JPS60500097A - 白血球の母集団の容量を区別する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 白血球の体積示差方法 本発明は白血球の少なくとも２種の母集団を体積示差（ｙ０１Ｂ１６　ｄｉ［ｅ ｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）する方法および試薬系に関する。特に、本発明は白血球 の少なくとも２種の母集団：（１）ＩＪンバ球母集団、（２）単球母集団、およ び好中球、好酸球および好塩基球を含む顆粒球母集団をはクールター　エレクト ロニクス　インコーホレーテッドの登録商標である）を用いて分類ふよび計算す る方法に関する。

これらのテークは以上な白血球比を注意する予検手段として利用される。この方 法によりｍ認された異常な状態は診断の重要性を知らせ、技術者に更に研究すよ び大きさに分ける（ｓｉｚｉｎｇ）原理を利用する体積分布による正常な人間の 白血球の分離は、現在、臨床的診断方法として適用されている。この方法はある 大きさおよび形を維持するすべての生きている細胞の基本的特性に基づく。循環 血液における各タイプの細胞は３立方ミクロンのように′小さい、すなわち、小 板の場合の３ｆＬから多形核細胞の場合の１３５０ｆＬの範囲のそれ自ために、 小板、白血球及び赤血球の大きさ分布を計算および測定する目的でこの体積示差 を使用できるように設計されている。

あいにく、赤血球およびリンパ白血球は細胞大きさが極めて重なり合っており、 実際のところ大きさ区別だけでは互に計算することができない。慣習手段には赤 血球を間質溶解する強い溶解性表面活性剤（Ｉｙｔｉｃ　−５ｕｒｆａｃｔａｎ ｔ　ｒｅａｇｅｎｔ）の使用を含んでおり、赤血球を極めて小さい粒子に減少し または膜溶解化させ、および細胞質をリンパ白血球およびミニロイド白血球から 取除き、計算すべき耐溶解核（Ｉｙｓｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｎｕｃｌｅｉ） だけを残留する。最初の細胞体積は著しく作用し、かつ最小に減少するから、も っばら単一白血球母集団をカウンターは、全血液試料を等張性希釈液に希釈し、 ライジング試薬を添加し、短時間で計算するように設計されている。それ故、希 釈液−ライシンイブ系はう分に速やかな赤血球ライジング　力イネテックス（ｌ ｙｓ−ｉｎｇ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を得るようにする。更に、白血球体積の変化 をデータ収集段階中最小にする必要があり、理想的には数分間にわたり安定にす る必要がある。また、試薬系は赤血球および小板数並びに大きさ分布、ヘモクロ ビン吸収スペクトルおよび全白血球計数の統合を維持させるようにする。フィン ガ　ステック（ｆ　ｉ−ｎｇｅｒ　５ｔｉｃｋ）血液は、等張性希釈液中で予希 釈する場合に少なくとも２時間にわたり安定にする必要がある。

アメリカ特許第３．８７４．８５２号明細書には第四アンモニウム塩洗浄剤、お よび単一体積白血球計数およびヘモクロビン定量を含むライジングおよびクロマ ゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）形成試薬として用いるシアン化カリウムを含有する 組成物について記載されている。

アメリカ特許第４．２８６．９６３号明細書には白血球のリンパ／ミニロイド母 集団の示差定量を行い、またクロマゲン形成によりヘモクロビンを測定する全血 液中の赤血球の速やかなライジングのための溶解性希釈液（ｌｙｔｉｃ　ｄｉｌ ｕｅｎｔ）が表面活性特性を有する少なくとも１種の第四アンモニウム塩、およ び２−フェノキシエタノールの如きある種の添加剤を含有していることを示して いる。

アメ慧力特許第４．３４６．０１８号明細書には白血球のリンバーミニロイド母 集団の示差二体積測定についての等張多目的な血液希釈液およびこの希釈液をラ イジング試薬（ｌｙｓｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ）系と用いる方法が記載されてい る。

血液中のリンパ球、単球および顆粒球の３種−容積母集団の分析を達成するため には、白血球体積ヒストグラムは谷を基線に近付けることにより小さい細胞質破 片（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｄｅｂｒｉｓ）で完全に分離した母集団を示すようにす る必要がある。各母集団の統合はリンパ球、単球および顆粒球の相対数を与える 。リンパ母集団はリンパ球および小さい異型性リンパ球の含有するのを示すと共 に、ミニロイド母集団は２種のサブ−グループ、単球および顆粒球を含有する。

