SE535788C2

SE535788C2 - Komposition för separation av spermier från ett spermaprov

Info

Publication number: SE535788C2
Application number: SE0950143A
Authority: SE
Inventors: Jane Morrell; Heriberto Rodriguez-Martinez
Original assignee: Jane Morrell; Rodriguezmartinez Heriberto
Priority date: 2007-09-07
Filing date: 2008-09-05
Publication date: 2012-12-18
Also published as: EP2198015B1; BRPI0816375B1; SE0950143L; WO2009031970A1; SA08290560B1; CA2698988C; US20110004051A1; AR068224A1; BRPI0816375A2; US8939887B2; ES2656799T3; CA2698988A1; EP2198015A4; EP2198015A1

Abstract

Sammanfattning Föreliggande uppfinning avser området av veterinärmedicin, i synnerhetkompositioner och metoder som är användbara för att bearbeta djursperma föranvändning vid assisterad reproduktion. Uppfinningen avser en komposition förseparation av spermier från ett spermaprov, vilken innefattar åtminstone ett salt aven alkalimetall, och/ eller en alkaliskt jordartsmetall, EDTA, en zwitterjonsbuffert,silan-belagda silikapartiklar och vatten, varvid kompositionen har ett pH av 7,0-7,35 och en osmolaritet av 300-345 mOsm. Dessutom avser den en metod för attbereda spermier från ett spermaprov från ett icke-humant djur, vilken metodinnefattar steget av separation av spermierna från andra spermabeståndsdelargenom centrifugering igenom ett enkelskikt av en kolloid formulering. Företrädesvisär den kolloida formuleringen en komposition enligt uppfinningen. Uppfinningenavser också en metod för separation av en spermiesubpopulation av intresse frånett spermaprov från ett icke-humant djur, vilken metod innefattar stegen avtillhandahållande en densitetsgradient innefattande åtminstone två skikt avkompositionen enligt uppfinningen, varvid varje skikt har olika densiteter,separation av spermiesubpopulationer i spermaprovet genom centrufigering genomdensitetsgradienten och selektering av spermiesubpopulationer av intresse.Slutligen avser uppfinningen spermier beredda med metoderna enligt uppfinningenoch användningen av sådana spermier för artificell insemination, in vitro- fertilisering eller intracytoplasmatisk spermieinjektion.

Description

20 25 30 535 788 en osmolaritet inom intervallet 300-310 mOsm, t ex Equipure och Bovipure (båda framställda av Nidacon International). Även om Bovipure rapporterades ge bra resultat för att bearbeta nötkreatursperrnier för IVF (4), gav användningen av Equipure såsom en densitetsgradient för hingstspermier inte samma gynnsamma effekter på spermiekvaliteten (5) som har rapporterats för humanspermier (6).

Beredningen av humana spermaprover utförs vanligtvis i 1,5 ml alikvoter av sperma. Även om beredningen av djursperma i sådana små volymer år adekvat för att bereda spermier för IVF eller ICSI, är avsevärt större spermieantal nödvändiga för artíﬁciell insemination i djur. Följaktligen ñnns det ett behov av enkla och lämpliga metoder fór att bereda spermier från djursperma på platsen för insamlingen därav och i adekvata antal för användning i artiñciell ínsemination.

Det finns också ett behov av djurspeciﬁka kompositioner som lämpar sig för sådana metoder.

Sammanfattning av uppfinningen I en första aspekt avser föreliggande uppfinning en komposition för separation av spermier från ett spermaprov, innefattande åtminstone ett salt av en alkalimetall, och / eller en alkalisk jordartsmetall, EDTA, en zvvitterjonsbuffert, silanbelagda silíkapartiklar och vatten, varvid kompositionen har ett pH av 7 ,O-7 ,35 och en osmolaritet av 300-345 mOsm.

I en utföringsform av denna aspekt innefattar kompositionen: - natriumklorid i en koncentration av 97 ,5-l40,0 mM - kaliumklorid i en koncentration av 4,0-5,5 mM - glukos i en koncentration av 1,0-1,4 mM ~ EDTA i en koncentration av 0, 10-O, 14 mM - HEPES i en koncentration av 15,0-19,0 mM - tri-natriumcitrat i en koncentration av 4,8-8,3 mM - laktat i en koncentration av 0,0-4,0 mM; och - silanbelagda silikapartiklar i en concentration av 300- 1000 g/ 1.

I en ytterligare utföringsform av denna aspekt har kompositionen ett pH inom intervallet 7,10-7,25, företrädesvis ca 7,15 innan den autoklaveras. Kompositionen 10 15 20 25 30 535 788 har vidare företrädesvis en osmolaritet av 320-345 mOsm, såsom 320-330 mOsm.

Den genomsnittliga diametern av de silanbelagda silikapartiklarna kan vara 10- 1000 nm, företrädesvis 10-100 nm.

I ytterligare en aspekt avser uppfinningen en metod för att bereda spermier från ett spermaprov från ett icke-humant djur, vilken innefattar separation av spermierna från andra spermabeståndsdelar genom centrifugering av spermaprovet genom ett enkelskikt av en kolloidformulering.

I en utföringsforrn av denna aspekt använder metoden kompositionen enligt den första aspekten.

I en utföringsform av denna aspekt ligger densiteten hos kolloidfonnuleringen inom intervallet 1,05-1,14 g/ ml, såsom 1,051- 1,1 1 g/ml. Formuleringen kan ha ett pH av 6,8-7,4, företrädesvis 7,0-7,3 och en osmolaritet av 300-345 mOsm, såsom 320-330 mOsm.

I en utföringsform av denna aspekt utförs metoden i en behållare som inte år av plast, såsom en glasbehållare.

I en utföringsform av denna aspekt utförs metoden i behållare med en volym av 10 ml eller mer än 10 ml, såsom 50-200 rnl. Höjden av den kolloida fonnuleringen i behållaren kan vara 30-45 mm.

I en utföringsform av denna aspekt bearbetas hela ejakulatet.

I en utföringsform av denna aspekt är djuret en fågel eller ett däggdjur, såsom en häst, tjur, gris eller hund.

I en utföringsform av denna aspekt år den genomsnittliga diametern av de belagda silikapartildarna 10-1000 nm, företrädesvis 10-100 nm.

I en utföñngsform av denna aspekt är spermaprovet inte oligospermískt. 10 15 20 25 30 535 788 I en utföringsform av denna aspekt separeras spermier från sâdesplasman och de cellulära och icke-cellulära komponenterna av sådesplasman, såsom bakterier, virus, leukocytes, partiklar etc. Varje separerad komponent kan användas separat.

I en utföringsform av denna aspekt används metoden för att förlänga varaktigheten av spermiemotiliteten. Detta beskrivs vidare i exemplen nedan.

I en utföringsform används metoden för att reducera variationen i spermiekvalítet mellan ej akulat. Detta beskrivs vidare i exemplen nedan.

De olika utföringsforrnerna av metoden enligt uppfinningen kan kombineras med varandra.

I ytterligare en aspekt avser uppfmningen en metod för att separera en sperrniesubpopulation av intresse från ett sperrnaprov från ett icke-humant djur, innefattande stegen av tillhandahållande av en densitetsgradient innefattande åtminstone två skikt av kompostionen enligt den första aspekten, varvid varje skikt har olika densiteter, separation av spermiesubpopulationer i spermaprovet genom centrifugering genom densitetsgradienten och selektion av sperrniesubpopulationen av intresse.

Denna spermiesubpopulation kan t ex vara haploida spermier eller spermier som har normal rörlighet, med ursprung från häst, nötkreatur eller gris.

Slutligen avser uppfmningen spermier som är bearbetade med metoden enligt uppfmningen och användningen av sådana spermier i AI, IVF och ICSI.

Kort beskrivning av figurerna Figur 1: Effekt på hingstspermieöverlevnad under användning av färsk eller lagrad sperma fór kolloid centrifugering (n= 12). Anm.: insamlingsdag= dag 1; följaktligen är dag 2= 24 timmar; dag 3= 48 timmar etc. 10 15 20 25 30 535 788 Figur 2: Effekt av tvättning (n=38) respektive ej tvättning av spermiepelleten efter enkelskiktscentrifugering på genomsnittliga subjektiva motílitetbedömningar (%).

Figur 3: Effekt av osmolariten hos kolloider på hingstspermier med normal morfologi efter kolloid centrífugering (n=15).

Figur 4: Effekt av kolloid osmolaritet på spermiekromatindefekter (n=l2).

Figur 5: Effekt av separation av spermier från sädesplasman utan åtföljande selektion av spermierna för bra kvalitet under användning av kolloid densitet (n=3).

Figur 6: Jämförelse av olika densiteter av kolloiden (80% och 60%) som används för enkelskiktscentrifugering (n=8).

Figur 7: Effekt av uppskalning av enkelskiktscentrifugering på utbytet av hingstspennier: kontroll (4 ml kolloid plus 1,5 ml utspâtt ejakulat), indexerat till 1 för varje behandling.

Figur 8: Subjektiv motilitet i spermaprover fóre och efter enkelskiktscentrifugering, under jämförande av små (4,0 ml kolloid plus 1,5 ml utspått ejakulat] och stora (20 ml kolloid och 7,5 ml utspätt ejakulat) behandlingar (n=8).

Figur 9: Subjektiv motilitet i spermaprover före och efter enkelskíktscentrifugering, under jämförande av små (4,0 ml kolloid plus 1,5 ml utspätt ejakulat) och extra stora (60 ml kolloid och 22,5 ml utspått ej akulat) behandlingar (n=4).

Figur 10: Effekt av uppskalning av den kolloida centrifugeringen på hingstspermiernas viabilitet (n=8).

Figur 11: Effekt av uppskalningen av den kolloida centrífugeringen på hingstspermiernas motilitet (n=7). 10 15 20 25 30 535 788 Figur 12: Effekt av uppskalningen av den kolloida centriﬁigeringen på hingstspermiernas hastighet (n=7).

Figur 13: Effekt av ökning av både kolloidens volym och ej akulatets volym på hingstspermiernas motilitet (n=9).

Figur 14: Effekt av kolloidens osmolaritet på galtspermiers motilitet efter densitetsgradientcentrifugering i små och stora centrifugrör: osmolaritet 305 mOsm (n=4). Anm.: dag 1 är dagen för beredning; dag 2 år plus 24 timmar etc.

Figur 15: Effekt av kolloidens osmolaritet på galtspermiers motilitet efter densitetsgradientcentrifugering i små och stora centrifugrör: osmolaritet 330 mOsm (n=8). Anm.: dag 1 är dagen för beredningen; dag 2 är plus 24 timmar etc.

Figur 16: Jämförelse av densitetsgradientcentrifugering och enkelskíktscentrifugering av galtsperrnier (n=l2 ejakulat). Anm.: dag 1 är dagen för beredningen; dag 2 är plus 24 timmar etc.

Figur 17: Effekt av inkubation i 37°C på motiliteten av galtspermier från enkelskiktsberedningar (n= 18 ejakulat).

Figur 18: Jämförelse av kolloid centrifugering under användning av färska respektive lagrade galtsperrnier (n=12 ejakulat).

Detaljerad beskrivning av uppfinningen Föreliggande uppfinning syftar till att förbättra kompositioner och metoder inom tidigare teknik för att bereda spermier från olika djurejakulat med avseende på kvalitet och även enkelhet hos denna beredning. Förbåttringen av sperrniekvalitet inkluderar förlängning av spermieöverlevnad, förbättrad spermiemotilitet, viabilitet, morfologi, kromatinintegritet och fertiliseringsförmåga. Förbåttringama av metoderna inkluderar ökat utbyte, enkelhet att genomföra metoden, kapacitet att bearbeta stora volymer av ejakulat, selektion av spermiesubpopulationer och optimering för de enskilda arterna. Detta specificeras vidare i exemplen. 10 15 20 535 788 Kompositionen enligt uppfinningen kan produceras som en stamkomposition.

Denna stamkomposition har en densitet av ungefär 1,14 g/ ml. Stamkompositionen kan användas outspädd för bestämda applikationer men kan också spädas med en lämplig buffert. Lämpliga spädningar är exempelvis 80%, 70%, 67,5%, 65%, 60% och 40% av stamkornpositionen. De utspädda kompositionerna kan naturligtvis också bearbetas direkt, utan att en stamlösning först produceras.

