dita composição tendo um pH de 7,0-7,35 e uma osmolaridade de 300-345 mOsm.
Em uma modalidade deste aspecto, a composição compreende:
- cloreto de sódio em uma concentração de 97,5-140,0 mM
- cloreto de potássio em uma concentração de 4,0-5,5 mM
- glicose em uma concentração de 1,0-1,4 mM
- EDTA em uma concentração de 0,10-0,14 mM
- HEPES em uma concentração de 15,0-19,0 mM
- Citrato trissódico em uma concentração de 4,8-8,3 mM
- lactato em uma concentração de 0-4,0 mM; e
- partículas de sílica revestidas com silano em uma concentração de 300-1000 g/L.
Em uma outra modalidade deste aspecto, a composição tem um pH dentro da faixa de 7,10-7,25, preferivelmente cerca de 7,15, antes da autoclavagem. A composição adicionalmente preferivelmente tem uma osmolaridade de 320-345 mOsm, tal como 320-330 mOsm. O diâmetro médio das partículas de sílica revestidas com silano pode ser de 10-1000 nm, preferivelmente 10-100 nm.
Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para preparar espermatozóides de uma amostra de sêmen de um animal nãohumano, compreendendo a etapa de separar os espermatozóides dos outros constituintes do sêmen por centrifugação através de uma camada única de uma formulação de colóide.
Em uma modalidade deste aspecto, o método faz uso da composição de acordo com o primeiro aspecto.
Em uma modalidade deste aspecto, a densidade da formulação de colóide está dentro da faixa de 1,05-1,14 g/mL, tal como 1,051-1,11 g/mL. A formulação pode ter um pH de 6,8-7,4, preferivelmente 7,0-7,3 e uma osmolaridade de 300-345 mOsm, tal como 320-330 mOsm.
Em uma modalidade deste aspecto, o método é realizado em um recipiente de não-plástico, tal como um recipiente de vidro.
Em uma modalidade deste aspecto, o método é realizado em recipientes com volume de 10 ml ou acima de 10 ml, tal como 50-200 ml. A altura da formulação de colóide no recipiente pode ser de 30-45 mm.
Em uma modalidade deste aspecto, o ejaculado total é processado.
Em uma modalidade deste aspecto, o animal é uma ave ou um mamífero, tal como um cavalo, um touro, um porco ou um cão.
Em uma modalidade deste aspecto, o diâmetro médio das partículas de sílica revestidas com silano é 10-1.000 nm, preferivelmente ΙΟΙ 00 nm.
Em uma modalidade deste aspecto, a amostra de sêmen não é oligospérmica.
Em uma modalidade deste aspecto, espermatozóides são separados do plasma seminal e dos componentes celulares e não-celulares do plasma seminal, tais como bactérias, vírus, leucócitos, partículas etc. Cada componente separado pode ser usado separadamente.
Em uma modalidade deste aspecto, o método é usado para prolongar a duração da motilidade do esperma. Isto é adicionalmente descrito nos exemplos abaixo.
Em uma modalidade deste aspecto, o método é usado para reduzir a variação em qualidade de esperma entre ejaculados. Isto é adicionalmente descrito nos exemplos abaixo.
As modalidades diferentes do método de acordo com este aspecto podem ser combinada umas com as outras.
Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para separar uma subpopulação de espermatozóides de interesse de uma amostra de sêmen de um animal não-humano, compreendendo as etapas de:
formar um gradiente de densidade compreendendo pelo menos duas camadas da composição de acordo com o primeiro aspecto, cada camada tendo uma densidade diferente;
separar as subpopulações de esperma na amostra de sêmen por centrifugação através do gradiente de densidade; e selecionar a subpopulação de espermatozóides de interesse.
A subpopulação de espermatozóides pode ser e.g. espermatozóides haplóides ou espermatozóides tendo motilidade normal, de e.g. origem equina, bovina ou porcina.
Finalmente, a invenção refere-se aos espermatozóides preparados com o método de acordo com a invenção e ao uso de tais espermatozóides em AI, IVE e ICSI.
Descrição breve dos desenhos
Figura 1: Efeito sobre a sobrevivência do esperma de garanhão do uso de esperma novo ou armazenado para centrifugação sobre colóide (n=12). Nota: dia de coleta = Dia 1; consequentemente Dia 2 = 24 horas, Dia 3 — 48 horas etc.
Figura 2: Efeito de lavagem (n=38) ou não lavagem (n=38) da pelota de esperma após a centrifugação sobre camada única sobre as estimativas de motilidade subjetivas médias (%).
Figura 3: Efeito de osmolaridade de colóides sobre espermatozóides de garanhão com morfologia normal após a centrifugação sobre colóide (n= 15).
Figura 4: Efeito de osmolaridade coloidal sobre defeitos de cromatina de espermatozóide (n=12).
Figura 5: Efeito de separação de espermatozóides do plasma seminal sem seleção concomitante para espermatozóides de qualidade boa usando densidade de colóide (n=3).
Figura 6: Comparação de diferentes densidades de colóide (80% e 60%) usadas para centrifugação sobre camada única (n=8).
Figura 7: Efeito de aumento de escala da centrifugação sobre camada única sobre o rendimento de espermatozóides de garanhão: controle (4 mL de colóide mais 1,5 mL de ejaculado diluído) indexado em 1 para cada tratamento.
Figura 8: Motilidade subjetiva de amostras de esperma antes e após a centrifugação sobre camada única, comparando tratamentos pequeno (4,0 mL de colóide mais 1,5 mL de ejaculado diluído) e grande (20 mL de colóide e 7,5 mL de ejaculado diluído) (n=8).
Figura 9: Motilidade subjetiva de amostras de esperma antes e após a centrifugação sobre camada única, comparando tratamentos pequeno (4,0 mL de colóide mais 1,5 mL de ejaculado diluído) e extragrande (60 mL de colóide e 22,5 mL de ejaculado diluído) (n=4).
Figura 10: Efeito de aumento de escala de centrifugação sobre colóide sobre viabilidade de espermatozóide de garanhão (n=8).
Figura 11: Efeito de aumento de escala de centrifugação sobre colóide sobre a motilidade de espermatozóide de garanhão (n=7).
Figura 12: Efeito de aumento de escala de centrifugação sobre colóide sobre a velocidade de espermatozóide de garanhão (n=7).
Figura 13: Efeito de aumento de ambos o volume de colóide e o volume de ejaculado sobre a motilidade de espermatozóide de garanhão (n=9).
Figura 14: Efeito de osmolaridade de colóide sobre a motilidade de espermatozóide de varrão após a centrifugação sobre gradiente de densidade em tubos de centrífuga pequenos e grandes: osmolaridade 305 mOsm (n=4). Nota: Dia 1 é dia de preparação; dia 2 é mais 24 horas etc.
Figura 15: Efeito de osmolaridade de colóide sobre a motilidade de espermatozóide de varrão após a centrifugação sobre gradiente de densidade em tubos de centrífuga pequenos e grandes: osmolaridade 330 mOsm (n=8). Nota: Dia 1 é dia de preparação; dia 2 é mais 24 horas etc.
Figura 16: Comparação de centrifugação sobre gradiente de densidade e centrifugação sobre camada única de espermatozóides de varrão (n=12 ejaculados). Nota: Dia 1 é dia de preparação; dia 2 é mais 24 horas etc.
Figura 17: Efeito de incubação a 37°C sobre a motilidade de espermatozóides de varrão de preparações de camada única (n=18 ejaculados).
Figura 18: Comparação de centrifugação sobre colóide usando espermatozóides de varrão novos e armazenados (n=12 ejaculados). Descrição detalhada da invenção
A presente invenção almeja aperfeiçoar as composições e os métodos da técnica anterior para a preparação de espermatozóides de ejaculados de animal com relação à qualidade da, e também à simplicidade da, preparação. O aperfeiçoamento em qualidade de esperma inclui prolongação da sobrevivência do esperma, capacidade de fertilização, integridade de cromatina, morfologia, viabilidade, e motilidade de espermatozóide melhoradas. Os aperfeiçoamentos dos métodos incluem rendimento aumentado e facilidade de operação, capacidade para processar volumes grandes de ejaculado, seleção de subpopulações de esperma, e otimização para espécies individuais. Isto é adiante detalhada nos exemplos.
A composição de acordo com a invenção pode ser produzida como uma composição de estoque. Esta composição de estoque tem uma densidade de aproximadamente 1,14 g/mL. Esta composição de estoque pode ser usada não diluída em certas aplicações mas também pode ser diluída com um tampão adequado. Diluições apropriadas são e.g. 80%, 70%, 67,5%, 65%, 60% e 40% da composição de estoque. Estas composições diluídas também podem naturalmente ser preparadas diretamente, sem primeiro produzir a composição de estoque.
As partículas de sílica revestidas com silano usadas podem ser um produto comercialmente disponível, tal como RediGrad disponível na GE Healthcare, ou qualquer outra composição de partículas com características comparáveis.
Alguns exemplos de composições de acordo com a invenção são dados como Estoque A (adequado para uso com espécie porcina) e Estoque E (adequado para outras espécies, tal como espécies equina, bovina ou canina) em Tabela I abaixo. Tampão E e tampão A podem ser usados para preparar as composições diluídas correspondentes, mas também outros tampões podem ser utilizados. Tampão A pode, como um exemplo, ser substituto de Solução de Descongelamento de Beltsville (BTS) em diluição de Estoque A. O pH das composições de estoque exemplificadas é cerca de 7,15, mas este aumenta durante a autoclavagem para cerca de 7,33.
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Tabela I
| Composto químico | Estoque E mM | Estoque A mM | Tampão E mM | Tampão A mM | 80% E mM | 80% A mM |
| NaCl | 104 | 113 | 135 | 121 | 115 | 113 |
| KCl | 4,3 | 4,7 | 5,5 | 5,0 | 4,7 | 4,7 |
| Glicose | 1,1 | 1,2 | 1,2 | 1,3 | 1,2 | 1,2 |
| EDTA | 0,11 | 0,13 | 0,13 | 0,12 | 0,13 | 0,13 |
| HEPES | 16 | 18 | 18 | 19 | 18 | 18 |
| CaCl2 | 2,5 | 2,7 | 0 | 0 | 0 | 2,7 |
| Citrato de Na | 7,6 | 8,1 | 5,8 | 1,6 | ||
| Lactato de Ca | 3,0 | 2,5 | 0 | |||
| Lactato de Na | 19 | 3,8 | ||||
| H2O * | 1 L | 1 L | 0,2 L | 0,2 L | ||
| RediGrad | 1 L | 1 L | 0,8 L | 0,8 L | ||
| Densidade | 1,13 ± 0,005 g/mL | |||||
| Osm | 320 | 330 | 320 | 330 | 320 | 330 |
| pH | 7,15-7,35 | 7,15-7,35 | 7,15 | 7,15 |
* água de qualidade para injeção
Um método é necessário para prolongar a vida utilizável de espermatozóides de garanhão destinados para AI. Os presentes inventores 5 compararam a centrifugação sobre gradiente de densidade ou centrifugação através de uma camada única de colóide como métodos potenciais de preparar espermatozóides de garanhão. Ambos os métodos pareceram prolongar a duração da motilidade de espermatozóide comparados com os espermatozóides não centrifugados (P < 0,001), potencialmente prolongando 10 deste modo a vida utilizável de espermatozóides de garanhão tratados para AI. Ademais, foi feita uma comparação da eficácia de seleção usando (i) sêmen de garanhão diluído recém-coletado, e (ii) amostras de sêmen armazenadas durante a noite a 4°C antes dos procedimentos.
