DE3390432C2 - - Google Patents

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DE3390432C2
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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur volumetri­ schen Differenzierung von Leukozyten-Populationen nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Die Leukozyten umfassen wenigstens drei Populationen, nämlich (1) eine Lymphozyten-Population, (2) eine Monozy­ ten-Population und (3) eine Granulozyten-Population, welche Neutrophile, Eosinophile und Basophile enthält. Die Daten der Leukozyten-Populationen können bei Reihenunter­ suchungen, die die Aufmerksamkeit auf abnormale Leukozy­ ten-Verhältnisse lenken, Informationen von diagnostischer Bedeutung liefern.
Die Trennung von normalen menschlichen Leukozyten auf Grund der Volumenverteilung durch Zählung und Größenbestimmung wird mit Coulter Counter Instrumenten durchgeführt und als klinische Diagnose-Methode eingesetzt. Diese Methode ba­ siert auf der grundlegenden Eigenschaft aller lebenden Zellen, eine bestimmte Größe und Form aufrechtzuerhalten. Jeder Zelltyp im zirkulierenden Blut hat sein eigenes charakteristisches Volumen, das von einem kleinen Volumen von drei Kubikmikron für Blutplättchen bis 650 Kubikmikron für polymorphonukleare Zellen reicht. Die neuen Coulter Counter Instrumente sind so ausgelegt, daß sie von dieser Volumendifferenz zum Zählen und zur Bestimmung der Größen­ verteilung der Blutplättchen, Leukozyten und Erythrozyten Gebrauch machen, um pathologische Stadien festzustellen und zu erfassen.
Erythrozyten und lymphoide Leukozyten überlappen sich jedoch nachteiligerweise hinsichtlich der Zellgröße, so daß es schwierig ist, die einen in Gegenwart der anderen durch Größen-Diskriminierung allein zu zählen. Nach der herkömm­ lichen Praxis wird daher ein stark lytisches, oberflächen­ aktives Reagenz verwendet, das die Erythrozyten stromatoly­ siert, sie zu sehr kleinen Teilchen zerkleinert und zu einer Membran-Lyse führt, wobei das Zytoplasma sowohl von den lymphoiden wie von den myeloiden Leukozyten abgestreift wird, so daß lediglich der gegenüber einer Lyse resistente Kern übrigbleibt, der gezählt wird. Da das ursprüngliche Zellvolumen erheblich beeinträchtigt und auf ein Minimum reduziert wird, ist bei der üblichen Größenverteilungs- Analyse lediglich eine einzige Leukozyten-Population sicht­ bar.
Das automatische Blutzell-Zählgerät Coulter Counter Model S Plus ist ausgelegt, um die Probe des Gesamtblutes in einem isotonischen Verdünnungsmittel zu verdünnen, ein lytisches Reagenz hinzuzugeben und kurz danach mit dem Zählen zu beginnen, vgl. US 35 49 994. Ein verdünntes lytisches System muß daher eine Erythrozyten lysierende Kinetik besitzen, die ausreichend schnell ist, um eine vollständige Stromatolysierung der roten Blutzellen (Erythrozyten) während der Lyseperiode zu bewirken. Darüberhinaus muß die Änderung des Leukozyten- Volumens minimal sein, während die Daten gesammelt werden, wobei es im Idealfall einige Minuten stabil sein sollte. Das Reagenz-System muß gleichfalls die Integrität der Erythrozyten- und Blutplättchen-Zahl und die Größenvertei­ lung, das Hämoglobin-Absorptions-Spektrum und die gesamte Leukozyten-Zählung unangetastet lassen. Durch Fingeranste­ chen gewonnenes Blut muß mindestens zwei Stunden stabil sein, wenn es mit dem isotonischen Verdünnungsmittel vorverdünnt worden ist.
In der US-Patentschrift 38 74 852 ist eine Formulierung für eine Zusammensetzung enthalten, die ein quaternäres Ammo­ niumsalz-Detergenz und Kaliumcyanid enthält und als lyti­ sches und Chromagen bildendes Reagenz eingesetzt wird, um eine einzige Volumen-Leukozyten-Zählung und eine Hämo­ globin-Bestimmung zu erhalten
Nach der US-PS 42 86 963 enthält ein lytisches Verdünnungs­ mittel zur schnellen Lyse roter Blutzellen im Gesamtblut zur Durchführung einer differentiellen Bestimmung von lymphoiden und myeloiden Populationen von Leukozyten sowie zur Bestimmung von Hämoglobin durch Chromagen-Bildung ein Gemisch aus einer wäßrigen Salzlösung von wenigstens einem quaternären Ammoniumsalz, das oberflächenaktive Eigenschaf­ ten aufweist, sowie bestimmte Additiven, wie 2-Phenoxy­ ethanol.
Aus der DE-OS 31 23 669 ist ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 bekannt, mit dem lymphoide und myeloide Populationen von Leukozyten volumetrisch differen­ ziert werden können.
Um eine Analyse von Lymphozyten, Monozyten und Granulozy­ ten-Populationen im Blut zu erhalten, muß das Leukozyten- Volumen-Histogramm sauber getrennte Populationen mit wenig zellulären Bruchstücken zeigen, wobei die Minima bis nahe an die Grundlinie gehen können. Die Integration jeder Population gibt die relative Anzahl der Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten-Zellen an. Es ist gezeigt worden, daß die lymphoide Population Lymphozyten und kleine atypische Lymphozyten enthält, während die myeloide Popula­ tion zwei Untergruppen enthält, die Monozyten und die Granulozyten. Die Granulozyten umfassen Neutrophile, Eosi­ nophile und Basophile.
