DE69733590T2

DE69733590T2 - Reagenz zum Messen von Retikulozyten und Verfahren zu deren Messung

Info

Publication number: DE69733590T2
Application number: DE69733590T
Authority: DE
Inventors: Yasumasa Miki-shi Hyogo Akai; Kayo Kobe-shi Hyogo Hatanaka; Yuji Kobe-shi Hyogo Itose; Takashi Kakogawa-shi Hyogo Sakata
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1996-04-12
Filing date: 1997-04-10
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2017-04-11
Also published as: CA2202207C; AU712405B2; US5891731A; EP0806664A2; EP0806664A3; AU1777597A; CA2202207A1; EP0806664B1; DE69733590D1; TW379284B

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reagenz zum Messen von Retikulozyten und ebenfalls ein Verfahren zu ihrer Messung. Insbesondere betrifft sie ein Reagenz zur Messung von Retikulozyten und eines Retikulozyten-Reifungsindex in Blut auf dem Gebiet klinischer Versuche und ebenfalls ein Verfahren zu ihrer Messung.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Retikulozyten sind junge Erythrozyten unmittelbar nach einer Freisetzung von entkernten Erythroblastenzellen im Knochenmark in das periphere Blut. Eigenschaften von Retikulozyten sind, daß sie als Spuren der Reifungsschritte von Erythrozyten als Reststoffe in ihren Zellen Zellorganellen wie Ribosomen und Mitochondrien und eine geringe Menge RNA zurückbehalten, die nicht in gereiften Erythrozyten enthalten sind.
Auf dem Gebiet klinischer Versuche ist es sehr wichtig, Retikulozyten zu klassifizieren und zu zählen, um den hämatopoetischen Zustand im Knochenmark von Patienten zu erfassen. In einer normalen und gesunden Person, in der die Hämatopoese im Knochenmark normal ist, macht die Gesamtzahl von Retikulozyten 0,5–3,0% der Gesamtzahl der Erythrozyten aus. Jedoch nimmt die Zahl der Retikulozyten für den Fall ab, daß die Hämatopoese im Knochenmark abnormal ist, zum Beispiel wenn die Hämatopoese im Knochenmark gehemmt ist, während die Zahl der Retikulozyten zunimmt, wenn die Hämatopoese im Knochenmark gefördert wird. Genauer gesagt nimmt sie im Verlauf der Chemotherapie für aplastische Anämie und bösartigen Tumor ab, während sie im Fall von hämolytischer Anämie und dgl. zunimmt.
Eines der herkömmlichen Verfahren zum Zählen von Retikulozyten ist ein manuelles Verfahren, in dem eine Blutprobe mit einer Färbelösung vermischt wird, die einen basischen Farbstoff wie New Methylene Blue (NMB) oder Brilliant Cresyl Blue (BCB) enthält, um die oben genannten Reststoffe, die in Retikulozyten enthalten sind, auszufällen und anzufärben, und jede Zelle unter einem Mikroskop beobachtet wird, um Retikulozyten von gereiften Erythrozyten zu unterscheiden.
Jedoch gibt es Probleme in einem solchen manuellen Verfahren, indem der Vorgang der Präparation der Probe mühselig ist, individuelle Unterschiede der Unterscheidung der Zellen durch das medizinische technische Personal auftreten und der statistische Fehler aufgrund der Tatsache, daß die Zahl der gezählten Zellen gering ist, hoch ist.
Um diese Probleme zu lösen, wurde ein Verfahren (Durchflußzytometrie) durchgeführt. In diesem Verfahren werden Retikulozyten einer Fluoreszenzanfärbung unter Verwendung eines fluoreszenten basischen Farbstoffs anstelle des oben genannten basischen Farbstoffs unterworfen, die vorwärts gestreute Lichtintensität und Fluoreszenzintensität der Zellen werden mit einem Durchflußzytometer gemessen, und gereifte Erythrozyten und Retikulozyten werden hauptsächlich mittels des Unterschieds der Fluoreszenzintensitäten zwischen ihnen unterschieden, klassifiziert und gezählt. Als Farbstoff, der für dieses Verfahren verwendet wird, sind Acridinorange, Thiazolorange, Auramin O, etc. allgemein bekannt.
Zusätzlich ist es in diesem Verfahren ebenfalls möglich, Retikulozyten abhängig vom Reifungsgrad mittels der Fluoreszenzintensität der Retikulozyten zu klassifizieren und zu zählen, wodurch der Reifungsindex der Retikulozyten berechnet werden kann. Da es bekannt ist, daß der Anteil der Retikulozyten mit hoher Fluoreszenzintensität oder der Anteil der jüngsten Retikulozyten nützlich als Index zur Erholung der hämatopoetischen Fähigkeit des Knochenmarks ist, wurde erwartet, daß von diesem Verfahren Gebrauch gemacht wird.
Jedoch ist ein Argonlaser, der sehr kostspielig und groß ist, als Lichtquelle zur Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs erforderlich, und daher besteht das Problem, daß die Vorrichtung selbst kostspielig und auch groß wird. Zusätzlich erfordern die oben genannten Farbstoffe, die für die Durchflußzytometrie verwendet werden können, ausgenommen Auramin O, eine Anfärbungszeit von 5 Minuten oder mehr zur Anfärbung der Retikulozyten. Speziell wurde von L. G. Lee et al.: Cytometry; 7: 508–517 (1986) berichtet, daß Thiazolorange eine Anfärbungszeit von 60 Minuten oder mehr erfordert, und deshalb ist es schwierig, die Präparation der Probe vollständig zu automatisieren, wodurch ein Problem im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit der Arbeitskraft besteht. So wird die Vorbereitung der Probe von Hand durchgeführt, und deshalb besteht ein Problem, daß die Daten abhängig von der Technik der Person variieren werden, die die Probe vorbereitet, und daß speziell im Fall des Reifungsindex der Retikulozyten ein großer Unterschied in den Daten auftreten kann.
