DE3390432C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur volumetri
schen Differenzierung von Leukozyten-Populationen nach dem
Oberbegriff des Anspruchs 1.
Die Leukozyten umfassen wenigstens drei Populationen,
nämlich (1) eine Lymphozyten-Population, (2) eine Monozy
ten-Population und (3) eine Granulozyten-Population, welche
Neutrophile, Eosinophile und Basophile enthält. Die Daten
der Leukozyten-Populationen können bei Reihenunter
suchungen, die die Aufmerksamkeit auf abnormale Leukozy
ten-Verhältnisse lenken, Informationen von diagnostischer
Bedeutung liefern.
Die Trennung von normalen menschlichen Leukozyten auf Grund
der Volumenverteilung durch Zählung und Größenbestimmung
wird mit Coulter Counter Instrumenten durchgeführt und als
klinische Diagnose-Methode eingesetzt. Diese Methode ba
siert auf der grundlegenden Eigenschaft aller lebenden
Zellen, eine bestimmte Größe und Form aufrechtzuerhalten.
Jeder Zelltyp im zirkulierenden Blut hat sein eigenes
charakteristisches Volumen, das von einem kleinen Volumen
von drei Kubikmikron für Blutplättchen bis 650 Kubikmikron
für polymorphonukleare Zellen reicht. Die neuen Coulter
Counter Instrumente sind so ausgelegt, daß sie von dieser
Volumendifferenz zum Zählen und zur Bestimmung der Größen
verteilung der Blutplättchen, Leukozyten und Erythrozyten
Gebrauch machen, um pathologische Stadien festzustellen und
zu erfassen.
Erythrozyten und lymphoide Leukozyten überlappen sich
jedoch nachteiligerweise hinsichtlich der Zellgröße, so daß
es schwierig ist, die einen in Gegenwart der anderen durch
Größen-Diskriminierung allein zu zählen. Nach der herkömm
lichen Praxis wird daher ein stark lytisches, oberflächen
aktives Reagenz verwendet, das die Erythrozyten stromatoly
siert, sie zu sehr kleinen Teilchen zerkleinert und zu
einer Membran-Lyse führt, wobei das Zytoplasma sowohl von
den lymphoiden wie von den myeloiden Leukozyten abgestreift
wird, so daß lediglich der gegenüber einer Lyse resistente
Kern übrigbleibt, der gezählt wird. Da das ursprüngliche
Zellvolumen erheblich beeinträchtigt und auf ein Minimum
reduziert wird, ist bei der üblichen Größenverteilungs-
Analyse lediglich eine einzige Leukozyten-Population sicht
bar.
Das automatische Blutzell-Zählgerät Coulter Counter Model S
Plus ist ausgelegt, um die Probe des Gesamtblutes in einem
isotonischen Verdünnungsmittel zu verdünnen, ein lytisches
Reagenz hinzuzugeben und kurz danach mit dem Zählen zu
beginnen, vgl. US 35 49 994. Ein verdünntes lytisches System muß daher eine
Erythrozyten lysierende Kinetik besitzen, die ausreichend
schnell ist, um eine vollständige Stromatolysierung der
roten Blutzellen (Erythrozyten) während der Lyseperiode zu
bewirken. Darüberhinaus muß die Änderung des Leukozyten-
Volumens minimal sein, während die Daten gesammelt werden,
wobei es im Idealfall einige Minuten stabil sein sollte.
Das Reagenz-System muß gleichfalls die Integrität der
Erythrozyten- und Blutplättchen-Zahl und die Größenvertei
lung, das Hämoglobin-Absorptions-Spektrum und die gesamte
Leukozyten-Zählung unangetastet lassen. Durch Fingeranste
chen gewonnenes Blut muß mindestens zwei Stunden stabil
sein, wenn es mit dem isotonischen Verdünnungsmittel
vorverdünnt worden ist.
In der US-Patentschrift 38 74 852 ist eine Formulierung für
eine Zusammensetzung enthalten, die ein quaternäres Ammo
niumsalz-Detergenz und Kaliumcyanid enthält und als lyti
sches und Chromagen bildendes Reagenz eingesetzt wird, um
eine einzige Volumen-Leukozyten-Zählung und eine Hämo
globin-Bestimmung zu erhalten
Nach der US-PS 42 86 963 enthält ein lytisches Verdünnungs
mittel zur schnellen Lyse roter Blutzellen im Gesamtblut
zur Durchführung einer differentiellen Bestimmung von
lymphoiden und myeloiden Populationen von Leukozyten sowie
zur Bestimmung von Hämoglobin durch Chromagen-Bildung ein
Gemisch aus einer wäßrigen Salzlösung von wenigstens einem
quaternären Ammoniumsalz, das oberflächenaktive Eigenschaf
ten aufweist, sowie bestimmte Additiven, wie 2-Phenoxy
ethanol.
Aus der DE-OS 31 23 669 ist ein Verfahren nach dem
Oberbegriff des Anspruchs 1 bekannt, mit dem lymphoide und
myeloide Populationen von Leukozyten volumetrisch differen
ziert werden können.
