CN103884537A - 沿岸水体沉积物表层底栖微型藻类的提取方法 - Google Patents

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沿岸水体沉积物表层底栖微型藻类的提取方法，涉及微型藻的分离。提供一种用于稳定同位素测定的沿岸水体泥质或泥沙质沉积物表层的底栖微型藻类样品的提取方法。采集沉积物，在沉积物表层铺设第一层沙层，在第一层沙层表面覆上筛绢，筛绢上再铺设第二层沙层，从上到下形成“第二层沙层-筛绢-第一层沙层-沉积物层”的四层结构，在第二层沙层上喷洒过滤海水湿润沙表面，盖上透光外罩并放在有光的环境中；收集筛绢上的沙至海水中并搅拌，使底栖微型藻类充分悬浮，待沙沉淀后，导出上层水液，经筛绢过滤拦截可能的细沙颗粒，然后将滤液过滤至GF/F膜上，即得沿岸水体沉积物表层底栖微型藻类，可用于碳、氮稳定同位素的测定。

Description

沿岸水体沉积物表层底栖微型藻类的提取方法
技术领域
本发明涉及微型藻的分离，尤其是涉及一种用于稳定同位素测定的沿岸水体泥质或泥沙质沉积物表层的底栖微型藻类样品的提取方法，主要用于提取具有运动能力的羽纹硅藻和具鞭毛的甲藻等藻类，通过该技术可以提取环境中含量较低的微型藻类，用于稳定同位素测定以及用于底栖微型藻类的进一步纯化、培养的粗样品需求。
背景技术
在沿岸海洋生态系统中，初级生产者是支持食物网正常流转的物质基础或有机碳的来源。在这些初级生产者中，底栖微型藻类在河口、澙湖、潮滩等沿岸浅水系统的营养贡献得到广泛的关注(Miller DC,Geider RJ,MacIntyre HL.Microphytobenthos:the ecological role of the“secret garden”of unvegetated,shallow-water marine habitats.II.Role in sediment stability andshallow-water food webs.Estuaries,1996,19:202-212;Ansell A,Gibson R,Barnes M.The role ofbenthic microalgae in neritic ecosystems.Oceanography and marine biology:an annual review,1999,37:47-86)。许多研究表明，在近岸的海草床生态系统和盐沼湿地，底栖微型藻类在食物网的营养动态中扮演着重要的角色(Moncreiff CA,Sullivan MJ.Trophic importance of epiphyticalgae in subtropical seagrass beds:evidence from multiple stable isotope analyses.MarineEcology-Progress Series,2001,215:93-106)。
在食物网研究中，稳定同位素示踪技术是用于追溯消费者有机碳源及确定其营养级的有效工作。在底质为泥质或泥沙质沉积物的沿岸浅水系统，却很少人关注底栖微型藻类在食物网营养动态中的作用。这主要是由于泥质或泥沙质水质浑浊，传统的方法很难获取纯净、无污染的底栖微型藻类样品。有研究表明，在无植被覆盖的沿岸浅水系统底栖微型藻类生物量和生产力高(Maclntyre HL,Geider RJ,Miller DC.Microphytobenthos:the ecological role of the“secret garden”of unvegetated,shallow-water marine habitats.I.Distribution,abundance andprimary production.Estuaries,2006,19:186-201)。