In US-PS 5,360,739 wird ein Durchflußzytometrieverfahren offenbart, in dem Retikulozyten durch Messung der Streulichtlintensität und Extinktion oder Fluoreszenzintensität unter Verwendung eines He/Ne-Lasers, der eine relativ kostengünstige Lichtquelle ist, und von Oxazin 750 als Farbstoff bestimmt werden. Jedoch wird das Problem abnormaler Lymphozyten, das später erwähnt werden wird, dort nicht beschrieben.
Wo 94/18828 offenbart ein Mehrzweckreagenzsystem zur schnellen Lyse von Vollblutproben. Das Reagenzsystem erlaubt eine schnelle Analyse einer Vollblutprobe zur Bestimmung von wenigstens fünf Klassen von peripheren weißen Blutkörperchen, zellkernhaltigen roten Blutkörperchen und Lymphozyten-Immunophänotypisierung an einer automatisierten Hämatologieinstrumentation.
EP-A-0 226 272 offenbart einen Farbstoff zur Anfärbung von Retikulozyten zur Detektion in einem Durchflußzytometer, wobei der Farbstoff aus "Thiazolorange" ausgewählt wird.
EP-A-0 545 314 offenbart Reagenzzusammensetzungen und ihre Verwendung in der Identifizierung und Charakterisierung von Retikulozyten in Vollblut. Verfahren zur Charakterisierung und Unterscheidung von Retikulozyten und reifen roten Blutkörperchen verwenden Reagenzzusammensetzungen, die organische kationische Farbstoffe zur Anfärbung der Retikulozyten in der Blutprobe und Pufferlösungen einschließen.
JP 61079163 offenbart ein Reagenz zur Bestimmung von Blutkörperchen, wobei das Reagenz eine wäßrige Lösung umfaßt, die ein kugelförmig machendes Mittel, das aus einem kationischen oder nichtionischen Tensid besteht, ein Fixierungsmittel und einen basischen Fluoreszenzfarbstoff enthält.
US-PS 3,916,205 offenbart eine Reagenzzusammensetzung zur Anfärbung von Leukozyten, Erythrozyten und Retikulozyten, wobei die Reagenzzusammensetzung Brilliantsulfaflavin, Ethidiumbromid und 4,4'-Bis{4-(3-sulfanilino)-6-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-1,3,5-triazin-2-yl}aminostilben-2,2'-sulfonsäuretetranatriumsalz umfaßt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Reagenz zum Messen von Retikulozyten bereit, umfassend wenigstens einen Farbstoff, der spezifisch Retikulozyten anfärbt, und wenigstens einen Farbstoff, der spezifisch Leukozyten anfärbt.
Ebenfalls stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Messung von Retikulozyten unter Verwendung des oben genannten Reagenz bereit.
Kurze Erläuterung der Zeichnungen
1 ist eine Zeichnung, die optische Teile eines Durchflußzytometers mit einer Lichtquelle mit roter Wellenlänge zeigt, das im erfindungsgemäßen Meßverfahren verwendet wird;
2 ist ein Streuungsdiagramm, das die Vorwärtsstreulichtintensität und Fluoreszenzintensität einer peripheren Blutprobe aus einer normalen und gesunden Person darstellt, gemessen unter Verwendung eines Reagenz zur Messung von Retikulozyten gemäß der vorliegenden Erfindung, das einen Farbstoff A, der spezifisch Retikulozyten anfärbt, und einen anderen Farbstoff B enthält, der spezifisch die Leukozyten anfärbt;
3 ist ein Streuungsdiagramm, das die Vorwärtsstreulichtintensität und Fluoreszenzintensität einer peripheren Blutprobe eines Patienten mit abnormalen Lymphozyten darstellt, gemessen unter Verwendung eines Reagenz zur Messung von Retikulozyten gemäß der vorliegenden Erfindung, das einen Farbstoff A, der spezifisch Retikulozyten anfärbt, und einen anderen Farbstoff B enthält, der spezifisch die Leukozyten anfärbt;
4 ist ein Streuungsdiagramm, das die Vorwärtsstreulichtintensität und Fluoreszenzintensität einer peripheren Blutprobe einer normalen und gesunden Person darstellt, gemessen unter Verwendung eines Reagenz zur Messung von Retikulozyten gemäß der vorliegenden Erfindung, das einen Farbstoff A, der spezifisch Retikulozyten anfärbt, und einen anderen Farbstoff C enthält, der spezifisch die Leukozyten anfärbt;
5 ist ein Streuungsdiagramm, das die Vorwärtsstreulichtintensität und Fluoreszenzintensität einer peripheren Blutprobe einer normalen und gesunden Person darstellt, gemessen unter Verwendung eines Reagenz zur Messung von Retikulozyten, das nur einen Farbstoff A enthält, der spezifisch Retikulozyten anfärbt; und
6 ist ein Streuungsdiagramm, das die Vorwärtsstreulichtintensität und Fluoreszenzintensität einer peripheren Blutprobe eines Patienten mit abnormalen Lymphozyten darstellt, gemessen unter Verwendung eines Reagenz zur Messung von Retikulozyten, das nur einen Farbstoff A enthält, der spezifisch Retikulozyten anfärbt.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung soll ein Reagenz und ein Meßverfahren realisieren, wodurch Retikulozyten genau und schnell gemessen werden können, selbst für den Fall einer ungewöhnlichen Probe, wie oben beschrieben, zum Beispiel einer Probe aus einem Patienten, in der viele abnormale Lymphozyten auftreten. Selbst mit einer Probe aus einem Patienten, in der viele abnormale Leukozyten vorhanden sind, kann das Reagenz zur genauen Klassifizierung und Zählung von Retikulozyten verwendet werden, weil die Fluoreszenzintensität der Leukozyten allein gestärkt wird, ohne die Fluoreszenzintensität der gereiften Erythrozyten und Retikulozyten zu verändern.