Aufgabe der Erfindung ist es, wenigstens eine volumetrische Differenzierung von Monozyten- und Granulozyten-Popu­ lationen zu erreichen. Dies wird erfindungsgemäß durch das im Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren erreicht. Dadurch wird ein Verfahren zur Klassifizierung und zum Zählen von insgesamt drei Leukozyten-Populationen bereitgestellt, nämlich der Lymphozyten-, Monozyten- und Granulozyten-Population, insbesondere in automatischen Teilchen-Zählsyste­ men, wie dem automatischen Coulter Counter Model S Plus, und zwar bei lediglich geringfügig modifizierter Program­ mierung und Leukozytengrößen-Kanalbildung.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt also folgende Stufen: Die Gesamtblutprobe und das lytische Reagenz werden zugeführt und die Gesamtblutprobe wird mit dem lytischen Reagenz in einem vorgegebenen Gesamtvolumen vermischt, und zwar in einer Art und Weise, daß ein einen niedrigen Gradienten aufweisender lytischer Schock entsteht, wodurch eine volumetrische Modifizierung der einzelnen Monozyten und Granulozyten während einer längeren Zeitspanne erfolgt, so daß die volumetrische Differenzierung dieser beiden Populationen möglich ist.
Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Reagenz- System umfaßt ein Mehrzweck-isotonisches Blutver­ dünnungsmittel, das ein Gemisch aus organischen Pufferstof­ fen, Zellmembran stabilisierenden Stoffen und keimtötenden Stoffen enthält, wobei die Endvolumen-Konzentration und die gesamte Menge desselben dazu dienen, die Lyse-Ge­ schwindigkeit des lytischen Reagenzes auf die Leukozyten zu verlangsamen und eine differentielle Volumenreduktion zu erhalten, während die herkömmlichen Hämogramm-Parameter stabilisiert werden.
Das lytische Reagenz, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, ist ein Gemisch aus einer wäßrigen Lösung quaternärer Ammoniumsalze mit oberflächen­ aktiven Eigenschaften, und zwar mit einem Volumen-Konzen­ trationsbereich und in einer Gesamtmenge, die wirksam ist, um drei Leukozyten-Volumen-Histogramme zu ergeben. Das lytische Reagenz ist hypotonisch und neigt deshalb dazu, der Schrumpfung der myeloiden Zellen zu begegnen, welche Schrumpfung bestens bekannt ist. Die Daten werden mit einer Coulter Counter Standard-Einrichtung in Verbindung mit einem Coulter Channelyzer und einem X-Y-Schreiber erhalten.
Hilfsrecheneinrichtungen und Datenverarbeitungsgeräte sind für eine vollständige Automatisierung erwünscht, jedoch nicht notwendig, um die Messungen durchzuführen.
Bei einer bevorzugten kommerziellen Ausführugsform der Erfindung wird ein Alkalimetallcyanid als Chromagen bilden­ des Reagenz hinzugefügt. Andere Chromagen bildende Reagen­ zien, wie Drabkin′s Reagenz, welches Kaliumferricyanid, Kaliumcyanid und Natriumbicarbonat enthält, können gleich­ falls verwendet werden.
Überraschenderweise ist festgestellt worden, daß, wenn das herkömmliche lytische Reagenz und Verfahren so modifiziert wird, daß die Leukozyten in der Blutprobe dem lytischen Reagenz unter milderen Bedingungen ausgesetzt sind, die Leukozyten nicht mehr ständig einer hohen Konzentration des lytischen Reagenzes ausgesetzt sind, d. h. der lytische Schock reduziert wird, wobei die Granulozyten mit einem größeren Volumen aufrechterhalten werden, wodurch eine dritte Population sichtbar und zählbar gemacht wird, nämlich die Monozyten, d. h. ein mittlerer Volumenbereich zwischen Lymphozyten und Granulozyten wird in einem ausreichenden Ausmaß expandiert (von Granulozyten befreit), um eine Hervorhebung dieser dritten Population, also der Monozyten, zu ermöglichen. Aus diesem Grunde werden an Stelle einer Trennung der Leukozyten in lediglich zwei Populationen, nämlich Lympho­ ide und Myeloide, wie sie aus der US-PS 42 86 963 und der DE-OS 31 23 669 hervorgehen und wie sie in Fig. 1A gezeigt ist, die Myleoid-Zellen in zwei Unterpopulationen getrennt, wodurch insgesamt drei Populationen vorliegen, nämlich Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten gemäß Fig. 1B. Weiterhin wurde bei Durchführung dieses Verfahrens festgestellt, daß das Coulter-Gerät in der Lage ist, mehrere Arten von abnormen Blutproben durch Überprüfung der Positionen und der relativen Größe der Maxima und der Minima des Histogramms festzustellen, sowie durch das Auffinden eines abnorm hohen Prozentsatzes von Zellen im Monozyten-Bereich, ferner durch abnorme Gesamtweißzählun­ gen. Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt daher für den Arzt eine spezielle klinische Verwendbarkeit.