Um eine Analyse von Lymphozyten, Monozyten und Granulozy
ten-Populationen im Blut zu erhalten, muß das Leukozyten-
Volumen-Histogramm sauber getrennte Populationen mit wenig
zellulären Bruchstücken zeigen, wobei die Minima bis nahe
an die Grundlinie gehen können. Die Integration jeder
Population gibt die relative Anzahl der Lymphozyten,
Monozyten und Granulozyten-Zellen an. Es ist gezeigt
worden, daß die lymphoide Population Lymphozyten und kleine
atypische Lymphozyten enthält, während die myeloide Popula
tion zwei Untergruppen enthält, die Monozyten und die
Granulozyten. Die Granulozyten umfassen Neutrophile, Eosi
nophile und Basophile.
Aufgabe der Erfindung ist es, wenigstens eine volumetrische
Differenzierung von Monozyten- und Granulozyten-Popu
lationen zu erreichen. Dies wird erfindungsgemäß durch das
im Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren erreicht. Dadurch
wird ein Verfahren zur Klassifizierung und zum Zählen von
insgesamt drei Leukozyten-Populationen bereitgestellt,
nämlich der Lymphozyten-, Monozyten- und Granulozyten-Population, insbesondere in automatischen Teilchen-Zählsyste
men, wie dem automatischen Coulter Counter Model S Plus,
und zwar bei lediglich geringfügig modifizierter Program
mierung und Leukozytengrößen-Kanalbildung.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt also folgende Stufen:
Die Gesamtblutprobe und das lytische Reagenz werden
zugeführt und die Gesamtblutprobe wird mit dem lytischen
Reagenz in einem vorgegebenen Gesamtvolumen vermischt, und
zwar in einer Art und Weise, daß ein einen niedrigen
Gradienten aufweisender lytischer Schock entsteht, wodurch
eine volumetrische Modifizierung der einzelnen Monozyten
und Granulozyten während einer längeren Zeitspanne erfolgt,
so daß die volumetrische Differenzierung dieser beiden
Populationen möglich ist.
Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Reagenz-
System umfaßt ein Mehrzweck-isotonisches Blutver
dünnungsmittel, das ein Gemisch aus organischen Pufferstof
fen, Zellmembran stabilisierenden Stoffen und keimtötenden
Stoffen enthält, wobei die Endvolumen-Konzentration und die
gesamte Menge desselben dazu dienen, die Lyse-Ge
schwindigkeit des lytischen Reagenzes auf die Leukozyten zu
verlangsamen und eine differentielle Volumenreduktion zu
erhalten, während die herkömmlichen Hämogramm-Parameter
stabilisiert werden.
Das lytische Reagenz, das bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren eingesetzt wird, ist ein Gemisch aus einer
wäßrigen Lösung quaternärer Ammoniumsalze mit oberflächen
aktiven Eigenschaften, und zwar mit einem Volumen-Konzen
trationsbereich und in einer Gesamtmenge, die wirksam ist,
um drei Leukozyten-Volumen-Histogramme zu ergeben. Das
lytische Reagenz ist hypotonisch und neigt deshalb dazu,
der Schrumpfung der myeloiden Zellen zu begegnen, welche
Schrumpfung bestens bekannt ist. Die Daten werden mit einer
Coulter Counter Standard-Einrichtung in Verbindung mit
einem Coulter Channelyzer und einem X-Y-Schreiber erhalten.
Hilfsrecheneinrichtungen und Datenverarbeitungsgeräte sind
für eine vollständige Automatisierung erwünscht, jedoch
nicht notwendig, um die Messungen durchzuführen.
Bei einer bevorzugten kommerziellen Ausführugsform der
Erfindung wird ein Alkalimetallcyanid als Chromagen bilden
des Reagenz hinzugefügt. Andere Chromagen bildende Reagen
zien, wie Drabkin′s Reagenz, welches Kaliumferricyanid,
Kaliumcyanid und Natriumbicarbonat enthält, können gleich
falls verwendet werden.
Überraschenderweise ist festgestellt worden, daß, wenn das
herkömmliche lytische Reagenz und Verfahren so modifiziert
wird, daß die Leukozyten in der Blutprobe dem lytischen
Reagenz unter milderen Bedingungen ausgesetzt sind, die
Leukozyten nicht mehr ständig einer hohen Konzentration des
lytischen Reagenzes ausgesetzt sind, d. h. der lytische
Schock reduziert wird, wobei die Granulozyten mit einem
größeren Volumen aufrechterhalten werden, wodurch eine
dritte Population sichtbar und zählbar gemacht wird,
nämlich die Monozyten, d. h. ein mittlerer Volumenbereich
zwischen Lymphozyten und Granulozyten wird in einem
ausreichenden Ausmaß expandiert (von Granulozyten befreit), um eine
Hervorhebung dieser dritten Population, also der Monozyten, zu
ermöglichen. Aus diesem Grunde werden an Stelle einer Trennung der
Leukozyten in lediglich zwei Populationen, nämlich Lympho
ide und Myeloide, wie sie aus der US-PS 42 86 963 und der
DE-OS 31 23 669 hervorgehen und wie sie in Fig. 1A gezeigt
ist, die Myleoid-Zellen in zwei Unterpopulationen getrennt,
wodurch insgesamt drei Populationen vorliegen, nämlich
Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten gemäß Fig. 1B.
Weiterhin wurde bei Durchführung dieses Verfahrens
festgestellt, daß das Coulter-Gerät in der Lage ist,
mehrere Arten von abnormen Blutproben durch Überprüfung der
Positionen und der relativen Größe der Maxima und der
Minima des Histogramms festzustellen, sowie durch das
Auffinden eines abnorm hohen Prozentsatzes von Zellen im
Monozyten-Bereich, ferner durch abnorme Gesamtweißzählun
gen. Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt daher für den
Arzt eine spezielle klinische Verwendbarkeit.