De silanbelagda silikapartiklarna som används i metoden kan vara en kommersiellt tillgänglig produkt, såsom RediGrad som kan erhållas från GE Healthcare, eller någon annan partikelkomposition med jämförbara egenskaper.

Några exempel på kompositioner enligt uppfinningen ges som stamlösning A (lämplig för användning med grisarter) och stamlösning E (lämplig för andra arter, såsom häst, nötkreatur eller hund) i tabell I nedan. Buffert E och buffert A kan användas för att framställa motsvarande utspädda kompositioner, men andra buffertar kan också användas. Buffert A kan exempelvis ersättas med Beltsville Thawing Solution (BTS) i spädning av stamlösning A. I dessa exempel på stamlösningar är pH ca 7,15, men pH ökar under autoklavering till ca 7,33. 10 15 535 788 8 Tabell I Stamlösning Stamlöaning Buffert Buffert 80%E 80% A Kemikalie E mM A nrM E mM A mM mM mM NaCl 104 113 135 121 115 113 KC] 4,3 *_ v 5,5 5,0 4,7 4,7 Glukos 1,1 1,2 1,2 1,3 1,2 1,2 EDTA 0,11 0,13 _ 0,13 0,12 0,13 0,13 HEPES 16 18 18 19 18 18 CaClz 2,5 2,7 0 O 0 2,7 Na-citrat 7,6 8,1 5,8 1,6 Ca-laktat 3,0 2,5 O Na-laktat 19 3,8 H20 * 1 1 l 1 0,2 1 0,2 l RediGrad 1 1 1 1 0,8 1 0,8 1 l 'šensitet 1,13 :t 0,005 w Osm 320 330 320 330 320 330 pH 7,15-7,35 7,15-7,35 7,15 7,15 * vatten-för-injektion-kvalitet En ny metod är nödvändig för att förlänga den användbara livslängden av hingstspermier som år avsedda för A1. Föreliggande uppfinnare jämförde densitetsgradientcentrifugering eller centrifugering genom ett enkelskikt av kolloid såsom potentiella metoder för att bereda hingstspermier. Båda metoderna verkade förlänga varaktigheten av spermiemotilitet jämfört med ocentrifugerade spermier (P< 0,001), vilket därmed potentiellt förlänger den användbara livslängden av behandlade hingstspermier för AI. Dessutom gjordes en jämförelse av effektiviteten av selektionen under användning av (i) färskt insamlad, utspâdd hingstsperma och (ii) spermaprover lagrade över natten vid 4°C, före bearbetningarna.

För färsk, utspädd spenna, sågs ett liknande utvinningsutbyte av rörliga spermier för de två beredningsmetoderna (27,0 i 6,56 miljoner spermier mot 32,6 i 7,79 för enkelskikt respektive densitetsgradienteﬂ. Emellertid förminskades utbytet med 18- 20%, då sperma lagrad under kyla användes för centrifilgering jämfört med färsk sperma, och en större variation sågs mellan ejakulaten än mellan färska ejakulat. lO 15 20 25 30 535 788 Återigen förbättrades sperrniemotilitet och sperrnieöverlevnad i de centrifugerade spermieberedningarna jämfört med lagrade, obearbetade ej akulat. Slutsatsen kan därmed dras att de två kolloida centrifugeringsteknikerna ger ekvivalenta spermie- beredningar och att enkelskiktsmetoden skulle vara lärnplig för användning på fältet. Detta beskrivs vidare i exempel 1.

Spermiemorfologi och kromatinintegritet har knutits till hingstsperrniernas fertiliteten. Tidigare studier med humana ejakulat har visat att andelen spermiema med normal morfologi och med intakt kromatin kan ökas under användning av densitetsgradientcentrifugering (6). Föreliggande uppfinnare undersökte huruvida en sådan metodik kunde vara effektiv för hingstsperrna, genom att använda antingen densitetsgradientcentrifugering eller den ovannämnda nya metoden, enkelskiktscentrifugering. Det fanns en sigçniﬁkant höjning i andelen morfologiskt normala sperrnier i spermieberedningarna efter kolloidal centrifugering oavsett vilken centrifugeringsmetod som användes (före centrifugering 67,5 :t l3,06%; efter enkelskiktscentrifugering 77,1 d: 9,3%; efter densitetsgradientcentrifugering 76,7 i 8,7 %; P < 0,001). Vidare minskade variationen mellan hingstar betydligt genom centrifugeringen. Några av de morfologiska abnorrnalitietema minskade betydligt efter kolloidal centrifugering, t ex minskade förekomsten av proximala cytoplasmadroppar med 20%, och förekomsten av distala cytoplasmadroppar med 50%, under det att kolloidal centrifugering hade liten effekt på proportionerna av förekomsten av smala eller päronforrnade huvuden. Sammantaget tyder dessa resultat på att kolloidal centrifugering är en lämplig metod för att skörda morfologiskt normala spermier från ejakulat som ska användas i AI och som dessutom delvis kan minska variationen som ses mellan hingstar. Detta beskrivs vidare i exempel 1.

Dessutom gav de båda metodema av kolloidal centrifugering spermiepreparationer där kromatinirrtegriteten förbättrades signifikant (DNA-fragmenteringsindexet i icke-selekterade preparationer: 11,0 i 4,6; enkelskiktscentrifugering: 4,8 i 2,6; densitetsgradientcentrifugering: 4,8 i: 2,8; P < 0,001). Det fanns inte någon skillnad mellan de två centrifugeringsmetoderna. Dessutom var det negativa förhållanden mellan den normala morfologln och DNA-fragmenteringsindexet (DFI) (P < 0,001), mellan normal morfologi och standardavvikelsen av DFI (SD_DFI), (P< 0,001), och 10 15 20 25 30 535 788 10 mellan DFI och dråktighetsfrekvensen (P < 0,03). För speciﬁka sperrniehuvuddefekter fanns det ett direkt förhållande mellan förekomsten av päronformade huvuden och DFI (P < 0,05), kårnsâckar och DFI (P < 0,001), och mittstycksdefekter och DFI (P < 0,01); mellan lösa huvuden och SD-DFI (P < 0,001) saxnt mellan lösa huvuden och genomsnittlígLDFI (P < 0,05). Slutsatsen är att enkelskiktscentrifugering var lika effektiv som densitetsgradientcentrifugering för att anrika hingstspermiepreparationer med normal kromatinstruktur och kan därmed hjälpa till med att förbättra dráktighetsfrekvensen för artificiell insemination. Förekomsten av vissa morfologiska defekter kan väl indikera en kromatinskada och skulle därmed kunna användas som en markör för att förutse fertiliteten av inseminationsdoser. Detta beskrivs vidare i exempel 1. Användningen av kolloid centrifugering för att bereda djurspermier för Al kommer att kräva bearbetning av stora volymer av ejakulat eller stort antal spermier. Metoder för att öka den volym som kan bli hanterad och reducera förluster under centrifugering utforskades genom att förändra parametrar såsom osmolariteten och densiteten hos den kolloida formuleringen och användningen av centrifugrör av olika material (glas vs. plast) och storlekar (10 vs. 50 ml). Genom att minska densiteten hos kolloiden som används för enkelskiktet ökade utbytet av rörliga spermier väsentligt jämfört med normaldensitetskolloiden (genomsnitt i SD: 72,6 i 28,9 miljoner vs. 28,9 :t 24,7 miljoner), samtidigt som spermieöverlevnaden förlängdes med 24 timmar jämfört med icke-centrifugerat ejakulat. Användning av glas- i stället för plaströr ökade signifikant det genomsnittliga utbytet: (42,2 i 22,14 miljoner resp. 39,3 d: 19,87 miljoner spermier för glas- resp. plaströr; P< 0,01). Användning av stora centrifugrör (50 ml) tillsammans med ökande volymer av kolloid och sperma (”uppskalning”) gav varierande resultat, förmodligen p g a skillnader mellan ej akulaten. Volymer om 8- 10 ml kolloid (antingen i ett eller två skikt) tillsammans med 4,5 ml utspådd sperma i 50 ml rör gav emellertid de högsta utbytena jämfört med de vanliga volymema i 10 ml rör, vilket antyder att det bör vara möjligt att utvinna tillräckliga mängder spennier för Al. Detta beskrivs vidare i exempel 3.

I en jämförelse av två osmolariteter av kolloidformuleringen var det genomsnittliga utbytet för ”normal” (320 mOsm) och ”hög” (345 mOsm) för enkelskikt: 30,19 ( i 16,9) respektive 25,8 (i 18,5) miljoner spermier för de två osmolariterna, medan utbytet för densitetsgradienter var 31,84 ( i 19,7) respektive 26,46 ( :t 20,0) miljoner 10 15 20 25 30 535 788 ll spermier, med avsevärd variation mellan ejakulaten. Dessa skillnader är inte statistiskt signifikanta. Användning av kolloiden med ”hög” osmolaritet för enkelslciktet resulterade emellertid i en förhöjning av antalet morfologiskt normala spermier i preparationen (P < 0,001). Dessutom observerades denna trend också för densitetgradienter, även om skillnadema här inte var statistiskt signifikanta (P < 0,05 1). För enskilda morfologiska abnormiteter var skillnaden mellan den normala och höga kolloidformuleringens förmåga att avlägsna onormala spermier inte signifikant. En ökning av osmolariteten hos kolloidformuleringe kan därmed vara gynnsam för bearbetningen av ejuakulat som innehåller en stor andel onormala spermier. Detta beskrivs vidare i exempel 3.

I ett ytterligare exempel modiñerades enkelskiktsmetoden av kolloidal centrifugering för att snabba upp bearbetningen och skalades upp för att göra det möjligt att bearbeta hela ej akulatet, som år voluminöst hos hingstar, i ett litet antal stora rör.

Utelämnandet av det andra centrifugerings”tvâtt”steget från det ursprungliga protokollet resulterade i betydligt tidsbesparande och påverkade inte menligt spermiemotiliteten. För ”uppskalningen” gav användning av 8 till 12,5 m1 kolloid (80%) med 5 ml ejakulat inte så god spenniemotilitet i spermiepreparationerna som 4 ml kolloid i 10 ml centrifugrör. Når antingen 15 eller 20 rnl kolloid av olika densiteter (60-80%) användes för att centrifugera 7,5 ml utspätt ejakulat i 50 ml centrifugrör, erhölls emellertid spermiepreparationer som ansågs vara ekvivalenta, vad gäller kvalitet, med dem från normalstora preparationer. Det upptäcktes att 15 ml 60% kolloid gav de bästa spermiepreparationerna i termer av spermieutbyte och spermieöverlevnad. Spermiemotilitet skilde sig inte mellan behandlingarna.

Dessutom gav användningen av 60 ml kolloid (80%) med 22,5 ml utspâtt ejakulat i 200 ml centrifugrör spermiepreparationer som ansågs vara likadana som spermiepreparationerna från 4 ml kolloid i 10 ml centrifugrör med avseende på motilitet och överlevnadslängd. Slutligen hade de bearbetade spermierna fertiliseringsförmàga, eftersom drâktigheter uppnåddes efter insemination av de kylda, transporterade, centrifugerade spermierna Uppskalningen beskrivs vidare i exempel 4.

Fertiliseringsförxnåga hos utvalda frysta och upptinade tjurspermier testades genom in vitro-fertilisering (IVF), varvid spermierna bereddes antingen på en 10 15 20 25 30 535 788 12 densitetsgradient eller på ett enkelskikt av kolloid. Den genomsnittliga fertiliseringsgraden, blastocystutvecklingsgraden och det totala antalet celler var 56,3 i 23,3%, 23,5 i l7,4°/o resp. 83,2 i 29,9 för densitetsgradientberedda spermier och 58,1 i 23,3%, 24,5 i l4,3% resp. 94,6 i 23,4 för spermier som bereddes på ett enkelskikt av kolloid. Medelvärdena för olika parametrar av datorbaserad analys av spermiemotílitet skilde sig inte mellan de två sperrníepreparationsmetodema. Dessa resultat bekräftar rapporterna för hingst och galt, nämligen att spermierna som år beredda på ett enkelskikt av kolloid inte har annat uppförande eller andra egenskaper än gradientberedda spermier, och tyder vidare på att det inte finns någon skillnad i fertilíseringsfönnåga hos spermier i de båda typema av preparationer. Detta beskrivs vidare i exempel 6.

Kolloidal centrifugering har tidigare använts för att välja spennier med normal morfologi. Inom ramen för föreliggande uppfinning, ordes ett försök att välja ut spermier med normal storlek från en polymorf population i ett tjurejakulat.

