DE3123669A1

DE3123669A1 - Verfahren, mehrzweckblutverduennungsmittel und verfahren, reagens zur differentiellen bestimmung der lymphoiden-myeloiden population von leukozyten

Info

Publication number: DE3123669A1
Application number: DE19813123669
Authority: DE
Inventors: James Harrison 33319 Ft. Lauderdale Fla. Carter; Harold Richardson 33169 Miami Fla. Crews; Stephen Lawrence 33013 Hialeah Fla. Ledis
Original assignee: Coulter Electronics Inc
Current assignee: Coulter Electronics Inc
Priority date: 1980-06-16
Filing date: 1981-06-15
Publication date: 1982-04-22
Also published as: FR2484649A1; HK10586A; NO163426B; NO812020L; JPH0315757A; IT8148687A0; SE503205C2; SE8800040L; JPH0358067B2; AU7184881A; AU5361886A; SE453693B; NL191719B; IL63093A; CH660791A5; GB2077916B; NZ197422A; HK52886A; IL63093A0; FR2484649B1

Description

lftp. E. Eder

9 7 £ R Q Coulter Electronics · T^c._c ^: * ^:..^::.^P^-liä· K:..Schieschke

IZ-ODDa ' "'""β München 40. Eüsabethstraße

Verfahren, Mehrzweckblutverdünnungsmittel und lysierendes Reagens zur differentiellen Bestimmung der lympnoidenmyeloiden Population von Leukozyten

Die Erfindung bezieht sich auf ein Blutverdünnungsmittel zur Verwendung bei der elektronischen Zählung und Grössenbestimmung von Blutkörperchen, zur Bestimmung des Hämoglobins und der Gesamtwerte sowie der Blutplättchen-•parameter in einer' einzigen Blutzellenprobe mittels elektronischer Geräte. Es wird angestrebt, Reagentien und Methoden für das automatische Blutzählgerät, Coulter Counter Modell S Plus, das von Coulter Electronics, Inc. ' Hialeah, Florida, hergestellt wird; zu schaffen, die in der Lage sind, bei den Zellenvolumenwerten, die von einem Coulter Channelyzer gesammelt werden, zwei Leukozytenpopulationen voneinander zu unterscheiden, und zwar (1) eine lymphoide·Population (Lymphozyten) und (2) eine myeloide Population -(Neutrophile, Monozyten, Eosinophile und Basophile). Derartige Werte sind als Klassifizierungsmittel geeignet, um abnormale Leukozytenverhältnisse festzustellen. Die abnormalen Verhältnisse, die diese Methode anzeigt, 'liefern Informationen von diagnostischer Bedeutung und für andere Untersuchungen.

Die Trennung von normalen menschlichen Leukozyten durch Volumenverteilung,' bei der das Prinzip der Zählung und der Größenbestimmung ausgenutzt wird,· das von Wallace H. Coulter entwickelt wurde und in den Coulter Counter-Geräten zur Anwendung kommt, wird heutzutage als klinische Diagnosemethode verwendet. Diese Methode basiert auf der fundamentalen Eigenschaft aller lebenden Zellen, ihr Zellenvolumen durch genetische Code-Informationen zu regulieren. Jede Art von Zellen im Blutkreislauf hat ihr eigenes charakterisst isches Volumen, das von so wenig wie drei Kubikmikrometer für Blutplättchen bis zu 450 Kubikmikrometer für polymorphonukleare Zellen reicht. Es sind weiterentwickelte Coulter Counter-Geräte geschaffen worden, die diesen Volumenunterschied zum Zwecke des Zählens und der Bestimmung der

Größenverteilung von Blutplättchen und Erytrozyten ausnutzen, um pathologische Stadien festzustellen und zu überwachen. - -

Allerdings überlappen sich Erytrozyten und lymphoide Leukozyten hinsichtlich der Zellengröße, weshalb es nicht möglich ist, die einen in Gegenwart der anderen nur durch Unterscheidung der Größe zu zählen. Nach der herkömmlichen Praxis wird ein stark lytisches, oberflächenaktives .Reagens eingesetzt, das die Erytrozyten stromatolisiert, · wodurch sie zu sehr kleinen Teilchen zerkleinert werden, oder das eine Membranauflösung herbeiführt, so daß das Zytoplasma sowohl von den lymphoiden wie von den myeloiden Leukozyten freigesetzt wird und lediglich die lyseresistenten Kerne zur Zählung zurückbleiben. Da das ursprüngliche Zellenvolumen drastisch beeinträchtigt und auf ein Minimum verkleinert wird, ist lediglich eine Population bei der Größenbestimmungsanalyse sichtbar.