许多研究也显示，底栖微型藻类可能是消费者重要的碳源，如栖息在沉积物中的多毛类，小型甲壳动物以及植食性螺和滤食性双壳类等软体动物(Kang CK,Kim JB,Lee KS,Kim JB,Lee PY,Hong JS.Trophic importance of benthicmicroalgae to macrozoobenthos in coastal bay systems in Korea:dual stable C and N isotopeanalyses.Marine Ecology Progress Series,2003,259:79-92;Yokoyama H,Ishihi Y.Feeding of thebivalve Theora lubrica on benthic microalgae:isotopic evidence.Marine Ecology Progress Series,2003,255:303-309)。鱼类胃含物的分析结果显示，底栖微型藻类是鯔鱼，罗非鱼等杂食性鱼类的重要食物来源(黄良敏,张雅芝,潘佳佳,等.厦门东海域鱼类食物网研究.台湾海峡,2008,27:64-73;Lin HJ,Kao WY,Wang YT.Analyses of stomach contents and stable isotopesreveal food sources of estuarine detritivorous fish in tropical/subtropical Taiwan.Estuarine,Coastaland Shelf Science,2007,73:527-537)。因此，在利用稳定同位素技术研究沿岸系统的食物网动态时，底栖微型藻类的作用不容忽视，这对充分理解沿岸生态系统结构和功能具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于稳定同位素测定的沿岸水体泥质或泥沙质沉积物表层的底栖微型藻类样品的提取方法。
本发明包括以下步骤：
1）采集沉积物，在沉积物表层铺设第一层沙层，在第一层沙层表面覆上筛绢，筛绢上再铺设第二层沙层，从上到下形成“第二层沙层-筛绢-第一层沙层-沉积物层”的四层结构，在第二层沙层上喷洒过滤海水湿润沙表面，盖上透光外罩并放在有光的环境中；
2）收集筛绢上的沙至海水中并搅拌，使底栖微型藻类充分悬浮，待沙沉淀后，导出上层水液，经筛绢过滤拦截可能的细沙颗粒，然后将滤液过滤至GF/F膜上，即得沿岸水体沉积物表层底栖微型藻类，可用于碳、氮稳定同位素的测定。
在步骤1）中，所述沉积物的厚度可为1～2cm，沉积物的表面积最好在0.04m2以上，保证可以在环境较低的藻密度下提取足够用于稳定同位素分析的样品；所述沉积物的表面最好完整，没有被扰动和翻转；
所述第一层沙层的厚度最好是0.5mm，第一层沙层的沙颗粒粒径最好是0.5～1mm，第一层沙层的沙可采用石英砂，所述沙最好预先在马弗炉550℃灼烧4h以去除其中的有机质，然后将灼烧过的沙子滤洗，烘干；
所述筛绢的孔径可为63μm；筛绢是用于阻止栖息沉积物中的底栖动物进入沙层，但又能让底栖微型藻类自由进出沙层，由于底栖微型藻类个体小，粒径大多在63μm以下，因此所述的筛绢筛绢孔径最好是63μm左右的孔径；
所述第二层沙层的厚度可为0.5cm；
所述过滤海水可取自采样区域的海水且需经过0.22μm的微孔滤膜过滤（无菌水）；
所述透光外罩可采用玻璃外罩或亚克力外罩等；
所述有光的环境可以是现场或实验室，但以现场为最佳，可以避免运输过程中可能的污染和干扰。
在步骤2）中，所述海水可采用经0.22μm滤膜过滤的海水；所述筛绢可采用孔径为63μm的筛绢；所述GF/F膜可采用预先在马弗炉550℃灼烧过的GF/F膜，GF/F膜可采用玻璃纤维膜等，GF/F膜最好经酸化、水洗去酸和烘干。