Enkelskikt av kolloid med olika densiteter användes för att identifiera lämpliga densiteter för densitetsgradienten. Genom att använda kolloiddensiteter av 55% och 70%, var det möjligt att erhålla två spermie-subpopulationer, en innehållande nästan bara spermier med normal storlek och en annan som var anrikad på makrocefaliska spermier. De mikroeefaliska spermierna selekterades ut genom kolloiden med lägsta densitet och framträdde därför inte i någon av de selekterade subpopulationema. Detta beskrivs vidare i exempel 5.

Hindren för att använda densitetsgradientcentrifugering i andra djurarter, såsom galt, liknar dem som listats för hingst. Föreliggande uppfinnare undersökte följande: (i) effekten av ökande osmolaritet hos en kolloid formulering på effektiviteten av galtspermieselektion under densitetsgradientcentrifugering, i syfte att utveckla kolloidformuleringar specifika för djurspermier, (ii) en jämförelse av densitetsgradíentcentrifugering med centrifugering genom ett enkelskikt av kolloid för beredning av galtsperrnier, (iii) effekten på galtspermierna av autoklavering av kolloiden, samt (iv) tvättning av spermierna efter kolloidal centrifligering.

Resultaten visade att ökande osmolaritet hos kolloiden som användes för densitetsgradientscentrifugering av galtspermier ökade andelen rörliga spermier i 10 15 20 25 30 535 788 13 den resulterande spermiepreparationen. Dessutom behölls spenniemotilitet åtminstone 24 timmar längre hos de centrifugerade spermiepreparationerna än hos kontroller (ocentrifugerade alikvoter), d v s 7-8 dagar för spermier centrifiigerade på en denistetsgradient jämfört med mindre än 6 dagar för ocentrifugerade spermier.

När kolloidenkelskikt och densitetsgradienter jämfördes, var sperrniemotilitet signifikant bättre (P< 0,001) i de centrifugerade spermiepreparationerna (medel i sd: 79,6 i 8, 1% och 74,2 i 12,0% för enkelskikt respektive densitetsgradient) än i ocentrifugerade kontroller (62,9 :t 12,7%). Det genomsnittliga utbytet av rörliga spermier för enkelskiktet var 67,5 i 25,6%, och för densitetsgradienten 59,6% i 223% (icke signifikant). Överlevnaden ökade signifikant genom kolloidal centrifugering (ocentrifugerade preparationer 3, 1 i 0,3 dagar, enkelskikt (SL) 5,5 i 0,79 dagar, densitetsgradient (DG) 5,75 i 0,62 dagar; P < 0,001 för ocentrifugerade vs. centrifugerade preparationer; SL vs. DG icke signifikant). Näivaron av bakterier i ocentrifugerade spermaprover kan ha bidragit till frånfället av spermierna. Kolloidal centrifugering verkade avlägsna bakterierna.

Autoklavering av kolloidformuleringen hade ingen effekt på spermieantalet, spermierörligheten eller spennieöverlevnaden, jämfört med icke-autoklavering av kolloiden. Dessutom hade tvättning av den spermiepellet som erhölls efter kolloidal centrifugering därav ingen effekt på spermieantalet, spermiernotiliteten eller spermieöverlevnaden, jämfört med ingen tvättning. Galtspermier kunde lagras i 24 timmar innan centrifugering utan att detta hade en skadlig effekt på spermiemotilitet och varaktighet av motilitet i de centrifugerade preparationerna.

Avslutningsvis förbättrar en ökad osmolaritet hos kolloidfonnuleringen selektionen av spermier under densitetsgradientcentrifugeringen. Avslutningsvis ger centrifugering på ett kolloidenkelskikt spermiepreparationer som i motilitet och utbyte liknar dem från densitetsgradienter och dessa preparationer visar förbättrad spermiemotílitet och överlevnadslängd jämfört med kontrollspermieprover (ocentrifugerade). Enkelskiktsmetoden kan underlätta utvecklingen av en uppskalad metod för beredning av stora volymer ejakulat. Detta beskrivs vidare i exempel 6.

Föreliggande uppfinnare undersökte användningen av enkelskiktscentrifugering (SLC) för att bereda hundspermier för AI, under det att spermiemotilitet och 10 15 20 25 30 535 788 14 morfologi jämfördes i icke-selekterade och selekterade sperrnieprover. Genomsnittlig spenniemotilitet ökade från 77,2 i 19,6% före SLC till 87,6 i 2,7°/o efter SLC, under det att den genomsnittliga progressiva motiliteten ökade från 48,6 i 18% till 67,9 :t ll°/o. Genomsnittlig normalmorfologi var 62,2 :t 42,8 i icke-selekterade prover och 82,5 i 19,1% hos SLC-selekterade prover. Efter lagring i 7 dagar vid 4°C var sperrniemotilitet <5% i icke-selekterade sperinieprover och 57 i 11,3% i de SLC- selekterade spermiepreparationerna. Spermieutbytet varierade mellan 12 och 47% beroende på sperrniekvalitet i det ursprungliga ej akulatet. Slutsats: Dessa preliminära resultat indikerar att SLC kan vara en användbar metod för att förbättra hundsperrniekvaliteten i spermiedoser avsedda för AI. Detta beskrivs vidare i exempel 7.

Exempel Följande exempel beskriver vidare några specifika utföringsformer av uppfinningen.

Dessa exempel ska inte anses som begränsande och omfånget av uppfinningen är det enligt de bifogade patentkraven.

EXEMPEL 1: Hingst Mål: (i) att jämföra enkelskiktscentrifugering (SLC) och densitetsgradientcentrifuger-ing (DGC) på hingstspermiekvalitet i termer av spermiemotílitet, utbyte, spermíemorfologi, kromatinintegritet och spermieöverlevnad (kvarhållande av motilitet) under användning av nyinsamlad hingstsperma; (ii) att jämföra spermiekvalitet efter kolloid centrifugering av färsk och lagrad hingstsperma.

Metoder: sperma samlades in från 10 hingstar hos kommersiella AI-stuterier med sedvanliga metoder. Ej akulaten späddes med egentillverkade eller kommersiellt tillgängliga spermaspâdningsvâtskor (Kenneys extender [7], INRA 96 |IMV, Frankrikel) uppvärmda till 37°C och sperrniekoncentrationen justerades till ca lOOxlOﬁ/ml. Alikvoter från 38 ejakulat användes för DGC och SLC såsom följer: en densitetsgradient preparerades genom att pipettera 2 ml av 80% kolloid E in i ett centrifugrör och därefter försiktigt placera ett 2 ml skikt med lägre densiteten överst; en alikvot (1,5 ml) av den utspädda sperman pipetterades ovanpå det övre 10 15 20 25 30 535 788 15 lagret av kolloid. Gradienten centrifugerades i 300 x g för 20 minuter, varefter supernatanten och det mesta av gradientmaterialet kastades bort. Sperrniepelleten överfördes till ett rent centrifugrör som innehöll 5 rnl av Kenneys spâdningsmedel och tvättades genom att centrifugeras i 10 minuter vid 500 x g. Efter tvåttningen resuspenderades spenniepelleten i färsk Kenney's spådningsmedel (1 ml). För SLC var metoden liknande den som för DGC med undantaget att 4 ml av 80% kolloid E placerades i centrifugröret i stället för två skikt av olika densiteter (2 ml av varje densitet).

Sperrniekvalitet i de icke-selekterade och centrifugerade sperrnaprovema bedömdes såsom följer: subjektiv motilitetbedömning, spermíemorfologi (8, 9) och kromatin- integritet under användning av metoden av Evenson et al. (10) modifierad genom Januskauskas et al. (11, 12).

För subjektiv motilitetbedömning undersöktes alikvoter (0,5 ul) av det utspâdda ejakulatet och spermiepreparationer med faskontrastljusrnikroskopi (x200) omedelbart efter beredning på en upphettad mikroskop-platta (38°C), och därefter en gång dagligen tills motiliteten hade sjunkit till ungefär 20%.

Spermiepreparationerna lagrades antingen i kylskåp [6°C) eller vid rumstemperatur (22-30°C). N är spermiemotilitet undersöktes hos sperma som hade lagrats vid 6°C, ﬁck proverna stå i rumstemperatur under 15 minuter innan alikvoter togs för motilitetbedömning.

I den andra experimentet, lagrades utspädda ejakulat (n = 21) över natt i en isolerad transportbox med kylklampar, d v s genom att använda stanclardmetoden för transport av hingstspenna. Endera densitetsgradjent- eller enkelskiktscentifugering genomfördes med den lagrade sperman dagen efter, med motilitetbedömningar som gjordes på de spermiepreparationer från såväl färska som lagrade ejakulat.

Resultat: Når färsk, utspädd sperma användes för kolloid centrifugering, var andelen rörliga spermier, morfologiskt normala spermier och spermier med intakt kromatin liknande för de två centrifugeringsmetoder. Dessa parametrar av spermiekvalitet följande på endera metod av kolloidcentrifugering var bättre än i de 10 15 20 535 788 16 ocentrifugerade provema (Tabell 1), och spermieöverlevnadslängden förbättrades signifikant från 4 dagar till 10 dagar vid 6°C och från 2 till 6 dagar vid rumstemperatur.

Tabell 1: Effekt av enkelsldktscentrifugering och densitetsgradient- centrifugering på spermiekvalitet hos hingst, medel i SD (n= 38).

Ocentrifugerad _ _ _ kømron Efter kolloidcentnfugenng Parameter Enkelskikt Densitetsgradient Motilitet (%) 68,0 i 9,2 84,7 i 5,41* 84,3 i 5,9* Utbyte 27,0 i 6,6” 32,6 i 7,8” 2,4 i 1,3 5,6 i 1,83” 5,7 i 1,9” Överlevnad vid 4°C (dagar) intervall 1-5 intervall 3-9 intervall 3-10 Överlevnad vid rumstemperatur 2,1 i 0,7 3,0 i 0,9” 3,1 i 0,91* (dagar) intervall 1-3 intervall 2-6 intervall 2-5 Normal morfologi (%) 67,5 i 13,0 77,1 i 9,3” 76,7 i 8,7” Kromatinskada (%) 11,0 i 4,6 4,8 i 2,6* 4,8 i 2,8” *I signifikant skillnad efter centrifugering; b ingen skillnad mellan metoder.

Då kyldlagrad sperma användes för centriﬁigering, reducerades utbytet med 18- 20% jämfört med färsk sperma, och mer variation observerades mellan ej akulat än för färska ejakulat. Återigen förbättrades spermiemotilitet och spermieöverlevnad i de centrifugerade sperrnapreparatíonema jårmfört med lagrade obearbetade ejakulat (Figur 1).

Konklusioner: de två kolloidcentrifugeringstelcnikerna ger ekvivalenta spermiepreparationer med förbättrad spermiekvalitet jämfört de ocentrifugerade kontrollproverna. SLC eller DGC kunde genomföras med lagrad sperma såväl som med färsk sperma, även om spermiekvaliteten i de resulterande spermiepreparationerna var bättre när färsk sperma användes. Eftersom SLC är enklare och snabbare att genomföra än DGC, skulle den vara lämplig för användning på fältet. 10 15 20 25 30 535 788 17 EXEMPEL 2: Hingst Mål: (i) att undersöka förändringarna i spermiernotilitet, viabilitet och kromatinintegritet med lagring efter kolloidcentrifugering; (ii) att undersöka nödvändigheten av att tvätta spermiepelleten genom en retrospektiv dataanalys.

Metoder: sperma samlades in från 4 hingstar på kommersiella AI-stuterier med sedvanliga metoder. Ejakulaten späddes med egentillverkade eller kommersiellt tillgängliga spermaspâdningsvätskor (Kenneys extender, INRA 96) uppvärmda till 37°C och spermiekoncentrationen justerades till ca 1O0x1O6/ml. Alikvoter från dessa ejakulat användes för SLC, såsom beskrivits tidigare, genom att placera 1,5 ml av det utspådda ejakulatet ovanpå 4 ml kolloid (80%). Spermiepelleten tvättades inte. Spermiekvalitet (sperrniemotilitet, spermíeviabilitet, membran- samt kromatinintegritet) bedömdes i SLC-bearbetade och i ocentrifugerade kontrollprover omedelbart och efter 24 och 48 timmar. Metodema år såsom beskrivet i exempel 1 med tillägget av metoden för datorstödd analys av spermiemotilitet (CASA, 13), sperrnieviabilitet och membranintegritet (14). Spermapreparationerna lagrades i kylskåp (6°C). Vid bedömning av motilitet hos sperrnier som hade lagrats vid 6°C, ñck provema jâmviktas vid rumstemperatur under 15 minuter innan de bedömdes.