Para sêmen diluído, novo, um rendimento de recuperação 15 similar de espermatozóides móveis foi visto para os dois métodos de preparação (27,0 ± 6,56 milhões de espermatozóides versus 32,6 ± 7,79 para gradientes em camadas únicas e em densidade, respectivamente). Contudo, o rendimento foi reduzido em 18-20% quando sêmen armazenado frio foi usado para centrifugação comparado com sêmen novo, e variação maior entre
Petição 870180147296, de 01/11/2018, pág. 11/15 ejaculados foi observada do que para ejaculados novos. De novo, motilidade de espermatozóide e sobrevivência de esperma foram aperfeiçoadas nas preparações de esperma centrifugadas comparadas com os ejaculados armazenados, não processados. E concluído que as duas técnicas de centrifugação sobre colóide produzem preparações de esperma equivalentes, e que o método de camada única seria conveniente para uso no campo. Isto é adiante descrito em exemplo 1.
Morfologia de esperma e integridade de cromatina têm estado ligadas à fertilidade de espermatozóides de garanhão. Estudos prévios com ejaculados de humano têm mostrado que a proporção de espermatozóides com morfologia normal e com cromatina intacta pode ser aumentada pelo uso de centrifugação sobre gradiente de densidade (6). Os presentes inventores investigaram se tal metodologia podería ser eficaz para sêmen de garanhão, pelo uso quer de centrifugação sobre gradiente de densidade quer do método novo mencionado acima, centrifugação sobre camada única de Houve um aumento significativo na proporção de espermatozóides morfologicamente normais nas preparações de esperma após a centrifugação sobre colóide independente de qual método de centrifugação foi usado (antes da centrifugação 67,5 ± 13,06%; após camada única 77,1 ± 9,3%; após gradiente de densidade 76,7 ± 8,7%; P < 0,001). Além disso, a variação entre garanhões foi reduzida consideravelmente por centrifugação. Algumas das anormalidades morfológicas foram consideravelmente reduzidas após a centrifugação sobre colóide, e.g. a incidência de gotículas citoplásmicas proximais diminuiu em 20% e a incidência de gotículas citoplásmicas distais em 50%, enquanto que a centrifugação sobre colóide teve pouco impacto sobre as proporções de cabeças de formato estreito ou de pêra presentes. No todo, estes resultados sugerem que a centrifugação sobre colóide é um método adequado para colher espermatozóides com morfologia normal de ejaculados a serem usados para AI e, ademais, pode reduzir um pouco da variação vista entre os garanhões. Isto é adiante descrito em exemplo 1.
Em adição, ambos os métodos de centrifugação sobre colóide deram preparações de esperma nas quais a integridade de cromatina foi significativamente melhorada (índice de fragmentação de DNA em preparações não selecionadas, 11,0 ± 4,6; centrifugação sobre camada única, 4,8 ±2,6; centrifugação sobre gradiente de densidade, 4,8 ±2,8; P < 0,001). Não houve diferença entre os dois métodos de centrifugação. Ademais, houve relações negativas entre morfologia normal e o índice de fragmentação de DNA (DFI) (P < 0,001), morfologia normal e o desvio padrão de DFI (SDDFI), (P < 0,001), e DFI e taxa de gravidez (P < 0,03). Para defeitos específicos, houve uma relação direta entre a incidência de cabeças de formato de pêra e DFI (P < 0,05), bolsas nucleares e DFI (P < 0,001), e defeitos de peça intermediária e DFI (P < 0,01); entre cabeças separadas e SD DFI (P < 0,001), e entre cabeças separadas e DFI_médio (P < 0,05). Em conclusão, centrifugação sobre camada única foi tão eficaz quanto centrifugação sobre gradiente de densidade em enriquecimento de preparações de esperma de garanhão para espermatozóides com estrutura de cromatina normal e assim pode ajudar a melhorar as taxas de gravidez por inseminação artificial. A presença de certos defeitos morfológicos pode ser indicativa do dano de cromatina e poderia ser usada como um marcador para predizer a fertilidade de doses de inseminação. Isto é adiante descrito em exemplo 1. O uso de centrifugação sobre colóide para preparar espermatozóides de animal para AI dependerá do processamento de volumes grandes de ejaculado ou de números grandes de espermatozóides. Métodos para aumentar o volume de ejaculado que pode ser manuseado e para reduzir a perda durante a centrifugação foram investigados pela alteração dos parâmetros tais como osmolaridade e densidade da formulação de colóide e o uso de tubos de centrífuga de materiais diferentes (vidro versus plástico) e de tamanhos diferentes (10 mL versus 50 mL). Redução da densidade do colóide usado para a camada única substancialmente aumentou o rendimento de espermatozóides móveis comparado com o colóide de densidade normal (média ± SD: 72,6 ± 28,9 milhões de comparado com 28,9 ± 24,7 milhões de), enquanto que também prolongou a sobrevivência de esperma em 24 horas comparado com o ejaculado não centrifugado. Uso de tubos de vidro no lugar de tubos de plástico significativamente aumentou o rendimento médio: (42,2 ± 22,14 milhões e 39,3 ± 19,87 milhões de espermatozóides para vidro e plástico respectivamente; P < 0,01). Uso de tubos grandes de centrífuga (50 mL) juntos com volumes aumentados de colóide e sêmen (aumento de escala produziu resultados variáveis, provavelmente devido às diferenças inter-ejaculados. Contudo, volumes de 8-10 mL de colóide (quer em uma quer em duas camadas) juntos com 4,5 mL de sêmen diluído em tubos de 50 mL, deu os rendimentos mais altos comparado com os volumes costumeiros em tubos de 10 mL, indicando que deve ser possível recuperar números suficientes de espermatozóides para AI. Isto é adiante descrito em exemplo 3.
Em uma comparação de duas osmolaridades de formulação de colóide, normal (320 mOsm) e alto (345 mOsm), significam que os rendimentos para camadas únicas foram 30,19 (± 16,9) e 25,8 (± 18,5) milhões de espermatozóides respectivamente as duas osmolaridades, enquanto que rendimentos para gradientes de densidade foram 31,84 (± 19,7) e 26,46 (± 20,0) milhões de espermatozóides respectivamente, com variação considerável entre ejaculados. Estas diferenças não são estatisticamente significativas. Contudo, o uso de colóide de osmolaridade alta para a camada única resultou em um aumento no número de espermatozóides morfologicamente normais na preparação (P < 0,001). Ademais, esta tendência também foi observada para os gradientes de densidade, embora aqui a diferença seja não exatamente estatisticamente significativa (P < 0,051). Para anormalidades morfológicas individuais, diferenças na capacidade da osmolaridade normal e alta das formulações de colóide para remover os espermatozóides anormais não foram significativas. Portanto, a osmolaridade da formulação de colóide pode ser benéfica para processamento de ejaculados contendo uma proporção alta de espermatozóides anormais. Isto é adiante descrito em exemplo 3.
Em um exemplo adicional, o método de centrifugação sobre colóide em camada única foi modificado para acelerar o processo e aumentar a escala para permitir que o ejaculado inteiro, que é volumoso em garanhões, seja processado em um número menor de tubos grandes. A omissão da segunda etapa de lavagem de centrifugação do protocolo original resultou em economia de tempo considerável e não afetou adversamente a motilidade de espermatozóide. Para o aumento de escala, o uso de 8 a 12,5 mL de colóide (80%) com 5 mL de ejaculado não deu motilidade de espermatozóide tão boa quanto nas preparações de esperma de 4 mL de colóide em tubos de centrífuga de 10 mL. Contudo, quando quer 15 mL quer 20 mL de colóide de várias densidades (60-80%) foram usados para centrifugar 7,5 mL de ejaculado diluído em tubos de centrífuga de 50 mL, foram obtidas preparações de esperma que foram consideradas equivalentes em qualidade àquelas das preparações de tamanho normal. Foi verificado que 15 ml de colóide 60% deram as melhores preparações de esperma em termos de rendimento esperma e sobrevivência de esperma. Motilidade de espermatozóide não foi diferente entre os tratamentos. Em adição, o uso de 60 mL de colóide (80%) com 22,5 mL de ejaculado diluído em tubos de centrífuga de 200 mL deram preparações de esperma que foram consideradas similares em motilidade e duração de sobrevivência às preparações de esperma de 4 mL de colóide em tubos de centrífuga de 10 mL. Finalmente, os espermatozóides preparados foram capazes de fertilização visto que as gravidezes foram alcançadas após inseminação dos espermatozóides centrifugados, transportados, esfriados. Este aumento de escala é adiante descrito em exemplo 4.
A capacidade de fertilização de espermatozóides bovinos congelados-descongelados foi testada usando fertilização in vitro (IVF), os espermatozóides sendo preparados quer sobre um gradiente de densidade quer sobre uma camada única de colóide. Taxa de fertilização média, taxa de desenvolvimento de blastocisto e número total de células foram 56,3 ± 23,3%,
23,5 ± 17,4% e 83,2 ± 29,9 respectivamente para espermatozóides preparados por gradiente de densidade, e 58,1 ± 23,3%, 24,5 ± 14,3% e 94,6 ± 23,4 respectivamente, para espermatozóides preparados sobre uma camada única de colóide. Valores médios de vários parâmetros de análise computadorizada de motilidade de espermatozóide não foram diferentes entre os dois métodos de preparação de esperma. Estes resultados confirmam os relatórios para garanhão e varrão, a saber, que espermatozóides preparados sobre uma camada única de colóide não são diferentes em comportamento ou propriedades de espermatozóides preparados sobre gradiente, e adicionalmente indicam que não há diferença nas capacidades de fertilização de esperma nos dois tipos de preparações. Isto é adiante descrito em exemplo 6.
Centrifugação sobre colóide tem sido previamente usada para selecionar espermatozóides com morfologia normal. Dentro do contexto da presente invenção, uma tentativa foi feita para selecionar espermatozóides de tamanho normal de uma população polimórfica em um ejaculado de touro. Camadas individuais de colóide de densidades diferentes foram usadas para identificar as densidades adequadas para o gradiente de densidade. Pelo uso de densidades de colóide de 55% e 70%, foi possível obter duas subpopulações de esperma, uma contendo espermatozóides quase todos de tamanho normal, e a outra enriquecida em espermatozóides macrocefálicos. Os espermatozóides microcefálicos foram separados pelo colóide de densidade mais baixa e portanto não apareceram em qualquer uma das subpopulações selecionadas. Isto é adiante descrito em exemplo 5.
Obstáculos para o uso de centrifugação sobre gradiente de densidade em outras espécies, tal como o varrão, são similares àqueles listados para garanhão. Os presentes inventores investigaram os seguintes: (i) o efeito do aumento da osmolaridade de uma formulação de colóide sobre a eficácia de seleção de esperma de varrão durante a centrifugação sobre gradiente de densidade, tendo em vista o desenvolvimento de formulações de colóide específicas para espermatozóides de animal, (ii) a comparação de centrifugação sobre gradiente de densidade com a centrifugação sobre uma camada única de colóide para preparar espermatozóides de varrão, (iii) o efeito sobre espermatozóides de varrão da autoclavagem do colóide, e (iv) lavagem dos espermatozóides após a centrifugação sobre colóide.
Os resultados mostraram que o aumento da osmolaridade do colóide usado para centrifugação sobre gradiente de densidade de espermatozóides de varrão aumentou a proporção de espermatozóides móveis na preparação de esperma resultante. Ademais, motilidade de espermatozóide foi mantida mais longamente por pelo menos 24 horas nas preparações centrifugadas de esperma do que em controles (alíquotas não centrifugadas), isto é, 7 ou 8 dias para espermatozóides centrifugados sobre um gradiente de densidade comparado com menos do que 6 dias para espermatozóides não centrifugados. Para a comparação da camada única de colóide e do gradiente de densidade, motilidade de espermatozóide foi significativamente melhor (P < 0,001) nas preparações centrifugadas de esperma (médias ± sd: 79,6 ±8,1% e 74,2 ± 12,0% para camada única e gradiente de densidade respectivamente) do que nos controles não centrifugados (62,9 ± 12,7%). O rendimento médio de espermatozóides móveis para a camada única foi 67,5 ± 25,6%, e para o gradiente de densidade foi 59,6% ±22,3% (ns). Sobrevivência foi significativamente aumentada pela centrifugação sobre colóide (preparações não centrifugadas 3,1 ± 0,3 dias, SL 5,5 ± 0,79 dias, DG 5,75 ± 0,62 dias; P < 0,001 para não centrifugado versus centrifugado; SL versus DG ns). A presença de bactérias nas amostras de esperma não centrifugadas pode ter contribuído para morte dos espermatozóides. Centrifugação sobre colóide pareceu remover as bactérias.