Das Reagenz der vorliegenden Erfindung umfaßt einen Farbstoff, der spezifisch Retikulozyten anfärbt, und einen anderen Farbstoff, der spezifisch die Leukozyten anfärbt. Der Farbstoff, der spezifisch Retikulozyten anfärbt, bezeichnet einen Farbstoff, der Retikulozyten in einem solchen Ausmaß anfärben kann, daß sie von anderen Blutkörperchen unterschieden werden können, und ist eine durch die Formel (I) dargestellte Verbindung:
worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Niederalkyl-Gruppe ist; R₂ und R₃ gleich oder verschieden und ein Wasserstoffatom, eine Niederalkyl- oder Niederalkoxy-Gruppe sind; R₄ ein Wasserstoffatom, eine Acyl- oder Niederalkyl-Gruppe ist; R₅ ein Wasserstoffatom oder eine gegebenenfalls substituierte Niederalkyl-Gruppe ist; Z ein Schwefelatom, ein Sauerstoffatom oder ein mit einer Niederalkyl-Gruppe substituiertes Kohlenstoffatom ist; n 1 oder 2 ist; und X- ein Anion ist.
Die Niederalkyl-Gruppe für R¹ in der Formel (I) kann eine lineare oder verzweigtkettige Alkyl-Gruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffen sein, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Isobutyl, sek-Butyl, tert-Butyl, Pentyl oder Hexyl, und darunter sind eine Methyl- und eine Ethyl-Gruppe bevorzugt.
Die Niederalkyl-Gruppe für R₂ und R₃ kann die gleiche wie die obige für R₁ sein, und die Niederalkyl-Gruppe für R₂ und R₃ kann eine Alkoxy-Gruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffen sein, wie Methoxy, Ethoxy oder Propoxy, und darunter sind eine Methoxy- und Ethoxy-Gruppe bevorzugt. R₂ und R₃ können in der ortho-, meta- oder para-Position substituiert sein. Es ist besonders bevorzugt, daß sowohl R₂ als auch R₃ Wasserstoffatome sind.
Die Acyl-Gruppe für R₄ kann bevorzugt aus aliphatischen Carbonsäuren stammen, wie eine Acetyl- oder Propionyl-Gruppe, worunter eine Acetyl-Gruppe besonders bevorzugt ist. Die Niederalkyl-Gruppe für R₄ kann die gleiche wie für R₁ sein.
Die Niederalkyl-Gruppe für R₅ kann die gleiche wie für R₁ sein. Die Niederalkyl-Gruppe für R₅ kann mit 1 bis 3 Hydroxyl-Gruppen oder Halogenatomen, wie Fluor, Chlor, Brom und Iod, substituiert sein. Darunter sind eine Hydroxymethyl- und Hydroxyethyl-Gruppe bevorzugt.
Die Niederalkyl-Gruppe für Z kann die gleiche wie für R₁ sein. Bevorzugt ist Z ein Schwefelatom.
Beispiele für das Anion X^– können ein Halogenion (wie ein Fluor-, Chlor-, Brom- und Iodion), ein Borohalogenidion (wie BF₄ ^–, BCl₄ ^– und BBr₄ ^–), ein Ion einer Phosphor-Verbindung, ein Ion einer Halogensauerstoffsäure, ein Fluorosulfation, ein Methylsulfation und ein Ion einer Tetraphenylbor-Verbindung mit einem Halogenatom oder einer Halogenatomalkyl-Gruppe als Substituent im Phenylring. Darunter sind ein Bromion und BF₄ ^– bevorzugt.
Spezifische Beispiele für die durch die Formel (I) dargestellte Verbindung können wie folgt sein:
Unter den oben genannten Verbindungen, die durch die Formel (I) dargestellt werden, können die Verbindungen, in denen n = 1 ist, zum Beispiel durch Reaktion der Verbindung der folgenden Formel:
mit N,N-di-substituiertem Formamidin, gefolgt von der Reaktion der resultierenden Zwischenstufe mit einem durch die folgende Formel dargestellten Chinolin-Derivat:
und anschließend durch Behandeln mit Natriumborhydrid synthetisiert werden. In diesem Fall können R₂ und R₃ in der ortho-, meta- oder para-Position substituiert sein. Die Substituenten sind bevorzugt ein Wasserstoffatom.
Außerdem können die Verbindungen der Formel Formel (I), worin n = 2 ist, zum Beispiel unter Verwendung von Malondialdehydbis(phenylimin)salz anstelle N,N-di-substituiertem Formamidin in der oben genannten Reaktion synthetisiert werden.
Die Menge des oben genannten Farbstoffs im erfindungsgemäßen Reagenz ist derart, daß sie ausreichend zum Anfärben von Retikulozyten ist, aber sie kann geeignet eingestellt werden, abhängig vom Typ des Farbstoffs und der Zusammensetzung des Reagenz. Sie kann zum Beispiel ca. 0,1–100 mg/l auf das Gesamtvolumen des Reagenz sein, besonders bevorzugt ca. 0,3–30 mg/l oder noch mehr bevorzugt 0,3–3 mg/l.