Nachstehend sind Ausführungsformen der Erfindung anhand der
beigefügten Zeichnung näher erläutert. Darin zeigen:
Fig. 1A und 1B zum Vergleich Leukozyten-Verteilungs-Histogramme, die mit der
gleichen normalen Blutprobe erhalten wurden,
und zwar bei Fig. 1A unter Verwendung der
bekannten Zwei-Populationen-Technologie und
bei Fig. 1B unter Ver
wendung der vorliegenden Erfindung, um
ein Drei-Populationen-Histogramm zu er
halten; und
Fig. 1C und 1D Drei-Populationen-Histogramme, die mit
verschiedenen Blutproben mit der vorlie
genden Erfindung erhalten worden sind.
Bei einem bekannten Gerät (US 35 49 994) wird Blut mit einem herkömm
lichen Verdünnungsmittel vermischt, um eine erste Ver
dünnung zu erhalten, worauf mit einem lytischen Rea
genz vermischt wird, um eine zweite Verdünnung zu ergeben.
Das Gemisch bleibt in der Lysekammer während einer
kurzen, aber ausreichend langen Zeitspanne, um die
Erythrozyten zu zerstören (stroma
tolysieren) und deren Hämoglobin freizusetzen. Das
lytische Reagenz verwandelt ferner das Hämoglobin in ein
Chromagen, das sich zur Messung eignet. Die gebildete Sus
pension wird durch Abtastöffnungen in ein Leukozyten-Zähl
bad geleitet, wo die Leukozyten
elektronisch gezählt und deren Größe bestimmt wird. Da
das Verhältnis der Erythrozyten zu den Leukozyten in nor
malem Blut nahe 1000 : 1 liegt, müssen die Erythrozyten
schnell in kleine Bruchstücke zerkleinert werden, um eine
Beeinträchtigung mit der Leukozyten-Zählung zu verhin
dern. Gleichzeitig dürfen die Leukozyten nicht zerstört
werden, obgleich ihre Größe in einem mehr oder weniger
großen Ausmaß schrumpft. Wie vorstehend erörtert ist, wird
ein quaternäres Ammoniumsalz als stromato
lysierendes Reagenz mit fast augenblicklicher Zerstörung
der Erythrozyten auf ein Niveau, das eine Beeinträchtigung
der Zählung und Größenbestimmung der Leukozyten verhin
dert, verwendet. Das quaternäre Ammoniumsalz ist in einer
wäßrigen Lösung in einer Konzentration in einem Bereich
von insgesamt etwa 0,5 bis 10% enthalten, vorzugsweise
etwa 1 bis 5%, bezogen auf das Gewicht der Lösung, wobei
es mit dem Blut vermischt wird, das vorher mit einem Ver
dünnungsmittel verdünnt worden ist, und zwar in einem Ver
hältnis von etwa 1 : 11 des Volumens des lytischen Rea
genzes zu dem Volumen der verdünnten Probe. Es ist ver
ständlich, daß eine unterschiedliche Stärke des lytischen
Reagenzes eingesetzt werden kann, wenn die ursprüng
liche Verdünnung der Blutprobe von der vorstehend be
schriebenen abweicht, um die gleiche Endkonzentration des
reaktiven lytischen Reagenzes oder das gleiche Endver
hältnis des lytischen Reagenzes zu dem vorhandenen Ge
samtblut zu erhalten. Wenn eine Zwei-Volumen-Trennung der
Leukozyten gemäß dem Verfahren der DE-OS 31 23 669
durchgeführt wird, ist festgestellt worden, daß
die Lymphoid-Myeloid-Histogramme, die nach der Lyse
erhalten werden, aus einem Lymphozyten-Maximum von etwa
50 bis 100 Kubikmikron und einem Myelozyten-Maximum bestehen, das
in einem Volumenbereich von 100 bis 400 Kubikmikron Monozyten und
Granulozyten (Eosinophile und Neutrophile) enthält.
Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt und experimentell bestimmt, daß
Lymphozyten und Monozyten empfindlicher als Granulozyten
gegenüber den normalerweise verwendeten lytischen Rea
genzien sind. Durch Modifizierung der Kinetik der lysierenden
Methode, um die Leukozyten in der Blutprobe
dem lytischen Reagenz unter milderen Bedingungen auszu
setzen, werden die Granulozyten weniger "ge
schockt", d. h. sie werden einem geringeren bzw. ge
ringen Gradienten des lytischen Schocks ausgesetzt, wo
durch keine Reduzierung der Größe in einem Ausmaß auftritt,
wie sie bei den bekannten Reagenzien-Systemen und Methoden
hervorgerufen wird. Dies wird erreicht, indem die verdünnte
Blutprobe mit dem lytischen Reagenz weniger schnell
behandelt wird und indem das lytische Reagenz in einer
niedrigeren Konzentration verwendet wird, als dies rou
tinemäßig der Fall ist. Es wird jedoch etwa die gleiche
Menge lytisches Reagenz benötigt, um eine vollständige
Stromatolysierung der Erythrozyten sicherzustellen.