Bei dem automatischen Blutzellenzählgerät Coulter Counter Modell S Plus wird eine Probe Gesamtblut in einem isotonischen Verdünnungsmittel verdünnt, ein lysierendes Reagens zugegeben .und dann nach 7,5 see mit dem Zählen*begonnen.

Die Werte für die.Erytrozyten und Leukozyten' werden.4 see lang gesammelt und die Werte für die Blutplättchen bis zu 20 see. Demzufolge muß ein Verdünnungs-/Lyse-System zu einer Erytrozytenlysekinetik führen, die hinreichend schnell verläuft, um eine vollständige Stromatisierung während der Lyseperiode zu erreichen, die jedoch die Leukozyten während dieses Zeitraums nicht vollständig freilegt. Darüber hinaus müssen Veränderungen des Leukoz.ytenvolumens während dieses Datenspeicherungsvorganges minimal sein, wobei es im'Idealfall mehrere Minuten unverändert bleiben

sollte. Das Reagens-System muß weiterhin die Unversehrtheit der Erytrozyten und Blutplättchenzahl, der Größenverteilung, der Hämoglobinabsorptionskurve und der gesamten Leukozytenzählung gewährleisten. Durch Finger-anstechen erhaltenes Blut muß wenigstens zwei Stunden stabil bleiben, wenn es in dem isotonischen Verdünnungsmittel vorverdünnt wird.

Um eine Analyse der realtiven Populationen von lymphoiden-und myeloiden Zellen im Blut zu erreichen, muß das Leuko zytenvolumenhistogramm scharf getrennte lymphoide und myeloide Peaks mit wenig Erytrozytentrümmern aufweisen, so daß die Minima der Grundlinie sehr nahe kommen. Die Integration jedes Peaks gibt die relative Population der lymphoiden und myeloiden Zellen wieder. Es ist festgestellt worden, daß der lymphoide Peak 'Lymphozyten und kleine atypische Lymphozyten aufweist, während der myeloide Peak polymorphonukleare Zellen, Bänder, Monozyten, Eosinophile, Basophile und große atypische Lymphozyten enthält.

In der US-PS 3 87 4 8 52 ist eine Formel angegeben, die eine Verbindung einschließt, die ein quaternäres Ammoniumsalzdetergens und Cyanid enthält und als lysierendes und Chromagen bildendes Reagens eingesetzt wird, um eine einzige Volumen-

leukozytenzählung und Hämoglobinbestimmung in dem Coulter Counter Modell S durchzuführen. Es sind weitere Untersuchungen durchgeführt worden, bei denen quaternäre Ammoniumsalze als lysierende Reagentien verwendet wurden, um Leukozytenzählungen von zwei Populationen zu erhalten.

Nach der US-Patentanmeldung Nr. 096 697 vom 13. November 1977 der Anmelderin enthält ein lytisches Verdünnungsmittel zur raschen Lyse von roten Blutkörperchen im Gesamtblut zur differentiellen Bestimmung der -lymphoiden und myeloiden

Populationen von Leukozyten sowie zur Bestimmung des Hämoglobins durch Chromagenbildung ein Gemisch aus einer wässrigen Salzlösung aus wenigstens einem quaternären Ammoniumsalz mit oberflächenaktiven Eigenschaften sowie bestimmte Additive, wie 2-Phenoxyäthanol.

Die zwei Volumen-Verteilungsänalyse ist wegen der vielen Verdünnungsmittel schwierig, wobei die beiden Populationen sich rasch in eines bewegen, so daß nicht genügend Zeit verbleibt, in. der e,ine Zählung zur-Analyse durchgeführt· werden kann. .