Autoclavagem da formulação de colóide não teve efeito sobre o número de espermatozóides, a motilidade de espermatozóide ou a sobrevivência de esperma, comparada com não-autoclavagem do colóide. Ademais, lavagem da pelota de esperma obtida após a centrifugação sobre colóide versus não lavagem da pelota de esperma não teve efeito sobre os números de espermatozóides, a motilidade de espermatozóide ou a sobrevivência de esperma. Espermatozóides de varrão poderíam ser armazenados por 24 horas antes da centrifugação sem ter um efeito prejudicial sobre a motilidade de espermatozóide e a duração da motilidade nas preparações centrifugadas. Em conclusão, aumento da osmolaridade da formulação de colóide melhora a seleção de espermatozóides durante a centrifugação sobre gradiente de densidade. Em conclusão, centrifugação sobre uma camada única de colóide produz preparações de esperma que são similares em motilidade e rendimento àquelas de gradiente de densidades, e estas preparações mostram motilidade de espermatozóide e duração de sobrevivência melhoradas comparadas com as amostras de esperma de controle (não centrifugadas). O método de camada única pode facilitar o desenvolvimento de um método de aumento de escala para preparar volumes grandes de ejaculado. Isto é adiante descrito em exemplo 6.
Os presentes inventores investigaram o uso de SLC para preparar espermatozóides de cão para AI, comparando morfologia e motilidade de espermatozóide em amostras de esperma selecionadas e não selecionadas. Motilidade de espermatozóide média foi aumentada de 77,2±19,6% antes de SLC para 87,6±2,7% após SLC enquanto que motilidade progressiva média foi aumentada de 48,6±18% para 67,9±11%. Morfologia normal média foi 62,2 ± 42,8 em amostras não selecionadas e 82,5 ± 19,1% em amostras selecionada por SLC. Após armazenagem por 7 dias a 4°C, motilidade de espermatozóide foi <5% em amostras de esperma não selecionadas e 57 ± 11,3% nas preparações de esperma selecionadas por SLC. O rendimento de esperma variou de 12-47% dependendo da qualidade do esperma no ejaculado original. Conclusão: Estes resultados preliminares indicam que SLC pode ser um método útil para melhorar a qualidade de esperma de cão em doses de esperma para AI. Isto é adiante descrito em exemplo 7.
Exemplos
Os seguintes exemplos adicionalmente descrevem algumas modalidades específicas da invenção. Estes exemplos não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção que é aquele das reivindicações anexada.
EXEMPLO 1: garanhão
Objetivos: (i) comparar centrifugação sobre camada única (SLC) e centrifugação sobre gradiente de densidade (DGC) sobre qualidade de esperma de garanhão em termos de motilidade de espermatozóide, rendimento, morfologia de esperma e integridade de cromatina, e sobrevivência (retenção de motilidade) usando sêmen de garanhão recémcolhido; (ii) comparar qualidade de esperma após a centrifugação sobre colóide de sêmens de garanhão novo e armazenado.
Métodos: sêmen foi colhido de 10 garanhões em coudelarias comerciais para AI usando métodos padrão. Os ejaculados foram diluídos usando agentes diluentes de sêmen feitos em casa ou comercialmente disponíveis (agente diluente de Kenney [7], INRA 96 [IMV, França)) aquecidos para 37°C e a concentração de esperma foi ajustada para cerca de 100xl06/mL. Alíquotas de 38 ejaculados foram usadas para DGC e SLC como segue: um gradiente de densidade foi preparado por pipetagem de 2 mL de colóide E 80% para dentro de um tubo de centrífuga e cuidadosamente dispondo em camadas 2 mL da camada de densidade menor sobre o topo; uma alíquota (1,5 mL) de sêmen diluído foi pipetada sobre o topo da camada superior de colóide. O gradiente foi centrifugado a 300 x g por 20 minutos, após os quais o sobrenadante e a maioria do material de gradiente foram jogados fora. A pelota de sêmen foi transferida para um tubo de centrífuga limpo contendo 5 mL de agente diluente de Kenney e foi lavada por centrifugação por 10 minutos a 500 x g. Após a lavagem a pelota de esperma foi ressuspensa em agente diluente de Kenney novo (1 mL). Para SLC, o método foi similar àquele para DGC com a exceção de que 4 mL de colóide E 80% foram posicionados no tubo de centrífuga em vez das duas camadas de densidades diferentes (2 mL de cada densidade).
Qualidade de esperma nas amostras de esperma centrifugadas e não selecionadas foi avaliada como segue: avaliação de motilidade subjetiva, morfologia de esperma (8, 9) e integridade de cromatina usando o método de Evenson et al. (10) modificado por Januskauskas et al., (11, 12).
Para avaliação de motilidade subjetiva, alíquotas (0,5 pL) do ejaculado diluído e das preparações de esperma foram examinadas por microscopia de luz de contraste de fases (x200) imediatamente após preparação, em um estágio de microscópio aquecido (38°C), e uma vez ao dia até que a motilidade tivesse caído para aproximadamente 20%. Preparações de esperma foram armazenadas quer no refrigerador (6°C) quer na temperatura ambiente (22-30°C). Quando se avalia a motilidade de espermatozóides que haviam sido armazenados a 6°C, as amostras foram permitidas repousarem na temperatura ambiente por 15 minutos antes de as alíquotas serem tiradas para avaliação de motilidade.
No segundo experimento, ejaculados diluídos (n = 21) foram armazenadas durante a noite em uma caixa de transporte isolada contendo bolsas de gelo, i.e. usando o método padrão para transportar sêmen de garanhão. Centrifugações quer sobre gradiente de densidade quer sobre camada única foram realizadas no dia seguinte usando o sêmen diluído armazenado, com estimativas de motilidade sendo feitas sobre as preparações de esperma de ambos os ejaculados novo e armazenado.
Resultados: Quando sêmen diluído, novo foi usado para centrifugação sobre colóide, a proporção de espermatozóides móveis, espermatozóides morfologicamente normais e espermatozóides com cromatina intacta foram similares para os dois métodos de centrifugação. Estes parâmetros de qualidade de esperma após qualquer método de centrifugação sobre colóide foram melhores do que nas amostras não centrifugadas (Tabela 1) e duração da sobrevivência de esperma foi significativamente melhorada, variando de 4 dias a 10 dias a 6°C e de 2 a 6 dias na temperatura ambiente.
Tabela 1: Efeito de centrifugação sobre camada única e centrifugação sobre gradiente de densidade sobre qualidade de esperma de garanhão, média ± SD (n= 38)
| Parâmetro | Controle não centrifugado | Após a centrifugação sobre colóide | |
| Camada única | Gradiente de densidade | ||
| Motilidade (%) | 68,0 ± 9,2 | 84,7 ± 5,4 ab | 84,3 ± 5,9 ab |
| Rendimento | 27,0 ± 6,6 b | 32,6 ± 7,8 b | |
| Sobrevivência a 4°C (dias) | 2,4 ±1,3 Faixa 1-5 | 5,6 ± 1,8 ab Faixa 3-9 | 5,7 ± 1,9 ab Faixa 3-10 |
| Sobrevivência na temperatura ambiente (dias) | 2,1 ±0,7 Faixa 1-3 | 3,0±0,9ab Faixa 2-6 | 3,1 ±0,9 ab Faixa 2-5 |
| Morfologia normal (%) | 67,5 ± 13,0 | 77,1 ± 9,3a b | 76,7 ± 8,7 ab |
| Dano em cromatina (%) | 11,0 ±4,6 | 4,8±2,6ab | 4,8±2,8ab |
a diferença significativa após a centrifugação; b sem diferença entre métodos.
Quando o sêmen armazenado frio foi usado para centrifugação, o rendimento foi reduzido em 18-20% comparado com sêmen novo, e variação maior entre ejaculados foi observada do que para ejaculados novos. De novo, motilidade de espermatozóide e sobrevivência de esperma foram melhoradas nas preparações centrifugadas de esperma comparadas com ejaculados armazenados, não processados (Figura 1).
Conclusões: as duas técnicas de centrifugação sobre colóide produzem preparações de esperma equivalentes, com qualidade de esperma melhorada comparadas com amostras de controle não centrifugadas. SLC ou DGC podería ser realizada com sêmen armazenado bem como com sêmen novo, embora a qualidade de sêmen nas preparações de esperma resultantes fosse melhor quando sêmen novo foi usado. Visto que SLC é mais simples e mais rápida de realizar do què DGC, seria conveniente para uso no campo.
EXEMPLO 2 garanhão
Objetivos: (i) para investigar as mudanças em motilidade de espermatozóide, viabilidade e integridade de cromatina com armazenagem após a centrifugação sobre colóide; (ii) para investigar a necessidade de lavagem da pelota de esperma por análise de dados retrospectiva.
Métodos: sêmen foi colhido de 4 garanhões em coudelarias comerciais para AI usando métodos padrão. Os ejaculados foram diluídos usando agentes diluentes de sêmen feitos em casa ou comercialmente disponíveis (agente diluente de Kenney, INRA 96) aquecidos para 37°C e a concentração de esperma foi ajustada para cerca de 100xl06/mL. Alíquotas destes ejaculados foram usadas para SLC como previamente descrito, usando
1,5 mL de ejaculado diluído dispostos em camada sobre o topo de 4 mL de colóide (80%). A pelota de esperma não foi lavada. Qualidade de esperma (motilidade de espermatozóide, viabilidade de espermatozóide, integridade de membrana e integridade de cromatina) foi avaliada em amostras preparadas por SLC e amostras de controle não centrifugadas imediatamente e após 24 h e 48 h. Métodos são como descritos em Exemplo 1, com a adição do método para análise computadorizada de motilidade de espermatozóide (CASA) (13) viabilidade de espermatozóide e integridade de membrana (14). Preparações de esperma foram armazenadas no refrigerador (6°C). Quando se avalia a motilidade de espermatozóides que haviam sido armazenados a 6°C, as amostras foram permitidas se equilibrarem na temperatura ambiente por 15 minutos antes de realização da avaliação.
Para a análise retrospectiva, foi feita uma comparação dos dados de motilidade subjetiva de 38 ejaculados preparados por centrifugação sobre camada única com subsequente lavagem da pelota de esperma e 39 ejaculados onde não houve lavagem da pelota de esperma após a centrifugação sobre camada única.
Resultados: houve uma deterioração rápida em motilidade de espermatozóide nas amostras não centrifugadas durante 48 h, acompanhada por um decréscimo em viabilidade de espermatozóide, integridade de membrana e integridade de cromatina. Em contraste, nas amostras preparadas por SLC, todos estes parâmetros de qualidade de esperma foram melhores do que nas amostras não centrifugadas e foram retidos durante 48 h (Tabelas 25)·
Tabela 2: Parâmetros de motilidade (subjetiva por CASA) para amostras de esperma antes da centrifugação sobre colóide, imediatamente após a centrifugação sobre colóide e a 24 h e 48 h após a centrifugação sobre colóide enquanto armazenadas a 5°C (10 ejaculados).
| Amostra | Tempo | Motilidade subjetiva | CASA motilidade total | C-mot | Não 1-mot | 1-mot |
| Não centrifugada | 0 | 64 ± 3,9 | 72,11 ± 13,1 | 2,26 ± 0,93 | 46,7+ 14,4 | 34,8 ± 22,9 |
| + 24 | 31,5+15,1 | 33,3 ± 19,4 | 4,77 ± 5,4 | 59,95 ± 9,4 | 9,69 ± 8,6 | |
| + 48 | 10 + 6,6 | 12,1 ± 12,2 | 1,97 + 2,4 | 45,9 + 21,3 | 10,3 12,4 | |
| Centrifugada | 0 | 77 ± 7,5 | 85,7 ± 9,0 | 5,6 ± 3,6 | 27,1 ± 14,3 | 59+18,1 |
| + 24 | 72,5+ 18,7 | 71,3 + 2,34 | 12,25 ± 6,2 | 31,0 + 22,0 | 49,8 + 23,1 | |
| + 48 | 48,5 ± 14,9 | 61,712,7 | 10,97 + 4,9 | 38,31 + 25,0 | 44,68 ± 23,2 |
Nota: motilidade por CASA = população móvel total de acordo com CASA; C-mot = motilidade circular; não-1 mot = motilidade não-linear; 1-mot = motilidade progressiva linear. 1) Motilidade subjetiva: amostras centrifugadas tiveram motilidade significativamente maior do que as amostras não centrifugadas em todos os instantes de tempo (P < 0,001).