Nachstehend sind Ausführungsformen der Erfindung anhand der beigefügten Zeichnung näher erläutert. Darin zeigen:
Fig. 1A und 1B zum Vergleich Leukozyten-Verteilungs-Histogramme, die mit der gleichen normalen Blutprobe erhalten wurden, und zwar bei Fig. 1A unter Verwendung der bekannten Zwei-Populationen-Technologie und bei Fig. 1B unter Ver­ wendung der vorliegenden Erfindung, um ein Drei-Populationen-Histogramm zu er­ halten; und
Fig. 1C und 1D Drei-Populationen-Histogramme, die mit verschiedenen Blutproben mit der vorlie­ genden Erfindung erhalten worden sind.
Bei einem bekannten Gerät (US 35 49 994) wird Blut mit einem herkömm­ lichen Verdünnungsmittel vermischt, um eine erste Ver­ dünnung zu erhalten, worauf mit einem lytischen Rea­ genz vermischt wird, um eine zweite Verdünnung zu ergeben. Das Gemisch bleibt in der Lysekammer während einer kurzen, aber ausreichend langen Zeitspanne, um die Erythrozyten zu zerstören (stroma­ tolysieren) und deren Hämoglobin freizusetzen. Das lytische Reagenz verwandelt ferner das Hämoglobin in ein Chromagen, das sich zur Messung eignet. Die gebildete Sus­ pension wird durch Abtastöffnungen in ein Leukozyten-Zähl­ bad geleitet, wo die Leukozyten elektronisch gezählt und deren Größe bestimmt wird. Da das Verhältnis der Erythrozyten zu den Leukozyten in nor­ malem Blut nahe 1000 : 1 liegt, müssen die Erythrozyten schnell in kleine Bruchstücke zerkleinert werden, um eine Beeinträchtigung mit der Leukozyten-Zählung zu verhin­ dern. Gleichzeitig dürfen die Leukozyten nicht zerstört werden, obgleich ihre Größe in einem mehr oder weniger großen Ausmaß schrumpft. Wie vorstehend erörtert ist, wird ein quaternäres Ammoniumsalz als stromato­ lysierendes Reagenz mit fast augenblicklicher Zerstörung der Erythrozyten auf ein Niveau, das eine Beeinträchtigung der Zählung und Größenbestimmung der Leukozyten verhin­ dert, verwendet. Das quaternäre Ammoniumsalz ist in einer wäßrigen Lösung in einer Konzentration in einem Bereich von insgesamt etwa 0,5 bis 10% enthalten, vorzugsweise etwa 1 bis 5%, bezogen auf das Gewicht der Lösung, wobei es mit dem Blut vermischt wird, das vorher mit einem Ver­ dünnungsmittel verdünnt worden ist, und zwar in einem Ver­ hältnis von etwa 1 : 11 des Volumens des lytischen Rea­ genzes zu dem Volumen der verdünnten Probe. Es ist ver­ ständlich, daß eine unterschiedliche Stärke des lytischen Reagenzes eingesetzt werden kann, wenn die ursprüng­ liche Verdünnung der Blutprobe von der vorstehend be­ schriebenen abweicht, um die gleiche Endkonzentration des reaktiven lytischen Reagenzes oder das gleiche Endver­ hältnis des lytischen Reagenzes zu dem vorhandenen Ge­ samtblut zu erhalten. Wenn eine Zwei-Volumen-Trennung der Leukozyten gemäß dem Verfahren der DE-OS 31 23 669 durchgeführt wird, ist festgestellt worden, daß die Lymphoid-Myeloid-Histogramme, die nach der Lyse erhalten werden, aus einem Lymphozyten-Maximum von etwa 50 bis 100 Kubikmikron und einem Myelozyten-Maximum bestehen, das in einem Volumenbereich von 100 bis 400 Kubikmikron Monozyten und Granulozyten (Eosinophile und Neutrophile) enthält.
Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt und experimentell bestimmt, daß Lymphozyten und Monozyten empfindlicher als Granulozyten gegenüber den normalerweise verwendeten lytischen Rea­ genzien sind. Durch Modifizierung der Kinetik der lysierenden Methode, um die Leukozyten in der Blutprobe dem lytischen Reagenz unter milderen Bedingungen auszu­ setzen, werden die Granulozyten weniger "ge­ schockt", d. h. sie werden einem geringeren bzw. ge­ ringen Gradienten des lytischen Schocks ausgesetzt, wo­ durch keine Reduzierung der Größe in einem Ausmaß auftritt, wie sie bei den bekannten Reagenzien-Systemen und Methoden hervorgerufen wird. Dies wird erreicht, indem die verdünnte Blutprobe mit dem lytischen Reagenz weniger schnell behandelt wird und indem das lytische Reagenz in einer niedrigeren Konzentration verwendet wird, als dies rou­ tinemäßig der Fall ist. Es wird jedoch etwa die gleiche Menge lytisches Reagenz benötigt, um eine vollständige Stromatolysierung der Erythrozyten sicherzustellen. Durch Modifizierung der Kinetik des Verfahrens werden die Lymphozyten auf ein Volumen von 50 bis 100 Kubikmikron und die Monozyten auf 100 bis 160 Kubikmikron reduziert, wobei die Granulo­ zyten einen Volumenbereich von 180 bis 450 Kubikmikron zeigen. Die Granulozyten-Population überlappt folglich nicht mehr mit der Monozyten-Population, so daß diese Populationen ge­ trennt bestimmt und gezählt werden können. Die erhaltenen Daten müssen während einer Zeitspanne erhalten werden, während der die drei unterschiedlichen Populationen vor­ liegen.
