CN102620974A

CN102620974A - 一种从天然水体悬浮物中富集纯化藻类细胞的方法

Info

Publication number: CN102620974A
Application number: CN2012100991132A
Authority: CN
Inventors: 李哲; 郭劲松; 方芳; 刘静; 张利萍; 冯婧; 龚本洲
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2012-04-06
Filing date: 2012-04-06
Publication date: 2012-08-01

Abstract

本发明公开了一种从天然水体悬浮物中富集纯化藻类细胞的方法，1）将水样滤过64μm浮游生物网，以去除浮游动物和大颗粒悬浮物；2）将过滤后的水样进行浓缩富集处理，使含水率在80%～90%间，得到悬浮物匀浆；3）制备密度为1260～1290kg/m³的无机硅溶胶；4）将制备得到的无机硅溶胶加入离心管内，再将悬浮物匀浆添加到无机硅溶胶表面，最后将离心管放在离心机上进行分离纯化；5）离心后，移取离心管顶部1cm深度之上的物质即为富集纯化的藻类细胞并避光保存至冰箱中即可。本发明分离富集效率高，纯度高，操作简单，过程易控制，能够满足科学、高效开展天然水体藻类细胞元素组成、同位素示踪等实验研究的相关要求。

Description

一种从天然水体悬浮物中富集纯化藻类细胞的方法

技术领域

本发明涉及生态环境分析方法，具体涉及从天然水体悬浮颗粒中分离富集纯化藻类细胞的方法，分离得到的藻类细胞可用于淡水生态学、地球化学领域开展藻类细胞元素组成、同位素示踪等研究，属环境科学研究领域。

背景技术

水中的悬浮物（suspended solids）通常是指悬浮存在于水体中的一大类固态混合物，包括无机悬浮颗粒物（不溶于水的泥沙颗粒、黏土胶体颗粒等）、有机悬浮颗粒物（浮游动植物活体、动物残体、粪便、碎屑、微生物等）。广泛存在于天然水体中的悬浮物，不仅影响了天然水体的水质理化性质（如浊度、色度等），而且也是各种污染物质（重金属、农药等）和生源要素（C、N、P）的主要载体和存在形式，是水环境科学、水域生态学与生物地球化学等领域具有重要价值的研究对象。

藻类是一类具有叶绿素，能进行放氧的光合作用；植物体没有真正根、茎、叶的分化，用单细胞的孢子或合子进行繁殖的低等植物。作为水中悬浮物的主要组成之一，浮游营生于水中的藻类（通常也称“浮游植物”）是水域生态系统（尤其是大型水体）的主要生产者，其光合作用将提供食物网的最初能量来源，驱动着物质在不同营养层级中传递与循环利用。

近年来，在淡水生态学、地球化学研究中广泛开展的化学计量学、同位素示踪等研究工作需要对天然水体中藻类细胞开展元素含量或物质组成分析研究，以明确藻类细胞体内元素组成或相关物质的生物地球化学过程。然而目前天然水体中藻类细胞的常规采样分析方法还难以满足前述研究的相关要求。

在已有的水域生态系统观测规范（见《水域生态系统观测规范》，中国生态系统研究网络科学委员会编，中国环境科学出版社2007年出版）和国内外相关文献报道中，对天然水体藻类细胞体内元素含量与物质组成进行测试分析的方法是以湖泊生态系统为基础设计的，即默认湖泊水体中绝大多数悬浮颗粒物是藻类细胞，采用微孔滤膜过滤水样截留悬浮物以实现藻类细胞在微孔滤膜上富集，并开展后续测试分析工作（如元素分析、同位素示踪等）。该方法对开展藻类细胞内元素含量和物质组成分析仍存在明显而突出的不足：

一方面，微孔滤膜过滤将使水中其他有机或无机悬浮颗粒连同藻类细胞一起截留在微孔滤膜表面。截留于微孔滤膜表面的悬浮物（藻类细胞）通常一并进行元素分析、同位素示踪等后续测试分析工作，同实际情况存在较大偏差。

另一方面，同湖泊相比，河流、水库等过流型水体中无机悬浮颗粒物（泥沙颗粒等）在颗粒物中所占比重不容忽视，而藻类细胞含量则相对偏少。采用微孔滤膜过滤的方式富集水中藻类细胞，不仅容易出现无机悬浮颗粒堵塞微孔滤膜，影响微孔滤膜过滤效果，造成滤膜浪费，也无法使藻类细胞得到高效率分离富集。滤后开展的元素分析、同位素示踪等分析测试工作存在很大误差。