Die Farbstoffe, die spezifisch Leukozyten anfärben, schließen diejenigen mit der Formel (II) oder (III) ein:
worin R₆ und R₇ gleich oder verschieden und ein Wasserstoffatom, eine Niederalkyl-, Niederalkoxy- oder Phenyl-Gruppe sind; R₈ bis R₁₁ gleich oder verschieden und ein Wasserstoffatom oder eine Niederalkyl-Gruppe sind; und X- ein Anion ist,
worin R₁₂ und R₁₃ gleich oder verschieden und ein Wasserstoffatom, eine Niederalkyl-Gruppe, Niederalkoxy-Gruppe oder Niederalkyl-substituierte Amino-Gruppe sind; R₁₄ und R₁₅ sind gleich oder verschieden und ein Wasserstoffatom oder eine Niederalkyl-Gruppe sind; und X^– ein Anion ist.
Die Niederalkyl- und Niederalkoxy-Gruppen in den obigen Formeln (II) und (III) können die gleichen wie R¹ sein.
Beispiele für das Anion X^– sind die gleichen wie oben beschrieben. Darunter ist ein Chlorion bevorzugt.
Der oben genannte Farbstoff wird im erfindungsgemäßen Reagenz in einer solchen Konzentration verwendet, daß Leukozyten ausreichend angefärbt werden können und die Anfärbung der Retikulozyten mit dem Farbstoff zur Messung von Retikulozyten nicht gestört wird. Die Konzentration kann geeignet in Abhängigkeit vom Typ des Farbstoffs und der Zusammensetzung des Reagenz eingestellt werden. Zum Beispiel kann sie ca. 0,001–200 mg/l auf das Gesamtvolumen des Reagenz sein, besonders bevorzugt ca. 0,003–3 mg/l und noch mehr bevorzugt 0,003–0,03 mg/l.
Im Reagenz der vorliegenden Erfindung kann der Farbstoff, der spezifisch Retikulozyten anfärbt, schnell in die Erythrozyten eindringen, um die RNA in den Zellen anzufärben. Deshalb ist es noch möglich, selbst durch die alleinige Verwendung des Farbstoffs, der spezifisch Retikulozyten anfärbt, Retikulozyten zu klassifizieren und zu zählen. In einem speziellen Fall, in dem zum Beispiel viele abnormale Zellen vom Lymphozyten-Typ aufgrund von akuter lyphozytischer Leukämie oder dgl. auftreten, sind jedoch die Fluoreszenzintensitäten von sowohl Lymphozyten als auch ungereiften Retikulozyten beinahe gleich, und es ist entsprechend schwierig, sie zu unterscheiden.
Andererseits kann im erfindungsgemäßen Reagenz der Farbstoff, der spezifisch Leukozyten anfärbt, spezifisch nur Leukozyten in den oben genannten Konzentrationen anfärben. Obwohl die Situation abhängig vom Typ des Farbstoffs variieren kann, ist es wahrscheinlich, daß der Farbstoff, der spezifisch die Leukozyten anfärbt, spezifisch die granulären Komponenten und Kerne anfärben kann, die nicht in Retikulozyten enthalten sind, sondern in Leukozyten enthalten sind, wodurch die Fluoreszenzintensität der Leukozyten stärker wird. Im Ergebnis resultiert ein deutlicher Unterschied zwischen den Fluoreszenzintensitäten von Retikulozyten und Leukozyten, oder mit anderen Worten wird die Fluoreszenzintensität der Leukozyten stark im Vergleich mit derjenigen der Retikulozyten, während sich die Fluoreszenzintensität der Retikulozyten nicht verändert, wodurch die Unterscheidung von beiden selbst im oben genannten Fall noch möglich ist.
Die oben beschriebenen Beispiele für die Farbstoffe können durch eine rote Wellenlänge angeregt werden, aber die vorliegende Erfindung ist nicht darauf beschränkt. Der Farbstoff kann in Kombination mit einem Farbstoff verwendet werden, der durch eine andere Wellenlänge angeregt werden kann, wie zum Beispiel blaue Wellenlänge, und selbst in einem solchen Fall ist es noch möglich, die Unterscheidung der Retikulozyten von Leukozyten zu verbessern.
Das erfindungsgemäße Reagenz kann ferner ein mehrwertiges Anion zur Hemmung der nicht-spezifischen Anfärbung von Erythrozyten, einen Puffer, ein osmotisches Kompensationsmittel und/oder einen Anfärbungspromotor enthalten.
Im Verlauf der Untersuchung der Zusammensetzung des Reagenz haben die Erfinder festgestellt, daß dann, wenn NaCl (speziell Cl^–) als Hauptkomponente für das osmotische Kompensationsmittel in einer üblicherweise verwendeten Anfärbungslösung verwendet wird, die nicht spezifische Fluoreszenz der Erythrozyten hoch ist, während die spezifische Fluoreszenz der Retikulozyten niedrig ist, und daß als Ergebnis die Unterscheidung zwischen Erythrozyten und Retikulozyten schwierig wird. Andererseits haben die Erfinder ebenfalls festgestellt, daß dann, wenn Cl^– in der Anfärbungslösung durch ein mehrwertiges Anion ersetzt wird, die nicht-spezifische Fluoreszenz der gereiften Erythrozyten signifikant gehemmt wird, wodurch die Unterscheidung zwischen Erythrozyten und Retikulozyten leichter wird. Entsprechend ist es im erfindungsgemäßen Reagenz bevorzugt, daß das mehrwertige Anion enthalten ist. Als mehrwertiges Anion sind ein Sulfation, Phosphation, Carbonation und Polycarboxylation speziell bevorzugt, und Beispiele für Verbindungen, die sie liefern können, sind Zitronensäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, EDTA und Alkalimetallsalze davon. Diese mehrwertigen Anionen können als Kombination daraus verwendet werden. Die Konzentration des mehrwertigen Anions in bezug auf sein Verhältnis zu allen anionischen Komponenten im Reagenz kann nicht weniger als 50% oder bevorzugt nicht weniger als 70% sein.