Dies ist das erste Mal, daß festgestellt wurde, wie die Kinetik dieses Vorganges so gesteuert werden kann, daß dieses wichtige Ergebnis erhalten wird. Bisher wurde das Hauptgewicht auf eine im wesentlichen augenblickliche Zer­ störung der Erythrozyten auf ein Niveau gelegt, bei dem eine Beeinträchtigung der Leukozyten-Bestimmung ver­ hindert ist. Im vorliegenden Fall wird jedoch das Hauptge­ wicht auf eine Beurteilung der differentiellen Volumen der einzelnen Klassen von Leukozyten gelegt, welche im Gegensatz zu Erythrozyten in vielerlei Hinsicht variieren, und zwar hinsichtlich der Morphologie, des Vorliegens unterschiedlicher nuklearer Formen, des Volu­ mens sowie der Funktion für die Gesundheit und im Krank­ heitsfall.
Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur differentiellen Bestimmung von Lymphozyten-, Monozyten- und Granulozyten- Populationen von Leukozyten bereitgestellt, insbesondere mit Hilfe automatischer Zählsysteme. Hämogrammwerte können gleichfalls bestimmt werden.
Vorzugsweise werden bei dem Verfahren in Kombination ver­ wendet:
  • (A) ein isotonisch ausgeglichenes Mehrzweck-Verdünnungs­ mittel, das beispielsweise eine wäßrige Lösung von
    • 1. einem organischen Puffermittel;
    • 2. einem Zellmembran-stabilisierenden Mittel; und
    • 3. einem keimtötenden Mittel;
  • umfaßt,
    wobei das Verdünnungsmittel einen vorgegebenen pH und eine vorgegebene Osmolalität aufweist; und
  • (B) ein lytisches Reagenz, welches eine wäßrige Lösung eines quaternären Ammoniumsalzes mit oberflächenak­ tiven Eigenschaften ist.
Um ein geeignetes Chromagen für die Hämoglobin-Bestimmung zu bilden, kann ferner ein Alkalimetallcyanid bereitge­ stellt werden. Andere Chromagen bildende Reagenzien kön­ nen gleichfalls verwendet werden.
Die quaternären Ammoniumsalze besitzen folgende Formel:
worin R₁ ein langkettiges Alkylradikal mit 10 bis 18 Koh­ lenstoffatomen ist und R₂, R₃ und R₄ kurzkettige Alkyl­ radikale mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind sowie X- ein Salz ist, das ein Radikal oder ein Anion, wie Cl-, wie Br-, PO₄3- und CH₃SO₄- ist. Bei besonders geeigneten Kombina­ tionen weist das langkettige Alkyl 12 bis 16 Kohlenstoff­ atome auf, während die kurzen Ketten Methyl oder Ethyl sind und X- Chlorid oder Bromid ist.
Bei dem bevorzugten lytischen Reagenz kommt eine Kombina­ tion von Dodecyltrimethylammoniumchlorid mit Tetradecyl­ trimethylammoniumbromid und Kaliumcyanid zur Anwendung.
Andere quaternäre Ammoniumsalze, die zu wirksamen Ergeb­ nissen führen, umfassen Hexadecyltrimethylammoniumbromid oder Hexadecyldimethylammoniumbromid in Kombination mit Dodecyltrimethylammoniumchlorid.
Beispiel nach dem Stand der Technik
Wenn die vorgeschlagenen Richtlinien befolgt werden, die der Öffentlichkeit über die Volumen- und Durchflußein­ stellung eines Coulter Counter Model S Plus bekannt sind, um eine Zwei-Volumen (lymphoid/myeloid) Population von Leukozyten zu erhalten, werden folgende Zusätze in den angegebenen Konzentrationen angewendet:
Mit solchen bekannten Verdünnungsmitteln bzw. Reagenzien werden Verteilhistogramme entsprechend Fig. 1A er­ halten.
Beispiel 1
Es wird die gleiche Formulierung des Verdünnungsmittels wie bei dem Beispiel nach dem Stand der Technik verwendet, jedoch eine andere Konzentration der Zusätze, wobei das Volumen des lytischen Reagenzes verdoppelt wird, so daß ein Histogramm mit drei Populationen erhalten werden kann. Zum Beispiel:
Beispiel 2
Es wird die gleiche Formulierung des Verdünnungsmittels nach dem Stand der Technik verwendet, jedoch mit folgender Formulierung der Zusätze für das lytische Reagenz und mit einer Verdoppelung des Volumens des lytischen Reagenzes, wobei ein Histogramm mit drei Populationen erhalten wird:
Beispiel 3
Es wird die gleiche Formulierung des Verdünnungsmittels des Beispiels nach dem Stand der Technik verwendet, jedoch mit folgender Formulierung der Zusätze für das lytische Reagenz und mit einer Verdoppelung des Volumens des lytischen Reagenzes, wobei ein Histogramm mit drei Popula­ tionen erhalten wird:
Die Bereiche des pH und der Osmolatität des Verdünnungs­ mittels, wie sie für die Erfindung verwendet werden, kön­ nen größer sein als in dem Beispiel nach dem Stand der Technik, beispielsweise: pH 7,0±0,4; Osmolalität 320±50 mOs/Kg.