虽然目前还可以采用64μm浮游生物网在水下拖网，或采集一定体积（如1L）水样滴加鲁哥试剂沉淀浓缩等方式实现对水体中藻类细胞富集，但上述方法仅适用于对藻类物种和现存量进行显微镜定性镜检或定量计数分析。同微孔膜滤的方法一样，上述方法无法根本解决从悬浮颗粒物中分离出藻类细胞的核心难题；而由于采用化学方式杀死藻类细胞，这在一定程度上对天然水体藻类细胞自身化学组成造成污染，并不适用于藻类细胞元素分析或同位素示踪实验研究。

从天然水体悬浮物中富集分离纯化藻类细胞是开展藻类细胞元素分析、同位素示踪实验的关键基础，但国内目前仍未见有相关研究报道。因此，有必要开发出一套从天然水体中富集纯化藻类细胞的方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种分离富集效率高、纯度高的从天然水体悬浮物中富集纯化藻类细胞的方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种从天然水体悬浮物中富集纯化藻类细胞的方法，其步骤为：

1）水样采集与预处理：从天然水体中取一定体积的水样，并将水样滤过64μm浮游生物网，以去除浮游动物和大颗粒悬浮物；

2）悬浮颗粒物浓缩富集：将第1）步过滤后的水样进行浓缩富集处理，使含水率在80%～90%间，得到悬浮物匀浆并放入冰箱中避光保存；

3）无机硅溶胶的制备：将无机硅溶胶用水进行稀释，使之密度为1260kg/m³～1290 kg/m³；

4）离心机上分离纯化：将第3）步制备得到的无机硅溶胶加入离心管内，再将第2）步得到的悬浮物匀浆从冰箱取出后震荡或搅拌均匀，再添加到无机硅溶胶表面，悬浮物匀浆和无机硅溶胶的体积比为1:3-1:4，最后将添加有悬浮物匀浆和无机硅溶胶的离心管放在离心机上进行分离纯化，离心机转速1500～2000rpm/min，分离纯化10～20min；

5）取液保存：离心后，移取离心管顶部1cm深度之上的物质即为富集纯化的藻类细胞并避光保存至冰箱中即可。

第2）步悬浮颗粒物浓缩富集使用连续流离心机，连续流离心机工作转速18000～22000rpm，离心过程中不断搅拌使水样悬浮物均匀分布。

若水中悬浮物浓度较高且主要为无机泥沙颗粒（水体浑浊且偏黄），第1）步水样滤过64μm浮游生物网之前可静置沉淀15～30min，以去除易沉的大颗粒泥沙。

若为海水或硬度较大的淡水样品，所述浓缩富集后的悬浮物匀浆需用去离子水滗洗以进一步去除其中丰富的二价阳离子；也可以使用离子交换膜进行离子交换，离子交换膜配置与二价阳离子相同电导率的一价阳离子。

本发明分离富集效率高，纯度高，操作简单，过程易控制，可有效避免传统膜滤方法富集天然水体悬浮颗粒但无法分离纯化藻类细胞的缺陷，能够满足科学、高效开展天然水体藻类细胞元素组成、同位素示踪等实验研究的相关要求。

附图说明

图1-本发明流程图。

具体实施方式

天然水体中浮游藻类是一类元素组成相对一致的有机生命体，而其他悬浮颗粒物的组成成分则较为复杂。在物理性质上，浮游藻类细胞密度接近于水体，同其他悬浮颗粒物相比较小，且不同藻种间的密度差异并不明显，通常在920kg/m³～1280kg/m³之间。而浮游动物体密度则通常相对较大（密度约在1500kg/m³左右），无机悬浮颗粒物密度则更大（如泥沙颗粒密度大于2300kg/m³）。基于上述差异，本发明提出采用密度梯度离心的方法，通过离心力场作用使不同密度的颗粒物分别停留在特定密度介质层中，进而实现从天然水体悬浮物中分离纯化藻类细胞的目的。

根据上述思路，本发明提出了“连续流离心浓缩富集→无机硅溶胶密度梯度离心纯化→C:Chla评估检验效果”的总体技术方案，具体技术流程图见附图1。

下面结合附图对本发明作进一步说明。

参见图1，从图上可以看出，本发明的具体操作步骤为：

1）水样采集与预处理

从天然水体取一定体积水样，通常为60～80L，视水样中悬浮物含量多寡而定。根据水体表观特征判别水中悬浮物主要组成与大致的藻类细胞浓度水平。若水中悬浮物浓度较高且主要为无机泥沙颗粒（水体浑浊且偏黄），可静置沉淀15～30min，去除易沉的大颗粒泥沙后滤过64μm浮游生物网（25^#浮游生物网），去除浮游动物和其他大颗粒悬浮物。若水中无机泥沙颗粒较少，悬浮物以有机碎屑和藻类细胞为主（水体偏绿或偏褐色），可直接将水样滤过64μm浮游生物网。

