CN112033867A - 一种海水中浮游植物的现场计数方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种海水中浮游植物的现场计数方法，属于海洋调查方法领域，采取目标水样，过200μm的筛绢，制成海水样品P1；与等体积十二烷基硫酸钠溶液在离心管中震荡混匀，制成混合样品H2，混合样品H2同时、分别注入化学和生物过程在线监测系统上的8个长颈玻璃漏斗，溶液在重力作用下通过漏斗流入下方的容器；采用化学和生物过程在线监测系统自动采集/记录流动混合样品H2的电容耦合非接触电导σ数据；当所有混合样品H2完全流出长颈漏斗后，化学和生物过程在线监测系统自动统计每个检测通道出现的倒峰型信号数量n1,n2….n8，本发明述方法能够在现场对海水样品中浮游植物数量进行测量，简单快捷。
Description
技术领域：
本发明属于海洋调查方法领域，具体地涉及一种海水中浮游植物的现场计数方法。
背景技术：
浮游植物指在水体中以浮游生活的微小植物类群，是水生生态系统食物链中最基础、最重要的一环，是水质和富营养化的监测、评价以及风险预警的重要指标之一。准确获取海水环境中浮游植物类群的数量是海洋调查的主要目的之一。
目前获取海水中浮游植物类群数量的方法基本上都包括以下几个步骤：采集、固定、转运、浓缩和计数。
显微镜法是最经典的计数方法，但该方法耗时较长，对专业知识要求高，结果易被水样中非藻颗粒物干扰，而且，显微镜放大倍数的局限可造成微型及超微型浮游植物的漏检。
血球计数法虽然方便、快捷，自动化程度较高，但计数室内的杂物或未洗净的微生物会影响计数结果，因而仅适于实验室纯种培养的高浓度样品。
库尔特计数是通过测量细胞体积和个数，得出各颗粒的大小，统计出粒度的分布，其重现分析功能可分析到单个脉冲信号，灵敏度较高，但该方法也仅适合于实验室纯种培养的样品。
基于色素的化学分析方法是利用浮游植物不同类群间色素组成和含量的不同来确定群落组成和丰度。由于环境变化以及不同的细胞生长周期会导致浮游植物的光合色素含量发生一些变化，从而导致分类结果和计数受到影响。
叶绿素a浓度测定法能够确定细胞生物量，准确度高，但操作较复杂、耗时长。而且，不同种类浮游植物的叶绿素a相对浓度随浮游植物群落的变化而变化。因此，叶绿素a浓度只是浮游植物浓度的近似值。
以浊度法为代表的分光光度计数法自动化程度较高，操作简单、耗时短，测定结果重现性好、误差小，且测定时可以不破坏样品，但测定易受细胞生长和生理状态的影响，还易受细胞生长后期细胞碎片和有机颗粒等非细胞因素的影响。
流式摄像机法综合了显微镜法、叶绿素荧光法和流式细胞仪法的功能，能够给出每一种浮游植物的尺寸和图像，非常适合检测基于天然叶绿素荧光的浮游植物样品，可以对浮游植物自动计数，但普适性较差，要求较高的样品浓度，重现性不太理想，而且设备昂贵。
添加鲁哥固定液静止沉降，利用虹吸原理浓缩样品是浮游植物采集最常用的方法。在倒置显微镜计数方法(
计数法，国际上浮游植物调查研究最通用的方法之一)中，通过在计数杯中直接沉淀达到浓缩的目的——先将鲁哥试剂固定的水样摇匀后注入沉降管中，盖好盖玻片静置沉淀(时间≥24h)。为减少浓缩时间，Paxinos等人开发了压滤浓缩方法，所得计数结果与传统的沉降浓缩结果具有很好的相关性(R2＝0.98)，浓缩过程只需2h左右。即使如此，依然存在效率较低的问题。
此外，最重要的是，现有自动化/半自动化计数技术都无法实现现场应用。
迄今为止，能够在现场直接准确确定海水样品中浮游植物数量的调查方法依然亟待建立。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是提供一种海水中浮游植物的现场计数方法，所述方法能够在现场对海水样品中浮游植物数量进行测量，简单快捷。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种海水中浮游植物的现场计数方法，该方法的具体步骤如下：