Es ist darauf hinzuweisen, daß das Alkalimetallcyanid, beispielsweise in Form von Kaliumcyanid, einen wahlweise verwendeten Zusatz darstellt, um ein Chromagen zur Hämo­ globin-Bestimmung zu bilden und nicht für die Bildung eines drei Populationen differenzierenden Leukozyten- Histogramms erforderlich ist.
Wenn ein Handelsprodukt verwendet wird, das unter einem Warenzeichen verkauft wird, werden die vorstehenden Formu­ lierungen erforderlichenfalls im Hinblick auf die Reinheit und die genaue Zusammensetzung des verkauften Handelspro­ dukts eingestellt, um die gleichen Ergebnisse mit dem Ge­ rätesystem zu erhalten.
Es können andere Arten von automatischen und halbautoma­ tischen Blutzellen-Analysiergeräten mit unterschiedlichen Volumina und Konzentrationen der Verdünnungsmittel und des lytischen Reagenzes, als vorstehend angegeben, einge­ setzt oder für den Einsatz hergerichtet werden. Auch kön­ nen Unterschiede in der Durchflußgeschwindigkeit usw. ein­ gebaut werden. Derartige Unterschiede können auch in Coulter Couter-Instrumenten des Typs Models S Plus und anderer Modelle angewendet werden, wenn gleichzeitig die grundsätzliche erfindungsgemäße Lehre zur Anwendung kommt, d. h. die Granu­ lozyten mit einem höheren Volumen erhalten werden gegen­ über den Monozyten, wodurch die Zählung der Monozyten als dritter unterschiedlicher Population ermöglicht wird.
Wie aus den vorstehenden Beispielen ersichtlich ist, wird das neue Ergebnis der Bildung eines Histogramms mit drei Populationen an Stelle des Histogramms mit zwei Popula­ tionen erreicht, indem ein handelsübliches lytisches Reagenz, das z. B. unter dem Warenzeichen Lyse S Plus verkauft wird, etwa auf die Hälfte seiner Konzentration verdünnt und dann etwa das doppelte Volumen des lytischen Reagenzes angewendet wird. Dabei versteht es sich, daß die Kon­ zentration der aktiven Bestandteile der Formulierungen des lytischen Reagenzes geändert werden können, wenn das Volumen des lytischen Reagenzes entsprechend modifiziert wird, solange die Verhältnisse der lytischen Bestandteile innerhalb bestimmter Grenzen aufrechterhalten werden. Zum Beispiel: Ein Teil Tetradecyltrimethylammo­ niumbromid auf 9,5±4 Teile Dodecyltrimethylammonium­ chlorid-50%ige Lösung; oder ein Teil Dimethylethylhexa­ decylammoniumbromid auf 14±6 Teile Dodecyltrimethyl­ ammoniumchlorid-50%ige Lösung; oder ein Teil Hexadedyltri­ methylammoniumbromid auf 13±6 Teile Dodecyltrimethyl­ ammoniumchlorid-50%ige Lösung. Auch sollte das Verhältnis des Gesamtbluts zu den aktiven lytischen Bestandteilen in einem bestimmten Bereich gehalten werden. Zum Beispiel: 0,132±0,060 mg Tetradecyltrimethylammoniumbromid und 1,25±0,60 mg Dodecyltrimethylammoniumchlorid-50%ige Lö­ sung wird pro µl Gesamtblut zugegeben. Das Verhältnis des Gesamtbluts zu den aktiven auflösenden Bestandteilen be­ trägt daher etwa 1 µl: 1,4 mg. Die vorstehend angegebenen Werte sind lediglich Beispiele, die auf geeigneten Formu­ lierungen basieren, wobei zu erwarten ist, daß vernünftige Abweichungen davon zu geeigneten Ergebnissen führen, um das Ziel der Erfindung zu erreichen.
Nach der bekannten Betriebsweise eines automatischen Coulter Counter Model S Plus Teilchen-Zählsystems wird das Gemisch aus dem Gesamtblut und dem isotonischen Ver­ dünnungsmittel einem Bad zur Zählung von Leukozyten zuge­ führt, wobei das lytische Reagenz ebenfalls dem Zählbad während eines Teils dieser Zufuhr zugegeben wird, und zwar für etwa eine halbe Sekunde. Bei einer bevorzugten Aus­ führungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Zeit der Zufuhr des lytischen Reagenzes erhöht, so daß das lytische Reagenz zu dem Zählbad während etwa 1½ Sekunden während der Zeit zugegeben wird, in der das ver­ dünnte Blut dem Zählbad zugeführt wird. Um beste Ergeb­ nisse zu erhalten, werden die Leitung zur Zufuhr des lytischen Reagenzes und die Leitung zur Zufuhr des verdünn­ ten Blutes miteinander während eines signifikanten Teils ihrer Länge verbunden, so daß eine Vermischung vor dem Eintritt in das Zählbad erreicht wird. Diese langsamere Zufuhr des lytischen Reagenzes und dessen längere Einwir­ kung auf das Blut, jedoch bei niedrigerer Konzentration, führt zu einer verbesserten Herabsetzung des lytischen Schocks, d. h. einem niedrigen oder niedrigeren Gradienten der lytischen Wirkung, wodurch erfindungsgemäß drei Volu­ mina von Leukozyten erhalten werden. Stattdessen können das lytische Reagenz und das Verdünnungsmittel vorher kombiniert werden, um ein lytisches Ver­ dünnungsmittel zu erhalten, das zur Verdünnung und zur Lyse der gesamten Blutprobe in einer Weise verwendet wird, mit der die lytische Wirkung mit dem gewünschten niedrigen Gradienten erzielt wird.