顆粒球は好学１、好酸球および好塩基球を含んでいる。

本発明は全血液試料を試薬系に作用させて単球および顆粒球母集団の少なくとも 体積示差を達成する方法に関する。事実、本発明は白血球の３種の母集団、即動 粒子力ランチング　システムにおいて、もっばら僅かに修正したプログラミング および白血球大きさチャンネライジング（ｓｉｚｅ　ｃｈａｎｎｅｌｙｚｉｎｇ ＞能力によって分類および計算する方法を提供することである。

本発明の方法は全血液試料から得られた少なくとも単球および顆粒球母集団を体 積示差する方法であって、全血液試料およびライジング試薬を供給し；全血液試 料を予定全量のライジング試薬と低勾配の溶解シッヨク（ｌｙｔｉｅ　５ｈｏｃ ｋ）を得るこ２により単球および顆粒球の少なくとも１つの母集団の個々の血球 を体積修正を得るようにこれらの母集団の体積示差を得るのに十分な時間にわた り混合する各工程からなることを特徴とする。

本発明の方法にもちいる試薬系は有機緩衝剤、細胞膜安定化剤および殺菌薬の混 合物からなる多目的等張性希釈液を包含し、その最終体積濃度および全量は白血 球に対するライジンク試薬の溶解カイネテ・ソクス（１ｙｔｉｃ　ｋｉｎｅｔｉ ｃｓ）を遅くすると共に、慣習ノへモクラムパラメータを安定化する。

本発明の方法に最適なライジング試薬は３種の白血球体積ヒストグラムを与える のに効果的な体積濃度および全量の表面活性特性を有する第四アンモニウム塩の 水溶液の混合物である。ライジング試薬は低張であり（ｔ＋ｙｐｏｔｏｎｉｃ） 　、それ故ミニロイドの収縮に抵抗する。

いるデータを示す。補助計算およびデータ処理装置は完全自動化に望ましいが、 しかし測定の性能にだいしては必ずしも必要ではない。

本発明の好適な例においては、アルカリ金属シアン化物をクロマゲン形成剤とし て添加する。また、フェロシアン化−９７リウムおよび重炭酸ナトルウムを含有 するドラブキンの試薬（Ｄｒａｂｋｉｎ　′ｓ　ｒｅａｇｅｎｔ）の如きの他の クロマゲン形成剤を用いることができる。

本発明においては、普通のライジング試薬および方法を血液試料中の白血球をラ イジング試薬にゆるやかに曝すように修正することによって白血球を常に溶解剤 （Ｉｙｔｉｃ　ａｇｅｎｔ）の高濃度に曝さずに、すなわち、「−溶解ショック 」を減少し、顆粒球を高体積で維持し、第３の母集団、即ち、単球を具象化およ び算出し：すなわち、リンパ球と顆粒球との間の中間体積範囲を第３の母集団、 単球を高めるのに十分に拡大するくｍ粒球を存在しないようにする）予期しない 事実を見出しまた。このために、アメリカ特許第４．２８６．９６３号および第 ４．３４６．０１８号明細書に記載されており、かつ第１Ａ図に示しているよう に単に白血球をリンパおよびミニロイドに２種−母集団分離する代わりに、ミニ ロイド細胞を２種のザブ母集団に分離して第１Ｂ図示すように３種の母集団全体 、すなわち、リンパ球、単球および顆粒球を得ることができる。更に、本発明の 方法を用いることによってヒストグラムのピークおよび谷の位置および相対的大 きさを算出することにより、および単球範囲における細胞のいじょうい割合を見 出すことにより、同時に異常な全白血球計数により異常血液試料の二三のタイプ を検出できることを確かめた。このために、本発明のこの新規な方法は医者に対 して特別臨床利用性を有している。

本発明の実施は白血球を計算および分類することを望むものではない。本発明は 器械使用により計算および／または分類を高めるのにもちいることができる。

更に、等生性希釈剤およびライジング試薬は血液の添加に対して予備混合または 後混合することができる。

後混合した場合には、血液試料を十分に強いライジング試薬に作用させずに、希 釈液で希釈する必要がある。

本発明の具体例を添付図面により説明する：第１Ａ図からＩＣＩＤ図は同じスケ ールで取った白血球分布ヒストグラムを示す曲線図である： 第１Ａおよび１８図は同じ正常血液試料から展開したヒストグラムを比較的に示 し、ており、第１Ａ図は従来の２種−母集団技術を用いており、および第１Ｂ図 は本発明の方法を用いて３種−母集団ヒストグラムを達成しており： 第１ＣおよびＩＤ図は異なる血液試料から本発明により展開した３種−母集団ヒ ストグラムを説明している。