Das erfindungsgemäße Reagenz kann ebenfalls einen Puffer enthalten, um den pH konstant zu halten. Der Puffer wird verwendet, um den pH konstant zu halten, wodurch das stabile Anfärbungsergebnis der Retikulozyten aufrechterhalten wird. Er kann in einer Konzentration von etwa einigen mM bis 100 mM verwendet werden. Es gibt keine besondere Beschränkung bezüglich des Puffertyps, soweit er üblicherweise verwendet wird, und zum Beispiel können Carboxylate, Phosphate, Good-Puffer, Taurin, Triethanolamin, etc. geeignet verwendet werden, abhängig vom gewünschten pH. Der geeignete pH für das erfindungsgemäße Reagenz kann abhängig von den verwendeten Farbstoffen variieren und kann im Bereich von 6,0–11,0 sein, bevorzugt 7,0–10,0 und besonders bevorzugt 8,0–9,5. Wenn der pH niedriger als der oben genannte Bereich ist, werden die Erythrozyten instabil und eine Hämolyse neigt stattzufinden, wodurch eine genaue Messung der Retikulozyten schwierig wird. Wenn der pH höher als der genannte ist, disszoiieren saure funktionelle Gruppen an der Erythorzytenmembran, und sie neigen deshalb an den Farbstoff zu binden, der kationisch ist, wodurch die nicht-spezifische Fluoreszenz der Erythrozyten zunimmt. Als Ergebnis besteht eine Tendenz, daß die Unterscheidung zwischen gereiften Erythrozyten und Retikulozyten schwierig wird, und dies ist nicht bevorzugt. Wenn das oben genannte mehrwertige Anion eine Pufferfähigkeit besitzt, um den pH auf einen geeigneten Bereich einzustellen, ist es möglich, das Anion selbst als Puffer zu verwenden.
Das erfindungsgemäße Reagenz kann ebenfalls ein osmotisches Kompensationsmittel enthalten. Es ist wünschenswert, daß der osmotische Druck des Reagenz auf einen physiologischen osmotischen Druck eingestellt wird, so daß eine hypotonische Hämolyse der Erythrozyten verhindert werden kann, und gewöhnlich kann dieser Druck auf den Bereich von 150–600 mOsm/kg eingestellt werden. Es gibt keine besondere Beschränkung für das verwendete osmotische Kompensationsmittel, aber Alkalimetallsalze von Propionsäure oder dgl. und Saccharide wie Glucose und Mannose sind beispielsweise geeignet. Alkalimetallhalogenide wie NaCl und Erdalkalimetallhalogenide können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, ihr Prozentanteil zu den gesamten anionischen Komponenten im Reagenz kann weniger als 50% sein. Die osmotischen Kompensationsmittel können als Kombination daraus verwendet werden. Wenn der osmotische Druck innerhalb eines geeigneten Bereichs durch das oben genannte mehrwertige Anion und den Puffer eingestellt werden kann, besteht kein Bedarf, daß das osmotische Kompensationsmittel enthalten ist.
Das erfindungsgemäße Reagenz kann ebenfalls ein durch die Formel (IV) dargestelltes kationisches Tensid als Anfärbungspromotor enthalten:
worin R₁₆ eine Alkyl-Gruppe mit 8–12 Kohlenstoffen ist; R₁₇, R₁₈ und R₁₉ gleich oder verschieden und eine Niederalkyl-Gruppe sind; und Y^– ein Halogenion ist.
Die Alkyl-Gruppe mit 8–12 Kohlenstoffen in der Formel kann eine lineare oder verzweigtkettige Alkyl-Gruppe sein, wie Octyl, Decyl oder Lauryl. Darunter sind eine Octyl- und eine Decyl-Gruppe bevorzugt.
Die Niederalkyl-Gruppe kann die gleiche wie R₁ sein.
Y^– ist bevorzugt ein Chlorion oder Bromion.
Spezifische Beispiele für das kationische Tensid sind
Octyltrimethylammoniumbromid (OTAB),
Decyltrimethylammoniumbromid (DTAB),
Lauryltrimethylammoniumchlorid (LTAC),
Myristyltrimethylammoniumbromid (MTAB) und
Cetyltrimethylammoniumchlorid (CTAC).
Bezüglich der Konzentration des kationischen Tensids, das ein Anfärbungspromotor ist, wird die wirksame Konzentration niedriger, wenn die Gesamtkohlenstoffanzahl größer wird. Zum Beispiel kann die geeignete Konzentration 300–20 000 mg/l auf das Reagenz für OTAB, 500–3000 mg/l für DTAB und 50–250 mg/l für LTAC sein. Die obigen Anfärbungspromotoren können als Kombination daraus verwendet werden. Der Wirkungsmechanismus des kationischen Tensids ist nicht eindeutig, aber es wird angenommen, daß das Mittel mit der Zellmembran der Erythrozyten wechselwirkt, wodurch die Permeabilität des Farbstoffs gefördert wird. Deshalb ist die Verwendung von zu viel Anfärbungspromotor nicht bevorzugt, weil der Promotor die Erythrozyten beschädigt und in manchen Fällen eine Hämolyse verursacht.