Das Reagenzsystem und das Verfahren der Erfindung sind so ausgelegt, daß eine Dreiphasen-Größenverteilung der Leukozyten erhalten wird, so daß der Impulshöhenanalysator (z. B. des Coulter Counter Modell S Plus-Systems) Lymphozyten, mononukleare Zellen (Monozyten) und Granulozyten identifi­ zieren und zählen kann.
Nach diesen Methoden werden die Schritte der Zufuhr und der Vermischung in einer solchen Weise durchgeführt, daß die Blutzellen-Volumenmodifizierung bewirkt, daß die Granulozyten-Population eine Volumenverteilung mit einem größeren Volumen als das der Monozyten-Population annimmt.
Beim Schritt der Vermischung des Blutes und des Verdün­ nungsmittels mit dem lytischen Reagenz wird eine erheb­ lich geringere Konzentration des lytischen Reagenzes verwendet, so daß die Leukozyten einem lytischen Schock mit einem niedrigen Gradienten ausgesetzt werden. Beim Vermischen wird das lytische Reagenz außerdem mit einer erheblich geringeren Geschwindigkeit und/oder während einer erheblich längeren Zeitspanne zugeführt, was gleich­ falls bewirkt, daß die Leukozyten einem lytischen Schock mit geringem Gradienten ausgesetzt sind.
Wenn nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit einem lang­ sameren Zusatz des lytischen Reagenzes und der längeren Einwirkung auf das Blut, jedoch bei einer niedrigeren Konzentration, vorgegangen wird, ist unerwarteterweise festgestellt worden, daß wenigstens die Monozyten- und Granulozyten-Populationen differentiell klassifiziert wer­ den können, indem eine Gesamtblutprobe mit dem lytischen Reagenz auf ein bestimmtes Geamtvolumen verdünnt wird. Die Endverdünnung des Gesamtblutes mit den aktiven lytischen Bestandteilen kann erreicht werden, indem ledig­ lich das lytische Reagenz verdünnt wird, an Stelle eines ursprünglichen Zusatzes des Verdünnungsmit­ tels zu dem Gesamtblut, bevor es mit dem lytischen Rea­ genz gemäß den bekannten Verfahren vermischt wird.
Wenn nach dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgegangen wird, werden bestimmte abnormale Blutproben mit einem Man­ gel an Granulozyten erkennbar. Diese zeigen Lymphozyten mit dem üblichen Volumenbereich von 50 bis 100 Kubikmikron, Mono­ zyten mit einem Volumenbereich von lediglich 100 bis 160 Kubikmikron und im wesentlichen keine Zellen im Bereich zwischen 180 und 450 Kubikmikron Proben, die lediglich Lymphozyten und Monozy­ ten enthalten, wurden aus normalem Blut mit bekannten physikalischen Methoden der Dichtetrennung erhalten, wo­ bei diese Proben zeigten, daß Monozyten nach der Lyse in etwa dem gleichen Einheitsvolumenbereich erscheinen.
Fig. 1B zeigt ein Verteilhistogramm einer Probe normalen Blutes, das erfindungsgemäß erhalten wurde, indem z. B. ein Coulter Counter Modell S Plus Gerät und ein kalibrierter Coulter Modell C-1000 Channelizer verwendet wurde. Die Population auf der linken Seite enthält Lymphozyten. Die mittlere Population enthält mononukleare Zellen. Die Popu­ lation auf der rechten Seite enthält Granulozyten. Die Population mononuklearer Zellen umfaßt Monozyten und bei seltenen abnormalen Proben kann sie auch Bruchstücke und Promyelozyten enthalten. Die Granulozyten-Population um­ faßt segmentierte Neutrophile, Bänder, Metamyelozyten, Eosinophile und Basophile.
Falls die absolute Zahl der Zellen in dem Monozyten-Be­ reich über dem normalen Bereich liegt, würde dies bei Durchführung der Erfindung identifiziert werden. Es wird dann ein Blutabstrichplättchen hergestellt und bestimmt, welcher Art die vorhandenen abnormalen Zellen sind. Im Fall der Überlappung der Zellpopulationen und stark abnor­ maler Proben wird der Benutzer bei dem automatischen Be­ trieb des Systems unter Verwendung der Erfindung aufmerk­ sam gemacht, wie den Fig. 1C und 1D zu entnehmen ist.
Die Verdünnung eines lytischen Reagenzes, das sich zur Bildung einer Zweivolumen-Lymphoid-Myeloid-Population bei etwa der Hälfte der Konzentration und bei Verdoppelung des Volumens des lytischen Reagenzes eignet, wobei die Konzentrationsverhältnisse der aktiven Bestandteile modi­ fiziert und die Geschwindigkeit des Zusatzes des lytischen Reagenzes herabgesetzt wird, verbreitert das Minima oder Tal des Volumenbereiches oberhalb der Lymphozyten während einer Zeitspanne, die ausreichend lang ist, um zu ermög­ lichen, daß die dritte Population, die Monozyten, durch den automatischen Teilchenzähler quantifiziert werden.
