DE60200722T2

DE60200722T2 - Verfahren zur Kontrolle der Absolutzahlen von Zellen oder anderen Partikeln in einer Probe

Info

Publication number: DE60200722T2
Application number: DE60200722T
Authority: DE
Inventors: Jose Alberto Orfao De Matos Correia E Vale
Original assignee: Universidad de Salamanca
Current assignee: Universidad de Salamanca
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2002-02-11
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2022-02-12
Also published as: ES2224039T3; EP1236992B1; US20020115130A1; DE60200722D1; ES2178594A1; ES2178594B1; US6913901B2; EP1236992A1

Description

Die Erfindung bezieht sich hauptsächlich, aber nicht ausschließlich, auf ein einfaches, schnelles und präzises Vorgehen für die Steuerung der pro Volumeneinheit gefundenen absoluten Anzahl von Zellen (oder anderer Teilchen bzw. Partikel) in Suspension in einer Probe.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet ein Flusszytometer ausgestattet mit einem oder mehreren Lasern und basiert auf der Verwendung einer Mischung von verschiedenen Populationen von Referenzteilchen in bekannten Mengen und Abmessungen. Das Verfahren ist für Forschungs-, diagnostische, prognostische Zwecke verwendbar, und um therapeutische Protokolle zu bewerten.
Die Aufzählung der absoluten Zahlen von Zellen (oder anderer Teilchen) einer Probe stellt sowohl in der biomedizinischen Forschung und in klinischen diagnostischen Laboratorien eine Information von außerordentlicher Wichtigkeit dar.
Zur Zeit sind eine Anzahl von verschiedenen Verfahren für die Aufzählung der in einer Probe vorhandenen absoluten Zellzahlen erhältlich, wobei das am meisten fehlerfreie und präzise davon Proben verwendet, in dem die zu zählenden Teilchen in Suspension sind. Von diesen setzen die bemerkenswertesten Techniken zwei Arten von Instrumenten ein: hämatologische Analysatoren und Flusszytometer.
Während die hämatologischen Analysatoren volumetrische Verfahren für das Zählen von Partikeln verwenden, die durch die Messung der Impedanz und seit kurzem durch die Lichtstreuung eines Lasers nachgewiesen werden, sind die hinter der Auszählung von absoluten Zellzahlen oder anderer Partikel in Flusszytometern stehenden Prinzipien unterschiedlich und schließen verschiedene volumetrische Verfahren oder die Verwendung von Referenzteilchen ein.
Obwohl die volumetrischen Flusszytometrieverfahren für die Auszählung von absoluten Zahlen von Zellen oder anderer Partikel nur in einer begrenzten Anzahl von Instrumenten angewendet werden können, wobei nur zwei zur Zeit kommerziell erhältlich sind, können die Verfahren auf der Grundlage der Verwendung von Referenzteilchen in jedem Flusszytometer angewendet werden, unabhängig vom Hersteller, einschließlich der populärsten Modelle.
Durch dieses letztere Verfahren können wir die in einem definierten Volumen einer Probe vorhandene Anzahl der Zellen (oder anderer Teilchen) bestimmen, wobei eine definierte Anzahl von Referenzteilchen zu einem gewissen, ebenso vorbestimmten Volumen der Probe zugegeben wird. Die Genauigkeit des Verfahrens hängt von der Zubereitung der Mischung von Referenzteilchen und der Messung des Volumens der Probe ab, unabhängig von der möglichen Zugabe von variablen Volumina anderer, die Messung erschwerender Reagenzien zu der vorhergehenden Mischung, wie etwa monoklonale Antikörper, um die interessierenden Zellen zu identifizieren, oder Lysierungslösungen, welche spezifisch kernlose Zellen zerstören (zum Beispiel rote Blutzellen in zur Untersuchung von Leukozyten verwendeten Proben).
Ohne Zweifel sind die kritischsten Schritte in dieser Technik

1) die präzise Messung eines bestimmten Volumens der Probe.
2) die Mischung einer präzisen Anzahl von Referenzteilchen mit der Probe.