2）悬浮颗粒物浓缩富集与保存

为使天然水体悬浮物（含藻类细胞）能够满足离心分离的要求，需要提升浓度水平，故采用连续流离心机（如CEPA-LE/GLE连续流离心机），满足从大容量天然水体中浓缩富集悬浮物（含藻类细胞）的要求。连续流离心机工作参数：

l 采集水样量：60～80L；

l 水样进样流量：200～300mL/min；

l 离心机工作转速：18000～22000rpm；

连续进样离心过程中采用机械搅拌方式维持进样器内水样悬浮物混合均匀。离心过程中人工值守以确保离心富集产物（悬浮物颗粒匀浆）不溢流出取样池，并可在过滤过程中通过调节转速、改变离心力以调节过滤产物的产率与含水率，保证悬浮物能够有效浓缩富集并不影响后续分离纯化工作。

浓缩富集后水样含水率在80%～90%间，悬浮物通常以粘稠状匀浆态形式存在，故称之为悬浮物匀浆。将悬浮物匀浆放入冰箱中避光保存，防止叶绿素a（Chla）分解。

3）制备特定密度的无机硅溶胶用于分离纯化

硅溶胶是纳米级二氧化硅微粒在水中均匀扩散形成的胶体溶液（mSiO₂·nH₂O），按照胶体分散介质的不同，通常分为有机硅溶胶和无机水性硅溶胶两种。但由于本发明所涉及藻类细胞分离效果评估（C:Chla）与后续分析处理（元素分析、物质组分分析等）需避免在离心分离过程中C、N、P等化学物质对藻类细胞的污染，故要求使用无机水性硅胶溶液。

本发明推荐采用杜邦公司生产Ludox TM-50型无机硅溶胶进行实验，该无机硅溶胶颗粒粒径10～20nm，分散性较好，对细胞无毒性和刺激性，市售密度为1400kg/m³。为满足密度梯度分离需要，即需要保证所采用分离介质的密度略高于藻类细胞而低于其他悬浮颗粒物，故需要对市售Ludox TM-50 无机硅溶胶进行常温下稀释制备。根据藻类细胞的密度上限，本发明提出制备后硅溶胶密度范围大致为1260kg/m³～1290 kg/m³，对于蓝藻（密度较轻）含量较多的样品可以取下限而对于硅藻（密度较重）含量较多的样品可以取上限。而最适宜的硅溶胶密度值需综合长期实验经验最终确定。

稀释倍数与稀释后硅溶胶密度根据以下公式计算：

通常硅溶胶直接在透明离心管中直接制备（50mL离心管中建议装填30mL制备后的硅溶胶）。制备后硅溶胶应避免同含二价阳离子（如Ca²⁺、Mg²⁺）的溶液接触以防止胶体脱稳凝结。制备后硅溶胶液体应迅速使用，避免悬浊液出现颗粒沉淀。若出现颗粒沉淀，可采用无机微孔滤膜过滤，但需重新计算并调整其密度值。

4）在台式离心机上分离纯化

将浓缩富集后的悬浮物匀浆从冰箱取出后震荡或搅拌均匀，用针筒或移液枪移取至硅溶胶表面，注入的悬浮物匀浆和无机硅溶胶的体积比为1:3-1:4。样品量视离心管容积确定，一只50mL离心管一次建议分离10mL悬浮物。在台式离心机上，以转速1500～2000rpm/min转速下分离纯化10～20min。离心后，离心管内介质顶层纯化产物为藻类细胞，底部则为其他悬浮颗粒物。

5）取液保存

采用针筒或移液枪移取离心后离心管顶部约0～1cm深度范围的藻类细胞纯化产物层于锥形瓶中避光保存至冰箱中，以备后续研究。

完成一次离心与藻类顶部样品提取后，可直接在剩余硅溶胶表面叠加移注需要离心的悬浮物匀浆，再次进行离心分离取样工作。但由于离心后将增加底部悬浮物含量，离心管中硅溶胶体积亦有损失，为避免离心分离效果下降，建议一支50mL离心管内重复“离心-取样”不超过3次。

累积于离心管底部的是分离后其他悬浮颗粒，不含有或含有极少量藻类细胞。由于其在分离过程中混有硅溶胶成分或被硅溶胶裹覆，为进一步提纯，可直接用移液枪或针筒从底部吸出后，移至于新的离心管中，加注去离子水（约30～40mL）摇匀后再次离心，离心条件同前述。通过二次离心稀释残留的硅溶胶，并使其他悬浮颗粒进一步得到纯化。

根据后续分析需要确定所需的藻类样品总量，并重复开展上述离心分离工作以满足实验需要。

下面对分离纯化效果评估指标进行说明。

分离纯化效果评估指标为C:Chla（悬浮物含C量和叶绿素a比值）。悬浮物含C量采用元素分析方法测定，Chla含量采用丙酮萃取法分析，两种方法均有相应的分析测试标准，见《水域生态系统观测规范》（中国生态系统研究网络科学委员会编，中国环境科学出版社2007年出版）。