アメリカ特許第３．５４９．９９４号明細書に記載されでいるように高速自動へ マトロシー機器の導入は透明で、安定性で、かつ再生性の溶液を与える高速赤血 球間質溶解試薬剤を必要としている。このタイプの機器では、血液を普通の希釈 液と混合して第１希釈を行い、次いでライジンク試薬と混合して第２希釈する。

混合物はライジンク　チャンバー内に短時間であるが、しかし赤血球を分解しく 間質溶解し）へミクロビンを放出するのに十分な時間にわたり維持する。また、 ライジング試薬はヘモグロビンを機器に適当なりロマゲンに転化する。生成した 懸濁物はセンシンク孔（ｓｅｎｓｉｎｇａｐｅｒｔｕｒｅｓ）を介して白血球力 ランチング　パスに送り、ここで白血球を電子的にカウントしおよび大きさを測 る。正常血液における赤血球対白血球比が１０００：　１の近くであるから、赤 血球は極めて小さい断片に速やかに小さくして白血球力ランチングに妨害しない ようにする必要がある。同時に、白血球は大きいまたは小さい度合に収縮するけ れども破壊してはならない。

上述するように、赤血球が白血球の大きさ分け（ｓｉｚｉｎｇ）およびカウンテ ングを妨害しないレベルに実際上瞬間に破壊する第四アンモニウム塩を間質溶解 試薬（ｓｔｒｏｍａｔｏｌｙｓｉｎｇｒｅａｇｅｎｔ）として用いるのが有利で ある。第四アンモニウム塩は約０．５〜１０％の範囲の濃度で水溶液状態で含有 させ、約１〜５重量％の溶液が好ましく、この第四アンモニウム塩は約１・１１ のライニ・ング試薬量対希釈試料量の杜で希釈液により予め希釈した血液と混合 する。反応ライジング試薬の同じ最終濃度、またはライジング試薬対全血液の比 をイ５く〕たヅ）に、血液試料の最初の希釈を上述する希釈からＹシなくちせる ように異なる強さのライジング試薬を用いるご−とができる。

アメリカ特許第４．、３４６　、０１．８　賢明細書に記載されている方法によ り白血球を２種の体積イ゛准する場△には、溶解後に得られた１ｙ〕パ　−、］ −ロイド　ニー；、］・１ラノ、は約５０〜１ｏｏｆＬ　！’；Ａｉけるリンパ 球ピークオ）よび１００〜４００　ｆＬの体積範囲の単球および甲頁粒球（好酸 球およ一１好学球）を含有するミニロイド　７−りからなｋ）　０本発明におい ては、ｉｊン’ｆＪり）、１ひ単球か普通に用いられる溶解剤に★・ｉ（７て顆 粒球より極めて＠感であることを見出し、か一つ力・７験的に確かめた。Ｊ血液 試料中の白血球を溶解試薬（ｊ　Ｖ　７　ｔ：　ニー　ｅ　：Ｉ　ｇ　ｅ　ｎ　 ｉ　’に極めてνΦるやかに曝ずように溶解方法の力１ネテ・、バズを修止１− ること（こよって、！貞粒Ｂ−＋、が「ン・・・ｌ・１４受ｊ、↑ζいよう（こ 、すなわち、溶解ン、ツ４゛◇）代し・ｌｒ、Ｊ配を受けるよぞ・にし、これに よって従来の試薬系および方法により生ずる大きさの範囲に減少しないようにす る。この事は、希釈血液試料を溶解試薬でゆるやかに処理することにより、およ び溶解試薬が普通の場合より低濃度である場合に達成できる。しかしながら、は ぼ同量の溶解試薬は赤血球の間質溶解化（ｓｔｒｏｍａｔｏｌｙｓａｔｉｏｎ） を完全にするために必要である。方法のカイネテックスおにける修正によって、 リンパ球は５０〜１００．ｆＬの体積に減少し、単球は１００〜１６０ｆＬに減 少し、顆粒球は１８０〜４５０ｆＬの体積範囲を示す。この結果、顆粒球母集団 は単球母集団とも重り合うことがなくなり、これらの母集団は別々に数えること ができる。データは３種の個々の母集団が存在する時間のわく内で得るようにす る必要がある。

この重要な結果を得るために作用の運動学を制御するようにする。従来において は、赤血球を白血球評価に妨害しないレベルに実際上瞬間に破壊することが力説 されている。この事は赤血球と異なって形態学、および健康状態および病気にお ける種々の核形態の存在、体積および機能に関して多くの手段によって変化する 白血球の個々の分類の示差体積を見分けるようにして。