所述收集筛绢上的沙的容器最好是玻璃容器，且经过酸泡、用超纯水洗净、烘干；所述搅拌用的棒最好是玻璃棒，且经过酸泡、用超纯水洗净、烘干。
本发明的意义在于获取一种提取泥、泥沙质沉积物表层底栖微型藻类的分离技术，通过该方法获得比较纯净，少有机碎屑干扰的底栖微型藻类样品用于碳、氮稳定同位素测定。
本发明旨在获得可以用于碳、氮稳定同位素测定的底栖微型藻类样品。本发明的原理是利用底栖微型藻类大多是具有一定运动能力的羽纹硅藻和具鞭毛的甲藻等藻类，可在沉积物表面上下移动。本发明是根据底栖微型藻类的趋光特性而设计的提取方法。本发明简单有效，提取的底栖微型藻类纯度较高，有机碎屑少。通过本发明获得的底栖微型藻类还可以进一步用于单个藻种的纯化培养。
附图说明
图1为铺设沙层后整个技术框架的示意图。
图2为利用该方法获取的底栖微型藻类。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明。
用箱氏采样器采集沉积物，用铲子采集表层1cm的沉积物1于搪瓷盆2中。沉积物表层铺洒0.2～0.5cm厚的第一沙层4，细沙的粒径在0.5～1mm，且须预先在马弗炉550℃灼烧，水洗和烘干。第一沙层4表面覆上孔径为63μm的筛绢5。筛绢5上再铺设0.5cm厚的第二沙层6，从上到下形成“沙-筛绢-沙-沉积物”的四层结构（参见图1）。在第二沙层6表面喷洒过滤海水湿润沙表面。在搪瓷盆2上盖上一个方形的亚克力外框3。
5h后，收集筛绢上的沙至过滤海水（0.22μm）中并搅拌，使底栖微型藻类充分悬浮。约1min后，导出上层水液，经63μm的筛绢过滤去除细沙后，将滤液过滤至经预先在马弗炉550℃灼烧过的GF/F膜上，所得的样品即为底栖微型藻类。将取0.5μl过滤液在显微镜下检查，所得的底栖微型藻类为羽纹硅藻（参见图2）。
实施例1：表层沉积物叶绿素a含量的测定
在某澙湖的内湖(N1～N5)、外湖(W1～W4)设置站位，用重力式沉积物采样器（参见中国专利CN201335783Y）采集沉积物样品。用切去针头端的50ml针筒采集采样管中的样品，在保温箱中避光保存。带回实验室后，利用洗净的竹片分层，每层1cm，共将沉积物分成3层。叶绿素a的浓度采用荧光法测量。在装有样品的10ml离心管内加90%丙酮研磨，经超声、萃取、冷冻离心、定容，在Hitachi F2500型荧光光度计上测定，整个过程尽量避光。计算公式为：叶绿素a浓度(μg/g)=Fd×(Rb-Ra)×r/(r-1)×v/M。其中，v为萃取液定容体积(ml)；M为样品质量(g)；Rb和Ra为样品酸化前后的荧光值；Fd和r分别为由标准曲线而得到的换算因子和纯叶绿素a的酸化比。结果表明（参见表1），沉积物叶绿素a的含量基本随着沉积物深度的增加逐渐降低，表层1cm的沉积物平均叶绿素a含量最高（4.03μg/g），远高于1～2cm和2～3cm的沉积物的叶绿素a含量（1.47μg/g和0.87μg/g）。因此，在采集表层沉积物分离底栖微型藻类时，采集的表层沉积物的厚度至少1cm以上，最好在1～2cm左右。
表1沉积物叶绿素a含量
Figure BDA0000487588420000041
实施例2：底栖微型藻类样品的采集及其碳、氮稳定同位素值的测定
在某半咸水澙湖，用机动舢板开至水深1m以浅，底质为泥质沉积物的水域。用箱式采样器采集20cm×20cm样方的沉积物样品。用铲子采集表层1cm的沉积物于25cm×35cm搪瓷盆中。在搪瓷盆上盖上一个方形的亚克力外框，带回实验室。往沉积物表层铺洒预先在马弗炉550℃灼烧过、粒径在0.5～1mm之间、0.2～0.5cm厚的沙层，沙层表面铺上63μm的筛绢，筛绢上再铺设0.5cm厚的沙层，从上到下形成“沙-筛绢-沙-沉积物”的四层结构。在沙表面喷洒过滤海水湿润沙表面。盖上亚克力外框，防止灰尘等污染，并将之放在有光的阳台下。傍晚（约5～6h后），收集筛绢上的沙至过滤海水（0.22μm）中并充分搅拌，使底栖微型藻类悬浮。1min后，导出上层水液。经63μm的筛绢过滤去除可能细沙后，将滤液过滤至经预先在马弗炉550℃灼烧过的GF/F膜上，所得的样品即为底栖微型藻类，主要为羽纹硅藻（图2）。