Zur Zeit gibt es zwei Wege die letztere Frage zu lösen: i) Zugabe eines bekannten Volumens der Probe zu Röhrchen, die lyophilisierte Referenzmikrokügelchen enthalten – TRUCOUNT^TM-Röhrchen – oder, alternativ, ii) zu einem Röhrchen mit einem bekannten Volumen der Probe wird ein genau abgemessenes Volumen einer Lösung zugegeben, welche in Suspension eine bekannte Anzahl von Teilchen oder Mikrokügelchen enthält – FLOWCOUNT^TM-Kugeln. Beim Letzteren wird angenommen, dass die Stammlösung der FLOWCOUNT^TM-Mikrokügelchen, aus der ein präzises Volumen pipettiert wird und welches vorher gevortext wurde, eine homogen verteilte Suspension von Referenz-Mikrokügelchen enthält. Zur gleichen Zeit wird in beiden Verfahren – FLOWCOUNT^TM und TRUCOUNT^TM – angenommen, dass während der Messung keine bevorzugte Auswahl entweder für die in der Probe vorhandenen zu zählenden Referenz-Mikrokügelchen oder für die Zellen (oder andere Teilchen) existiert.
In den vergangenen Jahren wurden beide Verfahren für die Berechnung der absoluten Anzahl von Teilchen für die Anwendung angepasst, anfänglich durch Forschungslaboratorien aber nachfolgend auch durch klinische diagnostische Laboratorien. Neben anderen Verwendungen wurden sie für die Zählung von CD4⁺ T-Lymphozyten im peripheren Blut von mit humanem Immundefizienzvirus (HIV) infizierten Individuen eingesetzt, als auch für die CD34⁺-Stamm- und hämatopoetischen Vorläuferzellen in Leukophoreseprodukten, um den Erfolg oder das Versagen einer in Aussicht stehenden Transplantation vorherzusagen. Vorläuferstudien haben gezeigt, dass die Störung des Niveaus der Variablität bei diesen Arten der Messungen vorhanden ist, welche gewöhnlicherweise durch das Training des für die Durchführung der Technik verantwortlichen Personals reduziert wird.
EP-A-0 586 183 offenbart ein Verfahren, das verschiedene Merkmale mit Anspruch 1 der vorliegenden Erfindung gemeinsam hat. Jedoch wird gemäß EP-A-0 586 183 zunächst eine bekannte Menge von ersten Mikroteilchen zu der Probe mit den zu messenden Teilchen gegeben. Dann wird, in einem separaten Schritt, eine bekannte Menge eines zweiten, unterschiedlichen Mikroteilchens zu der Mischung mit der Probe und den ersten Mikroteilchen gegeben.
Trotz der bis jetzt teilweisen Standardisierung der vorher beschriebenen Techniken und Verfahren gab es bei diesen Arten der Messungen kein beschriebenes Vorgehen, welches darauf gerichtet ist, die zwei signifikanten Variablen zu steuern:

1) die homogene Verteilung der Referenzteilchen sowohl in der Stammlösung und einmal mit der zu messenden Probe gemischt.
2) die selektive Akquisition der Zellen oder Referenzteilchen während der Messung im Flusszytometer.

Daher besteht eine Aufgabe dieser Erfindung im Vorschlag einer Lösung, welche erfolgreich diese zwei Variablen steuern wird, welche die Auszählung der absoluten Zahlen von Zellen/Teilchen in Suspension in einer Probe beeinflussen können, ohne zusätzliche Messungen zu erfordern.
Gleichermaßen besteht eine andere Aufgabe der Erfindung in der Steuerung des möglichen Vorhandenseins spezifischer negativer oder positiver Selektion von Zellen (oder anderer Teilchen) in der zu zählenden Probe während dem Messvorgang selbst.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren nach Anspruch 1. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den abhängigen Ansprüchen definiert.
Konsequenterweise stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Steuerung des Flusszytometrieprozesses der Auszählung absoluter Zahlen von Zellen (oder anderer Teilchen) pro Volumeneinheit einer Probe dar, basierend auf der Verwendung einer Mischung von zwei oder mehreren Sorten von Referenzteilchen mit unterschiedlichen Eigenschaften. Dieses Verfahren wird durch die folgenden Stadien gekennzeichnet:

a) Herstellen einer Mischung oder Stammlösung mit bekannten Verhältnissen und Mengen von zwei oder mehreren Populationen von Referenzteilchen mit verschiedenen Merkmalen;
b) Zugeben einer bekannten Menge dieser Mischung zu einem bekannten Volumen der Probe, welche die zu zählenden Zellen (oder andere Partikel) enthält;
c) Messen der Mischung, welche die Probe und die Referenzteilchen enthält, in einem Flusszytometer;
d) Berechnen der absoluten Anzahl der in der Probe vorhandenen zu zählenden Zellen (oder anderer Partikel);
e) Überprüfen, dass das Verhältnis zwischen den verschiedenen in der Probe nachgewiesenen Populationen der Referenzteilchen, mit dem übereinstimmt, welches in der anfänglichen Mischung oder Stammlösung vorhanden war, die verschiedene Populationen der Referenzteilchen enthält.

Für den Zweck dieser Erfindung wird durch den Begriff „Referenzzeichen mit distinkten Merkmalen" ausgedrückt, dass die Teilchen unterschiedliche Merkmale haben, zum Beispiel in Bezug auf ihre unterschiedlichen Dichten und/oder adhäsiven Eigenschaften und/oder Lichtstreuungs- und/oder Fluoreszenzeigenschaften.
Für die Zwecke dieser Erfindung wird für die Herstellung der Probe für die spezifische Identifikation der interessierenden Zellen (oder anderen Teilchen) vor ihrer Zählung die Selektion der interessierenden Zellen (oder anderer Teilchen) als auch die Kalibrierung und Einstellung des Flusszytometers gemäß den vielfältig beschriebenen und empfohlenen Verfahren für die Charakterisierung von Zellen oder anderer Teilchen unter Verwendung eines Flusszytometers durchgeführt.
Für die Analyse der Ergebnisse und für die akkurate Quantifizierung jeder Subpopulation der interessierenden Zellen (oder anderer Teilchen) und jede der Population von Referenzteilchen können verschiedene Computerprogramme verwendet werden, wie etwa Cell Quest^TM, Paint-A Gate, PRO^TM oder Expo 32^TM.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl in normalen als auch pathologischen Proben verwendet werden, für alle Zwecke, die die gesteuerte Zählung von Zellen (oder anderer Teilchen) vorhanden in einer Probe erfordern, einschließlich Zählungen für Forschungs-, diagnostische und prognostische Zwecke und für die therapeutische Evaluierung.
Wie durch das vorher beschriebene Verfahren angezeigt kann die Anzahl der Populationen der Referenzteilchen variieren, wie auch der Anteil und die absolute Menge jeder Population und ihre physikalischen und chemischen Kennzeichen bzw. Merkmale. Auf die gleiche Art und Weise ist zu verstehen, dass die Erfindung Variationen abdeckt, in welcher Reihenfolge die Mischung der Probe mit den Referenzpopulationen der Teilchen durchgeführt wird (Gabe der Referenzteilchen in einen Aufnahmebehälter, der die Probe für die Analyse enthält oder umgekehrt), und dass verschiedene Stammlösungen jede Population von Referenzteilchen einer bekannten Menge und Konzentration enthalten kann, oder dass die Stammlösung die bereits gemischten Referenzteilchen enthalten kann.
Aus dem Vorhergehenden kann gefolgert werden, dass die chemische Verbindung, die Form, Größe, Volumen, Dichte, Adhäsionskapazität, Fluoreszenz, Transparenz, Brechungsindex oder andere Eigenschaften jeder Population der verwendeten Referenzteilchen in Abhängigkeit von der Art der Zellen (oder anderer Teilchen) der zu zählenden Probe variieren kann. Auf die gleiche Art und Weise ist zu verstehen, dass jede Population von Referenzteilchen variierende Mengen einer oder mehrerer fluoreszierender Verbindungen oder von Verbindungen enthalten kann, die innerlich oder auf ihre Oberfläche Licht absorbieren können.