采用采水器采取目标深度海水水样，过200μm的筛绢除去包括浮游动物、泥沙在内的非浮游植物颗粒的干扰，制成海水样品P1；
取10mL以上的海水样品P1与等体积十二烷基硫酸钠(SDS)溶液在离心管中震荡混匀，制成混合样品H2；
进一步，该SDS溶液的浓度为5-10％，作用是将浮游植物良好分散，避免团聚，从而保证计数准确度。
将8个大端口直径为10mm的玻璃长颈漏斗分别竖直插入化学和生物过程在线监测系统(C&BMS，由装有该系统工作软件的便携式笔记本电脑自动控制)的8个工作通道；
进一步，漏斗细颈外径为3.0mm，内径为1.0mm，长度为260mm。
采用八道手动移液器将8个1mL的混合样品H2同时、分别注入8个长颈玻璃漏斗，溶液在重力作用下通过漏斗流入下方的容器；
采用C&BMS自动采集/记录流动混合样品H2的电容耦合非接触电导σ数据。当待测混合样品H2中每个浮游植物细胞通过C&BMS检测电极时，由于其导电能力低于本体溶液，因而产生倒峰型信号。当所有混合样品H2完全流出长颈漏斗后，C&BMS自动统计每个检测通道出现的倒峰型信号数量n1,n2…n8。
进一步，C&BMS的工作参数为激励频率1MHz、激励电压16V、采集σ值的频率为0.1s。
根据公式n＝(n1+n2+n3+n4+n5+n6+n7+n8)/8计算所测定混合样品H2中浮游植物的平均值，用以提高测定的准确性。
进一步，该值按照四舍五入取整数。
根据公式n海水＝n×2×1000计算得到海水样品中浮游植物的浓度，单位为个/L。
本发明与现有技术相比的有益效果：
1、本发明自动化程度较高，结果准确，重现性好。
2、仅需要不太昂贵的便携式仪器设备，可以实现现场测定。
3、本发明具有较高的效率——无需浓缩、固定和转移样品的步骤，从采集样品到获得结果数据仅需不到0.5h。
4、本发明不依赖专业技术人员，操作简单易学，因而易于推广。
附图说明：
图1为浮游植物自动计数工作示意图：1-移液器；2-长颈漏斗；3-化学和生物过程在线监测系统的检测通道；4-化学和生物过程在线监测系统；5-废液池；6-笔记本电脑；7-数据线；
图2为8通道C&BMS的记录曲线图：A-H分别为通道1、通道2、通道3、通道4、通道5、通道6、通道7和通道8。
具体实施方式：
下面通过实施例来详细叙述和解释本发明的技术方法，本实施例不对本发明内容作任何形式的限制。
实施例1：海水中微小原甲藻的快速计数
微小原甲藻又名微型原甲藻，藻体壳面呈心形或卵形，体长为15～23μm，宽度为13～17μm，顶刺长约1μm，是全球范围温带和亚热带的主要赤潮诱因生物之一。采用本发明实现了海水中该藻的快速计数，并用经典的显微镜法进行了对比验证。
步骤一、如图1所示，将青岛谷峰实验仪器有限公司生产的C&B 8-A型便携式8通道C&BMS主机(4)和联想公司生产的ThinkBook 14型便携式笔记本电脑(6)在调查船上放置妥当。将C&BMS主机(4)与笔记本电脑(6)采用数据线(7)连接。开机，点击专用软件TER-GO，在用户界面设置测定电容耦合非接触电导σ值的参数——激励频率为1MHz，输入电压为16V，记录频率为0.1s。
步骤二、采用F/2培养基、GY-FYQ-PYJ-02型培养架和藻种(都是上海光语生物科技有限公司产品)培养实验用的GY-H38微小原甲藻，条件为6 0001x光照度、14：10光周期和22℃。培养好的甲藻采用经0.45μm混合纤维素微孔滤膜(天津津腾公司产品)过滤处理的海水按照10％比例稀释，制成待测液P1。
步骤三、取20mL待测液P1与20mL 6％的SDS溶液在一个洁净玻璃杯中混匀，制成混合样品H2。
步骤四、将8个10mm口径玻璃长颈漏斗(2)(注：漏斗柄外径为3.0mm，内径为1.0mm，长度为260mm，江苏顺和教学仪器有限公司)分别竖直插入C&BMS(4)的八个工作通道(3)。
步骤五、采用八道手动移液器(1)将8个2mL的混合样品H2同时、分别注入8个长颈玻璃漏斗(2)，溶液在重力作用下通过漏斗(2)流入下方的废液池(5)。