Die Erfindung bezieht sich auf ein isotonisches Mehrzweckblutverdünnungsmittel sowie auf ein Verfahren unter Verwendung dieses Verdünnungsmittels mit einem lysierenden Reagenssystem, um eine routinemäßige Zählung der herkömmlichen Hämogrammwerte zu ermöglichen, ferner die Darstellung und Berechnung des lymphoiden und myeloiden Histogramms der Leukozyte und deren relativer Konzentrationen, insbesondere bei einem automatischen Zählgerät, wie dem automatischen Coulter Counter-Gerät mit nicht modifiziertem Programm und einem externen oder internen Leukozyten Channelyzer-Gerät.

Dieses isotonische Mehrzweckblutverdünnuhgsmittel· umfaßt ein Gemisch aus organischen Puffern, anästhetischen Mitteln und keimtötenden Mitteln in einer' osmotisch ausgeglichenen und im wesentlichen neutralen Lösung, wobei es dazu dient, die Kinetik der Zytoplasmafreisetzung von Leukozyten zu verlangsamen und gleichzeitig die traditionellen Hämogrammparameter zu stabilisieren.

Das lysierende Reagens ist ein Gemisch in Form einer wässrigen Lösung von wenigstens einem quaternären Ammoniumsalz

mit oberflächenaktiven Eigenschaften sowie einem Alkalimetallcyanid in einem Konzentrationsbereich, der Leukozytenhistogramme mit zwei Volumen liefert. Die Wiedergabe der Daten kann mit Hilfe eines Standard Coulter Counter-Geräts in Verbindung mit einem Channelyzer und einem X-Y-Aufzeichnungsgerät erreicht werden. Zusätzliche Rechen- und Datenverarbeitungsgeräte sind für eine vollständige Automatisierung erwünscht, jedoch für eine Durchführung der .Messungen nicht wesentlich.

Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur differentiellen Bestimmung .von. lymphoiden und myeloiden Populationen von Leukozyten sowie zur Messung der Hämogrammwerte bereitgestellt/ insbesondere bei einem automatischen Zählgerät, welches durch folgende Kombination gekennzeichnet ist:

A. Ein isotonisches Verdünnungsmittel in Form einer wässrigen Lösung aus einem Gemisch von

1. anästhetischen Verbindungen, einschließlich 4-Aminobenzoesäureesterderivate;

2. organischen Puffern; und

3. keimtötenden Mitteln;

das auf pH 7,0 + 0,1 erforderlichenfalls mit einer Natriumhydroxid-' oder Chlorwasserstofflösung und auf eine Osmolalität.von 3 20 + 5 Milliosmol pro kg mit Natriumsulfat und Natriumchlorid eingestellt ist.

B. Ein lysierendes Reagens in Form einer wässrigen Lösung aus einem Gemisch von wenigstens einem quaternären Ammoniumsalz mit oberflächenaktiven Eigenschaften und einem Alkalimetallcyanid in einem Konzentrationsbereich, der Leukozytenhistogramme mit zwei Volumina liefert.

Ein Verfahren zur Bestimmung der Leukozyten und des Hämo-

■ J:

globins im Blut, wobei ein lysierendes Reagens verwendet wird, das eine wässrige Lösung eines quaternären Ammoniumsalzes mit oberflächenaktiven Eigenschaften sowie ein Alkalimetallcyanid enthält, wird dazu verwendet, die Erytrorzyten und Blutplättchen zu stromatolisieren und Hämoglobin in ein Chromagen umzuwandeln, wobei an den Stickstoff des guaternären Ammoniumsalzes drei kurzkettige Alkylgruppen und eine langkettige Alkylgruppe gebunden sind, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß das quaternäre Ammoniumsalz und das Alkalimetallsalz in einem Konzentrationsbereich vorliegen, der Leukozytenhistogramme mit zwei Volumina liefert und eine routinemäßige Berechnung des lymphoiden und myeloiden Histogramms der Leukozyten und deren relativer Konzentrationen ermöglicht, insbesondere mit einem.automatischen Zählgerät.