Mit dieser Erfindung, da die interessierenden Zellen (oder andere Teilchen) innerhalb der Probe zur gleichen Zeit gezählt werden, gibt es eine erfolgreiche Steuerung jeder heterogenen Verteilung von Populationen von Referenzteilchen beim Mischen mit der Probe, und jeder selektiven Akquisition von Zellen (oder anderer Teilchen) während der Messung innerhalb des Flusszytometers.
Im Folgenden wird die Erfindung durch ein Beispiel veranschaulicht, welches keineswegs den Bereich seiner Anwendung begrenzt:
Material und Methoden: Erhalt der Probe
Peripheres Blut wurde aus 10 gesunden Spendern mobilisiert mit G-CSF über fünf Tage in VACUTAINER^TM-Röhrchen mit Tri-Kalium- (K3) EDTA als ein Antikoagulationsmittel gesammelt. Die Röhrchen wurden bis zum Beginn der Probenvorbereitung für die Zählung der CD34⁺-Stamm- und hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPC) bei Raumtemperatur gehalten.
Die Auszählung der absoluten Zahlen von CD34⁺ HPC wurde in allen Fällen innerhalb einer Zeitspanne von zwei Stunden nach Erhalt der Proben durchgeführt.
Herstellung einer Mischung von Teilchen- oder Referenz-Mikrokügelchen (Stammlösung der Referenzteilchen)
Um eine Mischung der Mikrokügelchen herzustellen, wurden zwei getrennte Lösungen, jeweils mit einer verschiedenen Art von Mikrokügelchen, in einer unterschiedlichen Konzentration verwendet. Die erste Lösung enthielt Polystyrol-Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 6,4 ± 0,1 μm und einer Dichte von 1,06 ± 0,02 markiert mit Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) bei einer bekannten Konzentration von 1500 Mikrokügelchen/μL in der Lösung. Die zweite Lösung enthielt Polystyrol Mikrokügelchen mit 10% Methacrylat mit einem Durchmesser von 6,2 ± 0,1 μm mit einer Dichte von 1,050 ± 0,03, welche mit Phycoerytrin konjugiert wurden, bei einer bekannten Konzentration von 500 Mikrokügelchen/μL in der Lösung. Unter Verwendung einer reversen Pipettiertechnik wurde eine Mischung (Stammlösung der Referenzteilchen) aus gleichen Teilen (1/1 v/v) der vorher erwähnten Lösungen hergestellt, die eine Endkonzentration von 1000 Mikrokügelchen/μL enthält; wobei 750 Mikrokügelchen/μL den Polystyrol-Mikrokügelchen und 250 Mikrokügelchen/μL den Polystyrol/Methacrylat-Mikrokügelchen entsprechen. Beide Gruppen von Kügelchen wiesen verschiedene Fluoreszenzeigenschaften auf, welche die individuelle Identifizierung jeder Sorte von Mikrokügelchen in einer zweidimensionalen Darstellung der grünen Fluoreszenz (FL₁) gegen orange Fluoreszenz (FL₂) ermöglichen.
Vorbereitung der Proben
Für jede Probe wurden parallel zwei Röhrchen vorbereitet. In jedem von ihnen wurden 100 μL peripheres Blut zugegeben unter Verwendung einer reversen Pipettiertechnik unter Einsatz einer digitalen Pipette, die vor der Probenvorbereitung kalibriert wurde, um genau die Volumina von 100 μL zu messen. Dann wurde zu jedem Röhrchen 20 μL anti-CD45 monoklonaler Antikörper konjugiert mit Allophycocyanin (APC) (HLE-1-Klon, Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA) gegeben. Ferner wurde zu einem Röhrchen 20 μL eines monoklonalen Antikörpers (IgG₁) anti-CD34 konjugiert mit Phycoerytrin (HPCA-2-Klon, Becton Dickinson Biosciences) von der Maus zugegeben, während zu dem zweiten Röhrchen anstelle dieses Antikörpers 20 μL eines IgG1-Immunglobulins von der Maus konjugiert mit Phycoerythrin ohne spezifische Reaktivität für die in humanen Zellen vorhandenen Antigene zugegeben wurde; dieses letztere Röhrchen wurde als eine negative isotypische Kontrolle verwendet.