步骤六、在笔记本电脑(6)上启动C&BMS(4)的专用软件，实时记录每个通道中混合样品H2下流过程中的电容耦合非接触电导σ值，得到8条响应曲线，显示各通道峰型信号数量n分别为49、49、52、51、50、50、51、50。根据公式n＝(n1+n2+n3+n4+n5+n6+n7+n8)/8计算所测定混合样品H2中浮游植物的平均值为50个(按照四舍五入取整数)。
步骤七、从步骤三至步骤七，重复实验5次，共用时70min。结果显示混合样品H2中浮游植物的平均值分别为50、47、55、52和48个(均按照四舍五入取整数)。因此，测定数据的相对标准偏差(RSD)为6.4％。
步骤八、显微镜计数：将2mL待测液P1用VM-C型漩涡混匀器(上海皓庄实验仪器公司产品)充分混匀后，加入1％的甲醛固定和0.15％鲁格氏试剂染色，漩涡混合10min，制成上镜液S1。采用移液器取0.1mL上镜液S1，置于容量为0.1mL、表面积为20mm×20mm的计数框内。在100倍显微镜(SGO-PH201型，深圳市深视光谷光学仪器有限公司产品)下全部计数，计数5次(共用时330min)。结果显示混合样品H2中浮游植物的平均值分别为38、42、37、58和49个。因此，测定数据的相对标准偏差(RSD)为19.6％。
步骤九、通过结果比较证实本发明方法优于经典显微镜方法：本方法测定样品共耗时为显微镜方法的21.2％，因而具有较高效率；本方法测定样品的数据RSD为显微镜方法的32.7％，因而具有较高的精密度。
实施例2：SDS分散液的浓度优化实验
实验所用海水信息见表1：
表1 实验用海水样品信息
步骤一同实施例1步骤一。
步骤二、采用柱状采水器(型号为3L，青岛尚隆鑫达商贸有限公司产品)取S1海水3L，转移到洁净加仑桶中。
步骤三、采用200μm的筛绢(烟台禾汽实验仪器有限公司产品)过滤海水，制成预处理海水样品S1P1。
步骤四、分别取10mL预处理海水样品S1P1放入12个50mL离心管中，然后再向该离心管中分别加入1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％和12％的SDS分散液，振荡混匀，制成混合样品S1H1、S1H2、S1H3、S1H4、S1H5、S1H6、S1H7、S1H8、S1H9、S1H10、S1H11和S1H12。
步骤五同实施例1步骤四。
步骤六、采用八道手动移液器(1)将8个1mL的混合样品S1H1同时、分别注入8个长颈玻璃漏斗(2)，溶液在重力作用下通过漏斗(2)流入下方的废液池(5)。
步骤七、在笔记本电脑(6)上启动C&BMS(4)的专用软件，实时记录每个通道中混合样品S1H1下流过程中的电容耦合非接触电导σ值，得到8条响应曲线，显示各通道峰型信号数量n分别为4、6、3、5、8、8、3、7，说明所测定浮游植物的数量分别为4、6、3、5、8、8、3、7。该测定结果数据的标准偏差(SD)为2.07。
步骤八、采用步骤五-步骤七相同方法分别测定S1H2、S1H3、S1H4、S1H5、S1H6、S1H7、S1H8、S1H9、S1H10、S1H11和S1H12中浮游植物的数量并计算数据的标准偏差(SD)，结果如表2所示：
表2 SDS分散液浓度与浮游植物计数值标准偏差(SD)的关系
| SDS浓度(％) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| SD | 5.02 | 4.68 | 3.03 | 2.10 | 2.07 | 2.10 | 2.04 | 2.11 | 2.05 | 2.04 | 2.39 | 3.25 |
步骤九、分析SDS分散液的浓度对计数S1海水样品中浮游植物值的影响。由表1可以看出，当SDS分散液的浓度在4％与10％之间时，所测定浮游植物数量值的标准偏差(SD)均不大于2.11，说明这种情况下浮游植物在混合样品中的分散性较好，因而计数的精密度较好。