Durch Modifizierung der Kinetik des Verfahrens werden die
Lymphozyten auf ein Volumen von 50 bis 100 Kubikmikron und die
Monozyten auf 100 bis 160 Kubikmikron reduziert, wobei die Granulo
zyten einen Volumenbereich von 180 bis 450 Kubikmikron zeigen. Die
Granulozyten-Population überlappt folglich nicht mehr mit
der Monozyten-Population, so daß diese Populationen ge
trennt bestimmt und gezählt werden können. Die erhaltenen
Daten müssen während einer Zeitspanne erhalten werden,
während der die drei unterschiedlichen Populationen vor
liegen.
Dies ist das erste Mal, daß festgestellt wurde, wie die
Kinetik dieses Vorganges so gesteuert werden kann, daß
dieses wichtige Ergebnis erhalten wird. Bisher wurde das
Hauptgewicht auf eine im wesentlichen augenblickliche Zer
störung der Erythrozyten auf ein Niveau gelegt, bei
dem eine Beeinträchtigung der Leukozyten-Bestimmung ver
hindert ist. Im vorliegenden Fall wird jedoch das Hauptge
wicht auf eine Beurteilung der differentiellen Volumen
der einzelnen Klassen von Leukozyten gelegt, welche
im Gegensatz zu Erythrozyten in vielerlei Hinsicht
variieren, und zwar hinsichtlich der Morphologie, des
Vorliegens unterschiedlicher nuklearer Formen, des Volu
mens sowie der Funktion für die Gesundheit und im Krank
heitsfall.
Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur differentiellen
Bestimmung von Lymphozyten-, Monozyten- und Granulozyten-
Populationen von Leukozyten bereitgestellt, insbesondere
mit Hilfe automatischer Zählsysteme. Hämogrammwerte können
gleichfalls bestimmt werden.
Vorzugsweise werden bei dem Verfahren in Kombination ver
wendet:
- (A) ein isotonisch ausgeglichenes Mehrzweck-Verdünnungs
mittel, das beispielsweise eine wäßrige Lösung von
- 1. einem organischen Puffermittel;
- 2. einem Zellmembran-stabilisierenden Mittel; und
- 3. einem keimtötenden Mittel;
- umfaßt,
wobei das Verdünnungsmittel einen vorgegebenen pH und eine vorgegebene Osmolalität aufweist; und - (B) ein lytisches Reagenz, welches eine wäßrige Lösung eines quaternären Ammoniumsalzes mit oberflächenak tiven Eigenschaften ist.
Um ein geeignetes Chromagen für die Hämoglobin-Bestimmung
zu bilden, kann ferner ein Alkalimetallcyanid bereitge
stellt werden. Andere Chromagen bildende Reagenzien kön
nen gleichfalls verwendet werden.
Die quaternären Ammoniumsalze besitzen folgende Formel:
worin R₁ ein langkettiges Alkylradikal mit 10 bis 18 Koh
lenstoffatomen ist und R₂, R₃ und R₄ kurzkettige Alkyl
radikale mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind sowie X- ein
Salz ist, das ein Radikal oder ein Anion, wie Cl-, wie Br-,
PO₄3- und CH₃SO₄- ist. Bei besonders geeigneten Kombina
tionen weist das langkettige Alkyl 12 bis 16 Kohlenstoff
atome auf, während die kurzen Ketten Methyl oder Ethyl
sind und X- Chlorid oder Bromid ist.
Bei dem bevorzugten lytischen Reagenz kommt eine Kombina
tion von Dodecyltrimethylammoniumchlorid mit Tetradecyl
trimethylammoniumbromid und Kaliumcyanid zur Anwendung.
Andere quaternäre Ammoniumsalze, die zu wirksamen Ergeb
nissen führen, umfassen Hexadecyltrimethylammoniumbromid
oder Hexadecyldimethylammoniumbromid in Kombination
mit Dodecyltrimethylammoniumchlorid.
Wenn die vorgeschlagenen Richtlinien befolgt werden, die
der Öffentlichkeit über die Volumen- und Durchflußein
stellung eines Coulter Counter Model S Plus bekannt sind,
um eine Zwei-Volumen (lymphoid/myeloid) Population von
Leukozyten zu erhalten, werden folgende Zusätze in den
angegebenen Konzentrationen angewendet:
Mit solchen bekannten Verdünnungsmitteln bzw. Reagenzien
werden Verteilhistogramme entsprechend Fig. 1A er
halten.
Es wird die gleiche Formulierung des Verdünnungsmittels
wie bei dem Beispiel nach dem Stand der Technik verwendet,
jedoch eine andere Konzentration der Zusätze, wobei das
Volumen des lytischen Reagenzes verdoppelt wird, so daß
ein Histogramm mit drei Populationen erhalten werden
kann. Zum Beispiel:
Es wird die gleiche Formulierung des Verdünnungsmittels
nach dem Stand der Technik verwendet, jedoch mit folgender
Formulierung der Zusätze für das lytische Reagenz und
mit einer Verdoppelung des Volumens des lytischen Reagenzes,
wobei ein Histogramm mit drei Populationen erhalten
wird:
Es wird die gleiche Formulierung des Verdünnungsmittels
des Beispiels nach dem Stand der Technik verwendet, jedoch
mit folgender Formulierung der Zusätze für das lytische
Reagenz und mit einer Verdoppelung des Volumens des
lytischen Reagenzes, wobei ein Histogramm mit drei Popula
tionen erhalten wird:
Die Bereiche des pH und der Osmolatität des Verdünnungs
mittels, wie sie für die Erfindung verwendet werden, kön
nen größer sein als in dem Beispiel nach dem Stand der
Technik, beispielsweise: pH 7,0±0,4; Osmolalität
320±50 mOs/Kg.