Nach vorsichtigem Vortexen für fünf Sekunden wurden beide Röhrchen für 15 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit inkubiert. Nach der Inkubation wurde zu jedem Röhrchen 2 ml der fixativfreien QUICKLYSIS (Cytognos, Salamanca, Spanien) hypotonischen Lösung zugegeben und eine zweite Inkubationsperiode wurde bei Raumtemperatur in der Dunkelheit für 10 Minuten durchgeführt.
Unmittelbar nach dieser Inkubation wurden 100 μL der gemischten Lösung der Referenzmikrokügelchen (Stammlösung) zu jedem Röhrchen gegeben, nach vorsichtigem Mischen in einem horizontalen Homogenisator. Dann wurden beide Röhrchen in einem horizontalen Homogenisator angeordnet und für 1 Minute vorsichtig gemischt, um eine homogene Verteilung sowohl der zu zählenden CD34⁺-Zellen als auch der zu der gefärbten Probe zugegebenen zwei Subpopulationen von Referenzmikrokügelchen zu erreichen.
Datenerhebung und Analyse
Nachdem die Mischung der Probe mit den Referenzteilchen homogenisiert wurde, wurde die Lichtstreuung und die Fluoreszenzeigenschaften sowohl der in den zwei Röhrchen vorhandenen Zellen als auch der Referenzteilchen, hergestellt für jede Probe in Übereinstimmung mit dem vorher erwähnten Verfahren, gemessen. Um dies zu erreichen, wurde ein FACSCalibur Flusszytometer (Becton Dickinson Biosciences) ausgestattet mit einem Argonlaser und einer Photodiode mit Lichtemission eingestellt auf 488 nm bzw. 630 nm, verwendet. Vor der Messung wurde das Flusszytometer kalibriert, wobei den Herstellerinstruktionen und -beschreibungen unter Verwendung von CRLIBRITE BEADS^TM (Becton Dickinson Biosciences) gefolgt wurde. Für die Datenerhebung wurde der Schwellenwert bei FSC (forward light scatter) im Kanal 50 (willkürliche Einheiten, gestaffelt von 0 bis 1023 Kanälen) eingestellt. Für jedes Röhrchen wurden Informationen von 100.000 Ereignissen unter Verwendung des CellQUEST^TM-Softwareprogramms gesammelt.
Die Identifikationen von CD34⁺ hämatopoetischen Vorläuferzellen wurden auf der Grundlage der starken Expression von CD34-PE (FL2⁺⁺), der schwachen Reaktivität für CD45-APC (FL4±) und mittlere Werten für FSC und SSC (side light scatter) durchgeführt. Wiederum wurden die zwei Subpopulationen von Mikrokügelchen durch ihre niedrigen FSC-Werte mit hohen SSC zusammen mit sowohl grüner (FL1^+/+++) und oranger (FL^+/++)-Fluoreszenz identifiziert.
Die spezifische Identifikation innerhalb der Referenzteilchen jeder der zwei unterschiedlichen Populationen von Referenzmikrokügelchen wurde auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen Fluoreszenzeigenschaften durchgeführt: Population 1 war F11⁺⁺⁺/FL2⁺ und Population 2 war FL1⁺/FL2⁺⁺.
Nachdem einerseits die Ereignisse, die CD34⁺-HPC auf der einen Seite und der zwei Populationen von Referenzteilchen auf der anderen Seite entsprechen, identifiziert wurden, wurde überprüft, dass die Population 1 der Referenzteilchen aus einer Anzahl von Ereignissen dreimal größer als die der Population 2 bestand.
Die absolute Zahl von CD34⁺-Zellen/μl der Probe wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet:
Anzahl der CD34⁺-Zellen/μl = 1.000 (Anzahl der zu jedem Röhrchen zugegebenen Mikrokügelchen/μl der Probe) × Anzahl der Ereignisse entsprechend zu CD34⁺-Zellen/Anzahl der Ereignisse, welche zu der Gesamtheit der zwei Populationen von Mikrokügelchen korrespondiert.