将GF/F膜在12N的HCl蒸汽中酸熏24h，去除样品中可能含有的无机碳成分，然后用MiliQ水洗涤，在60℃的烘箱中烘干后，保存在玻璃管中。所得样品在同位素质谱仪（DELTAV Advantage）中测定。样品的碳、氮稳定同位素比（δ13C和δ15N）采用DELTA V Advantage同位素比率质谱仪（Isotope Ratio Mass Spectrometer）测定，其外部设备为Flash EA1112HT元素分析仪（Elemental Analyzer）。样品在元素分析仪中高温燃烧后生成CO2和N2，质谱仪通过检测CO2的13C与12C比率和N2的15N与14N比率，并与国际标准物（Pee Dee Belnite和大气N2）比对后计算出样品的δ13C和δ15N比率值。计算公式如下：
δ13C和δ15N=(Rsample-Rstandard)/Rstandard×1000
其中，R指的是3C与12C和15N与14N。计算出某澙湖底栖微型藻类的δ13C和δ15N值分别为-20.23±1.21‰和5.11±1.07‰。

Claims (10)

1.沿岸水体沉积物表层底栖微型藻类的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
1）采集沉积物，在沉积物表层铺设第一层沙层，在第一层沙层表面覆上筛绢，筛绢上再铺设第二层沙层，从上到下形成“第二层沙层-筛绢-第一层沙层-沉积物层”的四层结构，在第二层沙层上喷洒过滤海水湿润沙表面，盖上透光外罩并放在有光的环境中；
2）收集筛绢上的沙至海水中并搅拌，使底栖微型藻类充分悬浮，待沙沉淀后，导出上层水液，经筛绢过滤拦截可能的细沙颗粒，然后将滤液过滤至GF/F膜上，即得沿岸水体沉积物表层底栖微型藻类，可用于碳、氮稳定同位素的测定。
2.如权利要求1所述沿岸水体沉积物表层底栖微型藻类的提取方法，其特征在于在步骤1）中，所述沉积物的厚度为1～2cm，沉积物的表面积在0.04m2以上。
3.如权利要求1所述沿岸水体沉积物表层底栖微型藻类的提取方法，其特征在于在步骤1）中，所述第一层沙层的厚度为0.5mm，第一层沙层的沙颗粒粒径最好是0.5～1mm，第一层沙层的沙可采用石英砂，所述沙最好预先在马弗炉550℃灼烧4h以去除其中的有机质，然后将灼烧过的沙子滤洗，烘干。
4.如权利要求1所述沿岸水体沉积物表层底栖微型藻类的提取方法，其特征在于在步骤1）和2）中，所述筛绢的孔径为63μm。
5.如权利要求1所述沿岸水体沉积物表层底栖微型藻类的提取方法，其特征在于在步骤1）中，所述第二层沙层的厚度为0.5cm。
6.如权利要求1所述沿岸水体沉积物表层底栖微型藻类的提取方法，其特征在于在步骤1）中，所述过滤海水取自采样区域的海水且需经过0.22μm的微孔滤膜过滤。
7.如权利要求1所述沿岸水体沉积物表层底栖微型藻类的提取方法，其特征在于在步骤1）中，所述透光外罩采用玻璃外罩或亚克力外罩。
8.如权利要求1所述沿岸水体沉积物表层底栖微型藻类的提取方法，其特征在于在步骤2）中，所述海水采用经0.22μm滤膜过滤的海水。
9.如权利要求1所述沿岸水体沉积物表层底栖微型藻类的提取方法，其特征在于在步骤2）中，所述GF/F膜采用预先在马弗炉550℃灼烧过的GF/F膜，GF/F膜可采用玻璃纤维膜，GF/F膜最好经酸化、水洗去酸和烘干。
10.如权利要求1所述沿岸水体沉积物表层底栖微型藻类的提取方法，其特征在于在步骤2）中，所述收集筛绢上的沙的容器是玻璃容器，且经过酸泡、用超纯水洗净、烘干；所述搅拌用的棒最好是玻璃棒，且经过酸泡、用超纯水洗净、烘干。
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