2) CASA: Amostras centrifugadas tiveram motilidade maior do que as amostras não centrifugadas em todos os instantes de tempo (0 h, P < 0,05, 24 h e 48 h P < 0,001); valores para c-mot e 1-mot foram significativamente maiores para amostras centrifugadas do que para amostras não centrifugadas em todos os instantes de tempo enquanto que valores para não-l-mot foram significativamente menores (P < 0,05).
Tabela 3: Efeito de armazenagem a 5°C sobre viabilidade de espermatozóide (coloração com SYBR-14/PI) em amostras de esperma selecionadas por SLC e não selecionadas no decorrer do tempo (n=10).
| Não selecionadas | Selecionadas | por SLC | ||||
| vivas | mortas | morrendo | vivas | mortas | morrendo | |
| 0 | 64,7 + 9,3 bd | 27,4 +9,lad | 7,9 ± 2,6 b | 79,5 +9,2b | 16,4 + 8,1 a | 4,1 ±2,0 b |
| + 24 | 50,3+18,3 °d | 40,0 ± 20,7 b | 10,0 +4,7 b | 79,1 + 8,8° | 15,9 +6,7 b | 5,0 ± 2,6 b |
| + 48 | 32,8+ 10,9°d | 56,8 +24,8 cd | 10,5 ± 6,8 ns | 75,6+6,8° | 18,5 + 5,6° | 5,9 ± 2,0 ns |
a, b, c = diferença significativa entre amostras centrifugadas e não centrifugadas
P < 0,05,
P < 0,01, P < 0,001 respectivamente.
d = diferença significativa entre amostras não centrifugadas em instantes de tempo diferentes
P < 0,05 ns = não significativo
Tabela 4: Mudanças em estabilidade de membrana plasmática de espermatozóides de garanhão com armazenagem a 5°C; coloração com
Annexin V / iodeto de propídio (n=10).
| AN-/PI- | AN-/PI+ | AN+/PI+ | AN+/PI- | |||||
| Tempo | Não selecionadas | SLC | Não selecionadas | SLC | Não selecionadas | SLC | Não selecionadas | SLC |
| 0 | 69,3 ± 8,2 ns b | 74.6 + 7.6 ns | 23,9 + 6,0 ab | 13,4 + 3,3 a | 4,8 + 3,3 a | 9,1 + 4,4 a | 2,0 + 0,4 ab | 2,9 + 0,5 a |
| 24 | 67,1 ± 12,2 ns | 74,1 ± 10,4 ns | 28,7 + 11,9a | 13,1 ± 2,8 a | 2,5 + 1,3 a | 7,9 + 5,6 a | 1,7 + 0,9 a | 5,0 + 3,7 a |
| 48 | 56,6+ 14,7 a b | 74,9 + 5,5 a | 39,1 ± 14,7 ab | 15,7 + 4,1a | 3,1 + 1,1a | 7,0 + 2,9 a | 1,3 + 0,8 ns b | 2.4 + 1.5 ns |
Nota: AN-/PI- — espermatozóides vivos com membranas estáveis; AN+/PI- = espermatozóides com membranas instáveis mas intactas; AN-/PI+ e AN+/PI+ = espermatozóides com membranas danificadas. SLC = centrifugação sobre camada única a = diferença significativa entre amostras centrifugadas e não centrifugadas, P < 0,05. b = diferença significativa entre amostras não centrifugadas a 0 h e 48 h, P < 0,05. ns = não significativo
Tabela 5: Efeito de armazenagem sobre integridade de cromatina em amostras de esperma selecionadas e não selecionadas no decorrer do tempo usando o Ensaio de Estrutura de Cromatina de espermatozóide (SCSA) (n=10).
| Não selecionadas | Selecionadas | |||||
| DFI | DFI médio | SD-DFI | DFI | DFI médio | SD-DFI | |
| 0 | 22,1 ±9,7 a | 414,9 +34,0 b | 23,8 + 3,99 | 11,3 +4,9 a | 414,9+31,7 b | 24,2 ±3,9 |
| + 24 | 29,6 ± 10,0 a | 413,8 +42 b | 21,8 +3,1b | 14,8 +6,8 a | 412,2 +35,2 b | 30,5 ± 2,3 b |
| + 48 | 41,1+20,3 b | 393,8 ± 45,6 | 21,3 + 3,3 a | 11,6 + 5,3 b | 418,6+37,0 | 28,3 ±3,7 a |
a= diferença significativa entre amostras centrifugadas e não centrifugadas, P <0,01 b · — diferença significativa entre amostras centrifugadas e não centrifugadas, P <0,001.
Na comparação retrospectiva de lavagem e não lavagem da pelota de esperma após a centrifugação sobre camada única, não houve diferença em motilidade subjetiva média das preparações de esperma preparadas por SLC (Figura 2).
Conclusões: qualidade de esperma (motilidade, viabilidade e integridade de cromatina) em amostras centrifugadas é retida durante armazenagem por 48 h, quer a 6°C quer na temperatura ambiente, enquanto que a qualidade de esperma de amostras não centrifugadas deteriorou. Lavagem da pelota de esperma após a centrifugação sobre camada única não é uma exigência absoluta em termos de qualidade de esperma e portanto este estágio pode ser omitido para economizar tempo.
EXEMPLO 3: Garanhão
Objetivo: para investigar o efeito de osmolaridade e densidade das formulações de colóide sobre o rendimento e a qualidade de amostras de esperma de garanhão, e também o uso de tubos de centrífuga de materiais diferentes (vidro versus plástico) e tamanhos diferentes (10 mL versus. 50 mL) sobre taxa de recuperação de esperma da centrifugação sobre colóide (SLC).
Métodos: centrifugação sobre colóide foi realizada como previamente descrito com as seguintes modificações de acordo com as diferentes investigações: (i) colóides de duas osmolaridades, 320 mOsm e 345 mOsm, foram usados para centrifugação sobre camada única e centrifugação sobre gradiente de densidade de alíquotas de 15 ejaculados de garanhão; (ii) colóides (4 mL) de densidades diferentes foram usados para SLC como segue: 40% (densidade baixa), 60% (densidade intermediária) e 80% (densidade padrão); (iii) alíquotas de 7 ejaculados foram preparadas por SLC em tubos de centrífuga de vidro e de plástico; (iv) uma comparação foi feita usando SLC ou DGC em tubos pequenos (gradiente 2+2+2,5 mL, camada única 4+1,5 mL) e tubos grandes (gradientes 4+4+3, 5+5+4,5, 9+9+6 e 9+9+7,5; camada única 8+3, 8+4,5 e 12+3) apenas uma vez cada. Números referem-se ao volume na camada inferior, volume na camada superior (para gradiente de densidades), ou para volume em camada única, e volume de ejaculado diluído respectivamente. Parâmetros usados para avaliar qualidade de esperma em todos estes estudos de parâmetros foram motilidade subjetiva de esperma e taxa de recuperação (rendimento), e também morfologia de esperma e integridade de cromatina para a comparação de osmolaridades diferentes, como previamente descrito.
Resultados (i): a taxa de recuperação foi ligeiramente menor para osmolaridades maiores de colóide comparadas com a osmolaridade normal, embora estas diferenças não fossem estatisticamente significativas (Tabela 1). Sobrevivência de esperma não foi afetada pela osmolaridade de colóide.
Tabela 6. Efeito de osmolaridade de colóide sobre o número de espermatozóides móveis na pelota após centrifugação sobre um colóide (média ± SD). n = 20
| 305-320 mOsm | 330-345 mOsm | ||
| Camada única | Gradiente de densidade | Camada única | Gradiente de densidade |
| 30,19 xl06± 16,9 | 31,84 xl06± 19,7 | 25,8 x 106± 18,5 | 26,46 x 106 ±20,0 |
Uso de um colóide de osmolaridade alta resultou em um aumento no número de espermatozóides morfologicamente normais na preparação (P < 0,001) (Figura 3). Ademais, esta tendência foi também observada para gradientes de densidade, embora aqui a diferença fosse não exatamente estatisticamente significativa (P < 0,051).
Para anormalidades morfológicas individuais, contudo, diferenças na capacidade das formulações de colóide de osmolaridades normal e alta para remover espermatozóides anormais não foram significativas. Em contraste, uso de um colóide de osmolaridade alta para a camada única não aumentou a efetividade de remoção de espermatozóides com cromatina danificada (Figura 4).
Resultados (ii:) Após centrifugação através da camada única de densidade baixa, as preparações de esperma foram muito similares ao controle (sêmen não centrifugado) em termos de números de espermatozóides móveis, presença de fragmentos celulares etc. Contudo, sobrevivência de esperma foi prolongada em aproximadamente 24 horas nas preparações centrifugadas (Figura 5). Quando os espermatozóides foram preparados sobre a camada única de uma densidade intermediária, as preparações continham uma proporção mais elevada de espermatozóides móveis, e estes espermatozóides sobreviveram por mais tempo do que os controles (alíquota não centrifugada), embora nenhum parâmetro tenha tão bom quanto nas amostras preparadas sobre a camada única normal (Figura 6). Números de espermatozóides foram aumentados substancialmente (P < 0,01) para as amostras preparadas sobre o colóide de 60% comparado com o colóide de 80% costumeiro (média ± SD: 72,6 ± 28,9 milhões comparados com 28,9 ± 24,7 milhões).
Resultados (iii): Uso de tubos de centrífuga de vidro no lugar de tubos de centrífuga de plástico para sete ejaculados resultou em um aumento significativo (P < 0,01) no número de espermatozóides aparecendo nas pelotas. Valores médios foram 42,2 milhões e 39,3 milhões para tubos de vidro e de plástico respectivamente.
Resultados (iv): houve diferenças consideráveis em rendimento entre ejaculados para um garanhão, expressado como uma proporção da carga inicial. O aumento de escala de gradientes consistentemente deu rendimentos menores do que os de gradiente costumeiros, mas dois dos volumes maiores de colóide usados como a camada única, e um dos gradientes, produziu rendimentos maiores do que o tamanho costumeiro de camada única (Figura 7). Aumento dos volumes acima destes níveis não aumentou a recuperação. A proporção de espermatozóides móveis foi reduzida ligeiramente no tubo grande comparado com o tubo pequeno (média 75% cf. 80%), independente de qual combinação de volume foi usada. Duração de sobrevivência de esperma não foi afetada pelo aumento de escala.
Conclusões: o rendimento de espermatozóides de garanhão obtido após SLC pode ser aumentado pelo abaixamento da densidade do colóide usado para a camada única, embora a qualidade de esperma não seja tão boa quanto quando a densidade normal é usada. Rendimento também pode ser aumentado pelo aumento de escala em tubos de centrífuga maiores. Uso de tubos de centrífuga de vidro em vez de plástico aumenta o rendimento ligeiramente mas não vale à pena os custos adicionais envolvidos na compra, na limpeza e na esterilização de tubos. Aumento da osmolaridade da formulação de colóide de 320 mOsm para 345 mOsm resulta em morfologia normal de esperma melhorada, mas não em integridade de cromatina, embora o rendimento de esperma possa ser diminuído.