Claims

Verfahren zur Steuerung der flusszytometrischen Zählung der absoluten Anzahl von Zellen oder anderer Partikel pro Volumeneinheit einer Probe, basierend auf der Verwendung einer Mischung von wenigstens zwei Typen von Referenzteilchen mit verschiedenen Merkmalen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellen einer Mischung mit bekannten Verhältnissen und Mengen von wenigstens zwei Populationen von Referenzteilchen mit verschiedenen Merkmalen; b) Zugabe einer bekannten Menge der Mischung zu einem bekannten Volumen der Probe, welche die Zellen oder andere zu zählende Partikel enthält, wodurch eine die Probe und die Referenzteilchen enthaltende Mischung erhalten wird; c) Messung der Mischung, welche die Probe und die Referenzteilchen enthält, in einem Flusszytometer, um so zu erhalten: (i) eine Anzahl der nachgewiesenen Zellen oder anderer zu zählender Partikel; (ii) eine Anzahl nachgewiesener Referenzteilchen entsprechend jeder Population der Referenzteilchen; d) Berechnung der absoluten Anzahl der in der Probe vorhandenen Zellen oder anderer zu zählender Partikel; e) Überprüfung, dass das Verhältnis zwischen der erhaltenen Anzahl nachgewiesener Referenzteilchen entsprechend jeder Population der Referenzteilchen, mit dem bekannten Verhältnis zwischen den Populationen der Referenzteilchen übereinstimmt, die in der in Schritt (a) hergestellten anfänglichen Mischung vorhanden war.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Unterscheidungsmerkmale der zwei Populationen der Referenzteilchen unterschiedliche Lichtstreuungseigenschaften einschließen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Unterscheidungsmerkmale der zwei Populationen der Referenzteilchen unterschiedliche chemische Zusammensetzungen einschließen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Unterscheidungsmerkmale der zwei Populationen der Referenzteilchen unterschiedliche Formen einschließen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Unterscheidungsmerkmale der zwei Populationen der Referenzteilchen unterschiedliche Größen einschließen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Unterscheidungsmerkmale der zwei Populationen der Referenzteilchen unterschiedliche Volumina einschließen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Unterscheidungsmerkmale der zwei Populationen der Referenzteilchen unterschiedliche Dichten einschließen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Unterscheidungsmerkmale der zwei Populationen der Referenzteilchen unterschiedliche Anhaftungseigenschaften einschließen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei die Unterscheidungsmerkmale verschiedene Fluoreszenzeigenschaften einschließen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Unterscheidungsmerkmale der zwei Populationen der Referenzteilchen ausgewählt werden, um Merkmale einzuschließen, welche für den Nachweis oder die selektive Erfassung der Zellen oder anderer zu zählender Partikel während der Messung in dem Flusszytometer geeignet sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt (b) "ex-vivo" erhaltene, gelagerte oder "in vitro" behandelte, normale oder pathologische Proben verwendet werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt (b) in ein Gefäß zur Aufnahme der Mischung der Probe mit den Referenzteilchen zuerst die Probe zugegeben wird, gefolgt durch die Referenzteilchen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei in Schritt (b) in ein Gefäß zur Aufnahme der Mischung der Probe mit den Referenzteilchen zuerst die Referenzteilchen zugegeben werden, gefolgt durch die Probe.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die chemische Zusammensetzung, die Form, das Volumen, die Größe, die Dichte und die Adhäsionsfähigkeit, die Fluoreszenz, die Transparenz, der Brechungsindex und/oder andere Merkmale jeder Population der Referenzteilchen in Abhängigkeit vom Typ der Zellen oder anderer zu zählender Partikel ausgewählt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Populationen der Referenzteilchen schwankende Mengen einer oder mehrerer Verbindungen enthalten, die entweder fluoreszierende Verbindungen sind oder im Innern und/oder auf ihrer Oberfläche Licht absorbieren.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die im Schritt (a) erhaltene Mischung eine Stammlösung ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Ergebnis der Überprüfung des Verhältnisses in Schritt e) verwendet wird, um zu bestimmen, ob es während der Mischung mit der Probe irgendeine heterogene Verteilung der Referenzteilchen und/oder während der Messung in dem Flusszytometer irgendeine selektive Erfassung der Referenzteilchen gab.