Außerdem hat das kationische Tensid die Wirkung, die Erythrozytenzellen kugelförmig zu machen, und es kann deshalb die Intensitätsverteilung des vorwärts gestreuten Lichts der Population der Erythrozyten zusammenführen. Als Ergebnis wird die Unterscheidung zwischen Thrombozyten- und Erythrozytenzellen leicht. Zusätzlich sind während der Therapie von Mikrozytose, wie z.B. Eisenmangelanämie, sowohl normozytische Erythrozyten als auch Mikrozyten, die durch die Krankheit hervorgerufen werden, im Blut vorhanden. Durch das erfindungsgemäße Reagenz ist es jetzt möglich geworden, zwischen den Erythrozyten mittels der Vorwärtsstreulichtintensität zu unterscheiden. Außerdem können auch Elliptozyten, die in kleinen Mengen auftreten, in der gleichen Weise unterschieden werden. Als solches ist es aufgrund der Wirkung des kationischen Tensids für die Kugelbildung der Erythrozyten möglich, Retikulozyten zu messen und gleichzeitig die morphologische Abnormalität von Erythrozyten, wie zum Beispiel Mikrozyten und Elliptozyten, gleichsam nachzuweisen.
Neben den oben genannten Komponenten kann das erfindungsgemäße Reagenz ferner ein Antiseptikum enthalten, wie 2-Pyridylthio-1-oxid-natrium und β-Phenethylalkohol.
Wenn die Farbstoffe, die im erfindungsgemäßen Reagenz verwendet werden, in wäßriger Lösung instabil sind, können die Farbstoffe außerdem durch Auflösen in einem geeigneten wasserlöslichen nicht-wäßrigen Lösungsmittel, wie Ethanol, Dimethylsulfoxid und Ethylenglykol, gelagert werden, und bei der tatsächlichen Anwendung können sie nach Vermischen mit einer wäßrigen Lösung verwendet werden, die die anderen Komponenten enthält. Jeder der Farbstoffe kann entweder im gleichen nicht-wäßrigen Lösungsmittel oder in unterschiedlichen nicht-wäßrigen Lösungsmitteln gelöst werden.
Das erfindungsgemäße Reagenz ist besonders wirksam in der Messung von Retikulozyten unter Verwendung eines Durchflußzytometers.
Zuerst wird in Schritt (1) das erfindungsgemäße Reagenz zum Messen von Retikulozyten mit einer hämathologischen Probe zur Herstellung einer zu messenden Probe vermischt. Die hämatologische Probe kann jede Probe sein, die zu messende Blutkomponenten enthält, wie zum Beispiel Knochenmarksflüssigkeit oder peripheres Blut, das mit einem gerinnungshemmenden Mittel behandelt wurde. Bevorzugt wird die zu messende Probe durch Vermischen des Reagenz zum Messen von Retikulozyten mit einer hämatologischen Probe in einem Verhältnis von 100:1 bis 1000:1 gefolgt von Umsetzen hergestellt. Die Reaktionstemperatur zu diesem Zeitpunkt ist geeignet ca. 25–50°C oder besonders geeignet 35–45°C. Die geeignete Reaktionsdauer kann in Abhängigkeit von den im Reagenz enthaltenen Farbstoffen variieren, aber kann bevorzugt von ca. 10 s bis zu 5 min sein, besonders bevorzugt von ca. 20 s bis zu 2 min und noch mehr bevorzugt von ca. 20 bis 60 s.
In Schritt (2) wird die in Schritt (1) erhaltene Probe in ein Fluidsystem eines Durchflußzytometers mit einer Lichtquelle mit roter Wellenlänge eingeführt. Es gibt keine besondere Beschränkung für die Lichtquelle mit roter Wellenlänge, insoweit sie Licht mit einer Wellenlänge emittieren kann, das den verwendeten Farbstoff (Fluoreszenzfarbstoff) anregen kann, wie zum Beispiel eine Lichtquelle, die Licht mit einer Wellenlänge von ca. 600–680 nm aussendet. Beispiele dafür sind ein He/Ne-Laser, ein Halbleiterlaser mit einem roten Wellenlängenbereich und dgl. Optische Teile für das Durchflußzytometer mit der Lichtquelle mit roter Wellenlänge, das hier verwendet wird, sind in 1 gezeigt. Vor einem Halbleiterlaser 1 befindet sich eine Durchflußzelle vor einem Kondensatorlinsensystem 2, und vor der Durchflußzelle befinden sich Lichtsammellinsen 5 für vorwärtsgestreutes Licht und eine Photodiode 6 vor einem Strahlenfänger 4. Zusätzlich befinden sich an der Seite der Durchflußzelle 3 ein Bandpaßfilter 8 und eine Photovervielfacherröhre 9 vor einer Lichtsammellinse 7 für die Seitenfluoreszenz. In Bezug auf die anderen Bauteile, wie zum Beispiel das Durchflußteil, das Datenverarbeitungsteil etc., können die bekannten Teile oder dgl. nach Modifikation verwendet werden.
In Schritt (3) wird das oben erwähnte Licht mit roter Wellenlänge auf die in einem Mantelstrom laufenden Zellen eingestrahlt, und in Schritt (4) werden von den Zellen ausgesandtes gestreutes Licht und Fluoreszenz gemessen. Das gestreute Licht zu diesem Zeitpunkt kann entweder vorwärts oder seitwärts gestreutes Licht sein, und außerdem kann das vorwärts gestreute Licht entweder vorwärts gestreutes Licht mit kleinem Winkel (1–5°) oder vorwärts gestreutes Licht mit großem Winkel (6–20°) sein. Obwohl das gestreute Licht ein Parameter ist, der die Zellgröße widerspiegelt, ist ein anderes Verfahren zum Erhalt der Zellgrößeninformation der Zelle ein elektrisches Widerstandsverfahren. In manchen Fällen ist es möglich, ein elektrisches Widerstandssignal mittels eines elektrischen Widerstandsverfahrens anstelle der Messung des gestreuten Lichts zu messen.