Es ist darauf hinzuweisen, daß das Alkalimetallcyanid,
beispielsweise in Form von Kaliumcyanid, einen wahlweise
verwendeten Zusatz darstellt, um ein Chromagen zur Hämo
globin-Bestimmung zu bilden und nicht für die Bildung
eines drei Populationen differenzierenden Leukozyten-
Histogramms erforderlich ist.
Wenn ein Handelsprodukt verwendet wird, das unter einem
Warenzeichen verkauft wird, werden die vorstehenden Formu
lierungen erforderlichenfalls im Hinblick auf die Reinheit
und die genaue Zusammensetzung des verkauften Handelspro
dukts eingestellt, um die gleichen Ergebnisse mit dem Ge
rätesystem zu erhalten.
Es können andere Arten von automatischen und halbautoma
tischen Blutzellen-Analysiergeräten mit unterschiedlichen
Volumina und Konzentrationen der Verdünnungsmittel und
des lytischen Reagenzes, als vorstehend angegeben, einge
setzt oder für den Einsatz hergerichtet werden. Auch kön
nen Unterschiede in der Durchflußgeschwindigkeit usw. ein
gebaut werden. Derartige Unterschiede können auch in
Coulter Couter-Instrumenten des Typs Models S Plus und
anderer Modelle angewendet werden, wenn gleichzeitig die
grundsätzliche erfindungsgemäße Lehre
zur Anwendung kommt, d. h. die Granu
lozyten mit einem höheren Volumen erhalten werden gegen
über den Monozyten, wodurch die Zählung der Monozyten als
dritter unterschiedlicher Population ermöglicht wird.
Wie aus den vorstehenden Beispielen ersichtlich ist, wird
das neue Ergebnis der Bildung eines Histogramms mit drei
Populationen an Stelle des Histogramms mit zwei Popula
tionen erreicht, indem ein handelsübliches lytisches
Reagenz, das z. B. unter dem Warenzeichen Lyse S Plus verkauft
wird, etwa auf die Hälfte seiner Konzentration verdünnt
und dann etwa das doppelte Volumen des lytischen
Reagenzes angewendet wird. Dabei versteht es sich, daß die Kon
zentration der aktiven Bestandteile der Formulierungen
des lytischen Reagenzes geändert werden können, wenn das
Volumen des lytischen Reagenzes entsprechend
modifiziert wird, solange die Verhältnisse der lytischen
Bestandteile innerhalb bestimmter Grenzen aufrechterhalten
werden. Zum Beispiel: Ein Teil Tetradecyltrimethylammo
niumbromid auf 9,5±4 Teile Dodecyltrimethylammonium
chlorid-50%ige Lösung; oder ein Teil Dimethylethylhexa
decylammoniumbromid auf 14±6 Teile Dodecyltrimethyl
ammoniumchlorid-50%ige Lösung; oder ein Teil Hexadedyltri
methylammoniumbromid auf 13±6 Teile Dodecyltrimethyl
ammoniumchlorid-50%ige Lösung. Auch sollte das Verhältnis
des Gesamtbluts zu den aktiven lytischen Bestandteilen
in einem bestimmten Bereich gehalten werden. Zum Beispiel:
0,132±0,060 mg Tetradecyltrimethylammoniumbromid und
1,25±0,60 mg Dodecyltrimethylammoniumchlorid-50%ige Lö
sung wird pro µl Gesamtblut zugegeben. Das Verhältnis des
Gesamtbluts zu den aktiven auflösenden Bestandteilen be
trägt daher etwa 1 µl: 1,4 mg. Die vorstehend angegebenen
Werte sind lediglich Beispiele, die auf geeigneten Formu
lierungen basieren, wobei zu erwarten ist, daß vernünftige
Abweichungen davon zu geeigneten Ergebnissen führen, um
das Ziel der Erfindung zu erreichen.
Nach der bekannten Betriebsweise eines automatischen
Coulter Counter Model S Plus Teilchen-Zählsystems wird
das Gemisch aus dem Gesamtblut und dem isotonischen Ver
dünnungsmittel einem Bad zur Zählung von Leukozyten zuge
führt, wobei das lytische Reagenz ebenfalls dem Zählbad
während eines Teils dieser Zufuhr zugegeben wird, und zwar
für etwa eine halbe Sekunde. Bei einer bevorzugten Aus
führungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die
Zeit der Zufuhr des lytischen Reagenzes erhöht, so daß
das lytische Reagenz zu dem Zählbad während etwa 1½
Sekunden während der Zeit zugegeben wird, in der das ver
dünnte Blut dem Zählbad zugeführt wird. Um beste Ergeb
nisse zu erhalten, werden die Leitung zur Zufuhr des
lytischen Reagenzes und die Leitung zur Zufuhr des verdünn
ten Blutes miteinander während eines signifikanten Teils
ihrer Länge verbunden, so daß eine Vermischung vor dem
Eintritt in das Zählbad erreicht wird. Diese langsamere
Zufuhr des lytischen Reagenzes und dessen längere Einwir
kung auf das Blut, jedoch bei niedrigerer Konzentration,
führt zu einer verbesserten Herabsetzung des lytischen
Schocks, d. h. einem niedrigen oder niedrigeren Gradienten
der lytischen Wirkung, wodurch erfindungsgemäß drei Volu
mina von Leukozyten erhalten werden. Stattdessen können
das lytische Reagenz und das Verdünnungsmittel vorher
kombiniert werden, um ein lytisches Ver
dünnungsmittel zu erhalten, das zur Verdünnung und zur
Lyse der gesamten Blutprobe in einer Weise verwendet
wird, mit der die lytische Wirkung mit dem gewünschten
niedrigen Gradienten erzielt wird.