För den retrospektiva analysen ordes en jämförelse av subjektiva motilitetsdata från 38 ej akulat bearbetade genom enkelskiktscentrifugering med efterföljande tvättning av spermiepelleten och 39 ej akulat där ingen tvättning av spermiepelleten gjordes efter enkelskiktscentrifugeringen.

Resultat: det skedde en snabb försämring i sperrniemotilitet hos de ocentrifugerade provema under 48 timmar, vilket åtföljdes av en minskningi sperrnieviabilitet, membran- och kromatinintegritet. I motsats till detta var alla parametrarna för sperrniekvalitet bättre för de SLC-bearbetade proverna än för de ocentrifugerade proverna och detta behölls under 48 timmar (Tabeller 2-5). 10 15 535 788 18 Tabell 2: Motilitetsparametrar (subjektiva och CASA) fór sperrnieprover fóre kolloidal centrifugering, omedelbart efter kolloid centrifugering och 24 timmar och 48 timmar efter kolloidal centrifugering under lagring vid 5°C (10 ejakulat).

Prov Tid subjektiv total CASA- e-mot ieke-l-mot l-rnot motilitet motilitet Ocentrifugerat 0 64 i 3,9 72,11 i 13,1 2,26 i 0,93 46,7 i 14,4 34,8 i 22,9 +24 31,5 i 15,1 33,3 i 19,4 4,77 i 5,4 59,95 i 9,4 9,69 i 8,6 +48 10 i 6,6 12,1 i 12,2 1,97 i 2,4 45,9 i 21,3 10,3 i 12,4 Centrifugerat 0 77 i 7,5 85,7 i 9,0 5,6 i 3,6 27,1 i 14,3 59 i 18,1 + 24 72,5 i 18,7 71,3 i 2,34 12,25 i 6,2 31,0 i 22,0 49,8 i 23,1 + 48 48,5 i 14,9 61,7 i 2,7 10,97 i 4,9 38,31 i 25,0 44,68 i 23,2 Anm.: CASA-motilitet= hela den motila populationen enligt CASA; C-mot: cirkulär motilitet; icke-l-mot= icke-linjär motilitet; 1-mot= linjär progressiv motilitet. l) Subjektiv motilitet: centrifugerade prover hade signifikant högre motilitet än ocentrifugerade prover vid alla tidpunkter (P< 0,001). 2) CASA: centrifugerade prover hade högre motilitet än occntrifugerade prover vid alla tidpunkter (0 timmar, P< 0,05, 24 och 48 timmar P< 0,001); vården för c-mot och l-mot var signifikant högre för centrifugerade prover än för ocentrifugerade prover vid alla tidpunkter, medan värden för icke-1-mot var signifikant lägre (P <0,05).

Tabell 3: Effekt av lagring vid 5°C på spermieviabilitet (SYBR-M/PI-infárgning) hos icke-selekterade och SLC-selekterade spermieprover över tid (n= 10).

Icke-selekterade SLC-selekterade levande döda döende levande döda döende 0 64,7 i 9,31=11 27,4 i 9,141 7,9 i 2,61 79,5 i 9,21 16,4 i 8,11* 4,1 i 2,01' 15,9 i +24 50,3 i 18,301 40,0 i 20,711 10,0 i 4,71* 79,1 i 8,8° öﬂb 5,0 i 2,61* +48 32,8 i 10,9°<1 56,8 i 24,841 10,5 i 6,8” 75,6 i 6,8° 18,5 i 5,6° 5,9 i 2,0ns a' b-C = signifikant skillnad mellan ocentrifugerade och centrifugerade prover (P<0,05, P<0,0l respektive P<0,001). d = signifikant skillnad mellan ocentrifugerade prover vid olika tidpunkter (P<0,05]. 10 15 535 788 19 Tabell 4: Ändringar i plasmamembranstabilitet hos hingsspermier lagrade i 5°C; Annexin V/propidiumjodid-infárgning (n=l0).

AN-/PI- AIP/PI+ AN+IPI+ AN+/PI- . Icke- Icke- Icke- Icke- Tld selekterade SLC selekterade SLC selekterade SLC selekterade SLC 74,6 i 13,4 i 9,1 i 2,9 i 0 69,3 i 8,211? 23,9 i 6,0* 4,8 i 3,32 2,0 i: 0,431* 7,6ns 3,33 4,49 0,53 74,1 i 13,1 i 7,9i 5,01 + 24 67,1 i 12,2ns 28,7 =b11,9@ 2,5 i 1,321 1,7 i O,9*= 103m 2,82* 5,6ﬂ 3,74 74,9 i 15,7 i 7,0 i 2,4 i + 48 56,6 i 14,74* 39,1 i 14,7» 3,1 i 1,1a 1,3 i o,8f.=** 5,5” 4,1ﬂ 2,9@ Läns Anm.: AN - /Pl- = levande spermier med stabila membran; AN+/ P1- = spermier med instabila men intakta membran; AN-/ PI+ och AN+/PI+ = spermier med skadade membran. SLC = enkelskiktscentrifugering ß = signifikant skillnade mellan ocentrifugerade och centrifugerade prover, p-s 0,05. b = signifikant skillnad mellan ocentrifugerade prover vid O och 48 timmar, p-s 0,05. ns = icke signifikant.

Tabell 5: Effekt av lagring på kromatinintegritet hos icke-selekterade och selekterade sperrnieprover över tid under användning av spermiekromatin- struktur-analys (Sperm Chromatin Structure Assay, SCSA) (n=10).

Icke-selekterade Selekterade DFI MedeLDFl SD-DFI DFI MedeLDFl SD-DFI 0 22,1 i 9,7= 414,9 i 34,01* 23,8 i 3,99 11,3 i 4,98 414,9 i 31,71* 24,2 i 3,9 + 24 29,6 i 10,0* 413,8 i 421* 21,8 i 3,11* 14,8 i 6,8a 412,2 i 35,21* 30,5 i 2,31* + 48 41,1 i 20,3” 393,8 i 45,6 21,3 i 3,38 11,6 i 5,3 b 418,6 i 37,0 28,3 i 3,7ﬁﬁ= signíﬁkant skillnad mellan occntrifugerade och centrifugerade prover, p<0,01. b = signifikant skillnad mellan ocentrifugerade och centrifugerade prover, p< 0,001. 10 15 20 25 30 535 788 20 I den retrospektiva jämförelsen av tvättning mot icke tvättning av sperrniepelleten efter enkelskiktscentrifugering fanns ingen skillnad i genomsnittlig subjektiv motilitet hos de SLC-bearbetade spermiepreparationerna (Figur 2).

Konklusioner: spermiekvalitet (motilitet, viabilitet och kromatínintegritet) i de centrifugerade provema behölls under lagring i 48 timmar, antingen vid 6°C eller rumstemperatur, medan spermiekvalitet hos de ocentrifugerade provema försämrades. Tvâttning av spermiepelleten efter enkelskiktscentrifugering är inte ett absolut krav i termer av spermiekvalitet och därför kan detta steg utelämnas för att spara tid.

EXEMPEL 3: Hingst Mål: att utröna effekten av osmolaritet och densitet hos kolloidformuleringar på utbyte och kvalitet av hingstspermieprover och dess kvalitet, och även användningen av centrifugrör av olika material (glas vs. plast) och olika storlekar (10 vs. 50 ml) på spermieutvinningsgraden från kolloidcentrifugering (SLC).

Metoder: kolloidcentrifugering utfördes som beskrivits tidigare, med följande modifieringar enligt de olika undersökningarna: (i) kolloider av två osmolariteter, 320 och 345 mOsm, användes för enkelskiktscentnfugering (SLC) och densitets- gradientcentrifugering av 15 hingstejakulatalikvoter; (ii) kolloider (4 ml) av olika densiteter användes för SLC såsom följer: 40% (låg densitet), 60% (mellanstor densitet) och 80% (stanclarddensitet); (iii) alikvoter av 7 ejakulat bearbetades genom SLC i glas och plastcentrifugrör; (iv) en jämförelse ordes genom att använda SLC eller DGC i små rör (gradient 2+2+2,5 ml, enkelskikt 4+1,5 ml) och stora rör (gradient 4+4+3, 5+5+4,5, 9+9+6 och 9+9+7,5; enkelskikt 8+3, 8+4,5 och l2+3), vardera vid ett tillfälle. Siffrorna refererar till volym i det nedersta lagret, volym i det övre lagret (för densitetsgradienter) eller för volym i enkelskikt respektive volym av det utspädda ejakulatet. De parametrarna som användes för att utvärdera sperrniekvalitet i alla dessa studier var subjektiv spermiemotilitet, utvinningsgrad (utbyte), samt spermiemorfologi och kromatinintegritet för jämförelse av olika osmolariteter, såsom beskrivits tidigare. 10 15 20 25 535 TBB 21 Resultat (i): utvinningsgraden av spermierna var något lägre för de högre osmolari- teterna av kolloiden jämfört med normal osmolaritet, även om dessa skillnader inte var statistiskt signifikanta (Tabell 1). Spermieöverlevnaden påverkades inte av kolloidens osmolaritet.

Tabell 6. Effekt av kolloidens osmolarítet på antalet rörliga spermier i pelleten efter centrifugering på en kolloid (medel :t SD). n = 20 305-320 mOsm 330-345 mOsm Enkelskikt Densitetsgradient Enkelskikt Densitetsgradient 30,19x106 i 16,9 31.84 xl06 :t 19,7 25,8 xlOßzt 18,5 26,46 xl06 i 20,0 Användning av en högre osmolaritet i kolloiden resulterade i en ökning av antalet morfologiskt normala spermier i preparationen (P < 0,001) (Figur 3). Dessutom observerades denna trend också för densitetsgradienter, även om skillnaden här inte var helt statistiskt signifikant (P< 0,051).

För enskilda morfologiska abnormaliteter var skillnaderna i förmåga att avlägsna onormala spermier emellertid inte signifikanta för kolloidformuleringar med normal och hög osmolaritet. Tvärtom ledde användningen av kolloid med hög osmolaritet inte till ökad effektivteten vad gäller avlägsnandet av spermier med skadat kromatin (Figur 4).

Resultat (ii): Efter centrifugering genom ett enkelskikt med låg densitet, var spermiepreparationema mycket lika kontrollen (ocentrifugerad sperma) i termer av antalet rörliga spermier, förekomst av cellspillror etc. Sperrnieöverlevnaden förlängdes emellertid med ungefär 24 timmar i de centrifugerade preparationerna (Figur 5). När spennierna bearbetades på ett enkelskikt med mellanstor densitet, innehöll preparationerna en högre andel rörliga spermier och spermier överlevde längre än kontrollerna (ocentrifugerad alikvot), även om ingendera parameter var lika bra som proverna bearbetade på det normala enkelskiktet (Figur 6).

Spennieantalet ökade väsentligt (P < 0,01) för prover beredda på 60% kolloid 10 15 20 25 30 535 788 22 jämfört med den vanliga 80% kolloiden (medel i SD: 72,6 :t 28,9 miljoner jämfört med 28,9 i 24,7 miljoner).

Resultat (iiij: Användning av glas- i stället för plastcentrifugrör för sju ej akulat resulterade i en signifikant ökning (P < 0,01) av antalet spermier som framträdde i pelleten. Medelvârdena var 42,2 miljoner och 39,3 miljoner för glas- respektive plaströr.

Resultat (iv): det fanns betydande skillnader i utbyte mellan ejakulaten för en hingst, uttryckt som proportionerna i den initiala laddningen. Uppskalningen av gradienterna gav konsekvent mindre utbyten än den vanliga gradienten, men två av de större volymerna av kolloiden som användes som ett enkelskikt och en av gradientema gav större utbyten än den vanliga storleken av enkelskikt (Figure 7).

Höjning av volymerna över dessa nivåer ökade inte utbytet. Andelen rörliga spermier reducerades något i det stora röret jämfört med det lilla röret (medel 75% cf. 80%), oberoende av vilken volymkombinatíon som användes.

Spermieöverlevnadslängden påverkades inte av uppskalningen.