いる。

本発明においては、白血球のリンパ球、単球および顆粒球母集団を、特に自動力 ランチング　システムにおいて示差測定する方法を提供する。同様に、ヘモグラ ム価を測定することができる。好ましくは、方法は（Ａ）例えば１．有機緩衝剤 ； ２、細胞膜安定化剤；および ３、殺菌薬 の水溶液からなる予定ｐｕ′Ｊ６よび重量オスモル濃度を有する多目的の等張的 平衡希釈液；および（Ｂ）表面活性特性を有する第四アンモニウム塩の水溶液で あるライジング試薬 を組合わせて用いる。

ヘモグロビン測定に適当なりロマゲンを形成するために、またアルカリ金属シア ン化物を得ることができる。また、多のクロマゲン形成剤を用いることができる 。

第四アンモニウム塩は次の式を有するニル基を示し；　Ｒ２，Ｒ３，およびＲ４ は１〜６個の炭素原子を有する短鎖アルキル基を示し：およびＸ−はＣ１−ｏ、 ’−、ｐロ、−３および　Ｃ１，ＳＯ，の如き塩形成基または輪イオンを示す） 。特に有用な組合せにおいては、長鎖アルキルは１２〜１６個、の炭素原子を有 し、短鎖アルキルとしてはメチルまたはエチルであり、Ｘ−とじては塩化物およ び臭化物である。

好ましいライジング試薬としてはドデシルトリメチル　アンモニウム　クロライ ドとテトラデシルトリメチル　アンモニウム　ブロマイドおよびシアン化カリウ ムとの組合せを用いることができる。効果的な結果を与える他の第四アンモニウ ム塩としてはドデシルトリメチル　アンモニウム　クロライドと組合せるヘキサ デシルトリメチル　アンモニウム　ブロマイドまたはヘキサデシルジメチルエチ ル　アンモニウム　ブロマイドを包含する。

従来技術の例 ■ クールター　カウンター　モデルＳプラスの体積および流れ調節に一般的に知ら れている推薦されうる方法により、白血球の２種一体積（リンパ−ミニロイド） 母集団を得るために、次に示す成分を次に示す濃度で使用した： ■、プロ力イン塩酸塩　０．１１　ｇ／Ｌ　Ｏ，０５〜０．２５ｇ／Ｌ２、Ｎ− （２−アセトアミド） イミノジ酢酸（ＡＤＡ）　１．４０ｇ／Ｌ　１．０　〜２．５ｇ／Ｌ３、ジメチ ロール尿素　１．００　ｇ／Ｌ　Ｏ，５〜２．５ｇ／Ｌ、Ｒ７，Ｏ±０．１ 重量オスモル濃度３２０±５ｍＯｓ／ｋｇ３、シアン化カリウム　３００ｍｇ／ Ｌ　２５０〜５００　ｇ／Ｌ４、水　１１にするのに十分な量 実施例　１ ゛上記従来技術の例におけると同様の希釈液の配合を用いたが、しかしライジン グ剤に対する成分の濃度を相違させ、かつライジング試薬の量を倍にして３種− 母集団ヒストグラムを得た。例えば： ３、シアン化カリウム　１５０ｍｇ／Ｌ　１２０−２５０ｍｇ／Ｌ４、水　ｌＩ ｌにするのに十分な量 実施例　２ 上記従来技術の例におけると同様の希釈液の配合を用いたが、ライジング剤に対 する成分を次に示す配合にし、か°つライジング試薬の量を倍にして３種−母集 団ヒストグラムを得た。

ライジング試薬〜３種　好ましい　濃度範囲母集団　濃　度 ３、シアン化カリウム　１５０ｍｇ／Ｌ　１２５〜２５０ｍｇ／Ｌ実施例　３ 上記従来技術の例におけると同様の希釈液を用いたが、しかしライジング剤に対 する成分を次に示す配合にしかつライジング試薬の量を倍にして３種−母集団ヒ ストグラムを得た： 本発明において用いる希釈液のｐＨおよび重量オスモル濃度の範囲は、例えばｐ Ｈ７，０±０．４；および重量オスモル濃度３２０±５０ｍＯｓ／ｋｇのように 従来技術の例に示すこれらより広くすることができる。

例えばシアン化物はヘモグロビン測定に対するクロマゲンの形成に用いるのに適 当な成分であるが、３種−母集団示差白血球ヒストグラムが得られない。

商標登録名で市販されている市販製品を用いる場合には、必要に応じて、同じ結 果を機器システムにより達成するために上述する配合を市販製品の純度および実 際の組成により調節する。