In Schritt (5) werden Thrombozyten und andere Zellen mittels der gestreuten Lichtintensität oder eines Streuungsdiagramms der Streulichtintensität und Fluoreszenzintensität unterschieden; in Schritt (6) werden Erythrozyten, Retikulozyten und Leukozyten mittels der Fluoreszenzintensität oder mittels eines Streuungsdiagramms der Fluoreszenzintensität und Streulichtintensität unterschieden; und in Schritt (7) werden Erythrozyten und Retikulozyten klassifiziert und gezählt, wodurch ihre Zellzahlen und ihre Zellverhältnis berechnet werden.
Es ist ebenfalls möglich, Retikulozyten für jeden Grad ihrer Reifung zu klassifizieren und zu zählen oder genauer gesagt mittels der Differenz der Fluoreszenzintensität, wodurch ihr Prozentanteil in den gesamten Retikulozyten berechnet werden kann.
Beispiel 1

Ein Reagenz zum Messen von Retikulozyten mit der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt.

Farbstoff A zum spezifischen Anfärben von Retikulozyten	3 mg
Farbstoff B zum spezifischen Anfärben der Leukozyten	0,03 mg
Tricin (Puffer)	1,79 g
Trinatriumcitratdihydrat(mehrwertiges Anion)	29,4 g
LTAC (kationisches Tensid; Anfärbungspromotor)	50 mg
Reines Wasser (eingestellt auf pH 9,0 unter Verwendung von Natriumhydroxid)	1 l

Oxadin 170
Blut (10 μl) einer normalen und gesunden Person, das mit einem gerinnungshemmenden Mittel behandelt war, wurde mit 2 ml des Reagenz vermischt, gefolgt von Inkubieren bei 40°C für 120 s. Die Vorwärtsstreulichtintensität und Fluoreszenzintensität wurden für die oben hergestellte Probe unter Verwendung eines wie in 1 gezeigten optischen Systems gemessen. Bezugnehmend auf ein Streuungsdiagramm wie in 2 gezeigt, betrug der Retikulozytenanteil 2,0%. Zur Kontrolle wurde die Probe ebenfalls unter Verwendung einer Vorrichtung R-2000 (hergestellt von Toa Medical Electronics Co., Ltd.) gemessen, woraufhin das Ergebnis 2,0% war.
Blut, das lymphozytische abnormale Zellen enthielt, wurde in der gleichen Weise gemessen, worauf das Streuungsdiagramm der 3 erhalten wurde. In diesem Streuungsdiagramm war es möglich, deutlich zwischen einer Population von Retikulozyten und einer Population von Leukozyten zu unterscheiden.
Beispiel 2

Farbstoff A zum spezifischen Anfärben von Retikulozyten	3 mg
Farbstoff C zum spezifischen Anfärben der Leukozyten	30 mg
Tricin (Puffer)	1,79 g
Trinatriumcitratdihydrat	29,4 g
LTAC	150 mg
Reines Wasser (eingestellt auf pH 9,0 unter Verwendung von Natriumhydroxid)	1 l

Bacic Green 4 (CI Nr. 42,000)
Blut (10 μl) einer normalen und gesunden Person, das mit einem gerinnungshemmenden Mittel behandelt war, wurde mit 2 ml des Reagenz vermischt, gefolgt von Inkubieren bei 40°C für 120 s. Die Vorwärtsstreulichtintensität und Fluoreszenzintensität wurden für die oben hergestellte Probe unter Verwendung eines wie in 1 gezeigten optischen Systems gemessen. Bezugnehmend auf ein Streuungsdiagramm wie in 4 gezeigt, betrug der Retikulozytenanteil 1,8%. Zur Kontrolle wurde die Probe ebenfalls unter Verwendung einer Vorrichtung R-2000 (hergestellt von Toa Medical Electronics Co., Ltd.) gemessen, woraufhin das Ergebnis 1,7% war.
Vergleichsbeispiel 1

Ein Reagenz zum Messen von Retikulozyten mit der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt:

Farbstoff A zum spezifischen Anfärben von Retikulozyten	3 mg
Tricin (Puffer)	1,79 mg
Trinatriumcitratdihydrat	29,4 g
LTAC	150 mg
Reines Wasser (eingestellt auf pH 9,0 unter Verwendung von Natriumhydroxid)	1 l

Blut (10 μl) einer normalen und gesunden Person, das mit einem gerinnungshemmenden Mittel behandelt war, wurde mit 2 ml des Reagenz vermischt, gefolgt von Inkubieren bei 40°C für 120 s. Die Vorwärtsstreulichtintensität und Fluoreszenzintensität wurden für die oben hergestellte Probe unter Verwendung eines wie in 1 gezeigten optischen Systems gemessen. Bezugnehmend auf ein Streuungsdiagramm wie in 5 gezeigt, betrug der Retikulozytenanteil 2,0%. Zur Kontrolle wurde die Probe ebenfalls unter Verwendung einer Vorrichtung R-2000 (hergestellt von Toa Medical Electronics Co., Ltd.) gemessen, woraufhin das Ergebnis 2,0% war.
Blut, das lymphozytische abnormale Zellen enthielt, wurde in der gleichen Weise gemessen, worauf das Streuungsdiagramm der 6 erhalten wurde. In diesem Streuungsdiagramm war es möglich, deutlich zwischen einer Population von Retikulozyten und einer Population von Leukozyten zu unterscheiden.