Konklusioner: utbytet av hingstsperrnier erhållet efter SLC kan höjas genom minskning av densiteten hos kolloiden som används för ett enkelskikt, även om spermiekvaliteten inte är så bra som när normaldensiteten används. Utbytet kan också höjas genom uppskalning till större centrifugrör. Genom att använda glascentrifugrör i stället för plastcentrifugrör ökar utbytet något men är kanske inte värt extrakostnadema som inbegrips i inhandling, rengöring och sterilisering av rören. En ökning av kolloidformuleringens osmolaritet från 320 mOsm till 345 mOsm resulterar i förbättrad normal spermiemorgologi, men inte kromatinintegritet, även om spermieutbytet kan minska.

EXEMPEL 4: Hingst Mål: att skala upp kolloidcentrifugeringstelmiken för att underlätta bearbetningen av hela ejakulat på fältet. 10 15 20 25 30 535 788 23 Experiment: (i) användning av 80% kolloid i 50 ml rör och i 200 ml rör (experiment 1); (ii) undersökning av effekten av att ändra densiteten av kolloiden (60% till 80%) i 50 ml rör (experiment 2); (iii) användning av 80% kolloid i 10 ml rör men ökning av volymen av det använda utspädda ejakulatet (experiment 3) och (iv) jämförelse av 80% kolloid i 10 ml rör med 1,5 ml och 4,5 ml ejakulatet överst och 67,5% kolloid i 50 ml rör med 15- 18 ml ejakulatet överst.

Elzperiment 1: Alikvoter från 8 ejakulat (4 hingstar, Västerbo Stuteri) transporterades till laboratoriet och användes för SLC såsom beskrivet ovan, benämnda såsom små (1,5 ml utspätt ejakulat på 4 ml kolloid i ett 10 ml rör) och stora (7,5 ml utspått ejakulat på 20 ml kolloid i ett 50 ml Falcon-rör). Dessa volymer av kolloiden utgör kolonner av samma höjd i de två typema av centrifugrör.

Efter centrifugering vid 300 x g i 20 minuter, resuspenderades de resulterade spermiepelletarna i färsk Kenneys spådningsmedel i ett rent rör, under användning av 1 ml Kenney's för den ”lilla” pelleten och 5 ml Kenney's för den ”stora” pelleten.

Spermiekvaliteten bedömdes i de SLC-selekterade spermiepreparationema och de icke-selekterade spermiepreparationema vad gäller subjektiv motilitet, CASA, spermieviabilitet (SYBR- 14/ PI-irifärgriing), membranintegritet (Annexin-V/PI) och spermiekromatinintegritet under användning av SCSA, som beskrivits tidigare.

Antalet spermier i varje spermiepellet räknades för att beräkna utbytet. Analyserna upprepades efter 24 lagring vid 5°C i 24 och 48 timmar. Subjektiva motilitetbedömningar upprepades tills spermiemotiliteten var <2O°/0. Alikvoter från ytterligare 4 ejakulat användes för SLC som beskrivet ovan benämnda såsom små (1,5 ml utspätt ejakulat på 4 ml kolloid i ett 10 ml rör), medan 22,5 ml av samma ej akulat placerades ovanpå 60 rnl kolloid i 200 ml Falcon-rör, benärnnda såsom extrastora (SLC-XL). SLC-XL-spermiepelletarna resuspenderades i 10 ml Kenney's.

Både små och stora sperrniepreparationer bedömdes för spermiemotilitet och överlevnadslängd. Metoderna var såsom beskrivits tidigare.

Resultat: Spermiemotilltet: Total motilitet förbättrades i de SLC-selekterade spermie- preparationema jämfört med de icke-selekterade, både enligt subjektiva motilitets- bedömningar och genom CASA. Enligt subjektiva motilitetbedömningar var dessa skillnader signifikanta vid alla tidpunkter (P< 0,001) och det fanns inga skillnader 10 15 20 535 788 24 mellan SLC-små och SLC-stora (Figur 8). Ett liknande resultat erhölls för SLC-XL och SLC-små prover (Figur 9).

CASA-resultaten visade också att skillnaderna mellan icke-selekterade och SLC- selekterade spermieprover var signifikanta vid alla tidpunkter (P<0,05), även om det också fanns vissa skillnader mellan SLC-små och SLC-stora (P<0,05), där de små preparationema hade bättre motilitet ån de stora (Tabell 7). För cirkulär motilitet, icke-linjär motilitet och linjär motilitet fanns det signifikanta skillnader mellan SLC- selekterade och icke-selekterade spermiepreparationer (P< 0,05), men inte mellan SLC-små och SLC-stora preparationer. Det var en bra korrelation mellan subjektiva och CASA-bedömningar fór total motilitet (r=O,8, P< 0,001).

Tabell 7: Motilitetsbedömningar (subjektiva och genom datorstödd motilitets- analys, CASA) av små och stora spermiepreparationer från enkelskikts- centriñigering (Medel t SD) fór total motilitet och olika motilitetsparametrar. subjektiv Linjär Tid CASA Cirkulär Icke-linjär Prov motilitet motilitet (tim) motilitet (%) motilitet (%) motilitet (%) 1%) 1%) 0 64 t 3,9 72,11 t 13,1* 2,26 t 0,93 ßb 46,7 t 14,4 34,8 t 22,9 Icke- +24 31,5 i 1s,1« 33,3 1 19,4ﬂ° 4,77 f s,4ﬂ= 59,95 t 9,4 9,69 i 3,6 selekterade +48 10 t 6,6 12,1 t 12,2° 1,97 t 2,4 45,9 t 21,3 10,3 t 12,4 0 77 t 7,5 85,7 t 9,0ﬂ 5,6 t 3,6” 27,1 t 14,3 59 t 18,1 Selekterade +24 72,5 t 18,7* 71,3 t 2,34° 12,25 t 6,2° 31,0 t 22,0 49,8 t 23,1 “små” +48 48,5 t 14,9 61,7 t 2,7° 10,97 t 4,9 38,31 t 25,0 44,68 t 23,2 0 77 t 8,6 80,22 t 10,09 6,9 t 3,9” 29,0 t 16,8 57,8 t 18,7 Selekterade +24 69 t l5,4f 56,8 t 20,7° 13,1 t 7,5 33,6 t 19,8 46,8 t 24,2 "stora" +48 54,5 t 9,8 42,3 t 18,3° 10,5 t 5,6 39,6 t 31,0 44,2 t 27,6 ﬂ = skillnad mellan icke-selekterade och SLC-selekterade, P< 0,05. f = skillnad mellan små och stora SLC-selekterade, P< 0,05.

Spermieviabilitet: Figur 10 visar resultaten av SYBR-l4 /PI-infârgning i små och stora SLC-selekterade och icke-selekterade sperrniepreparationer. Andelen levande spermier var signiﬁkant högre i de SLC-selekterade spermiepreparationerna än i de 10 15 20 25 535 788 25 icke-selekterade spermiepreparationema, under det att andelen döda respektive döende spermier var signiﬁkant mindre i de selekterade än i de icke-selekterade spermiepreparationerna. Det fanns inga skillnader i dessa andelar mellan SLC- stora och SLC-små spermiepreparationer. Med tiden minskade andelen levande spermiema signifikant i de icke-selekterade spermiepreparationerna medan andelen döda spermier steg signifikant (P< 0,05). Däremot ändrades inte dessa andelar i de SLC-selekterade spenniepreparationema. För SLC-XL-preparationer var det inte någon skillnad mellan medelvärdena för SLC-små och SLC-XL- spermiepreparationer för någon parameter (Tabell 8).

Tabell 8: Spermieviabilitet (°/°) i icke-selekterade, små och extrastora spermie- preparationer från enkelskiktscentrifiigering unde: användning av SYBR- 14/ PI-infárgning (Medel i SD) (n=4).

Små Extrastora Levande Döda Döende Levande Döda Döende o rimmar 82,8 1 4,9 14,7 l 5,3 2,5 i 0,3 85,4 l 2,5 12,2 i 1,8 2,3 i 0,8 24 timmar 83 i 6,2 14,2 i 6,3 2,7 i 0,3 86,1 ä: 1,9 11,1 i 1,7 2,9 i 0,9 48 timmar 78,8 :t 7,9 17,7 :b 8,7 3,5 x 1,1 80,3 :_ 4,3 15,0 i 4,1 4,6 :t 2,2 Anm.: Ingen signifikant skillnad mellan SLC-smá och SLC-XL enkelskiktspreparationer.

Värdena för varje parameter ändrades inte signifikant över tiden för endera SLC-små eller SLC-XL.

Spermiemembranintegritet: resultaten av Annexin-V/ PI-infärgning visas i Tabell 9 (SLC-små vs. SLC-stora) och Tabell 10 (SLC-små vs. SLC-XL). Det var ingen skillnad mellan SLC-små och SLC-stora spermiepreparationer vid någon tidpunkt: de enda skillnaderna mellan icke-selekterade och selekterade spermiepreparationer infärgade med Annexin-/PI- (intakta membran) var för SLC-små spenniepreparationer vid tiden O timmar (P< 0,05). Det var också signifikanta skillnader mellan icke-selekterade och SLC-selekterade spermiepreparationer i ﬂera av de andra parametrarna: mellan icke-selekterade och SLC-selekterade preparationer vid tiden O timmar, 24 timmar och 48 timmar för Annexin-/PH (P< 0,001); mellan icke-selekterade och SLC-selekterade preparationer vid 24 och 48 timmar för Annexin+/PI+ (P< 0,00l); mellan icke-selekterade och SLC-små 10 15 535 ?88 26 preparationer vid 0 timmar och 48 timmar, och mellan icke-selekterade och SLC- stora preparationer vid 24 timmar fór spermier infårgade med Annexin+/ PI- (P< 0,001). Det fanns inte några signifikanta skillnader mellan SLC-små och SLC-XL för någon av de uppmätta parametrarna, inte heller förändrades värdena signifikant med tiden.

Tabell 9: Spermiemembranintegritet i icke-selekterade och små och stora spenniepreparation från enkelskiktscentrifugering under användning av Annexin-V/propidiumjodid (medel i SD) (n=8).

Tid Annexin-V- Annexin- Annexin-V Behandling Annexin-V-l PI- /PI+ V+/PI+ +/PI- stora 74,2 i 8,7 13,8 i 6,1° 8,4 i 3,2 3,6 i 2,0 0 små 75,2 i 6,0* 12,8 i 2,8° 8,8 i 3,4° 3,2 i 0,6 timmar icke-selekterade 67,4 i 8,11* 24,7 i 6,0°d 5,7 i 3,5° 2,3 i 0,6 stora 69,1 i 14,8 13,8 i 3,4° 11,6 i 8,9* 5,5 i 4,1” 24 små 75,0 i 9,3 12,7 i 3,3° 7,1 i 3,6 5,3 i 4,1* timmar icke-selekterade 65,1 i 13,1 30,3 i 12,5° 2,5 i 1,3" 2,1 i 1,11” stora 73,3 i 6,4 15,1 i 3,9° 8,3 i 2,7° 3,4 i 1,9° 48 små 76,9 i 4,2 15,2 i 4,4= 6,1 i 1,6 2,1 i l,6°° timmar icke-selekterade 51,3 i 16,3 43,6 i 16,1°d 3,7 i 1,5ß 1,3 i 0,9° Anm.: inga skillnader mellan stora och små SLC-selekterade spermiepreparationer vid någon tidpunkt. ﬂrb» ° = skillnad mellan icke-selekterade och selekterade, P< 0,05, P< 0,01, P< 0,001; d = skillnad mellan 0 och 24 timmar, P< 0,05; ° = skillnad mellan 24 och 48 tummar, P< 0,05 10 15 535 27 788 Tabell 10: Spermiemembranintegritet i icke-selekterade och små och extrastora spermiepreparationer från enkelskiktscentriflagering under användning av Annexin-V/Propidium jodid färgning (medel i SD) |n=4).

Anm.: Ingen signifikant skillnad mellan SLC-små och SLC-extrastora enkelskiktspreparationer. Vârdena för varje parameter förändrades inte med tiden för endera små eller XL.