異なるタイプの自動および反自動血球分析機器を操作でき、また上述するとは異 なる容量および濃度の希釈液および溶解剤を用いて操作することができる。また 、流量などを相違させることができる。また、かか単球に関して高体積で顆粒球 を維持し、これにより第３種の独特の母集団として単球を数えることができるよ うに溶解ショックを減少する本発明の基本技術下で操作する。

上述する実施例から明らかなように、既知の２種−母集団ヒストグラムの代わり に３種−母集団ヒストグラムを得る新しい結果は商標登録［ライ上Ｓプラス（Ｌ ｙｓｅ　Ｓ　Ｐｌｕｓ）　ｊで市販されているライジング剤をその濃度の約１７ ２に希釈し、次いでライジング剤の容量の約２倍で使用して達成する。ライジン グ剤配合物における活性成分の濃度は、使用するライジング試薬の容量を対応し て修正する場合には、ライジング成分の割合をある範囲に維持するかぎり変える ことができる。

例えば、１部のテトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドに対して　９． ５±４部のドデシルトリメチル　アンモニウム　クロライド−５０％溶液；また は１部のジメチルエチルヘキサデシル　アンモニウム　ブロマイドに対して、１ ４±６部のドデシルトリメチルアンモニウム　クロライド−５０％溶液；または １部のヘキサデシルトリメチル　アンモニウム　ブロマイドに対して１３±６部 のドデシルトリメチル　アンモニウム　クロライド−５０％溶液。また、全血液 対活性溶解成分の割合はある範囲に維持する必要がある。例えば、０、１３２± ０．０６０ｍｇのテトラデシルトリメチル　アンモニウム　ブロマイドおよび１ ．２５±０．６０ｍｇドデシルトリメチル　アンモニウム　クロライド−５０％ 溶液を全血液ｕＬにつき添加する。それ故、全血液対活性溶解成分の割合は約１ ｕｌ、：ｌ、４ｍｇの割合にする。上記の値は好適な配合物に対する単なる例で あり、本発明の目的を達成する有用な結果を得ることができるかぎり割合を変え ランチング　システムについての既知操作に従って、伯仕液および等張性希釈液 の混合物を白血球力ランチング　パスに供給し、また溶解剤（Ｉｙｓｅ）を同じ 力ランチング　パスにかかる供給のある部分において約１７２秒間にわたって添 加する。本発明の新規な方法の好適間にわたって溶解剤をカウンテング　パスに 添加する。

良好な結果を得るためには、溶解剤供給ラインおよび希釈血液供給ラインをその 長さの有意部分で結合してカウンテンク　パスに導入する前に緊密に混合するよ うにする。ライジング試薬のこの遅い供給および低濃度における血液との相互作 用は［溶解シック−１の減少、すなわち溶解作用の低いまたはより低い勾配の達 成を促進し、本発明における白血球の３種の体積を生成する。あるいは、また、 ライジンク試薬および希釈液は予め混合して［溶解希釈液（Ｉｙｔｉｃ　ｄｉｌ ｕｅｎｔ）　ｊを生成する。くの溶解希釈液は溶解作用の望ましい低い勾配を達 成するように全血液試料を希釈ｊ７および溶解ずために用いる。

本発明の試薬系および方法は、クールター　カウンター　モデルＳプラス　ンス テトにおけるプラス高度゛アナライザーがリンパ球、ＣＦ核細胞（中球）および 顆粒球を確認でき、かつ数えるこｂができるように、白血球の３相状大きさ分布 を生成するようにする。

本発明においては、供給および混合の工程においては、血球体積修正力（頁粒球 母集団を中球母隼団の体積分布より大きい体積分布になるようにする。

血液および希釈液をライジンク試薬と混合する工程ではライジンク試薬の著しく 低い濃度を使用して行い、白血球に溶解ショックの低い勾配を作用させるように する。また、混合工程は著しく遅い速度で、および／または白血球を［−溶解シ ラＦり」の低い勾配に作用させる著しく長い時間にわたってライジンク試薬を供 給することを包含する。

ライジンク試薬の遅い供給および低濃度でその相互作用に関する本発明の方法に より、少なくとも単球および顆粒球母集団を全血液試料を予定全量に希釈したラ イジング試薬と混合するこきによって区別するように分類および計算することが できる。それ故、全血液の活性溶解成分に対する最終希釈は、従来の処理により 全血液をライジンク試薬と混合する前に全血液に希釈液を最初に添加するよりむ しろ、溶解試薬のみを希釈することによって得ることができる。