Das Reagenzsystem und das Verfahren der Erfindung sind
so ausgelegt, daß eine Dreiphasen-Größenverteilung der
Leukozyten erhalten wird, so daß der Impulshöhenanalysator
(z. B. des Coulter Counter Modell S Plus-Systems) Lymphozyten,
mononukleare Zellen (Monozyten) und Granulozyten identifi
zieren und zählen kann.
Nach diesen Methoden werden die Schritte der Zufuhr und
der Vermischung in einer solchen Weise durchgeführt, daß
die Blutzellen-Volumenmodifizierung bewirkt, daß die
Granulozyten-Population eine Volumenverteilung mit einem
größeren Volumen als das der Monozyten-Population annimmt.
Beim Schritt der Vermischung des Blutes und des Verdün
nungsmittels mit dem lytischen Reagenz wird eine erheb
lich geringere Konzentration des lytischen Reagenzes
verwendet, so daß die Leukozyten einem lytischen Schock
mit einem niedrigen Gradienten ausgesetzt werden. Beim
Vermischen wird das lytische Reagenz außerdem mit einer
erheblich geringeren Geschwindigkeit und/oder während
einer erheblich längeren Zeitspanne zugeführt, was gleich
falls bewirkt, daß die Leukozyten einem lytischen Schock
mit geringem Gradienten ausgesetzt sind.
Wenn nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit einem lang
sameren Zusatz des lytischen Reagenzes und der längeren
Einwirkung auf das Blut, jedoch bei einer niedrigeren
Konzentration, vorgegangen wird, ist unerwarteterweise
festgestellt worden, daß wenigstens die Monozyten- und
Granulozyten-Populationen differentiell klassifiziert wer
den können, indem eine Gesamtblutprobe mit dem lytischen
Reagenz auf ein bestimmtes Geamtvolumen verdünnt
wird. Die Endverdünnung des Gesamtblutes mit den aktiven
lytischen Bestandteilen kann erreicht werden, indem ledig
lich das lytische Reagenz verdünnt wird,
an Stelle eines ursprünglichen Zusatzes des Verdünnungsmit
tels zu dem Gesamtblut, bevor es mit dem lytischen Rea
genz gemäß den bekannten Verfahren vermischt wird.
Wenn nach dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgegangen
wird, werden bestimmte abnormale Blutproben mit einem Man
gel an Granulozyten erkennbar. Diese zeigen Lymphozyten
mit dem üblichen Volumenbereich von 50 bis 100 Kubikmikron, Mono
zyten mit einem Volumenbereich von lediglich 100 bis 160
Kubikmikron und im wesentlichen keine Zellen im Bereich zwischen 180
und 450 Kubikmikron Proben, die lediglich Lymphozyten und Monozy
ten enthalten, wurden aus normalem Blut mit bekannten
physikalischen Methoden der Dichtetrennung erhalten, wo
bei diese Proben zeigten, daß Monozyten nach der Lyse
in etwa dem gleichen Einheitsvolumenbereich erscheinen.
Fig. 1B zeigt ein Verteilhistogramm einer Probe normalen
Blutes, das erfindungsgemäß erhalten wurde, indem z. B. ein
Coulter Counter Modell S Plus Gerät und ein kalibrierter
Coulter Modell C-1000 Channelizer verwendet wurde. Die
Population auf der linken Seite enthält Lymphozyten. Die
mittlere Population enthält mononukleare Zellen. Die Popu
lation auf der rechten Seite enthält Granulozyten. Die
Population mononuklearer Zellen umfaßt Monozyten und bei
seltenen abnormalen Proben kann sie auch Bruchstücke und
Promyelozyten enthalten. Die Granulozyten-Population um
faßt segmentierte Neutrophile, Bänder, Metamyelozyten,
Eosinophile und Basophile.
Falls die absolute Zahl der Zellen in dem Monozyten-Be
reich über dem normalen Bereich liegt, würde dies bei
Durchführung der Erfindung identifiziert werden. Es wird
dann ein Blutabstrichplättchen hergestellt und bestimmt,
welcher Art die vorhandenen abnormalen Zellen sind. Im
Fall der Überlappung der Zellpopulationen und stark abnor
maler Proben wird der Benutzer bei dem automatischen Be
trieb des Systems unter Verwendung der Erfindung aufmerk
sam gemacht, wie den Fig. 1C und 1D zu entnehmen ist.
Die Verdünnung eines lytischen Reagenzes, das sich zur
Bildung einer Zweivolumen-Lymphoid-Myeloid-Population bei
etwa der Hälfte der Konzentration und bei Verdoppelung
des Volumens des lytischen Reagenzes eignet, wobei die
Konzentrationsverhältnisse der aktiven Bestandteile modi
fiziert und die Geschwindigkeit des Zusatzes des lytischen
Reagenzes herabgesetzt wird, verbreitert das Minima oder
Tal des Volumenbereiches oberhalb der Lymphozyten während
einer Zeitspanne, die ausreichend lang ist, um zu ermög
lichen, daß die dritte Population, die Monozyten, durch
den automatischen Teilchenzähler quantifiziert werden.