Diese Faktoren sind bei den bekannten Reagenzsystemen und der bekannten Methodik nicht vorhanden, um eine hin­ reichende Erhöhung der dritten Population zu ermöglichen, die in einer sehr geringen Zahl vorliegt.
Es ist hauptsächlich auf den verringerten Konzentrations­ gradienten des lytischen Reagenzes, das in der verdünnten Blutsuspension verteilt wird, zurückzuführen, daß das un­ erwartete Ergebnis der dritten Population erhalten wird. Durch das modifizierte Reagenz und die Verteilungsmethode werden die Zellen einem viel geringeren lysierenden Kon­ zentrationsgradienten ausgesetzt, wodurch die Kinetik der Lyse herabgesetzt wird und die Granulozyten-Popula­ tion ein größeres Volumen behält, wodurch die Feststellung und Zählung der dritten Population, nämlich der Monozy­ ten, ermöglicht wird.
Die dritte Population ist als Monozyten identifiziert wor­ den, und zwar durch:
  • a) die Beziehung zwischen angefärbten Abstrichen und manu­ ellen Differenzierungen,
  • b) die Verwendung von Lymphozyten/Monozyten-Zellpräpara­ tionen, um die Position der Monozyten-Population nach der Lyse zu demonstrieren, und
  • c) das Sortieren der Monozyten aus den Blutproben unter Verwendung eines Coulter Epics V-Strömungszytometers und anschließendem Durchlauf dieser Zellen durch das Coulter Counter S Plus-System, das entsprechend der Erfindung modifiziert worden ist, wobei die Position in dem Histogramm festgestellt wurde.
Leukozyten-Fraktionen, die nahezu reine Lymphozyten oder Monozyten oder Neutrophile oder Eosinophile enthalten, wurden durch Dichtegradienten-Trennungen hergestellt und diese gereinigten Proben wurden mit "Basis"-Blut kombi­ niert, um künstlich angereichertes Gesamtblut zu erhalten, um die Leukozyten-Histogramme im Vergleich zu manuellen Differential-Zählungen zu untersuchen. Diese mit Leukozy­ ten-Fraktion angereicherten Proben und normalen Proben wurden mit einem Coulter Counter S Plus-System untersucht, wobei zur manuellen Differential-Zählung Filme hergestellt wurden. Das Coulter Counter S Plus-Gerät ist so modifi­ ziert worden, daß der Lymphozyten-Prozentsatz im Größen­ bereich zwischen 40 und 103 Kubikmikron, die Monozyten zwischen 103 und 160 Kubikmikron und die Granulozyten oberhalb 160 Kubikmikron be­ stimmt werden konnten. Es wurden auch Änderungen der Kon­ zentration einiger aktiver Bestandteile des lytischen Reagenzes vorgenommen.
Ein Größenverteilungs-Histogramm einer normalen Gesamt­ blutprobe ist in Tabelle 1 wiedergegeben. Die Bestimmungen der Prozentanteile der einzelnen Zelltypen, wie sie mit dem Instrument und durch manuelle Differential-Zählung erhalten werden, sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Ein Vergleich der numerischen Bestimmung, die mit der automatischen, erfindungsgemäß modifizierten Lyse­ methode mit manueller Ablesung der Differential-Zählung von einem gefärbten Blutabstrichplättchen nach Wright (Standardmethode) einer normalen Blutprobe erhalten wird.
Eine mit Lymphozyten-Monozyten angereicherte Probe wurde nach der Standardtechnik von Ficoll-Hypaque hergestellt. Die Leukozyten wurden mit SBSS gewaschen und zu autologem Gesamtblut hinzugegeben. Die Größenverteilungsdaten des Instruments und der manuellen Differential-Bestimmungen der Prozentanteile der Hauptzelltypen sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
Tabelle 2
Lymphozyten/Monozyten-Anreicherung
Bei normalen Personen stellen die Zellen, die in den Volu­ menbereich zwischen den Lymphozyten und den Granulozyten fallen, die Monozyten-Population dar. Die roten Blutzellen sind völlig stromatolytisiert, wobei die Bestimmung der roten Blutzellen und Blutplättchen im wesentlichen die gleiche wie bei den bekannten Methoden ist.
In abnormalen Fällen tritt jedoch gelegentlich eine Er­ höhung der "Monozyten"-Population auf Grund zerstörter oder anderer unreifer Zellarten auf, welche durch mikrosko­ pische Überprüfung festgestellt werden können. Die Monozy­ ten-Population kann erheblich in Gegenwart dieser Zellen zunehmen, die in dem Monozyten-Bereich des weißen Zellen- Histogramms gefunden werden. Dies kann beispielsweise demonstriert werden, indem die Leukozyten-Größenvertei­ lungs-Diagramme mit manuellen Differential-Zählungen verglichen werden, die mit Gesamtblut erhalten wurden, das auf Glasplättchen verteilt und angefärbt wurde.
Das Gerät, das erfindungsgemäß betrieben wird, ist in der Lage, erheblich abnormale Blutproben durch Bestimmung der Positionen und der relativen Größe der Maxima und Minima des Histogramms bei einem abnormal hohen Prozentsatz der Zellen im Monozyten-Bereich und einer abnormalen weißen Gesamtzählung zu bestimmen.