SLC-små SLC-extrastora Annexin- Annexin Annexin- Annexin- Annexin- Annexin- Armexin- Annexin- v- /PI- ~v-/P1+ v+/P1+ v +/1>1- v-/PI- v-/Pn v+/P1+ v +/P1- O tim 76,8 i 4,8 11,4 i 1,6 8,9 i 3,9 2,8 i 0,3 76,9 i 7,8 13,8 i 3,8 5,7 i 1,9 3,7 i 2,2 24 tim 81,9 i 3,8 9,5 i 2,4 5,4 i 3,1 3,2 i 1,7 78,7 i 3,9 13,1 i 4,1 4,4 i 1,8 3,8 i 2,5 48 tim 80,0 i 2,3 12,9 i 4,3 5,5 i 1,3 1,71 i 1,5 80,8 i 4,8 14,0 i 6,8 3,4 i 1,7 1,7 i 0,7 Spermiekromatinintegritet (SCSA): de SLC-selekterade spermiepreparationema hade bättre spermiekromatjnintegritet, som visas av ett lägre värde för DFI, än de icke-selekterade spermiepreparationerna (Tabell 1 1), för alla tidpunkter som studerades (0 timmar, P< 0,01; 24 timmar och 48 timmar, P< 0,001). Det var inte några skillnader i endera medeLDFI, eller SD_DFI mellan de icke-selekterade och selekterade spermieproverna. För XL-provet var den ingen skillnad mellan små och stora för endera DFI eller SD_DFI (DFI små 11,2 i 3,8, XL 9,3 i 4,6; SD_DFI små 29,6 i 3,2, XL 27,4 i 6,0). Det var emellertid en signifikant skillnad mellan medel _DFl för små och extrastora (416,3 i 42,8 respektive 258,3 i 6,5; P< 0,05). 10 15 20 25 535 788 28 Tabell 11: Parametrar av spermiekromatinintegritetsanalys (Sperm Chromatin Structure Assay) fór icke-selekterade, små SLC-selekterade och stora SLC- selekterade spermiepreparationer lagrade i 48 timmar vid 5°C (n=8). lcke-selekterade Små SLC-selekterade Stora SLC-selekterade SD- SD- SD- DFI MedeLDFI DFI DFI Medel_DFI DFI DFI Mede1_DFI DFI 0 26,2 i 24,2 i 14,3 i 24,3 i 13,1 i 405,4 i 73,4 397,2 i: 71,1 400,2 i 71,5 27 i: 4 tim 6, 5° 4, 1 5,421 5,1 6,4ﬂ 24 33 i 22,4 i 16,0 i 28,9 i 16 i _ 415,1 161,8 398,8i67,4 393,4:t71,6 29i4,1 t1m 6,6” 3,8 7,511 5,9 7,1b 48 48,6 i 21,4 i 13,8 i 14,3 i 27,4 :t _ 404,3 i 44,8 404,8 i 69 26 :t 6,4 394,1 :t 71,1 t1m 20,1” 3,3 5,911 6,6* 4,0 Anm.: ß» b = DFI för icke-selekterade > SLC-selekterade, P<0,01 respektive P<0,001.

Spermieutbyte: det fanns en betydande skillnad mellan det genomsnittliga utbytet för SLC-små och SLC-stora spermiepreparationer (32 i 22,3% resp. 8,9 :t 8,9%, P< 0,001). I ett annat experiment var däremot utbytena för de extrastora proverna ungefär 25% högre än för de små proverna (25,5 i 14,l% jämfört med 20,2 i 5,9%).

Experiment 2: Alikvoter från 23 ej akulat (från 4 hingstar vid Vâsterbo stuteri och 10 hingstar från Flyinge AB), användes för SLC såsom beskrivet ovan, benänmda såsom små (1,5 ml utspâtt ejakulat på 4 ml kolloid i ett 10 ml rör) och stora (7,5 ml utspätt ejakulat på antingen 15 ml eller 20 ml kolloid av olika densiteter - 60%, 65%, 70%, 75% eller 80% - i ett 50 ml Falcon-rör). Notera att det inte var möjligt att använda alikvoter från varje ejakulat i var och en av de 10 behandlingarna i experiment 2 på grund av brist på prov. Efter centrifugering vid 300 x g i 20 minuter, togs de resulterande spermiepelletama fram och resuspenderades i färsk Kenney's spâdningsmedel i ett rent rör, under användning av 1 ml Kenney's spâdningsmedel för den “1illa” pelleten och 5 ml Kenneys för den “stora” pelleten.

Sperrniekvaliteten i de resulterande spermiepreparationena bedömdes med avseende på subjektiv motilítet och kromatinintegritet såsom beskrivet i experiment 1, och även spermicöverlevnaden och utbytet. Dessutom utfördes objektiv motilitetbedömriing under användning av antingen Qualispermm (15) -systemet (Flyinge-ejakulat; 9) eller MTM Motion Analyzer (13) (Västerbo-ejakulat). 10 15 535 788 29 Resultat: Måtningar för genomsnittlig subjektiv motilitetsbedömning och QualisperrnTM-motilitet för de olika kombinationerna av volym/ densitet visas in Tabell 12, tillsammans med överlevnad dvs. varaktighet av motilitet. Även om det inte fanns några skillnader mellan de olika kombinationerna av volym/ densitet vid subjektiv motilitetbedömning, fanns det signifikanta skillnader mellan de små och stora sperrniepreparationerna vid lägre kolloiddensiteter under användning av objektiv motilitetbedömning med Qualispennm. De stora spermiepreparationema behöll inte motiliteten lika länge som de små preparationema (P< 0,001).

Tabell 12: Effekten av förändrad volym och /eller densitet hos kolloiden som användes fór uppskalade preparationer av hingsspermier på genomsnittlig spermiemotillet och överlevnad (n=23).

Subjektiv Objektiv överlevnad V°1Vm/d°“it°t “hamdung mouum m) nummer my* (rimmar) Små. 85 i 0 76,5 :t 20,6 112 i 27,7 16/60 SÉOIa 83 i 7,6 72,1 i 16,4 160 i 13,9 Små 86,7 i 2,9 87,1 1 3,6* 136 i 36,7 15/65 Stora 81,7 i 14,4 59,9 l 5,9* 144 i 41,6 Små. 91,7 i 2,9* 86,9 i 2,6 120 i 24,0 15/70 Stora 80 i 5,0* 82 i 7,9 144 :t 24,0 Små 81,5 i 5,8 86,4 i 14,4 112 i 27,7 15/75 SIIOIa 80 i 10 91,6 i 3,8 112 :t 13,9 Små 85 i 5 69,7 i 16,1 112 i 36,7 15/80 StOra 81,7 i 14,4 73,3 i 14,5 112 i 27,7 Små 90 i: 0* ND 96 i 24 20/60 Støra 80 i 5* ND 80 i 36,7 20/65 Små. 90 i 0 ND 112 i 13,9 Stora 85 i 5 ND 72 i 41,6 Små 86,7 i 5,8 ND 192 i 98,9 20 70 / Stora 80 i 0 ND 104 i 50,0 Små 76,7 i 8,2 ND 84 i 29,4 20 80 / Stora 77,5 i 6,89 ND 92 1 18,1 Anm; * Qualispermm. l) Motilitet: Inga skillnader mellan stora preparationer. Signiñkanta skillnader mellan behandlingar för små preparationer: 15/70 vs. 15 / 60 P < 0,05; 15/ 70 vs. 15/80 P< 0,05; 15/70 vs. 20/80 P< 0,05; 20/60 vs. 20/80 P< 0,05; 20/65 vs. 20/80 P< 10 15 535 788 30 0,05. 2) överlevnad: Inga signifikanta skillnader mellan små preparationer; den stora preparationen 20/ 65 hade signifikant kortare överlevnad än den stora preparationen 15 /60; inga signifikanta skillnader mellan andra stora preparationer. Notera: små, 0 timmar vs. 2timmar, icke signifikant. Stora, O timmar vs. 24 timmar, icke signifikant. Små vs. stora, 0 timmar P< 0,05; 24 timmar, icke-signifikant.

DFI-resultaten (Tabell 13) indikerade återigen att det fanns skillnader mellan kontrollpreparationerna (SLC-små) och de SLC-stora preparationerna då lägre densiteter av kolloiden användes, t ex 60% och 65% (P< 0,05 vid 0 timmar) men inte då 70% eller mer användes. Dessa skillnader försvann emellertid vid 24 timmar. Det var inte någon signifikant skillnad mellan DFI för SLC-små preparationer vid 0 timmar och 24 timmar eller för SLC-stora preparationer vid 0 timmar och 24 timmar.

Tabell 13: Effekt av förändrad volym och/ eller densitet hos kolloiden som användes fór uppskalningspreparationer av hingstsperma på medelvärdena av DFI (%) (n=23).

Volym/ densitet Behandling DFI (%) 0 timmar DFI (%) 24 timmar små &61«4 igsiav 15/60 Stora 13,7 :t 7,5 10,2 :t 4,3 små 149211 5211 15/65 Stora 11,63 :t 1 22,4 :t Små 12,2 i 5,9 8,8 i 2,6 15/70 Stora 15,2 i 11,5 11,5 i 6,4 Små 12,0 i 6 18,6 i 9,1 15/80 Stora 5,5 i 1,9 5,0 i 2,1 Små 7,5 7,0 20/60 Stora 12,6 14,3 Små 13,7 :t 2,9 18,2 i 3,0 20 65 / Stora 7,1 i 2,1 8,7 i 3,5 Små 5,5 5,0 20 70 l Stofa 8 6:9 Små 14,3 i 5,4 16,0 1 7,5 20 80 I Stora 13,1 i 6,4 16,0 i 7,1 10 15 20 25 30 535 788 31 Experiment 3: ”Små” spermiepreparationer bearbetades som beskrivet tidigare för experiment 1 och 2 under användning av 1,5 ml från vart och ett av 7 utspâdda ej akulat. Ytterligare SLC ordes med en ökad volym av ej akulat (4,5 ml) placerad ovanpå 4 ml kolloid i 10 ml centrifugrör, benämnda såsom ”SLC-Inc” (vilket betyder ökad volym)~ Efter centrifugering rcsuspenderades varje ”SLC-Inc”-spermíepellet i 3 ml färsk Kenneys spådningsmedel och alla spermiesuspensioner lagrades vid 5°C.

Spermiekoncentrationen bestämdes för alla SLC-preparatíoner och spermieutbytet beräknades. Motiliteten hos spermiepreparationerna och det utspâdda ejakulatet bedömdes dagligen under användning av CASA (13), under det att membranintegritet mättes vid 24 timmar efter SLC-beredningen (14).

Resultat: CASA-motilitetsresultaten visas in Figur ll. Det var inte någon skillnad i motilitet mellan SLC-små och för SLC-Inc-spermiepreparationer, även om det fanns signifikanta skillnader mellan icke-selekterade och båda typer av selekterade spermiepreparationer vid 24 och 48 timmar. Den icke-selekterade spermiesuspensionen hade ingen måtbar motilitet efter 48 timmar.

Hastighetsdata skilde sig inte heller mellan de två typerna av SLC-selekterade spermiepreparationer (Figur 12). Även om det genomsnittliga utbytet för SLC-Inc- preparationema var större än för SLC-små (4l,2 :t 28,3% respektive 33,3 i 21,3%), var denna skillnad inte staüstiskt signifikant. Spermieviabiliteten skilde sig inte mellan de två SLC-rnetoderna (Små, levande: 72 i O,3%; Inc, levande 72 i 0,3%).

Experiment 4: Som för experiment 3 men med tillägget av en andra uppskalningsmetod under användning av 15 ml kolloid (densitet 67 ,5%) plus 15 ml utspätt ejakulat, i ett 50 ml Falcon-rör (som benämns "stort”). Subj ektiva och CASA- (13) motilitetmåtningar gjordes dagligen, viabilítetsbedömningar ordes vid 0 timmar respektive 24 timmar under det att alikvoter frystes för efterföljande SCSA vid 0, 24, 48 och 72 timmar.

Resultat: de subjektiva och CASA-motilitetsresultaten var lilmande dem som erhölls i experiment 3, utan skillnad mellan några av SCL-metoderna (Figur 13).

Det var en god korrelation mellan CASA- och subjektiva motilitetsresultat (r= 0,7 till 0,9 för centrifugerade respektive ocentrifugerade prover; P< 0,00 l). Utbytena skilde sig inte signifikant mellan de tre SLC-behandlingarna (medel i SD: små 33,3 :t 20%; 10 15 20 25 535 788 32 lnc 36,3 i l5,8%; stora 40 i 2 l,7%). Dessutom var det inte någon skillnad i spermieviabilitet mellan några av SLC-uppskalningsmetoderna (Tabell 14).