本発明の方法を用いることによって、顆粒球が欠乏するある異常な血液試料を確 かめた。この場合、リンパ球は５０〜１００ｆＬの普通体積範囲および単球は１ ００〜１６０ｆＬの体積範囲を示すが、１８０〜４５０ｆＬの範囲の細胞は示さ なかった。リンパ球および単球のみを含有する試料は既知の物理的密度分離技術 により正常な血液から調整した。また、これらの試料は、溶解後単球がほぼ同じ 独特の体積を示すことを確かめた。

本発明。上述す６修工は９−Ａｖ９−　ヵウ７９ｐモアルＳプラス機器に制限し ないが、しかし「溶解ショック」を減少または除去し、かつ体積ヒストグラムに おける改善を達成するために他の自動機器に、および希釈血液を溶解試薬で処理 するのに同様に考慮する常血液の分布ヒストグラムを示している。左側の母集団 はリンパ球を含んでいる。中間の母集団は単球を含んでいる。右側の母集団は顆 粒球を含んでいる。単核細胞母集団は単球を含んでおり、またまれに異常な試料 においては芽細胞およびプロミエロザイトを含んでいる。顆粒球は分断された（ ｓｅ’ｇｍｅｎｔｅｄ）好中球、バンド（ｂａ−ｎｄｓ）、メタミエロサイト、 好酸球および好塩基球を含んでいる。

単球区域における細胞の絶対数が正常範囲を超える場合には、この事は本発明の 操作で確認し、更に血液塗抹標本スライドを作り、かつ試験してどのようなタイ プの異常細胞が存在するがを確かめ、る。細胞母集団の重なり合った別々の異常 試料の場合には、オペレーターは第１Ｃおよび１０図から明らかなように本発明 において用いるシステムの自動操作によって警報を出す。

２種一体積（リンパ−ミニロイド）母集団を１７２の濃度にし、溶解剤容量を増 倍し、活性成分濃度割合を修正し、および溶解剤添加の速度を遅延するのに用い るライジング試薬の希釈は第３の母集団、単球を自動粒子カウンターにより定量 するのに十分長い時間中に顆粒球以上の体積範囲における谷を広くする。

これらのファクターは従来知られている試薬系および極めて数の少ない第３の母 集団を十分高める方法では存在しない。

希釈血液懸濁物に分散するライジング試薬の低濃度勾配は第３の母集団の予期し ない結果を高める。修正剤および分散方法は細胞を低溶解濃度勾配に曝し、ライ ジング　力イネテックスを遅くし、顆粒球を大きい体積で維持して第３の母集団 、すなわち、単球を検出し、数えるようにする。

第３の母集団は次のようにして単球であることを確認した： ａ９着色塗抹および主動示差（ｍａｎｕａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓ）と 相関する。

ｂ、リンパ球／単球配合物を用いて溶解後単球母集団位もちいて血液試料から単 球を分類し、次いでこれらの細胞を本発明により修正したクールター　カウンタ ーＳプラス　システムに通し、位置をヒストグラムに記録する。殆ど純粋なリン パ球、または単球、または好中球、または好酸球を含有する白血球フラクション を密度勾配分離により調製し、手動示差カウントと比較して白血球ヒストクラム を調べるためにこれら精製試料を膚ベース」血液と組合せて人工的に高めた全血 液１’０３．ｆ　Ｌの大きさ範囲に存在するリンパ球、１０３〜１６０ｆＬに存 在する単球および１６０ｆＬに存在する顆粒球を計算するように修正した。また 、装填物はライジング試薬のある活性成分の濃度にした。

正常の全血液試料大きさ分布ヒストクラムを表１に示す。また、機器によりまた は手動示差法により与える異なる細胞タイプの割合の評価を表１に示す。

表　１ 本発明の自動修正ライジング法から得た数値計算と正常血液試料のライトの染色 血液塗抹（Ｗｒｉｇｈｔ　ｓ　ｓｔａ’ｉｎｅｄｓｍｅａｒ）スライドからの手 動読み示差計算との仕較す　ン　パ　球　２１．７　２８ 単　球　５．７６ 好　中　球　Ｎ　６３ 好　酸　球　ｈ４ 好塩基球　ＢＯ Ｎ　＋　Ｅ　＋　８　＝　７２．６ リンパ球−単球に富んだ試料を標準フィコール−ヒバキュ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙ ｐａｑｕｅ）技術により作った。白血球を５ＢＳＳで洗浄し、自己（ａｕｔｏｌ ｏｇｏｕｓ）全血液に添加した。