EXEMPLO 4: garanhão
Objetivo: para aumentar a escala da técnica de centrifugação sobre colóide para facilitar o processamento de ejaculados inteiros no campo.
Experimentos: (i) uso do colóide 80% em tubos de 50 mL e em tubos de 200 mL (experimento 1); (ii) investigação do efeito de mudança da densidade do colóide (60% para 80%) em tubos de 50 mL (experimento 2); (iii) uso de colóide 80% em tubos de 10 mL mas aumentando o volume de ejaculado diluído usado (experimento 3); e (iv) comparação de colóide 80% em tubos de 10 mL com 1,5 mL e 4,5 mL de ejaculado sobre o topo e colóide 67,5% em tubos de 50 mL com 15-18 mL de ejaculado sobre o topo.
Experimento 1: Alíquotas de 8 ejaculados (4 garanhões, Coudelaria de Vãsterbo) foram transportadas para o laboratório e usadas para SLC como descrito acima, designadas pequena (1,5 mL de ejaculado diluído sobre 4 mL de colóide em um tubo de 10 mL) e grande (7,5 mL de ejaculado diluído sobre 20 mL de colóide em um tubo Falcon de 50 mL). Estes volumes de colóide representam colunas de mesma altura nos dois tipos de tubo de centrífuga. Após centrifugação a 300 g por 20 min, as pelotas de esperma resultantes foram ressuspensas em agente diluente de Kenney novo em um tubo limpo, usando 1 mL de agente diluente de Kenney para a pelota pequena e 5 mL de agente diluente de Kenney para a pelota grande. Qualidade de esperma foi avaliada nas preparações de esperma selecionadas por SLC e nas preparações de esperma não selecionadas para motilidade subjetiva, CASA, viabilidade de espermatozóide (coloração com SYBR14/PI), integridade de membrana (coloração com Annexin-V/PI) e integridade de cromatina de espermatozóide usando SCSA, como previamente descrito. O número de espermatozóides em cada pelota de esperma foi usado para calcular o rendimento. As análises foram repetidas após armazenagem a 5°C por 24 h e 48 h. Avaliações de motilidade subjetiva foram continuadas até que motilidade de espermatozóide fosse <20%. Alíquotas de uns outros 4 ejaculados foram usadas para SLC como descrito acima designadas pequenas (1,5 mL de ejaculado diluído sobre 4 mL de colóide em um tubo de 10 mL), enquanto que 22,5 mL do mesmo ejaculado foram dispostos em camada sobre o topo de 60 mL de colóide em tubos Falcon de 200 mL, designadas extragrandes (SLC-XL). As pelotas de esperma SLC-XL foram ressuspensas em 10 mL de agente diluente de Kenney. Ambas as preparações de esperma pequenas e grandes foram avaliadas para motilidade de espermatozóide e duração de sobrevivência. Os métodos foram como previamente descritos.
Resultados:
Motilidade de espermatozóide: Motilidade total foi melhorada nas preparações de esperma selecionadas por SLC comparadas com aquelas não selecionadas, de acordo tanto com estimativas de motilidade subjetiva quanto por CASA. De acordo com avaliações de motilidade subjetiva, estas diferenças foram significativas em todos os instantes de tempo (P < 0,001) e não houve diferenças entre SLC-pequena e SLC-grande (Figura 8). Um resultado similar foi obtido para amostras SLC-XL e SLC-pequena (Figura 9).
Os resultados de CASA também mostraram diferenças significativas entre amostras de esperma não selecionadas e selecionadas por SLC em todos os instantes de tempo (P < 0,05), embora houvesse também algumas diferenças entre a SLC-pequena e SLC-grande (P < 0,05), com as preparações pequenas tendo motilidade melhor do que as grandes (Tabela 7). Para motilidade circular, motilidade não-linear e motilidade linear, houve diferenças significativas entre preparações de esperma selecionadas por SLC e não selecionadas (P < 0,05), mas não entre preparações SLC-pequena e SLC-grande. Houve uma correlação boa entre avaliações subjetivas e CASA para motilidade total (r = 0,8, P < 0,001).
Tabela 7: Avaliações de motilidade (Análise de Motilidade Subjetiva Assistida por Computador) de preparações de esperma pequenas e grandes de centrifugação sobre camada única (médias ± sd) para motilidade total e vários parâmetros de motilidade.
| Amostra | Tempo (h) | Motilidade subjetiva (%) | CASA motilidade (%) | Motilidade circular (%) | Motilidade não-linear (%) | Motilidade linear (%) |
| Não selecionada | 0 | 64 ± 3,9 | 72,11 ± 13,1 a | 2,26 +0,93 ab | 46,7 ± 14,4 | 34,8 ± 22,9 |
| + 24 | 31,5 ± 15,1 a | 33,3+ 19,4 a c | 4,77+5,4 ac | 59,95 ± 9,4 | 9,69 ± 8,6 | |
| + 48 | 10 + 6,6 | 12,1 ± 12,2° | 1,97 + 2,4 | 45,9 + 21,3 | 10,3 12,4 | |
| Pequena selecionada | 0 | 77 ± 7,5 | 85,7 ± 9,0 a | 5,6 ± 3,6 b | 27,1 ± 14,3 | 59+18,1 |
| + 24 | 72,5+ 18,7 a1 | 71,3 +2,34 c | 12,25 ± 6,2 c | 31,0 + 22,0 | 49,8 + 23,1 | |
| + 48 | 48,5 ± 14,9 | 61,7 +2,7 c | 10,97 + 4,9 | 38,31 + 25,0 | 44,68 + 23,2 | |
| Grande selecionada | 0 | 77 ± 8,6 | 80,22+ 10,0a | 6,9 ± 3,9 a | 29,0+ 16,8 | 57,8+18,7 |
| +24 | 69+15,4* | 56,8 ± 20,7 a | 13,1 + 7,5 | 33,6+ 19,8 | 46,8 ± 24,2 | |
| +48 | 54,5 ± 9,8 | 42,3+ 18,3 c | 10,5 + 5,6 | 39,6 + 31,0 | 44,2 ± 27,6 |
a = diferença entre selecionadas por SLC e não selecionadas, P < 0,05. f = diferença entre selecionadas por SLC grandes e pequenas, P < 0,05.
Viabilidade de espermatozóide: Figura 10 mostra os resultados da coloração com SYBR-14/PI em preparações de esperma pequenas e grandes não selecionadas e selecionadas por SLC. A proporção de espermatozóides vivos foi significativamente maior nas preparações de esperma selecionadas por SLC do que nas preparações de esperma não selecionadas, enquanto que as proporções de espermatozóides mortos ou morrendo foram significativamente menores nas preparações de esperma selecionadas do que não selecionadas. Não houve diferenças nestas proporções entre preparações de esperma de SLC-grande e SLC-pequena. Com tempo, a proporção de espermatozóides vivos decresceu significativamente nas preparações de esperma não selecionadas enquanto que a proporção de espermatozóides mortos aumentou significativamente (P < 0,05). Em contraste, estas proporções não mudaram nas preparações de esperma selecionadas por SLC. Para as preparações SLC-XL, não houve diferença entre valores médios para preparações de esperma SLC-pequena e SLC-XL para qualquer parâmetro (Tabela 8).
Tabela 8: Viabilidade de espermatozóide em preparações de esperma Pequenas e Extra-Grandes de centrifugação sobre camada única usando coloração com SYBR-14/PI (Médias ± sd) (n=4).
| Pequenas | Extra-Grandes | |||||
| Vivo | Morto | Morrendo | Vivo | Morto | Morrendo | |
| 0h | 82,8 ± 4,9 | 14,7 ±5,3 | 2,5 ± 0,3 | 85,4 ± 2,5 | 12,2 ± 1,8 | 2,3 ± 0,8 |
| 24 h | 83 ± 6,2 | 14,2 ± 6,3 | 2,7 ± 0,3 | 86,1 ± 1,9 | 11,1 ± 1,7 | 2,9 ± 0,9 |
| 48 h | 78,8 ± 7,9 | 17,7 ±8,7 | 3,5 ±1,1 | 80,3 ± 4,3 | 15,0 ±4,1 | 4,6 ± 2,2 |
Nota: Nenhuma diferença significativa entre preparações em camada única de SLC-pequena e SLC-XL. Valores para cada parâmetro não mudaram significativamente com o tempo quer para SLC-pequena quer para SLC-XL.
Integridade de membrana de espermatozóide: os resultados da coloração com Annexin-V/PI são mostrados em Tabela 9 (SLC-pequena versus SLC-grande) e Tabela 10 (SLC-pequena versus SLC-XL). Não houve diferença entre as preparações de esperma SLC-pequena e SLC-grande em quaisquer instantes de tempo: as únicas diferenças entre coloração com
Annexin-/PI- (membranas intactas) de preparações de esperma não selecionadas e selecionadas foi para preparações de esperma SLC-pequenas em tempo 0 h (P < 0,05). Também houve diferenças significativas entre preparações de esperma são selecionadas e selecionadas por SLC em vários outros parâmetros: entre preparações não selecionadas e selecionadas por SLC a 0 h, 24 h e 48 h para Annexin-/PI+ (P < 0,001); entre preparações não selecionadas e selecionadas por SLC a 24 h e 48 h para Annexin+/PI+ (P < 0,001); entre preparações não selecionadas e SLC-pequenas a 0 h e 48 h, e entre preparações não selecionadas e SLC-grandes a 24 h para espermatozóides corados com Annexin+/PI- (P < 0,001). Não houve diferenças significativas entre SLC-pequena e SLC-XL para quaisquer dos parâmetros medidos, nem houve mudança de valores significativamente com o tempo.
Tabela 9: Integridade de membrana de espermatozóide em preparações de esperma não selecionadas e pequenas e grandes de centrifugação sobre camada única usando coloração com Annexin-V / Iodeto de Propídio (médias ± sd) (n=8).
| Tempo | Tratamento | Annexin-V/PI- | Annexin-V- /PI+ | Annexin- V+/PI+ | Annexin-V ±/PI- |
| Oh | grande | 74,2 ± 8,7 | 13,8 ± 6,lc | 8,4 ± 3,2 | 3,6 ±2,0 |
| pequeno | 75,2 ± 6,0 a | 12,8 ± 2,8 c | 8,8 ± 3,4 c | 3,2 ± 0,6 | |
| não selecionado | 67,4 ±8,1 a | 24,7 ± 6,0 cd | 5,7 ±3,5 c | 2,3 ± 0,6 | |
| 24 h | grande | 69,1 ± 14,8 | 13,8 ±3,4° | 11,6 ± 8,9 a | 5,5 ±4,1 b |
| pequeno | 75,0 ± 9,3 | 12,7 ±3,3° | 7,1 ±3,6 | 5,3 ±4,1 ce | |
| não selecionado | 65,1 ± 13,1 | 30,3 ± 12,5 c | 2,5 ± 1,3 a | 2,1 ± 1,1 bc | |
| 48 h | grande | 73,3 ± 6,4 | 15,1 ±3,9° | 8,3 ± 2,7 a | 3,4 ± 1,9c |
| pequeno | 76,9 ± 4,2 | 15,2±4,4C | 6,1 ± 1,6 | 2,1 ± 1,6 ce | |
| não selecionado | 51,3 ± 16,3 | 43,6 ± 16,1 cd | 3,7 ± 1,5 a | 1,3 ± 0,9 c |
Nota: sem diferenças entre preparações de esperma grandes e pequenas selecionadas por SLC em quaisquer instantes de tempo, a, b, c = diferença entre não selecionadas e selecionadas, P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001; d = diferença entre 0 e 24 h,P < 0,05; e = diferença entre 24 h e 48 h, P < 0,05
Tabela 10: Integridade de membrana de espermatozóide em preparações de esperma não selecionadas e Pequenas e Extra-Grandes de centrifugação sobre camada única usando coloração com Annexin-V / Iodeto de Propídio (médias ± sd) (n=4).
| SLC-Pequena | SLC-Extra Grande | |||||||
| AnnexinV-/PI- | AnnexinV-/PI+ | Annexin V+/PI+ | AnnexinV±/PI- | AnnexinV-/PI- | AnnexinV-/PI+ | Annexin V+/PI+ | Annexin V+ZPI- | |
| 0h | 76,8 ± 4,8 | 11,4 ± 1,6 | 8,9 ± 3,9 | 2,8 ± 0,3 | 76,9 ± 7,8 | 13,8+3,8 | 5,7 ± 1,9 | 3,7 ±2,2 |
| 24 h | 81,9 ±3,8 | 9,5 ± 2,4 | 5,4 ±3,1 | 3,2 ± 1,7 | 78,7 ± 3,9 | 13,1 ±4,1 | 4,4 ± 1,8 | 3,8 ±2,5 |
| 48 h | 80,0 ± 2,3 | 12,9 ± 4,3 | 5,5 ± 1,3 | 1,71 ± 1,5 | 80,8+4,8 | 14,0 ±6,8 | 3,4 ±1,7 | 1,7 ±0,7 |
Nota: sem diferença significativa entre preparações sobre camada única SLCpequena e SLC-XL. Valores para cada parâmetro não mudaram com o tempo quer para pequena quer para XL.