Bestimmte Arten und Zustände von Leukämie werden durch die Gegenwart sehr unreifer Zellen, die als Bruchstücke oder "Blasts" bezeichnet werden, gekennzeichnet, die nicht in normalem Blut und meistens nicht im abnormalen Blut gefunden werden. Diese "Blasts" werden teilweise durch ihre sehr große Größe auf den Blutglasplättchen identifiziert, jedoch sind sie anscheinend sehr empfind­ lich gegenüber der Lyse, wobei sie im Volumenbereich von 80 bis 150 Kubikmikron gefunden werden, und wobei die Lympho­ zyten- und Monozyten-Bereiche überlappen und ein breites Maximum in diesem Bereich erhalten wird, ohne dem typischen Lymphozyten/Monozyten-Minimum, das bei 100 Kubikmikron üblicherweise festgestellt wird. Derartige Proben werden im allgemeinen leicht mit dem Gerät auf Grund des ungewöhn­ lichen Histogramms und der häufig erheblich erhöhten Ge­ samtzählung der weißen Blutzellen festgestellt.
Blutproben, die durch zu lange Alterung, durch Einwirkung ungewöhnlich hoher Temperaturen usw. beschädigt worden sind, ergeben gleichfalls abnormale Histogramme, die leicht von einem geübten Beobachter sowie von der Rechen­ anlage in dem Gerät festgestellt werden können.
Fig. 1A und 1B zeigen zum Vergleich Leukozyten-Vertei­ lungs-Histogramme der gleichen Probe, die mit einem auto­ matischen Coulter Counter Modell S Plus Blutzellenzähler durchgeführt worden sind, wobei Fig. 1A unter Verwendung eines Reagenzsystems nach dem US-Patent 43 46 018 erhal­ ten wurde, während Fig. 1B mit einem Reagenzsystem und nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
Fig. 1C stellt das Histogramm eines Patienten mit schwerer Leukopenie dar. Es sind sehr wenige Zellen in der Granulozyten-Zone vorhanden. Das Lymphozyten-Maximum läuft in dem mononuklearen Bereich aus. Das angefärbte Blutglasplättchen zeigt gelegentlich mehrere Lappen auf­ weisende Neutrophile, eine normale Anzahl an reifen Lymphozyten und einige "Blasts".
Fig. 1D zeigt ein Lymphozyten-Maximum, das normal er­ scheint. Es ist eine deutliche Erhöhung des mononuklearen Bereiches sowie der Granulozyten-Zone festzustellen.

Claims (13)

1. Verfahren zur volumetrischen Differenzierung von Leukozyten-Populationen einer Gesamtblutprobe, wobei die Gesamtblutprobe mit einem lytischen Reagenz, das quaternäre Ammoniumsalze mit oberflächenaktiven Eigenschaften umfaßt, vermischt wird, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das lytische Reagenz in so niedriger Konzentration und/oder mit so einer geringen Geschwindig­ keit mit der Gesamtblutprobe vermischt wird, daß die Granulozyten-Population ein größeres Volumen erhält, wodurch eine getrennte Analyse und Zählung der Monozyten und Granulozyten ermöglicht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für die volumetrische Differenzierung ein automati­ sches Teilchen-Analysiersystem nach dem Coulter-Prin­ zip verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtblutprobe mit einem Verdünnungsmittel versetzt wird, das ein Gemisch aus einem Puffer, einem Zellmembran stabilisierenden Mittel und einem keimabtötenden Mittel umfaßt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer N-(1-Acetamido)-iminodiessigsäure (ADA), das zellstabilisierende Mittel Procainhydrochlo­ rid und das keimabtötende Dimethylolharnstoff ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das lytische Reagenz Mittel zur Bildung eines geeigneten Chromagens für die Hämoglobin-Bestimmung umfaßt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die quarternären Ammoniumsalze ein Gemisch von Dodecyltrimethylammoniumchlorid und Tetradecyltrimethylammoniumbromid sind.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Dodecyltrimethylammoniumchlorid in einem Konzentrationsbereich von 20 bis 55 g/L und das Tetradecyltrimethylammoniumbromid in einer Konzentra­ tion von 2 bis 6 g/L vorliegen.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeich­ net, daß das Dodecyltrimethylammoniumchlorid und das Tetradecyltrimethylammoniumbromid in einem Verhältnis von 9,5±4 : 1 vorliegen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die quaternären Ammoniumsalze ein Gemisch von Dodecyltrimethylammoniumchlorid und Hexadecyltrimethylammoniumbromid sind.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Dodecyltrimethylammoniumbromid und das Hexadecyltrimethylammoniumbromid in einem Verhältnis von 13±6 : 1 vorliegen.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die quaternären Ammoniumsalze ein Gemisch von Dodecyltrimethylammoniumchlorid und Dimethylätherhexadecylammoniumbromid sind.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Dodecyltrimethylammoniumchlorid und das Dimethylätherhexadecylammoniumbromid in einem Verhältnis von 14±6 : 1 vorliegen.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis der Gesamtblutpro­ be zu den quaternären Ammoniumsalzen des lytischen Reagenzes etwa 1 µl : 1,4 mg beträgt.
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