Tabell 14: Andel viabla spermier i olika SLC-spermiepreparationer vid 0 timmar och 24 timmar, medel i SD (n=9).

Centrifugering Centrifugering Centrifugering Liten volym Ökad volym Stor volym O timmar 78 i 11,3 84,9 i 8,9 81,4 i 11,5 + 24 76,5 i 11,3 81,4 i 8,9 76,6 i 9,0 Ingen signifikant skillnad mellan de tre centrifugeringsmetodema.

Signiﬁkanta skillnader fanns i medel-DFI mellan ocentrifugerade och centrifugerade prover, även om det fanns en interaktion med tiden, eftersom de ocentrifugerade provema visade försämrad spermiekvalitet vid lagring medan kromatinintegriteten hos de centrifugerade provema inte försâmrades med tiden (Tabell 15).

Tabell 15: Effekten av olika uppskalningsmetoder på kromatinintegritet hos hingstspennier, medel i SD (n=9).

Centrifugering Centrifugering Centrifugering Liten volym Ökad volym Stor volym o :im 20,7 i 10,2 14,2 i 1,7 13,9 i 6,8 24 19,2 i 11,3 12,9 i 8,0 19,2 i 10,4 48 :im 15,0 i 8,0 13,0 i 8,0 21,0 i 14,0 72 tim 17,0 i 10,0 18,0 i 11,0 22,0 i 8,0 Konklusion: Det år möjligt att skala upp SLC genom att öka volymen av det utspådda ejakulatet som används på 4 ml kolloid. För ytterligare ökningar i volym år det emellertid nödvändigt att använda ett större centrifugrör och att justera kolloiddensiteten, såsom visas i Tabell 16. Dessa justeringar ger spermiepreparationer som år ekvivalenta till de ursprungliga vad gäller spermiekvalitet och utbyte, baserat på spermiemotilitet, -viabilitet och - kromatínintegritet. 10 15 20 25 535 788 33 Tabell 16: Jämförelse av parametrar som ger jämförbar kvalitet i uppskalade spermiepreparationer och i originalmetoden.

Kolloidvolym Kolloiddensitet Volym av utpätt (ml) (%) ejakulat (ml) Original 4 80 1,5 Ökad volym 4 80 4,5 Stor uppskalning 15 67,5 15- 18 EXEMPEL 5: Tjur Mål: (i) att undersöka fertiliseringsförmågan hos tjurspermier som bereddes antingen på en densitetsgradient eller på ett enkelskikt av kolloid i IVF; (ii) att undersöka användningen av kolloid centrifugering för selektion av spermier med normal storlek från en polymorf population hos ett tjurejakulat.

Metoder: För det första experimentet ordes strån av kryokonserverad tjursperma tillgängliga på Universitetet i Gent, Belgien, där IVF-försöket genomfördes. Före centrifugeringen tinades stråna av utspädd sperma i vatten vid 37°C under 12 sekunder och koncentrationen justerades till 100 x 105 miljoner per ml. Kolloid centrifugering utfördes som beskrivet för hingstsperma under användning av 80% kolloid E för enkelskiktscentrifugering och 2 ml 40% plus 2 rnl 80% kolloid E för densitetsgradienten. Datoríserad spermiemotilitetsanalys (CASA) på ocentrifugerade kontroller och på båda typema av spenniepreparationer genomfördes av en erfaren operatör under användning av en Hamilton Thorne motilitetsanalysapparat. Data samlades in för följande parametrar: hastighet av den jämn bana, raklinjig hastighet, kroklinjig hastighet, amplitud av lateral huvudavvikelse, slagkorsfrekvens (beat cross frequency), rakhet (straightness), linjäritet, koncentration,% motilitetP/o progressiv motilitetP/o snabb motilitetP/o mellansnabb motilítetP/o långsam motilitet och% orörlig. Standardmetoder (16) användes för IVM och IVF för att bestämma fertiliseringsgrad (10). Odling av de fertiliserade oocytema fortsatte i 8 dagar, varefter% utveckling till blastocyst och det totala antalet celler bedömdes. För det andra experimentet samlades ejakulat in från en tjur som var känd för att producera både diploida och haploida spermier. Spermierna var mycket 10 15 20 25 535 788 34 polymorfa, där macrocefaliska och mikrocefaliska spermier förelåg, tillsammans med hel rad spermier som hade ungefär normal storlek. Sperman kryokonserverades på Universitetet i Helsingfors, Finland på vanligt sätt. Stråna sändes till SLU för ytterligare undersökningar. Före centrifugeﬁng tinades strâna av utspädd sperma i vatten vid 37°C under 12 sekunder innan den späddes med buffert B. Enkelskikt med kolloid av olika densiteter inom intervallet från 40-90% av starnlösningskolloiden användes för att identifiera lämpliga densiteter för efterföljande användning i en densitetsgradient. Kolloid centrifugering genomfördes såsom beskrivet tidigare, varvid den resulterande spermiepelleten resuspenderades ibuffert B. Förinfårgade objektglas (Testsimpletsg Online diagnostik, Tyskland) användes för att färga in spennierna för mikroskopisk undersökning. Andelen makrocefaliska spermier bland 200 spermier från ocentrifugerad och centrifugerad sperma registrerades.

Resultat (första experimentet» Medelfertiliseringsgrad, blastocystutvecklingsgrad och totalt antal celler var 56,27 % i 29,1, 23,5% i 17,4 resp. 83,2 i 29,9 för densitetsgradientberedda spermier och 58,1% i 23,3, 24,5% i 14,3 respektive 94,6 i 23,4 för spermier beredda på ett enkelskikt av kolloid. Medelvårdena för olika parametrar av den datoriserade analysen av spermiemotilitet skilde sig inte mellan de två spermieprepareringsmetoderna (Tabell 17).

Tabell 17: CASA-parametrar av nötkreatursspermier preparerade genom densitetsgradlenter och enkelsldktscentrifiigering.

Parameter Enkelskikt Densitet* Parameter Enkelskikt Densitet* gradient gfﬂdießt VAP l 12,36 i 9,93 ll 1,1 i 8,87 Konc 37,68 i 17,69 36,96 i 20,3 VSL 95,4 i 8,87 94,92 i 10,58 % mot 75,4 i 10,5 71,4 i 17,09 VCL 171,48 i 10,98 167,44 i 16,18 % prog mot 61,4 i 13,3 54,8 i 16,8 ALH 7,08 i 0,57 6,98 i 0,71 % snabb 69,4 1.- 11,04 64,6 i 17,87 BcF 23,12 i 5,63 23,3 1 5,54 % medelsnabb 6,6 1 1,95 6,6 1 1,95 STR 82,2 1 2,28 ss i 4,04 % långsam 14 i 6,12 15,2 i 9,49 LIN 55,6 i 4,05 56,2 i 3,70 °/o orörlig 10,4 i 6,69 13,4 i 8,53 Anm.: det finns inga signifikanta skillnader 10 15 20 535 788 35 ii) Resultaten av enkelslciktscentrifugeringen med de polymorfa spermiema visas i Tabell 18. Nästan alla spermier hade förmåga att passera genom enkelskikt med 40% och 50% kolloid. De högsta andelama makrocefaliska spermier fanns i pelleten efter ett 60% enkelskikt (49% makrocefaliska ), vilket åter minskade till 27% makrocefaliska då kolloiddensiteten höjdes till 70%. Under användning av en densitetsgradient med skikten 70/55°/o identiﬁerades två subpopulationer, en som var anrikad på spermier med normal storlek på grånsytan mellan de två skikten (8% makrocefaliska spermier och 92% normala), medan spermiepelleten var anrikad på makrocefaliska spermier (34%). Under användning av kolloiddensiteterna 55% och 70% var det möjligt att erhålla två spermiesubpopulationer, en som innehöll nästan alla spermier med normal storlek och en annan anrikad på de makrocefaliska sperrniema (Tabell 19). De mikrocefaliska spermiema selekterades ut genom kolloiden med lägst densitet och uppträdde därför inte i någon av de selekterade subpopulationema.

Tabell 18: Andel spermier med olika storlek före och efter enkelskíktcentrlfugering av tjurspermier.

Stor Liten Rest Före 24 6 70 Efter enkelskikt 40% Pellet 35,5 1 63,5 Kolloid (endast litet antal) 23 4 73 Före 26 6 68 Efter enkelskikt 60% Pellet 49 2 49 Kolloid 14 3 82 Efter enkelskikt 70% Pellet 27 3,5 69,5 Kolloid 15 3,5 80 Tabell 19: Andel spermier med olika storlek före och efter densitetsgradlenteentrlfugering av tjurspermier.

Stor Rest Liten Före 32 65 3 Efter 70/55 Pellet 34 64,5 1,5 70 Kolloid 17 81,5 1,5 Gränsyta 8 92 0 Övre del (<55%) (litet antal) 10 83,5 6,5 10 15 20 25 30 535 788 36 Konklusioner: 1) Spermiema beredda på ett enkelskikt av kolloid har inte annat uppförande eller andra egenskaper än spermierna beredda på en densitetsgradient. 2) Under användning av en kombination av enkelskiktscentrifugering och densitetsgradientcentrifugering var det möjligt att separera spermier i olika subpopulationer, exempelvis en som innehöll nästan alla spermier med normal storlek och en annan som var anrikad på makrocefalika spermíer.

EXEMPEL 6: Galt Mål: (i) att undersöka effekten av ökande osmolariteten hos en kolloid formulering och centrifugrörsstorlek på effektiviteten av galtspermieselektíon under densitetsgradientcentrifugering, i syfte att utveckla kolloidformuleringar som är specifika för djurspennier; (ii) att jämföra densitetsgradientcentrifugering med centrifugering på ett enkelskikt av kolloid för beredning av galtspermier, (iii) effekten av att sterilisera genom autoklavering av kolloiden; och (iv) effekten av att tvätta sperrniepelleten efter kolloidal centrifugering.

Metoder: den gelfria, spermierika fraktionen av ej akulatet samlades manuellt in från 8 galtar (the gloved hand method) och spåddes omgående 1:1 (v/v) i Beltsville Thawing Solution. Spermiekoncentration justerades till 100xl06/ ml.

Densitetsgradient- och enkelskiktscentrifugering genomfördes enligt metoden som beskrivits tidigare, under användning av 80% kolloid A för enkelskiktscentrifugering och 2 ml 40% plus 2 ml 80% kolloid A för densitetsgradientcentrifugeringen. I ett experiment antingen tvättades (genom resuspendering av pelleten i 5 ml spermaspâdningsmedel och centrifugering vid 500 gi 10 minuter) replikat av spermiepelletar eller ej. Spermiemotiliteten i de icke-selekterade och selekterade spermieproverna bedömdes subjektivt som följer: alikvoter (0,5 pl) undersöktes genom faskontrastljusmikroskopi (x 200), på en uppvärmd mikroskop-platta (38°C) omedelbart efter beredning och därefter dagligen tills motiliteten hade minskat till ca 20%. För bedömningarna under de efterföljande dagarna lagrades spermiepreparationema över natt vid rumstemperatur (l9-24°C, beroende på väder) och inkuberades vid 38°C under 15-30 minuter inför motilitetsutvârderingen.

Utvinningsgrad (utbyte) beräknades såsom andelen av spermier som initialt hade 10 15 20 25 30 535 788 37 laddats på kolloiden efter kolloid centrifugering och som uppträdde i spermiepelleten efter centrifugering.

Resultat: genom att öka osmolariteten av kolloiden som användes för densitets- gradientcentrifugering av galtspermier från 305 till 330 mOsm, ökade andelen rörliga spermier i den resulterande spermiepreparationen (Figurer 14 och 15).

Spermiemotiliteten bibehölls i åtminstone 24 timmar längre i de centrifugerade spermiepreparationema än i kontroller (ocentrifugerade alikvoter), d v s 7 eller 8 dagar för spermier centrifugerade på en densitetsgradient jämfört med mindre än 6 dagar för ocentrifugerade spermier. Vid jämförelse av ett enkelskikt av kolloid och en densitetsgradient var spermiemotiliteten signifikant bättre (P< 0,00 1) i de centrifugerade spermiepreparationerna (medel i SD: 79,6 i 8,1% och 74,2 :t 12,0% för enkelskikt respektive densitetsgradient) än i de ocentrifugerade kontrollerna (62,9 t l2,7%). Antalet spermier som erhölls efter centrifugering (Tabell 20) och medelutbytet skilde sig inte mellan de två metodema (medelutbyte av rörliga sperrnier, enkelskikt: 67,5 i: 25,6%; densitetsgradient: 59,6% :t 223%).