Integridade de cromatina de espermatozóide (SCSA): as preparações de esperma selecionadas por SLC tiveram integridade de cromatina de espermatozóide melhor, como mostrado por um valor menor para DFI, do que as preparações de esperma não selecionadas (Tabela 11), em todos os instantes de tempo (0 h, P < 0,01; 24 e 48 h, P < 0,001). Não houve diferenças quer em DFImédio quer em SDDFI entre as amostras de esperma não selecionadas e selecionadas. Para as amostras XL, não houve diferença entre pequenas e grandes quer para DFI quer para SD DFI (DFI de pequena 11,2 ± 3,89, XL 3 ± 4,6; SD_DFI de pequena 29,6 ± 3,2, XL 27,4 ± 6,0). Contudo, houve uma diferença significativa entre DFI_médio de pequena e XL (416,3 ± 42,8 e 258,3 ± 6,5 respectivamente; P < 0,05).
Tabela 11: Parâmetros do Ensaio de Estrutura de Cromatina de espermatozóide para preparações de esperma não selecionadas e pequenas selecionadas por SLC e grandes selecionadas por SLC armazenadas por 48 h a 5°C (n=8).
| Não selecionadas | Pequenas selecionadas por SLC | Grandes selecionadas | por SLC | ||||||
| DFI | Média DFI | SD-DFI | DFI | DFImédio | SD-DFI | DFI | DFImédio | SD-DFI | |
| Oh | 26,2 ± 6,5 a | 405.4 ± 73.4 | 24,2 ± 4,1 | 14,3 ± 5,4 a | 397,2 ± 71,1 | 24,3 ± 5,1 | 13,1 ± 6,4 a | 400,2 ± 71,5 | 27,0 ± 4 |
| 24 h | 33,0 ± 6,6 b | 415,1 ± 61,8 | 22,4 ± 3,8 | 16,0 + 7,5 b | 398,8 ± 67,4 | 28.9 ± 5.9 | 16,0 ± 7,1 b | 393,4 ± 71,6 | 29,0 ± 4,1 |
| 48 h | 48,6 ± 20, lb | 404,3 ± 44,8 | 21,4 ± 3,3 | 13,8 ± 5,9 b | 404,8 ± 69 | 26,0 ± 6,4 | 14,3 ± 6,6 b | 394.1 ± 71.1 | 27,4 ± 4,0 |
Nota: a, b = DFI para não selecionadas > selecionadas por SLC, P < 0,01 e P < 0,001 respectivamente.
Rendimento de esperma: houve uma diferença considerável entre o rendimento médio para preparações de esperma SLC-pequena e SLCgrande (32 ± 22,3% versus 8,9 ± 8,9% respectivamente, P < 0,001). Em contraste, em um experimento diferente, os rendimentos para as amostras XL foram aproximadamente 25% maiores do que para as amostras pequenas (25,5 ± 14,1% comparado com 20,2 ± 5,9%).
Experimento 2: Alíquotas de 23 ejaculados (de 4 garanhões em Coudelaria de Vãsterbo e 10 garanhões em Flyinge AB) foram usadas para SLC como descrito acima, designadas pequenas (1,5 mL de ejaculado diluído sobre 4 mL de colóide em um tubo de 10 mL) e grandes (7,5 mL de ejaculado diluído sobre quer 15 mL quer 20 mL de colóide de densidades diferentes - 60%, 65%, 70%, 75% ou 80% - em um tubo Falcon de 50 mL). Nota: não é possível usar alíquotas de cada ejaculado para cada um dos 10 tratamentos em Experimento 2 por causa de escassez de amostra.
Após centrifugação a 300 g por 20 min, as pelotas de esperma resultantes foram recuperadas e ressuspensas em agente diluente de Kenney novo em um tubo limpo, usando 1 mL de agente diluente de Kenney para a pelota pequena e 5 mL de agente diluente de Kenney a pelota grande. Qualidade de esperma nas preparações de esperma resultantes foi avaliada para motilidade subjetiva de esperma e integridade de cromatina como descrito em Experimento 1, e também sobrevivência de esperma e rendimento. Em adição, avaliação de motilidade objetiva foi realizada usando quer sistema Qualisperm™ (15) (ejaculados Flyinge; 9) quer o MTM Motion Analyzer (13) (ejaculados Vãsterbo).
Resultados: Avaliação média de motilidade subjetiva e medições de motilidade Qualisperm™ para as diferentes combinações de volume/densidade são mostradas em Tabela 12, junta com sobrevivência i.e.
duração de motilidade. Embora não houvesse diferenças entre as várias combinações de volume/densidade pela avaliação de motilidade subjetiva, houve diferenças significativas entres as preparações de esperma pequenas e grandes em densidades de colóide menores usando a avaliação de motilidade 5 objetiva com Qualisperm™. As preparações de esperma grandes não retiveram motilidade tão longamente quanto as preparações pequenas (P < 0,001).
Tabela 12: Efeito de alteração do volume e/ou da densidade de colóide usado para aumento de escala de preparações de espermatozóides de 10 garanhão sobre a motilidade e sobrevivência médias de esperma (n=23).
| Volume / densidade | Tratamento | Motilidade subjetiva (%) | Motilidade objetiva (%)* | Sobrevivência (horas) |
| 15/60 | Pequeno | 85 ±0 | 76,5 ± 20,6 | 112 ±27,7 |
| Grande | 83 ± 7,6 | 72,1 ± 16,4 | 160 ± 13,9 | |
| 15/65 | Pequeno | 86,7 ± 2,9 | 87,1 ± 3,6* | 136 ±36,7 |
| Grande | 81,7 ± 14,4 | 59,9 ± 5,9* | 144 ±41,6 | |
| 15/70 | Pequeno | 91,7 ±2,9* | 86,9 ± 2,6 | 120 ±24,0 |
| Grande | 80 ±5,0* | 82 ± 7,9 | 144 ± 24,0 | |
| 15/75 | Pequeno | 81,5 ±5,8 | 86,4 ± 14,4 | 112 ±27,7 |
| Grande | 80 ± 10 | 91,6 ±3,8 | 112 ± 13,9 | |
| 15/80 | Pequeno | 85 ±5 | 69,7 ± 16,1 | 112 ±36,7 |
| Grande | 81,7 ± 14,4 | 73,3 ± 14,5 | 112 ±27,7 | |
| 20/60 | Pequeno | 90 ±0* | ND | 96 ±24 |
| Grande | 80 ±5* | ND | 80 136,7 | |
| 20/65 | Pequeno | 90 ±0 | ND | 112 ± 13,9 |
| Grande | 85 ±5 | ND | 72 ±41,6 | |
| 20/70 | Pequeno | 86,7 15,8 | ND | 192 ±98,0 |
| Grande | 80 ±0 | ND | 104 ±50,0 | |
| 20/80 | Pequeno | 76,7 18,2 | ND | 84 ± 29,4 |
| Grande | 77,5 ± 6,89 | ND | 92 ± 18,1 |
Notas: * Qualisperm™. 1) Motilidade: sem diferenças significativas entre preparações grandes. Diferenças significativas entre tratamentos for preparações de tamanho pequeno: 15/70 versus 15/60 P < 0,05; 15/70 versus 15/80 P < 0,05; 15/70 versus 20/80 P < 0,05; 20/60 versus 20/80 P < 0,05;
20/65 versus 20/80 P < 0,05. 2) Sobrevivência: sem diferenças significativas entre preparações de amostra pequena; preparação grande 20/65 teve sobrevivência significativamente mais curta do que a preparação grande
15/60; sem diferenças significativas entre outras preparações grandes. Nota: pequeno, 0 h versus 24 h NS. Grande 0 h versus 24 h, NS. Pequeno versus grande, 0 h P < 0,05; 24 h NS.
Os resultados de DFI (Tabela 13) de novo indicaram que houve diferenças entre as preparações de controle (SLC-pequenas) e as preparações SLC-grandes onde as densidades de colóide menores foram usadas e.g. 60% e 65% (P < 0,05 a 0 h) mas não onde 70% ou maior foi usada. Contudo, estas diferenças desapareceram em 24 h. Houve sem diferença significativa entre DFI para preparações SLC-pequenas a 0 h e 24 h, ou para preparações SLC-grandes a 0 h e 24 h.
Tabela 13: Efeito de alteração do volume e/ou da densidade de colóide usado para aumento de escala das preparações de espermatozóides de garanhão sobre valores médios DFI (%) (n=23).
| Volume / densidade | Tratamento | DFI (%) 0 h | DFI (%) 24 h |
| 15/60 | Pequeno | 8,6 ± 4,4 | 11,3 ±6,7 |
| Grande | 13,7 ±7,5 | 10,2 ±4,3 | |
| 15/65 | Pequeno | 14,92 ± 1 | 5,2 ± 1 |
| Grande | 11,63 ± 1 | 22,4 ± | |
| 15/70 | Pequeno | 12,2 ±5,9 | 8,8 ±2,6 |
| Grande | 15,2 ± 11,5 | 11,5 ±6,4 | |
| 15/80 | Pequeno | 12,0 ±6 | 18,6 ±9,1 |
| Grande | 5,5 ± 1,9 | 5,0 ±2,1 | |
| 20/60 | Pequeno | 7,5 | 7,0 |
| Grande | 12,6 | 14,3 | |
| 20/65 | Pequeno | 13,7 ±2,9 | 18,2 ±3,0 |
| Grande | 7,1 ±2,1 | 8,7 ±3,6 | |
| 20/70 | Pequeno | 5,5 | 5,0 |
| Grande | 8 | 6,9 | |
| 20/80 | Pequeno | 14,3 ± 5,4 | 16,0 ±7,5 |
| Grande | 13,1 ±6,4 | 16,0 ±7,1 |
Experimento 3: preparações pequenas de esperma foram processadas como previamente descrito para experimentos 1 e 2 usando 1,5 mL de cada um de 7 ejaculados diluídos. SLC adicionais foram realizadas com um volume aumentado de ejaculados (4,5ml) dispostos em camada sobre o topo de 4 mL de colóide em tubos de centrífuga de 10 mL, designados SLC-Inc (significando volume aumentado). Após centrifugação, cada pelota de esperma SLC-Inc foi ressuspensa em 3 mL de agente diluente de Kenney novo e todas as suspensões de esperma foram armazenadas a 5°C. Concentração de esperma foi determinada para todas as preparações de SLC e rendimento de esperma foi calculado. A motilidade das preparações de esperma e do ejaculado diluído foi avaliada diariamente usando CASA (13), enquanto que a integridade de membrana foi medida a 24 h após preparação por SLC (14).