Ferner wird ein isotonisches Mehrzweckverdünnungsmittel bereitgestellt, das durch eine wässrige Lösung von

1. organischen Puffern;

2. anästhetischen Mitteln, einschließlich 4-Aminobenzosäureesterderivate; und

3. keimtötenden Mitteln

gekennzeichnet ist, welches Verdünnungsmittel auf pH 7,0 +0,1 erforderlichenfalls mit einer Natriumhydroxid- oder einer Chlorwasserstoffsäurelösung sowie auf. eine Osmolalität von 3 20+5 Milliosmol/kg mit Natriumchlorid und Natriumsulfat eingestellt wird.

Eine bevorzugte Formulierung des isotonischen Verdünnungsmittels besteht aus:

Wirksamer

Bestandteil Konzentrations

bereich

Procainhydrochlorid 0,11 g/l

N-(2-acetamido)-Iminodiessigsäure (ADA) 1.,40 g/l

Chlorhexidendiacetat 0,02 g/l

Dimethylolharnstoff · 1,00 g/l

Natrium-1-hydroxypyridin-2-thion 0,50 g/l

Natriumhydroxid' 0,50 g/l

Natriumsulfat, wasserfrei 9,72 g/l

Natriumchlorid 4,50 g/l·

Wasser auf einen Liter aufgefüllt.

Dieses Verdünnungsmittel wird erforderlichenfalls mit einer Natriumhydroxid- oder Chlorwasserstoffsäurelösung auf pH 7,0 ±-0,1 eingestellt. Die Osmolalität wird auf 320 + 5 Millio.smol/kg mit Natriumchlorid eingestellt.

Es ist bekannt, daß Blutzellen ATPase-Enzyme enthalten, die mit kleinen Aniorien (z. B. Chlorid) assoziierte Alkalimetallkationen in oder aus der Zelle durch einen energieverbrauchenden Mechanismus transportieren, um das osmotische Gleichgewicht, die Unversehrtheit der Zelle und die richtigen Membranpotentiale aufrechtzuerhalten. Natriumionen, die mit den viel größeren SuIfatanionen assoziiert sind, werden offenbar nicht so leicht transportiert, und zwar wegen der größeren Unterschiede der Ladungsdichten zwischen Sulfat- und Chloridanionen und der Potentialänderung der Membranladung, wenn Ionen in oder aus der Zelle transportiert werden. Das Gleichgewicht des internen osmotischen Drucks innerhalb der Zelle wird dadurch aufrechterhalten, daß etwa 30 Milli-' osmol Natriumchlorid eingeschlossen sind. Es ist bekannt, daß Natriumsulfat abnormale Plasmaglobuline auflöst und die Trübung der Hämoglobinlösung aufgrund der erhöhten Leuko-

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zytenzahl vermindert oder beseitigt.

Es ist bereits darauf hingewiesen worden, daß Procainhydrochlorid, das einer Klasse von anästhetischen Mitteln angehört, die 4-Aminobenzoesäureesterderivate und deren Salze einschließt, einen stabilisierenden Einfluß auf die Erytrozytenmembran ausübt, wobei die Wirkungsweise ungewiß ist.

Die erfindungsgemäße Verwendung von N-(2-acetamido)-Iminodiessigsäure (ADA) als organischer Puffer basiert auf deren Fähigkeit, schwache guaternäre Ammoniumsalzlysereagentien bei der Zerkleinerung lysierter Erytrozytentrümmer auf eine Teilchengröße von weniger als 45 Kubikmikrometer elektrisch zu unterstützen, wodurch eine Beeinträchtigung der Zählung und der Verteilung der Leukozyten in zwei unterschiedliche Populationen (lymphoide und myeloide) durch Erytrozyten verhindert wird.

Obwohl die Wirkungsweise des ADA nicht intensiv untersucht worden ist, ist sie als mäßig starker Ligand für Alkalimetalle der Gruppe II und Übergangsmetalle der Gruppe HB bekannt, desgleichen als hinreichend wirksamer Puffer. Da sie einer Aminosäure sehr ähnlich ist, wird ADA anscheinend von den Zellenmembrahproteinen angezogen und tritt mit denselben in Wechselwirkung. Es wird dann mit den Metallkationen koordiniert, wodurch die äußere Membranoberfläche für die umgebende Lösung positiver geladen erscheint, so daß die Solvatation und die Anziehung der Anionen um die äußere Membran unterstützt wird. Diese Beschichtung mit Lösungsmittelmolekülen und Anionen verhindert in wirksamer Weise die Annäherung und Ägglomerierung mit anderen Zellen in der Suspension. Die puffernde Wirkung der ADA verhindert Veränderungen in dieser lokalen Umgebung, wodurch eine Entsolvati-

sierung und ein Stabilitätsverlust vermieden werden.