Spermieöverlevnaden (Figur 16), ökade signifikant genom kolloidal centrifugering (ocentrifugerade preparationer: 3,1 :h 0,3 dagar, enkelskikt 5,5 i 0,79 dagar, densitetsgradient 5,75 i 0,62 dagar; P < 0,001 för ocentrifugerade vs. centrifugerade; enkelskikt vs. densitetsgradient, icke signifikant). Inkubering före motilítetutvårdering var nödvändig för lagrade sperrnaprover (Figur 17).

Förekomsten av bakterier i de ocentrifugerade spennaproverna kan ha bidragit till frånfållet av sperrnier. Kolloidal centrifugering verkade avlägsna bakteriema (subjektiv visuell bedömning). Autoklavering av den kolloida formuleringen hade ingen effekt pà spermieantalet, spermiemotiliteten eller Spermieöverlevnaden (Tabell 21). Vidare hade tvättning eller ej av spermiepelleten erhållen efter kolloidal centrifugering inte någon effekt på spermieantalet, spermiemotiliteten eller Spermieöverlevnaden (Tabell 22). Galtspermiema kunde lagras i 24 timmar före centrifugering utan att detta hade någon skadlig effekt på spermiemotiliteten och motilitetsvaraktígheten i de centrifugerade proverna (Figur 18). 10 15 20 535 788 38 Tabell 20: Antalet galtspermier erhållna efter densitetsgradient- och enkelsklktseentrifugering, medel i SD (miljoner) (n=20) Galt Enkelskikt Densitetsgradient P-värde 87 107,17 i 20,3 84,5 i 20,0 icke signifikant (ns) 1500 49,5 i 28,7 45,2 i 15,8 icke signiﬁkant 62 88,7 i 31,8 90,7 i 25,4 icke signifikant 367 93,2 i 25,5 90,8 i 32,7 icke signifikant Anm.: Signiﬁkanta skillnader mellan galtar (P <0,01) men inte mellan ejakulat.

Tabell 21: Effekten av autoklavering av kolloiden på spermiemotilitet, spermieöverlevnad och spermieantal i pelleten.

Parameter Autoklaverad Icke-autoklaverad Spermíemotílitet Dag 1 (%) 78,6 i 8,7 81,4 i 6,4 Spermieöverlevnad (dagar) 4,7 i 1,2 4,5 i 1,3 Spermíeantal (x106) 88,5 i 30,1 77,5 i 30,2 Anm.: skillnaderna mellan autoklaverade och icke-autoklaverade kolloider var inte signiﬁkanta.

Tabell 22: Effekten av tvättning av spermiepelleten på spermiemotilitet, spermieöverlevnad och spermieantal efter kolloid centrifugering.

Parameter 'tvättad Ej tvättad Spermiemotilitet Dag l (%) 80,7 i 10,3 75,4 i 9,9 Spermieöverlevnad (dagar) 6,1 i 1,2 5,4 i 1,1 Spermieantal (11106) 82,5 i 32,5 73,8 i 24,1 Anm: skillnaderna mellan tvättade och ej tvättade kolloider var inte signifikanta.

Konklusion: genom att öka osmolariteten av den kolloida formuleringen ökar selektionen av spermierna under densitetsgradientcentrifugering. Centrifugeríng på ett enkelskikt av kolloiden ger spermiepreparationer som har liknande motilitet och utbyte som dem från densitetsgradienterna och dessa preparatíoner uppvisar 10 15 20 25 535 788 39 förbättrad spermiemotilitet och överlevnadsvaraktighet jämfört med kontrollspermaproverna (ocentrifugerade) .

EXEMPEL 7: Hund Mål: att undersöka om enkelsldktscentrifugering (SLC) är gfnnsam för att selektera hundsperrnier av god kvalitet för inseminatíon.

Metoder: ej akulat med varierande sperrniekvalitet från fyra hundar samlades in genom digital manipulation. Alikvoter (4.5 ml) placerades på 4 ml 80% kolloid E i ett 12 ml centrifugrör. Efter centrifugering vid 300 g i 20 minuter resuspenderades den resulterande spermiepelleten i åggula-Tris-spâdnirigsmedel (1 ml) (17). En alikvot av det icke-selekterade ejakulatet späddes i åggula-Tris-spâdningsmedel till samma spermiekoncentration som den selekterade sperrníepreparationen.

Motilitetsbedömning under användning av datorstödd spermieanalys (CASA) och morfologisk utvärdering utfördes på. alla icke-selekterade och selekterade spermieprover.

Resultat: genomsnittet av spermiemotiliteten ökade från 77,2 :t 19,6% före SLC till 87,6 i 2.7% efter SLC, medan genomsnittet av den progressiva motiliteten ökade från 48,6 :t 18% till 67,9 :t 11% (Tabell 23). Genomsnittet av nonnal morfologi var 62,2 i 42,8% i icke-selekterade prover och 82,5 i 19, 1% i SLC-selekterade prover.

Efter lagring i 7 dagar vid 4°C var spermiemotiliteten < 5% i icke-selekterade spermaprover och 57 :t 1 1,15% i de SLC-selekterade spermiepreparatione.

Spermieutbytet varierade från 12 till 47% beroende på spermiekvaliteten i det ursprungliga ejakulatet. 535 788 40 Tabell 23: Motilitetsresultat genom datorstödd spermieanalys (CASA) fór icke- selekterade och SLC-selekterade hundspermaprover.

Hund Total motilitet (%) Progressiv motílitet (%) Utbyte (%) icke-selekterade selekterade lcke-selekterade selekterade 1 48,3 84,1 34,3 81,8 12 2 82,3 90 69 68,5 47 3 87,9 89,5 32,5 54,5 47,5 4 90,4 86,9 58,7 67,5 30 Medel 77,2 (l9,6) 87,6 (2,7) 48,6 (18) 67,9 (ll) 34,1 (l6,9) (SD) Konklusion: Dessa preliminära resultat indikerar att SLC kan vara en användbar metod för att förbättra hundsperrnickvaliteten i spermadoser avsedda för AI. 10 15 20 25 30 535 733 41 Referenser 1) Colenbrander, B., Gadella, B.M. and Stout, T.A.E (2003) The predictive value of semen analysis in the evaluation of stallion fertility. Reprod Dom Anim 38: 305-3 1 1. 2) Malmgren, L. (1998) Effectiveness of two systems for transporting equine semen.

Theriogenology 50: 833-839. 3) World Health Organisation. (1999) WHO laboratory manual for the analysis of human semen and sperm-cervical mucus interaction. Fourth ed. United Kingdom, Cambridge University Press. 4) Samardzija M., Karadjole, M., Matkovic, M., Cergolj, M., Getz, 1., Dobranic, T., Tomaskovic, A., Petric, J., Surina J., Grizelj, J., Karadjole, T. (2006) A comparison of BoviPure and Percoll on bull sperm separation protocols for IVF. Anim Reprod Sci 3-4: 237-247. 5) Macpherson, M., Blanchard, T.L., Love, C.C., Brinsko, S.P., Thompson, J .A. 81; Varner, D.D. (2002) Use of a silane-coated silica particle solution to enhance the quality of ejaculated semen in stallions. Theriogenology 58: 3 17-320. 6) Morrell, J .M. (2006) Update on semen technologies for animal breeding. Reprod Dom Anim 40: 1-5. 7) Kenney RM, Bergman RV, Cooper WL, Morse GW (1975) Minimal contamination techniques for breeding mares: techniques and preliminary findings. Proc Am Assoc Equine Practice 21: 327-336. 8) Williams W 81; Utica N (1920) Technique of collecting semen for laboratory examination with review of several diseased bulls. Cornell Vet 10: 87-94. 9) Skiktlöf, N. (1934) Morphological studies on the change in sperm structure and in the testes of bulls with decreased or abolished fertility. Acta Pathol Microbiol Scand Suppl 19: 254-267. 10) Evenson DP, Darzynkiewicz Z 8:. Melamed MR (1980) Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science 210: 1131-1133 11) Januskauskas A, Johannisson A 8:, Rodriguez-Martinez H (2001) Assessment of sperm quality through ﬂuorimetry and sperm chromatin structure assay in relation to file fertility of frozen-thawed semen from Swedish AI-bulls.

Theriogenology 55: 947-961. 10 15 535 788 42 12) Januskauskas A, Johannisson A, Rodriguez-Martinez I-l (2003) Subtle membrane changes in cryopreserved bull semen in relation to sperm viability, chromatin structure and ﬁeld fertility. Theriogenology 60:743-758. 13) Kavak A, Johannisson A, Lundeheim N, Rodriguez-Martinez H, Aidnik M 81. S Einarsson (2003) Evaluation of cryopreserved stallion semen from Tori and Estonian breeds using CASA and ﬂow cytometry. Anim Reprod Sci 76: 205- 2 1 6.) 14) Saravia F, Hernandez M, Wallgren MK, Johannisson A & H Rodriguez-Martinez (2007) Cooling during semen cryopreservation does not induce capacitation of boar spermier. Int J Androl 30: 485-499. 15) Tejerina F, Buranamanuay K, Saravia F, Wallgren M 81; H Rodriguez-Martinez (2008) Assessment of motility of ejaculated, liquid-stored boar spermier using Computerized instruments. Theriogenology 69: 1 129- 1 138. 16) Tanghe, S., Van Soom, A., Sterckx, V, Maes, D 8:. de Kruif, A. (2002) Assessment of different sperm quality parameters to predict in vitro-fertility of bulls.

Reprod Domest Anim 37: 127-132. 17) Ponglowhapen S, Essen-Gustavsson B & Linde Forsberg C (2004) Inﬂuence of glucose and fructose in the extender during long-term storage of chilled canine semen. Theriogenololgy 62: 1498-1517.

Claims

535 788 '13 PATENTKRAV

1. Komposition för separation av spermier från ett spermaprov, vilken innefattar åtminstone ett salt av en alkalimetall och / eller en alkalisk jordartsmetall, EDTA, en zwitterjonsbuffert, silanbelagda silikapartiklar och vatten, varvid kompositionen har ett pH av 7,0-7,35 och en osmolaritet av 320-345 mOsm.

2. Metod för beredning av spermier från ett spermaprov från ett icke-humant djur, vilken metod innefattar steget av att separera spermiema från andra spermabeståndsdelar genom centrifugering genom ett enkelskikt av en kolloid formulering, varvid den kolloida formuleringen år kompositionen enligt patentkrav 1 .

3. Metod enligt patentkrav 2, varvid densiteten hos den kolloida formuleringen ligger inom intervallet 1,05-1, 14 g/ ml.

4. Metod enligt patentkrav 2 eller 3, varvid den kolloida formuleringen har ett pH av 7 ,0-7,3.

5. Metod enligt något av patentkraven 2 till 4, varvid osmolaríteten hos den kolloida formuleringen år 320-330 mOsm.

6. Metod enligt något av patentkraven 2 till 5, varvid separationen utförs i en behållare med en volym av 10 ml eller mer, såsom 50-200 ml.

7. Metod enligt patentkrav 6, varvid höjden av kolloiden är 30-45 mm.

8. Metod enligt något av patentkraven 2 till 7, varvid den kolloida kompositionen år en 65-70% spâdning i buffert av en stamlösning av kolloidformuleringen, vilken starnlösning har en densitet av l,13 i 0,005 g/ ml.

9. Metod enligt något av patentkraven 2 till 8, varvid spermiema separeras från sädesplasma och dess cellulåra eller icke-cellulära beståndsdelar. 535 788 "19

10. Metod för separation av en spermiesubpopulation av intresse från ett spermaprov från ett icke-humant djur, vilken metod innefattar stegen av att tillhandahålla en densitetsgradient innefattande åtminstone två skikt av kompositionen enligt patentkrav 1, varvid varje skikt har olika densiteter, separera spermiesubpopulationen i spermaprovet genom centrifugering genom densitetsgradienten och selektera spenniesubpopulationen av intresse.

11. Metod enligt patentkrav 10, varvid spermiesubpopulatíonen är haploida spermier från tjursperma.

12. Sperrnier beredda genom en metod enligt något av patentkraven 2 till 1 1.

13. Användning av spermier enligt patentkrav 12 för artificiell insemínation, in vitro-fertilisering eller intracytoplasmisk spermieinjektion.