Resultados:_Os resultados de motilidade CASA são mostrados em Figura 11. Não houve diferença in motilidade entre as preparações SLCpequenas e SLC-Inc de esperma, embora houvesse diferenças significativas entre preparações não selecionadas e de ambos os tipos de preparações selecionadas de esperma em 24 h e 48 h. A suspensão de esperma não selecionada não teve motilidade mensurável após 48 h.
Dados de velocidade também não foram diferentes entre os dois tipos de preparações de esperma selecionadas por SLC (Figura 12). Embora o rendimento médio As preparações SLC-Inc maior do que para a SLC-pequena (41,2 ± 28,3% e 33,3 ± 21,3% respectivamente), esta diferença não foi estatisticamente significativa. Viabilidade de espermatozóide não foi diferente entre os dois métodos de SLC (pequena, viva 72 ± 0,3%; Inc, viva 72 ± 0,3%).
Experimento 4: Como para o experimento 3 mas com a adição de um segundo método de aumento de escala usando 15 mL de colóide (densidade 67,5%) mais 15 mL de ejaculado diluído, em um tubo Falcon de 50 mL (designado grande). Medições de motilidade subjetiva CASA (13) foram feitas diariamente, avaliações de viabilidade foram realizadas em 0 h e 24 h, enquanto que alíquotas foram congeladas para SCSA subsequente em 0 h, 24 h, 48 h e 72 h.
Resultados: Os resultados de motilidade subjetiva CASA foram similares àqueles obtidos em Experimento 3 sem diferença entre qualquer um dos métodos de SCL (Figura 13). Houve uma correlação boa entre resultados de CASA e motilidade subjetiva (r = 0,7 a 0,9 para amostras centrifugadas e não centrifugadas respectivamente; P < 0,001). Os rendimentos não foram significativamente diferentes entre os três tratamentos de SLC tratamentos (média ± SD: pequeno, 33,3 ± 20%; Inc 36,3 ± 15,8%; grande 40 ± 21,7%). Ademais, não houve diferença de viabilidade de espermatozóide entre qualquer um dos métodos de aumento de escala de SLC (Tabela 14).
Tabela 14: Proporção de espermatozóides viáveis em diferentes jreparações de esperma por SLC em 0 h e 24 h, média ± SD (n=9).
| Centrifugação de volume pequeno | Centrifugação de volume aumentado | Centrifugação de volume grande | |
| 0h | 78+11,3 | 84,9 ± 8,9 | 81,4+ 11,5 |
| +24 | 76,5+11,3 | 81,4+8,9 | 76,6 ± 9,0 |
Sem diferença significativa entre qualquer um destes tratamentos de centrifugação. Diferenças significativas foram encontradas em DFI médio entre as amostras não centrifugadas e centrifugadas, embora houvesse uma interação com o tempo, visto que as amostras não centrifugadas mostraram qualidade de esperma deteriorada com armazenagem enquanto que a integridade de cromatina das amostras centrifugadas não deteriorou com o tempo (Tabela 15).
Tabela 15: Efeito de diferentes métodos de aumento de escala sobre a integridade de cromatina de espermatozóide de garanhão, média ± SD (n=9).
| Centrifugação de volume pequeno | Centrifugação de volume aumentado | Centrifugação de volume grande | |
| Oh | 20,7+10,2 | 14,2 ± 7,7 | 13,9 + 6,8 |
| 24 | 19,2+11,3 | 12,9 ± 8,0 | 19,2+10,4 |
| 48 h | 15,0 + 8,0 | 13,0+8,0 | 21,0+ 14,0 |
| 72 h | 17,0+ 10,0 | 18,0+ 11,0 | 22,0 ± 8,0 |
Conclusão: É possível aumentar a escala da SLC pelo aumento do volume de ejaculado diluído usado sobre 4 mL de colóide. Contudo, para aumento adicional em volume é necessário usar um tubo de centrífuga maior e ajustar a densidade de colóide, como mostrado em Tabela
16. Estes ajustamentos produzem preparações de esperma que são equivalentes ao original em qualidade e rendimento de esperma, baseado em motilidade de espermatozóide, viabilidade e integridade de cromatina.
Tabela 16: Comparação de parâmetros dando qualidade comparável em preparações de esperma de escala aumentada e a preparação original.
| Volume de colóide (mL) | Densidade de colóide | Volume ejaculado diluído (mL) | |
| Original | 4 | 80 | 1,5 |
| Volume aumentado | 4 | 80 | 4,5 |
| Aumento de escala grande | 15 | 67,5 | 15-18 |
EXEMPLO 5: Touro
Objetivos: (i) para investigar a capacidade de fertilização de espermatozóides bovinos preparados quer sobre um gradiente de densidade quer sobre uma camada única de colóide em IVF. (ii) para investigar o uso de centrifugação sobre colóide para selecionar espermatozóides de tamanho normal de uma população polimórfica em um ejaculado de touro.
Métodos: para o primeiro experimento, canudos de espermatozóides de touro criopreservados foram tomados disponíveis na Universidade de Gent, onde o teste de IVF foi realizado. Antes da centrifugação, os canudos de sêmen diluído foram descongelados em água a 37°C por 12 segundos e a concentração foi ajustada para 100 x 106 milhões por mL. Centrifugação sobre colóide foi realizada como descrito para sêmen de garanhão usando colóide E 80% para a centrifugação sobre camada única e 2 mL de 40% mais 2 mL de colóide E 80% para o gradiente de densidade. Análise computadorizada de motilidade de espermatozóide (CASA) nos controles não centrifugados e em ambos os tipos de preparações de esperma foi realizada por um operador experiente usando um analisador de motilidade Hamilton Thome. Dados foram colhidos para os seguintes parâmetros: velocidade do caminho aplanado, velocidade em linha reta, velocidade curvilinear, amplitude de desvio de cabeça lateral, frequência transversal de batida, retidão, linearidade, concentração, motilidade %, motilidade progressiva %, motilidade rápida %, motilidade média %, motilidade lenta % e estática %. Métodos padrão (16) foram usadas para IVM e IVF para determinar a taxa de fertilização (10). Cultura dos oócitos fertilizados foi continuada por 8 dias, após os quais o desenvolvimento % para blastocisto e o 5 número total de células foram avaliados. Para o segundo experimento, ejaculados foram coletados de um touro conhecido por produzir espermatozóides tanto diplóides quanto haplóides. Os espermatozóides eram elevadamente polimórficos, com espermatozóides macrocefálicos e microcefálicos presentes, juntos com uma variedade inteira de 10 espermatozóides que eram de tamanho aproximadamente normal. O sêmen foi criopreservado na Universidade de Helsinki, Finlândia na maneira costumeira. Os canudos foram enviados para SLU para experimentação posterior. Antes da centrifugação, os canudos de sêmen diluído foram descongelados em água a 37°C por 12 segundos e o sêmen foi diluído com Tampão B. Camadas 15 únicas de colóide de densidades diferentes variando de 40-90% do colóide de estoque, foram usadas para identificar densidades adequadas para uso subsequente em um gradiente de densidade. Centrifugação sobre colóide foi realizada como previamente descrito, com a pelota de esperma resultante sendo ressuspensa em Tampão B. lâminas pré-coloridas (Testsimplets; Online 20 Diagnostics, Alemanha) foram usadas para colorir os espermatozóides para exame microscópico. A proporção de espermatozóides macrocefálicos em 200 espermatozóides das amostras de esperma não centrifugadas e centrifugadas foi registrada.
Resultados (primeiro experimento): Taxa de fertilização média, taxa de desenvolvimento de blastocisto e número total de células foram 56,27% ± 29,1, 23,5% ± 17,4 e 83,2 ± 29,9 respectivamente para espermatozóides preparados por gradiente de densidade, e 58,1% ± 23,3, 24,5% ± 14,3 e 94,6 ± 23,4 respectivamente para espermatozóides preparados sobre uma camada única de colóide. Valores médios de vários parâmetros de
Petição 870180147296, de 01/11/2018, pág. 12/15 análise computadorizada de motilidade de espermatozóide não foram diferentes entre os dois métodos de preparação de esperma (Tabela 17).
Tabela 17: parâmetros de CASA de espermatozóides bovinos preparados por gradiente de densidade e centrifugação sobre camada única.
| Parâmetro | Camada única | Gradiente de densidade | Parâmetro | Camada única | Gradiente de densidade |
| VAP | 112,36 ±9,93 | 111,1 ±8,87 | Cone | 37,68 ± 17,69 | 36,96 ± 20,3 |
| VSL | 95,4 ± 8,87 | 94,92 ± 10,58 | % mot | 75,4 ± 10,5 | 71,41 ±7,09 |
| VCL | 171,48 ± 10,98 | 167,44 ± 16,18 | % prog | 61,4 ± 13,3 | 54,8 ± 16,8 |
| ALH | 7,08 ± 0,57 | 6,98 ±0,71 | % rápido | 69,4 ± 11,04 | 64,6 ± 17,87 |
| BCF | 23,12 ±5,63 | 23,3 ± 5,54 | % médio | 6,6 ± 1,95 | 6,6 ± 1,95 |
| STR | 82,2 ± 2,28 | 83 ± 4,04 | % lento | 14 ±6,12 | 15,2 ±9,49 |
| LIN | 55,6 ± 4,05 | 56,2 ± 3,70 | % estático | 10,4 ± 6,69 | 13,4 ±8,53 |
Nota: não houve diferenças significativas.
(ii) Os resultados da centrifugação sobre camada única com os espermatozóides polimórficos são mostrados em Tabela 18. Quase todos os espermatozóides foram capazes de passar através das camadas únicas de colóides 40% e 50%. A proporção mais alta de espermatozóides macrocefálicos foi encontrada na pelota após uma camada única de 60% (49% de macrocefálico), diminuindo de novo para 27% de macrocefálico quando a densidade de colóide foi aumentada para 70%. Usando um gradiente de densidade com camadas de 70/55%, foram identificadas duas subpopulações, uma enriquecida com o esperma de tamanho normal na interface entre as duas camadas (8% de esperma macrocefálico e 92% de normal), enquanto que a pelota de esperma foi enriquecida com esperma macrocefálico (34%) Usando densidades de colóide de 55% e 70%, foi possível obter duas subpopulações de esperma, uma contendo espermatozóides de tamanho quase normal, e a outra enriquecida com os espermatozóides macrocefálicos (Tabela 19). Os espermatozóides microcefálicos foram selecionados pelo colóide de densidade mais baixa e portanto não apareceram em qualquer uma das subpopulações selecionadas.
Tabela 18: Proporções de espermatozóides de tamanhos diferentes antes da e após a centrifugação sobre camada única de espermatozóides de touro.
| Grande | Pequena | Restante | ||
| Antes | 24 | 6 | 70 | |
| Após SL 40% | Pelota | 35,5 | 1 | 63,5 |
| Colóide (apenas números pequenos) | 23 | 4 | 73 | |
| Antes | 26 | 6 | 68 | |
| Após SL 60% | Pelota | 49 | 2 | 49 |
| Colóide | 14 | 3 | 82 | |
| Após SL 70% | Pelota | 27 | 3,5 | 69,5 |
| Colóide | 15 | 3,5 | 80 |
Tabela 19: Proporções de espermatozóides de tamanhos diferentes antes de e após a centrifugação sobre gradiente de densidade de espermatozóides de touro.
| Grande | Restante | Pequeno | ||
| Antes | 32 | 65 | 3 | |
| Após 70/55 | Peloya | 34 | 64,5 | 1,5 |
| colóide70 | 17 | 81,5 | 1,5 | |
| Interface | 8 | 92 | 0 | |
| Topo (< 55%) (números pequenos) | 10 | 83,5 | 6,5 |
Conclusões:
1) Espermatozóides preparados sobre uma camada única de colóide não são diferentes em comportamento ou propriedades dos espermatozóides preparados sobre um gradiente de densidade.
2) Usando uma combinação de centrifugação sobre camada única e centrifugação sobre gradiente de densidade, foi possível separar os espermatozóides em subpopulações diferente, e.g. uma contendo todos os espermatozóides de tamanho quase normal, e a outra enriquecida com espermatozóides macrocefálicos.