おもな細胞タイプの割合の機器および手動示差評価についての大きさ分布状態を 次の表２に示す。

表　２ リンパ球／単球増加 リ　ン　パ　球　４５．５　４２ 単　球　１７．１　１８ 好　中　球　Ｎ　３４ 好　酸　球　Ｅ５ 好塩基球　ＢＩ Ｎ十Ｅ＋８＝４０．４ 正常な人体において、リンパ球と顆粒球との間の体積窓＜ｖｏｌｕｍｅ　ｗｉｎ ｄｏｗ）に落下する細胞は単球母集団からなる。赤血球は完全に間質溶解し、赤 血球および小板計算は既知方法においけると殆ど同しである。

しかしながら、異常な場合には顕微鏡検査で観察できる芽細胞または他の未熟な 細胞種により「単球」母ｆｌがときどき上昇する。単球は白血球ヒストグラムの 単球範囲に見出されるこれらの細胞の存在によって著しく増加する。この事は、 例えば白血球大きさ分布ヒストグラムをガラス　スライド上に分散し、染色した 全血液において観察した手動示差計数と互に関連することによって確かめること ができる。

本発明による機器操作は、ヒストクラムのピークおよび谷の位置および相対大き さを測定することによって、単球範囲における細胞の異常に高い割合によって、 および異常な全白血球計数によっ−Ｃ−三の異常な血液試料を検出することがで きる。

白血球のあるタイプおよび段階は１Ｆ常血液または極めて異常な血液にいて見出 されない「芽細胞」としで知られているきわめて未熟な細胞が存在することに特 徴を有する。これらの芽細胞は血液スライド上にお（Ｊる、その極めて大きい大 きさによって部分的に’Ｉｔ　Ａｇするが、しかしながら芽細胞は溶解剤に極め て敏感であり、リンパ球および単球範囲が重り合い、しかも通常ｎ認される１、 ｏＯｆｌで代表適なリンパ／単球「谷」が生じない範囲に広いピークを生ずる８ ０〜１．５０　ｆ　Ｌの体積範囲に見出される。一般に、かかる試料は普通でな いし。

ストクラムおよびしばしば高められた全白血球計数のために機器により検出しや すい。

また、過度の熟成、異常に高い温度なとにより損傷した血液試料は、操作観察者 によりおよび機器内のコンピータにより容易に確かめることのできる異常なヒＳ プラス自動血球カウンターで作成した同し試料の白血球分布ヒストクラムを互に 比較できるように示しており、第１Ａ図はアメリカ特許４．３４６．０１８号明 細′書の試薬系を用いて得、第１Ｂ図は本発明の試薬系および方法により得たヒ ストクラムの曲線図である。