Gemäß dem Reagenz und Meßverfahren der vorliegenden Erfindung können Retikulozyten genau und schnell mittels eines Durchflußzytometers unter Verwendung einer kostengünstigen und kleinen Lichtquelle selbst im Fall von speziellen Proben gemessen werden, die abnormale Lymphozyten oder dgl. enthalten. Somit kann gemäß dem Reagenz und Meßverfahren der vorliegenden Erfindung die Fluoreszenzintensität allein von Leukozyten in einer Probe, die abnormale Lymphozyten oder dgl. enthält, gefördert werden, ohne die Fluoreszenzintensitäten von gereiften Erythrozyten und Retikulozyten zu verändern, wodurch es jetzt möglich geworden ist, Retikulozyten genau zu klassifizieren und zu zählen.

Claims

Reagenz zum Messen von Retikulozyten, das wenigstens einen Farbstoff, der spezifisch Leukozyten anfärbt, um Retikulozyten von Leukozyten zu unterscheiden, und wenigstens einen Farbstoff umfaßt, der Retikulozyten spezifisch anfärbt, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff, der spezifisch Retikulozyten anfärbt, die Formel (I) hat:
worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Niederalkylgruppe ist; R₂ und R₃ gleich oder verschieden und ein Wasserstoffatom, eine Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppe sind; R₄ ein Wasserstoffatom, eine Acyl- oder Niederalkylgruppe ist; R₅ ein Wasserstoffatom oder eine gegebenenfalls substituierte Niederalkylgruppe ist; Z ein Schwefelatom, ein Sauerstoffatom oder ein mit einer Niederalkylgruppe substituiertes Kohlenstoffatom ist; n 1 oder 2 ist; und X^– ein Anion ist.
Reagenz zum Messen von Retikulozyten gemäß Anspruch 1, worin der Farbstoff, der spezifisch die Leukozyten anfärbt, durch die Formel (II):
worin R₆ und R₇ gleich oder verschieden und ein Wasserstoffatom, eine Niederalkyl-, Niederalkoxy- oder Phenylgruppe sind; R₈ bis R₁₁ gleich oder verschieden und ein Wasserstoffatom oder eine Niederalkylgruppe sind; und X^– ein Anion ist, oder durch die Formel (III) dargestellt wird:
worin R₁₂ und R₁₃ gleich oder verschieden und ein Wasserstoffatom, eine Niederalkylgruppe, Niederalkoxygruppe oder eine Niederalkyl-substituierte Aminogruppe sind; R₁₄ und R₁₅ sind gleich oder verschieden und ein Wasserstoffatom oder eine Niederalkylgruppe sind; und X^– ein Anion ist.
Reagenz zum Messen von Retikulozyten gemäß Anspruch 1, das weiterhin ein mehrwertiges Anion zur Hemmung einer nichtspezifischen Fluoreszenz von Erythrozyten umfaßt.
Reagenz zum Messen von Retikulozyten gemäß Anspruch 1, das weiterhin einen Puffer zum Einstellen des pH umfaßt.
Reagenz zum Messen von Retikulozyten gemäß Anspruch 1, das weiterhin ein osmotisches Kompensationsmittel zum Einstellen des osmotischen Drucks des Reagenz innerhalb eines physiologisch normalen Bereichs umfaßt.
Reagenz zum Messen von Retikulozyten gemäß Anspruch 1, das weiterhin einen Anfärbungspromotor umfaßt.
Reagenz zum Messen von Retikulozyten gemäß Anspruch 6, worin der Anfärbungspromotor ein kationisches Tensid ist.
Reagenz zum Messen von Retikulozyten gemäß Anspruch 7, worin das kationische Tensid durch die Formel (IV) dargestellt wird:
worin R₁₆ eine Alkylgruppe mit 8–12 Kohlenstoffen ist; R₁₇, R₁₈ und R₁₉ gleich oder verschieden und eine Niederalkylgruppe sind; und Y^– ein Halogenion ist.
Reagenz zum Messen von Retikulozyten gemäß Anspruch 8, worin das kationische Tensid wenigstens eines ist, das aus Lauryltrimethylammoniumchlorid, Decyltrimethylammoniumbromid und Octyltrimethylammoniumbromid ausgewählt ist.
Verfahren zum Messen von Retikulozyten unter Verwendung des Reagenz wie in Anspruch 1 definiert, umfassend die folgenden Schritte: (1) Vermischen des Reagenz wie in Anspruch 1 definiert mit einer hämatologischen Probe zum Herstellen einer zu messenden Probe; (2) Einführen der in Schritt (1) erhaltenen Probe in ein Fluidsystem eines Durchflußzytometers mit einer Lichtquelle mit roter Wellenlänge; (3) Einstrahlen des oben genannten Lichts mit roter Wellenlänge auf die Zellen, die in einem Mantelstrom laufen; (4) Messen des Streulichts und der von den Zellen ausgesandten Fluoreszenz; (5) Unterscheiden von Thrombozyten und anderen Zellen mittels der Streulichtintensität oder eines Streuungsdiagramms der Streulichtintensität und Fluoreszenzintensität; (6) Unterscheiden von Erythrozyten, Retikulozyten und Leukozyten mittels Fluoreszenzintensität oder mittels eines Streuungsdiagramms der Fluoreszenzintensität und Streulichtintensität; (7) Klassifizieren und Zählen von Erythrozyten und Retikulozyten, wodurch ihre Zellzahlen und das Zellverhältnis berechnet werden.