C:Chla比值越低证明分离后的悬浮物中所含的藻类细胞比重越高。通常情况下，分离后离心管内介质顶层纯化产物（藻类细胞）的C:Chla比值应远低于离心管底部其他悬浮颗粒物的C:Chla比值。综合相关文献报道，分离纯化后顶部藻类细胞层C:Chla比值应低于200，该值视为达到分离纯化目的的最高限值。

结合分离效果评估，可对前述分离过程参数设置进行调整（如硅溶胶密度、分离转速、时间等），以获得更好的分离效果。

其他注意事项说明。

天然水体中微生物（细菌、病毒）总含量远远低于天然水体中其他悬浮颗粒物含量和藻类细胞生物量水平，它们对藻类细胞分离纯化过程所造成的干扰忽略不计。

含二价阳离子的溶液将导致硅溶胶内胶体脱稳絮凝或凝结，应通过预处理予以避免。当天然水体中二价阳离子含量较高时，如海水、硬度较高的淡水等，应在天然水体悬浮物（含藻类细胞）浓缩富集后用去离子水滗洗，或使用离子交换膜，配置相同电导率的一价阳离子同悬浮物匀浆进行离子交换。

以下给出一个具体实施例以验证本方法的可行性。

于2010～2011年采集长江重庆段干支流水体进行藻类细胞的富集分离纯化工作。地表水样中二价阳离子量含量很少，未进行预处理。

根据上述方法，选取4种不同水样采用上述方法进行连续离心富集浓缩（连续流离心机工作转速20000rpm/min），其他参数信息见下表（其中水样1在离心前预沉淀30min）：

水样编号	总悬浮物浓度（mg/L）	主要性质简述	浓缩富集水样取用量	进样工作流量（mL/min）
					水样1	32.9	高泥沙含量	60L	250
水样2	14.6	高藻浓度	60L	250
					水样3	2.8	低悬浮物浓度	80L	200
水样4	9.3	高藻浓度	60L	200

硅溶胶制备密度为1270kg/m³，硅溶胶质量分数为67.5%，水的质量分数为32.5%。取30mL制备后硅溶胶于透明离心管中，在其上小心移注10mL浓缩后悬浮物，在台式离心机上以1500rpm转速离心分离15min。用针筒分别吸取离心后离心管内上层0～1cm范围内的藻类细胞、底部悬浮物分别测试C:Chla比值关系，结果见下表：

水样编号	原水C:Chla	离心管上层C:Chla	离心管底部C:Chla
				水样1	645±23	43±5	1123±56
水样2	297±10	140±8	387±32
				水样3	344±25	78±6	783±44
水样4	431±20	108±5	679±43

从上述结果可以看出，针对4种水样，离心后离心管上部的C:Chla比值低于200，并显著低于离心前的C:Chla比值和底部的悬浮物C:Chla比值，说明藻类细胞得到了很好的富集与分离，本发明提出的实验方法可行。

从横向水样分离效果比较分析中可以看出，上述方法在高泥沙含量水体（水样1）和低浓度悬浮物水体（水样3）均取得了较优的分离效果，而在水华期间（水样2）由于水体中绝大多数悬浮颗粒物为藻类细胞的悬浮颗粒物，硅溶胶的密度梯度分离纯化效率较上述水样略有下降，可以通过调节硅溶胶密度和相关分离参数以获取更优的分离效果。

Claims

1.一种从天然水体悬浮物中富集纯化藻类细胞的方法，其特征在于：其步骤为：

2.根据权利要求1所述的从天然水体悬浮物中富集纯化藻类细胞的方法，其特征在于：第2）步悬浮颗粒物浓缩富集使用连续流离心机，连续流离心机工作转速18000～22000rpm，离心过程中不断搅拌使原水样悬浮物均匀分布。

3.根据权利要求1或2所述的从天然水体悬浮物中富集纯化藻类细胞的方法，其特征在于：第1）步水样滤过64μm浮游生物网之前静置沉淀15～30min，以去除易沉的大颗粒泥沙。

4.根据权利要求3所述的从天然水体悬浮物中富集纯化藻类细胞的方法，其特征在于：所述浓缩富集后的悬浮物匀浆用去离子水滗洗以去除天然水体中的二价阳离子。

5.根据权利要求3所述的从天然水体悬浮物中富集纯化藻类细胞的方法，其特征在于：所述浓缩富集后的悬浮物匀浆用离子交换膜进行离子交换，以去除天然水体中的二价阳离子，离子交换膜配置与二价阳离子相同电导率的一价阳离子。