第１Ｃ図は重症白血球の患者から作成したヒストクラムである。きわめて少ない 細胞が顆粒球区域に存在する。リンパ球ピークは単核細胞区域に尾を引いている 。

染色血液スライドは偶発の複数裂片状好中球、正常数の熟成リンパ球および二三 の芽細胞を示した。

ｉｌＤ図は正常と思われるリンパ球ピークを示している。この場合、単核細胞区 域および顆粒球区域が顕著に上昇している。

上述する具体例は本発明を説明するために示しており、本明細書および請求の範 囲を逸脱しない限り変更を加えるこよができる。

＝５互−１− 国際調査報告

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．　自動粒子分析システムを用いて全血液試料から白血球（単球および顆粒球 ）の少なくとも２種の母集団を体積示差する方法において、 ■、混合および分析する分析システムにより用いる全血液試料および予定濃度の 等張的平衡な血液希釈液を供給し、該希釈液は予定ＰＨおよび重量オスモル濃度 に調節し、および ■０分析システムにより全血液試料および希釈液を予定全量のライジング試薬と 白血球の少なくとも１種の母集団の個々の血球の体積修正を得るように分析シス テムにより白血球母集団の自動示差を得るのに十分な時間にわたり混合する工程 からなり； 前記ライジング試薬は予定濃度で存在する表面活性特性を有する第四アンモニウ ム塩の水溶液の混合物からなることを特徴とする白血球の少なくとも２種の母集 団を体積示差する方法。 ２、　希釈液は１）緩衝剤、２）細胞膜安定剤および３）殺菌薬からなり、その 最終容積濃度および全量は少なくとも１種の白血球母集団におけるライジング　 力イネテックスを遅くするように作用する請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　前記緩衝剤をＮ−（１−アセトテミ、ド）イミンに酢酸（ＡＤＡ）とし； 前記細胞安定剤をプロ力イン塩酸塩とし；および前記殺菌薬をジメチロール尿素 きする請求の範囲第２項記載の方法。 ４、　前記希釈液は約７．０±０．４のｐＨおよび約３２０±５０ｍ　Ｏｓ　／ 　ｋｇの重量オスモル濃度を有する請求の範囲第２項記載の方法。 ５、　ライジング試薬はヘモグロビン測定に適当なりロマゲンを形成する試薬で ある請求の範囲第１項記載の方法。 ６、　前記クロマゲン形成試薬をアルカリ金属シアン化物とする請求の範囲第５ 項記載の方法。 ７、　前記第四アンモニウム塩をドデシルトリメチルアンモニウム　クロライド およびテトラデシルトリメチルアンモニウム　ブロマイドの混合物とする請求の 範囲第１項記載の方法。 ８、　前記ドデシルトリメチルアンモニウム　クロライドを２０〜５５ｇ／Ｌの 濃度範囲で存在させ、前記テトラゾシルトメチルアンモニウム　ブロマイドを２ 〜６ｇ／Ｌの濃度範囲で存在させる請求の範囲第７項記載の方法。 ９、前記ドデシルトリメチルアンモニウム　クロライドおよび前記テトラゾシル トメチルアンモニウムブロマイドを約９．５±４＝１の割合で存在する請求の範 囲第７項記載の方法。 １０、前記ライジング試薬における全血液対活性溶解成分の割合を約ｌ　ｕＬ： １４ｍｇにする請求の範囲第１項記載の方法。 １１、前記第四アンモニウム塩をドデシルトリメチルアンモニウム　クロライド およびヘキサデシルトリメチル　アンモニラｌ、　ブロマイドの混合物とする請 求の範囲第１項記載の方法。 １２、前記ドデシルトリメチルアンモニウム　クロライドおよび前記ヘキサデシ ルトリメチルアンモニウムブロマイドを約１３±６：１の割合で存在する請求の 範囲第１１項記載の方法。 １３、前記第四アンモニウム塩をドデシル）　ＩＪメチルアンモニウム　クロラ イドおよびジメチルエチルヘキザデシルアンモニウム　ブロマイドの混合物とす る請求の範囲第１項記載の方法。 １４、前記ドデシルトリメチル　アンモニウム　クロライドおよび前記ジメチル エチル モニラｌ、　ブロマイドを約１４±６：１の割合で存在する請求の範囲第１３項 記載の方法。 １５、供給および混合する前記上程を、血球体積修正が顆粒球母集団を単球母集 団の体積分布より大きい体積分布にするように達成する請求の範囲第１項記載の 方法。 １６、ライジング試薬を混合する前記工程では極めて低い濃度のライジング試薬 を用いて白血球が低勾配の溶解ショックを受けるようにする請求の範囲第１項記 載の方法。 １７、ライジンク試薬を混合する前記Ｉ程では、白血球が低勾配の溶解ショック を受けるようにするために極めて遅い速度でライジング試薬を供給する工程を含 む請求の範囲第１項記載の方法。 １８、ライジング試薬を供給する前記工程を十分長い時間にわたって達成する請 求の範囲第１７項記載の方法。 １９、ライジング試薬を供給する前記工程では極めて低い濃度のライジング試薬 を用いて白血球が低勾配の溶解ショックを受けるようにする請求の範囲第１８項 記載の方法。 ２０、全血液試料はリンパ球を含有し、血球の体積修正により３種−母集団示差 を得る請求の範囲第１項記載の方法。 ２１、血球の体積修正が、単球母集団をリンパ球と顆粒球母集団との間に体積的 に位置するようにする請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２、少なくとも１つの示差母集団を計算および分類する構成を含む請求の範囲 第１項記載の方法。 ２３、全血液試料をライジンク試薬と混合する前に血液希釈剤で少なくとも部分 的に希釈する請求の範囲第１項記載の方法。 ２４、ライジンク試薬を全血液試料と混合する前に血液希釈剤で少なくとも部分 的に希釈する請求の範囲第１項請載の方法。 ２５、全血液試料から得た少なくとも単球および顆粒球母集団を体積示差する方 法において、 ■．全血液試料およびライジング試料を供給し：および ■．全血液試料を予定全量のライジング試薬と、低勾配の溶解ショックを得るこ とにより単球および顆粒球の少なくとも１種の母集団の個々の血球の体積修正を 得るように、これらの母集団の体積示差を得るのに十分な時間にわたり混合する ことを特徴とする少なくとも単球および顆粒球母集団を体積示差する方法。