Dieser Mechanismus in Verbindung mit der Wirkung eines : lokalen Anästhetikums, wie Procainhydrochlorid, sowie Natriumsulfat unterstützen die Stabilisierung der Zellbestandteile der Blutprobe, wobei dieselben im wesentlichen gegenüber ihrem ursprünglichen Zustand in der Blutprobe hinsichtlich Zahl, Größenverteilung und Form unverändert bleiben. Dieser Faktor ist von großer diagnostischer Bedeutung bei der Interpretation der traditionellen Hämogrammparameter.

Obgleich Chlorhexidendiacetat üblicherweise als Virozid und keimtötendes Mittel verwendet wird, ist es bei der verwendeten Konzentration als solches nur wenig wirksam, jedoch unterstützt es ADA erheblich bei der Zerkleinerung der Hintergrundteilchen, die die Zählung der Leukozyten nach der Größenverteilung beeinträchtigen. Ferner weist Chlorhexiden eine gewisse Ähnlichkeit mit den .Aminen Arginin und Guanidin auf, so daß es mit den Membranproteinen durch Koordination und Wasserstoffbindung in Wechselwirkung treten .dürfte. Es unterstützt als solches offenbar die lysierenden Reagentien bei der vollständigen Stromatolyse der Erytrozyten-

-t

membranen.

Es wird angenommen, daß Dimethylharnstoff, ein Kondensat aus Formaldehyd und Harnstoff, nur sehr langsam in Lösung" bei neutralem pH mit den Leukozytenmembranen reagiert, wodurch eine Stabilität beim Stehenlassen in einem Ausmaß erreicht wird, das bei der Entfernung dieser Verbindung nicht ' erreicht wird. .Er ist als bakteriostatische, antiseptische Verbindung bekannt, die das Wachstum von Mikroorganismen . bei mäßigen Konzentrationen verhindert. Andere Verbindungen,

die zugegeben wurden, um die Leukozyten zu stabilisieren, sind Hexamethylentetramin und N-Hydroxymethylacetamid.

Natrium-1-hydroxypiridin-2-thion 'ist als Fungizid und Bakterizid in Schuppen-Haarschampoos bekannt. Es wird im vorliegenden Fall als ein Bakterizid und Fungizid verwendet, das offensichtlich die Form, die Größenverteilung oder die Anzahl der Zellenbestandteile in dem gesamten menschlichen Blut nicht beeinträchtigt. · ' .

Durch die Verwendung der Kombination von Dimethylolharnstoff und Natrium-1-hydroxypiridin-2-thion kommt ein sehr bakterizides Produkt zustande, das dem,· das durph den alleinigen Einsatz einer dieser Substanzen erhältlich ist, überlegen ist. Diese Kombination führt zu einem stabilen Hämogramm sowohl bei normalen wie bei abnormalen Proben, wobei gleichzeitig Informationen über die Volumenverteilung der weißen Zellen erhalten werden können, die von einem automatischen Gerät gespeichert werden.

Die Hauptaufgabe dieses Verdünnungssystems besteht darin, die Zellengröße und -form zu stabilisieren und die Unversehrtheit sämtlicher Zellenbestandteile des Blutes zu ge^- währleisten, und zwar in einem Ausmaß, wie es bisher nicht erreicht worden ist, um die diagnostische Genauigkeit der Bluthämogramme zu verbessern, die durch die automatische Volumenverteilungsanalyse und Zählung erhalten werden. Durch die Erfindung wird eine Weiterbildung und Verbesserung des Standes der Technik erreicht, indem die Bedingungen der Zellen im Blutkreislauf im wesentlichen unverändert bleiben, wenn sie verdünnt und für die automatische Blutzellenzählung und -größenbeStimmung vorbereitet werden. In Verbindung mit einem geeigneten lysierenden Reagens wird der Stand der

Technik derart weitergebildet, daß eine Verteilungsinformation über zwei Volumina der Leukozyten erhältlich ist.