EXEMPLO 6: Varrão
Objetivo: (i) para investigar o efeito do aumento da osmolaridade de uma formulação de colóide e o tamanho do tubo de centrífuga sobre a eficácia de seleção de esperma de varrão durante a centrifugação sobre gradiente de densidade, tendo em vista o desenvolvimento de formulações de colóide específicas para espermatozóides de animal, (ii) comparar centrifugação sobre gradiente de densidade com a centrifugação sobre uma camada única de colóide para preparar espermatozóides de varrão, (iii) o efeito da autoclavagem do colóide, e (iv) o efeito de lavagem da pelota de esperma após a centrifugação sobre colóide.
Métodos: a fração do ejaculado rica em esperma livre de gel foi coletado de 8 varrões usando o método de mão enluvada e foi imediatamente diluída 1:1 (v/v) em Solução de Descongelamento de Beltsville. Concentração de esperma foi ajustada para 100xl06/mL. Centrifugação sobre gradiente de densidade e centrifugação sobre camada única foram realizadas de acordo com o método previamente descrito, usando colóide A 80% para a centrifugação sobre camada única e 2 mL de colóide A 40% mais 2 mL de colóide A 80% para o gradiente de densidade. Em um experimento, pelotas de esperma duplicadas foram quer lavadas (por ressuspensão da pelota em 5 mL de agente diluente de esperma e centrifugação a 500 g por 10 min.), quer não lavadas. Motilidade de espermatozóide nas amostras de esperma não selecionadas e selecionadas foi avaliada subjetivamente como segue: alíquotas (0,5 pL) foram examinadas por microscopia de luz de contraste de fases (x 200), em um estágio de microscópio aquecido (38°C) imediatamente após preparação e subsequentemente em uma base diária até que a motilidade tivesse caído para aproximadamente 20%. Para as avaliações em dias subsequentes, as preparações de esperma foram armazenadas durante a noite na temperatura ambiente (19-24°C, dependendo das condições climáticas) e foram incubadas a 38°C por 15-30 minutos antes da avaliação de motilidade. Taxa de recuperação (rendimento) foi calculada como a proporção de espermatozóides inicialmente carregados sobre o topo do colóide que apareceram na pelota de esperma após a centrifugação.
Resultados: aumento da osmolaridade do colóide usado para centrifugação sobre gradiente de densidade de espermatozóides de varrão de 305 mOsm para 330 mOsm aumentou a proporção de espermatozóides móveis na preparação de esperma resultante (Figures 14 e 15). Motilidade de espermatozóide foi retida por pelo menos mais 24 horas nas preparações centrifugadas de esperma do que nos controles (alíquotas não centrifugadas), isto é, 7 ou 8 dias para espermatozóides centrifugados sobre um gradiente de densidade comparado com menos do que 6 dias para espermatozóides não centrifugados. Para a comparação da camada única de colóide e gradiente de densidade, motilidade de espermatozóide foi significativamente melhor (P <0,001) nas preparações centrifugadas de esperma (médias ± sd: 79,6 ± 8,1% e 74,2 ± 12,0% para camada única e gradiente de densidade respectivamente) do que nos controles não centrifugados (62,9 ± 12,7%). O número de espermatozóides obtidos após centrifugação (Tabela 20) e o rendimento médio não foram diferentes entre os dois métodos (rendimento médio de espermatozóides móveis, camada única: 67,5 ± 25,6%; gradiente de densidade: 59,6% ± 22,3%). Sobrevivência de esperma (Figura 16) foi significativamente aumentada pela centrifugação sobre colóide (preparações não centrifugadas 3,1 ± 0,3 dias, SL 5,5 ± 0,79 dias, DG 5,75 ± 0,62 dias; P < 0,001 para não centrifugado versus centrifugado; SL versus DG, ns). Incubação antes da avaliação de motilidade foi necessária para amostras de esperma armazenadas (Figura 17). A presença de bactérias nas amostras de esperma não centrifugadas pode ter contribuído para a morte dos espermatozóides. Centrifugação sobre colóide pareceu remover as bactérias (avaliação visual subjetiva). Autoclavagem da formulação de colóide não teve um efeito sobre números de espermatozóides, motilidade de espermatozóide ou sobrevivência de esperma (Tabela 21). Ademais, lavagem de pelota de esperma obtida após a centrifugação sobre colóide versus não lavagem da pelota de esperma não teve efeito sobre números de espermatozóides, motilidade de espermatozóide ou sobrevivência de esperma (Tabela 22). Espermatozóides de varrão puderam ser armazenados por 24 horas antes da centrifugação sem haver um efeito prejudicial sobre a motilidade de espermatozóide e a duração de motilidade nas preparações centrifugadas (Figura 18).
Tabela 20: Número de espermatozóides de varrão obtidos após centrifugação sobre gradiente de densidade e sobre camada única, média ± desvio padrão (milhões) (n=20)
| Varrão | Camada única | Gradiente de densidade | Valor de P |
| 87 | 107,17 + 20,3 | 84,5 ± 20,0 | NS |
| 1500 | 49,5 ± 28,7 | 45,2+15,8 | NS |
| 62 | 88,7 + 31,8 | 90,7 ± 25,4 | NS |
| 367 | 93,2 ± 25,5 | 90,8 ± 32,7 | NS |
Nota: Diferenças entre varrões são significativas (P < 0,01) mas não entre ejaculados.
Tabela 21: Efeito da autoclavagem do colóide sobre a motilidade de espermatozóide, sobrevivência de esperma e número de espermatozóides na pelota.
| Parâmetro | Autoclavado | Não-autoclavado |
| Motilidade de espermatozóide no Dia 1 (%) | 78,6 ± 8,7 | 81,4 + 6,4 |
| Sobrevivência de esperma (dias) | 4,7+1,2 | 4,5 ± 1,3 |
| Número de espermatozóides (xlO6) | 88,5 + 30,1 | 77,5 ± 30,2 |
Nota: diferenças entre colóides autoclavados e não-autoclavados não foram significativas.
Tabela 22: Efeito de lavagem a pelota de esperma após a centrifugação sobre colóide sobre a motilidade de espermatozóide, sobrevivência de esperma e número de espermatozóides.
| Parâmetro | Lavada | Não lavada |
| Motilidade de espermatozóide no Dia 1 (%) | 80,7+ 10,3 | 75,4 ± 9,9 |
| Sobrevivência de esperma (dias) | 6,1 ± 1,2 | 5,4+1,1 |
| Número de espermatozóides (xlO6) | 82,5 ± 32,5 | 73,8 + 24,1 |
Nota: diferenças entre pelotas de esperma lavadas e não lavadas não foram significativas.
Conclusão: aumento da osmolaridade da formulação de colóide melhora a seleção de espermatozóides durante a centrifugação sobre gradiente de densidade. Centrifugação sobre uma camada única de colóide produz preparações de esperma que são similares em motilidade e rendimento àqueles de gradientes de densidade, e estas preparações mostram motilidade de espermatozóide e duração de sobrevivência melhoradas comparadas com as amostras de esperma de controle (não centrifugadas).
EXEMPLO 7: Cão
Objetivo: para investigar se centrifugação sobre camada única (SLC) é benéfica em seleção de espermatozóides de cão de qualidade boa para inseminação.
Métodos: ejaculados de várias qualidades de esperma de quatro cães foram coletados por manipulação digital. Alíquotas (4,5 mL) foram dispostas em camadas sobre o topo de 4 mL colóide E 80% em um tubo de centrífuga de 12-mL. Após centrifugação a 300 g por 20 min, a pelota de esperma resultante foi ressuspensa em agente diluente gema-de-ovo-Tris (1 mL) (17). Uma alíquota do ejaculado não selecionado foi diluída em agente diluente gema-de-ovo-Tris para a mesma concentração de esperma que a da preparação de esperma selecionada. Avaliação de motilidade usando análise de esperma assistida por computador (CASA) e avaliação morfológica foram conduzidas em todas as amostras de esperma selecionadas e não selecionadas.
Resultados: motilidade de espermatozóide média foi aumentada de 77,2 ± 19,6% antes de SLC para 87,6 ± 2,7% após SLC enquanto que motilidade progressiva média foi aumentada de 48,6 ± 18% para 67,9 ±11% (Tabela 23). Morfologia normal média foi 62,2 ± 42,8 em amostras não selecionadas e 82,5 ± 19,1% em amostras selecionadas por SLC. Após armazenagem por 7 dias a 4°C, motilidade de espermatozóide foi <5% em amostras de esperma não selecionadas e 57 ± 11,3% nas preparações de esperma selecionadas por SLC. O rendimento de esperma variou de 12-47% dependendo da qualidade do esperma no ejaculado original.
Tabela 23: Resultados de mobilidade por análise de esperma assistida por computador (CASA) para amostras de esperma de cão não selecionadas e selecionadas por SLC.
| Motilidade total (%) | Motilidade Progressiva (%) | Rendimento (%) | |||
| Cão | não selecionada | selecionada | não selecionada | selecionada | |
| 1 | 48,3 | 84,1 | 34,3 | 81,8 | 12 |
| 2 | 82,3 | 90 | 69 | 68,5 | 47 |
| 3 | 87,9 | 89,5 | 32,5 | 54,5 | 47,5 |
| 4 | 90,4 | 86,9 | 58,7 | 67,5 | 30 |
| Média (SD) | 77,2(19,6) | 87,6 (2,7) | 48,6(18) | 67,9(11) | 34,1 (16,9) |
Conclusão: Estes resultados preliminares indicam que SLC pode ser um método útil para melhorar a qualidade de esperma de cão em doses de esperma para AI.
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Claims (11)
- REIVINDICAÇÕES1. Composição para separação de espermatozóides de uma amostra de sêmen, caracterizada pelo fato de consistir de- água,- cloreto de sódio em uma concentração de 97,5-140,0 mM;- cloreto de potássio em uma concentração de 4,0-5,5 mM;- glicose em uma concentração de 1,0-1,4 mM;- EDTA em uma concentração de 0,10-0,14 mM;- HEPES em uma concentração de 15,0-19,0 mM;- Citrato trissódico em uma concentração de 4,8-8,3 mM;- lactato em uma concentração de 0-4,0 mM; e- partículas de sílica revestidas com silano em uma concentração de 300-1000 g/L, dita composição tendo um pH de 7,0-7,35 e uma osmolaridade de 300-345 mOsm.
- 2. Método para preparar espermatozóides de uma amostra de sêmen de um animal não-humano, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de separar os espermatozóides dos outros constituintes do sêmen por centrifugação através de uma camada única de uma formulação de colóide, em que a formulação de colóide é uma composição como definida na reivindicação 1.
- 3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a densidade da formulação de colóide está dentro da faixa de 1,051,14 g/mL.
- 4. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a osmolaridade da formulação de coloide é 320-330 mOsm.
- 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a4, caracterizado pelo fato de que a separação é realizada em um recipiente com um volume de 10 mL ou maior, tal como 50-200 mL.Petição 870180147296, de 01/11/2018, pág. 13/15
- 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a altura do coloide é 30-45 mm.
- 7. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a composição de colóide é uma diluição de tampão 65-70% de uma formulação de coloide estoque tendo uma densidade de 1,14 g/mL.
- 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a7, caracterizado pelo fato de que a amostra de sêmen não é oligospérmica.
- 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a8, caracterizado pelo fato de que os espermatozóides são separados de plasma seminal e de seus componentes celulares ou não-celulares.
- 10. Método para separar uma subpopulação de espermatozóides de interesse de uma amostra de sêmen de um animal não humano, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:formar um gradiente de densidade tendo pelo menos duas camadas da composição como definida na reivindicação 1, cada camada tendo uma densidade diferente;separar as subpopulações de espermatozóides na amostra de sêmen por centrifugação através do gradiente de densidade; e selecionar a subpopulação de espermatozóides de interesse.
- 11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a subpopulação de espermatozóides é de espermatozóides haplóides de sêmen de touro.
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