步骤十、采用步骤二-步骤九相同方法分别分析SDS分散液的浓度对计数S2海水、S3海水、S4海水和S5海水样品中浮游植物值的影响，结果发现SDS分散液浓度与各样品种浮游植物测定值标准偏差(SD)之间的关系如下(表3)：
表3 SDS分散液浓度与各海水样品中浮游植物计数值标准偏差(SD)的关系
步骤十一、根据表2和表3分析SDS分散液的浓度对计数5个海水样品中浮游植物值的影响，结果表明当SDS分散液的浓度在5％与10％之间时，所有测定值的标准偏差(SD)不大于2.14，计数具有较好的精密度。
步骤十二、根据上述结果，确定采用本发明计数海水中浮游植物时SDS分散液的最优浓度为5-10％。
实施例3：青岛近岸海水中浮游植物的现场计数
取样站点：120°21.00′E；35°57.50′N
取样水深：0.5m
取样时间：2020年8月31日
调查船：中渔科101号
步骤一同实施例1步骤一。
步骤二和步骤三同实施例2步骤二和步骤三。
步骤四、取10mL预处理海水样品S1P1放入1个50mL离心管中，然后向该离心管中加入5％的SDS分散液，振荡混匀，制成混合样品S1H1。
步骤五和步骤六同实施例2步骤五和步骤六。
步骤七、在笔记本电脑(6)上启动C&BMS(4)的专用软件，实时记录每个通道中混合样品S1H1下流过程中的电容耦合非接触电导σ值，得到8条曲线如下(图2)：
步骤八、C&BMS的记录曲线图显示，各通道峰型信号数量n分别为6、6、8、5、6、5、6、5。根据公式n＝(n1+n2+n3+n4+n5+n6+n7+n8)/8计算所测定混合样品S1H1中浮游植物的平均值为6个(按照四舍五入取整数)。
步骤九、根据公式n海水＝n×2×1000计算得到海水样品中浮游植物的浓度为1.2×104个/L。
Claims (6)
1.一种海水中浮游植物的现场计数方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下：
采用采水器采取目标深度海水水样，过200μm的筛绢除去包括浮游动物、泥沙在内的非浮游植物颗粒的干扰，制成海水样品P1；
取10mL以上的海水样品P1与等体积十二烷基硫酸钠溶液在离心管中震荡混匀，制成混合样品H2；
将8个大端口直径为10mm的玻璃长颈漏斗分别竖直插入化学和生物过程在线监测系统的8个工作通道；
采用八道手动移液器将8个1mL的混合样品H2同时、分别注入8个长颈玻璃漏斗，溶液在重力作用下通过漏斗流入下方的容器；
采用化学和生物过程在线监测系统自动采集/记录流动混合样品H2的电容耦合非接触电导σ数据；当待测混合样品H2中每个浮游植物细胞通过化学和生物过程在线监测系统检测电极时，由于其导电能力低于本体溶液，因而产生倒峰型信号；当所有混合样品H2完全流出长颈漏斗后，化学和生物过程在线监测系统自动统计每个检测通道出现的倒峰型信号数量n1,n2…n8。
2.根据权利要求1所述的一种海水中浮游植物的现场计数方法，其特征在于所述该SDS溶液的浓度为5-10％。
3.根据权利要求1所述的一种海水中浮游植物的现场计数方法，其特征在于化学和生物过程在线监测系统的工作参数为激励频率1MHz、激励电压16V、采集σ值的频率为0.1s。
4.根据权利要求1所述的一种海水中浮游植物的现场计数方法，其特征在于漏斗细颈外径为3.0mm，内径为1.0mm，长度为260mm。
5.根据权利要求1所述的一种海水中浮游植物的现场计数方法，其特征在于根据公式n＝(n1+n2+n3+n4+n5+n6+n7+n8)/8计算所测定混合样品H2中浮游植物的平均值，用以提高测定的准确性。
6.根据权利要求5所述的一种海水中浮游植物的现场计数方法，其特征在于所述平均值按照四舍五入取整数，根据公式n海水＝n×2×1000计算得到海水样品中浮游植物的浓度，单位为个/L。
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