Durch das beschriebene Verdünnungsmittel werden mit einem halbautomatischen oder automatischen Coulter-Blutzellenzählgerät genaue Hämogramme erhalten., jedoch werden Leukozytenhistogramme mit zwei Volumina nur dann erhalten, wenn es in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen lysierenden Reagens verwendet wird.

Das lysierende Reagens ist eine wässrige Lösung von wenigstens einem quaternären Ammoniumsalz mit oberflächenaktiven Eigenschaften und einem Alkalimetallcyanid, wie in der US-PS 3 874 852 allgemein beschrieben, um eine Leukozytenzählung mit lediglich einem einzigen Volumen zu erhalten. Der hier beschriebene Konzentrationsbereich der Bestandteile muß genau eingehalten werden, um erfindungsgemäß eine Leukozytenzäh-.lung von ."zwei Populationen zu erhalten.

Bei den bevorzugten Verbindungen weist die langkettige Alkylgruppe der nachstehenden Formel 12 bis 16 Kohlenstoffatome auf, die kurzen Ketten sind Trimethyl und X ist Chlorid oder Bromid.

Das quaternäre Ammoniumsalzdetergens besitzt die Formel:

R.

worin R₁ ein langkettiger Alkylrest mit 10 bis 18 Kohlenstoffatomen ist, R , R und R kurzkettige Alkylreste mit

-^: · ^: '3 1.23663

1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind und X einen salzbildenden Rest darstellt, wie Cl, Br, J, PO und CH SO..

Eine bevorzugte Formulierung des lysierenden Reagens lautet folgendermaßen:

Effektiver ■ . Bestandteil ■ Konzentrationsbereich

Dodecyltrimethylammoniumchlorid "

"50%ige Lösung 60 g/l 40-70 g/l .

Tstradecyltrimethylammonium- . . ·

bromid Mytab . 6 g/l " '4-7 g/l

Kaliumcyanid · SOOmg/l . 250-500 mg/1

Wasser . auf einen Liter aufgefüllt.

Das vorstehende lysierende Reagens ist viel schwächer und weist eine geringere Reaktionsgeschwindigkeit auf, als das gegenwärtig verwendete Lyse S II. Andere quaternäre Ammoniumsalze, die gleichfalls wirksam sind, umiasr.cn Cetrimide (Hexadecyltrimethylammoniumbromid) und Bretol (Cetyldimethyläthylammoniumbromid), und zwar sowohl allein " wie in Kombination mit Dodecyltrimethylammoniumchlorid. Das Verdünnungssystem ist offenbar in der Lage, die Leukozytenmembran so ausreichend zu stabilisieren/ daß die Geschwindigkeit der Reaktion des lysierenden Reagens auf einen Punkt herabgesetzt wird, bei dem es möglich ist, das kleinere Volumen der lymphoiden Zellen von den größeren Volumen der myeloiden Arten (Neutrophile, Monozyten,' Eosinophile und Basophile) .zu unterscheiden. Wiederholte Messungen der Verteilung der Leukozytengröße haben gezeigt, daß die Histogramme bis zu 30 see stabil sind, bevor eine Degeneration erfolgt. Die Versuchsergebnisse zeigen an, daß die lymphoiden .Zellen innerhalb einer lysierenden Zeit von 7,5 see im wesentlichen auf ihr minimales Zellenvolumen verkleinert werden. Die

myeloiden Zellen weisen das zwei-bis dreifache ihres Endvolumeris bis zu 30 see nach der Zugabe des lysierenden Reagens auf, nach' weichem Zeitraum sich das Volumen langsam verkleinert, bis die myeloide Fraktion sich mit der lymphoiden Fraktion vermischt.