Diese Faktoren sind bei den bekannten Reagenzsystemen und
der bekannten Methodik nicht vorhanden, um eine hin
reichende Erhöhung der dritten Population zu ermöglichen,
die in einer sehr geringen Zahl vorliegt.
Es ist hauptsächlich auf den verringerten Konzentrations
gradienten des lytischen Reagenzes, das in der verdünnten
Blutsuspension verteilt wird, zurückzuführen, daß das un
erwartete Ergebnis der dritten Population erhalten wird.
Durch das modifizierte Reagenz und die Verteilungsmethode
werden die Zellen einem viel geringeren lysierenden Kon
zentrationsgradienten ausgesetzt, wodurch die Kinetik der
Lyse herabgesetzt wird und die Granulozyten-Popula
tion ein größeres Volumen behält, wodurch die Feststellung
und Zählung der dritten Population, nämlich der Monozy
ten, ermöglicht wird.
Die dritte Population ist als Monozyten identifiziert wor
den, und zwar durch:
- a) die Beziehung zwischen angefärbten Abstrichen und manu ellen Differenzierungen,
- b) die Verwendung von Lymphozyten/Monozyten-Zellpräpara tionen, um die Position der Monozyten-Population nach der Lyse zu demonstrieren, und
- c) das Sortieren der Monozyten aus den Blutproben unter Verwendung eines Coulter Epics V-Strömungszytometers und anschließendem Durchlauf dieser Zellen durch das Coulter Counter S Plus-System, das entsprechend der Erfindung modifiziert worden ist, wobei die Position in dem Histogramm festgestellt wurde.
Leukozyten-Fraktionen, die nahezu reine Lymphozyten oder
Monozyten oder Neutrophile oder Eosinophile enthalten,
wurden durch Dichtegradienten-Trennungen hergestellt und
diese gereinigten Proben wurden mit "Basis"-Blut kombi
niert, um künstlich angereichertes Gesamtblut zu erhalten,
um die Leukozyten-Histogramme im Vergleich zu manuellen
Differential-Zählungen zu untersuchen. Diese mit Leukozy
ten-Fraktion angereicherten Proben und normalen Proben
wurden mit einem Coulter Counter S Plus-System untersucht,
wobei zur manuellen Differential-Zählung Filme hergestellt
wurden. Das Coulter Counter S Plus-Gerät ist so modifi
ziert worden, daß der Lymphozyten-Prozentsatz im Größen
bereich zwischen 40 und 103 Kubikmikron, die Monozyten zwischen
103 und 160 Kubikmikron und die Granulozyten oberhalb 160 Kubikmikron be
stimmt werden konnten. Es wurden auch Änderungen der Kon
zentration einiger aktiver Bestandteile des lytischen
Reagenzes vorgenommen.
Ein Größenverteilungs-Histogramm einer normalen Gesamt
blutprobe ist in Tabelle 1 wiedergegeben. Die Bestimmungen
der Prozentanteile der einzelnen Zelltypen, wie sie mit
dem Instrument und durch manuelle Differential-Zählung
erhalten werden, sind in Tabelle 1 angegeben.
Ein Vergleich der numerischen Bestimmung, die mit der
automatischen, erfindungsgemäß modifizierten Lyse
methode mit manueller Ablesung der Differential-Zählung
von einem gefärbten Blutabstrichplättchen nach Wright
(Standardmethode) einer normalen Blutprobe erhalten wird.
Eine mit Lymphozyten-Monozyten angereicherte Probe wurde
nach der Standardtechnik von Ficoll-Hypaque hergestellt.
Die Leukozyten wurden mit SBSS gewaschen und zu autologem
Gesamtblut hinzugegeben. Die Größenverteilungsdaten des
Instruments und der manuellen Differential-Bestimmungen
der Prozentanteile der Hauptzelltypen sind in Tabelle 2
wiedergegeben.
Bei normalen Personen stellen die Zellen, die in den Volu
menbereich zwischen den Lymphozyten und den Granulozyten
fallen, die Monozyten-Population dar. Die roten Blutzellen
sind völlig stromatolytisiert, wobei die Bestimmung der
roten Blutzellen und Blutplättchen im wesentlichen die
gleiche wie bei den bekannten Methoden ist.
In abnormalen Fällen tritt jedoch gelegentlich eine Er
höhung der "Monozyten"-Population auf Grund zerstörter oder
anderer unreifer Zellarten auf, welche durch mikrosko
pische Überprüfung festgestellt werden können. Die Monozy
ten-Population kann erheblich in Gegenwart dieser Zellen
zunehmen, die in dem Monozyten-Bereich des weißen Zellen-
Histogramms gefunden werden. Dies kann beispielsweise
demonstriert werden, indem die Leukozyten-Größenvertei
lungs-Diagramme mit manuellen Differential-Zählungen
verglichen werden, die mit Gesamtblut erhalten wurden,
das auf Glasplättchen verteilt und angefärbt wurde.
Das Gerät, das erfindungsgemäß betrieben wird, ist in der
Lage, erheblich abnormale Blutproben durch Bestimmung der
Positionen und der relativen Größe der Maxima und Minima
des Histogramms bei einem abnormal hohen Prozentsatz der
Zellen im Monozyten-Bereich und einer abnormalen weißen
Gesamtzählung zu bestimmen.
Bestimmte Arten und Zustände von Leukämie werden durch
die Gegenwart sehr unreifer Zellen, die als Bruchstücke
oder "Blasts" bezeichnet werden, gekennzeichnet, die
nicht in normalem Blut und meistens nicht im abnormalen
Blut gefunden werden. Diese "Blasts" werden teilweise
durch ihre sehr große Größe auf den Blutglasplättchen
identifiziert, jedoch sind sie anscheinend sehr empfind
lich gegenüber der Lyse, wobei sie im Volumenbereich
von 80 bis 150 Kubikmikron gefunden werden, und wobei die Lympho
zyten- und Monozyten-Bereiche überlappen und ein breites
Maximum in diesem Bereich erhalten wird, ohne dem
typischen Lymphozyten/Monozyten-Minimum, das bei 100 Kubikmikron
üblicherweise festgestellt wird. Derartige Proben werden
im allgemeinen leicht mit dem Gerät auf Grund des ungewöhn
lichen Histogramms und der häufig erheblich erhöhten Ge
samtzählung der weißen Blutzellen festgestellt.
Blutproben, die durch zu lange Alterung, durch Einwirkung
ungewöhnlich hoher Temperaturen usw. beschädigt worden
sind, ergeben gleichfalls abnormale Histogramme, die
leicht von einem geübten Beobachter sowie von der Rechen
anlage in dem Gerät festgestellt werden können.
Fig. 1A und 1B zeigen zum Vergleich Leukozyten-Vertei
lungs-Histogramme der gleichen Probe, die mit einem auto
matischen Coulter Counter Modell S Plus Blutzellenzähler
durchgeführt worden sind, wobei Fig. 1A unter Verwendung
eines Reagenzsystems nach dem US-Patent 43 46 018 erhal
ten wurde, während Fig. 1B mit einem Reagenzsystem und
nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten
wurde.
Fig. 1C stellt das Histogramm eines Patienten mit
schwerer Leukopenie dar. Es sind sehr wenige Zellen in
der Granulozyten-Zone vorhanden. Das Lymphozyten-Maximum
läuft in dem mononuklearen Bereich aus. Das angefärbte
Blutglasplättchen zeigt gelegentlich mehrere Lappen auf
weisende Neutrophile, eine normale Anzahl an reifen
Lymphozyten und einige "Blasts".
Fig. 1D zeigt ein Lymphozyten-Maximum, das normal er
scheint. Es ist eine deutliche Erhöhung des mononuklearen
Bereiches sowie der Granulozyten-Zone festzustellen.
Claims (13)
1. Verfahren zur volumetrischen Differenzierung von
Leukozyten-Populationen einer Gesamtblutprobe,
wobei die Gesamtblutprobe mit einem lytischen Reagenz,
das quaternäre Ammoniumsalze mit oberflächenaktiven
Eigenschaften umfaßt, vermischt wird, dadurch gekenn
zeichnet, daß das lytische Reagenz in so niedriger
Konzentration und/oder mit so einer geringen Geschwindig
keit mit der Gesamtblutprobe vermischt wird, daß
die Granulozyten-Population ein größeres Volumen
erhält, wodurch eine getrennte Analyse und Zählung
der Monozyten und Granulozyten ermöglicht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß für die volumetrische Differenzierung ein automati
sches Teilchen-Analysiersystem nach dem Coulter-Prin
zip verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Gesamtblutprobe mit einem Verdünnungsmittel
versetzt wird, das ein Gemisch aus einem Puffer,
einem Zellmembran stabilisierenden Mittel und einem
keimabtötenden Mittel umfaßt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der Puffer N-(1-Acetamido)-iminodiessigsäure
(ADA), das zellstabilisierende Mittel Procainhydrochlo
rid und das keimabtötende Dimethylolharnstoff ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß das lytische Reagenz Mittel
zur Bildung eines geeigneten Chromagens für die
Hämoglobin-Bestimmung umfaßt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die quarternären Ammoniumsalze
ein Gemisch von Dodecyltrimethylammoniumchlorid
und Tetradecyltrimethylammoniumbromid sind.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß das Dodecyltrimethylammoniumchlorid in einem
Konzentrationsbereich von 20 bis 55 g/L und das
Tetradecyltrimethylammoniumbromid in einer Konzentra
tion von 2 bis 6 g/L vorliegen.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeich
net, daß das Dodecyltrimethylammoniumchlorid und
das Tetradecyltrimethylammoniumbromid in einem
Verhältnis von 9,5±4 : 1 vorliegen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die quaternären Ammoniumsalze
ein Gemisch von Dodecyltrimethylammoniumchlorid
und Hexadecyltrimethylammoniumbromid sind.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß das Dodecyltrimethylammoniumbromid und das
Hexadecyltrimethylammoniumbromid in einem Verhältnis
von 13±6 : 1 vorliegen.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die quaternären Ammoniumsalze
ein Gemisch von Dodecyltrimethylammoniumchlorid
und Dimethylätherhexadecylammoniumbromid sind.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,
daß das Dodecyltrimethylammoniumchlorid und das
Dimethylätherhexadecylammoniumbromid in einem
Verhältnis von 14±6 : 1 vorliegen.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch
gekennzeichnet, daß das Verhältnis der Gesamtblutpro
be zu den quaternären Ammoniumsalzen des lytischen
Reagenzes etwa 1 µl : 1,4 mg beträgt.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/454,926 US4485175A (en) | 1983-01-03 | 1983-01-03 | Method for three-volume differential determination of lymphocyte, monocyte and granulocyte populations of leukocytes |
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