Bei Verwendung eines kalibrierten Erytrozyten Coulter Modell S Plus und eines kalibrierten Coulter Modell C-1000 Channelyzer, hat sich gezeigt, daß die Volumina der. lymphoiden und myeloideh Peaks nach der Behandlung mit dem Reagenssystem etwa 8 5 Kubikmikrometer bzw. 260 Kubikmikrometer betragen, und zwar mit geringen Verteilungsbreiten. Leukozyten, die aus frischem Gesamtblut durch einfache Sedimentation mittels eines Ficoll-Paque Gradienten erhalten wurden, .zeigten Volumina etwa von 260 Kubikmikrometer beim lymphoiden Peak und 500 Kubikmikrometer beim myeloiden Peak mit viel breiteren Verteilungsbreiten. Eine frische Blutprobe, die durch Zentrifugieren mit einem Ficoll-Paque Gradienten nach einem Standardverfahren aufgetrennt wurde, ergab mononukleare Zellen (Lymphozyten und Monozyten), die von Granulozyten (Neutrophilen, Eosinophilen und Basophilen) getrennt waren. Es stellte sich heraus, daß die Lymphozyten mit dem lymphoiden Peak bei 260 Kubikmikrometer zusammenfielen, während sich die Monozyten um 550 Kubikmikrometer zentrierten- Die Granulozytenfraktion bildete einen ziemlich breiten Peak, der sich um 5OO Kubikmikrometer zentrierte. Die Trennung der beiden Populationen war mit dem chemisch lysierten Blut bei den Versuchen mit dem Coulter Counter Modell S Plus viel schärfer als mit den lebensfähigen Leukozyten, die mit der Ficoll-Paque-Methode erhalten wurden. Dies verdeutlicht, daß das lysierende Reagens die Leukozyten erheblich beschädigt, da deren Volumen auf das zwei- bis dreifache verkleinert wird, verglichen mit den Leukozyten, die nach der Ficoll-Paque-Trennung der gleichen Blutprobe erhalten werden.

Es hat sich herausgestellt, daß durch die Zugabe von Dodecyltrimethylammoniumchlorid vor allein das Volumen der lytnphoiden Zellen erfindungsgemäß verkleinert wird (d. h. eine dreifache Herabsetzung des Volumens von 260 Kubikmikrometer auf 85 Kubikmikrometer) , während das. Volumen der myelöiden Zellen in geringerem Umfang beeinflußt wird (d. h. eine zweifache Herabsetzung des Volumens von 500 Kubikmikrometer auf 260 Kubikmikrometer). Dodecyltrimethylammoniumchlorid ist als solches ein nur wenig lysierendes Reagens. Anscheinend verringert es die stark lysierende Wirkung von Mytab, so daß die" Lysierungsgeschwindigkeit auf ein Maß herabgesetzt wird, das eine Messung der verschiedenen Zellkernvolumina erlaubt. Die Zugabe von Dodecyltr imethy lammoniumbromid führt auch zu einer viel saubereren und schnelleren Lyse der Erytrozyten und einer schnelleren Umwandlung des Hämoglobins bei geringeren Konzentrationen von Mytab, so daß den Leukozyten-, Populationen eine bessere Stabilität verliehen wird.

Vorläufige Werte von mehr als 100 normalen und abnormalen frischen Blutproben, die von einer Blutbank und lokalen Krankenhäusern erhalten wurden, zeigen einen hohen Grad an Korrelation zwischen Leukozytenpopulationswerten bei

■β . -

dem Coulter Counter Modell S Plus-Channelyzer^Gerät und manuellen 100 Zellendifferenzierungen. Obwohl eine leichte Variation der myelöiden und lymphoiden Fraktionen' beobachtet wurde, konnten keine drastischen Abweichungen von der Korrelation festgestellt werden.

Beim Einsatz der erfindungsgemäßen Kombination von verdünnendem und lysierendem Reagens ergaben spektrophotometrische Aufnahmen (Wellenlänge gegenüber Absorption) des lysierten Blutes von dem Leukozytenbad des Coulter Counter Modell S Plus Hämoglobinkurven, die im wesentlichen mit

nachtragiloh aeancSert

jenen, die mit Lyse S II erzeugt werden/ identisch waren. Allerdings waren die Absorption bei und die erhaltenen errechneten Hämoglobinwerte etwa O₇2 g/l höher als bei. der Kombination von Isoton II und Lyse S II. Auch wurde festgestellt, daß die mittleren Zellenvolumenwerte um 1,0 bis Ί,5 Kubikmikrometer in dem neuen Zwei-Reagentiensystem größer waren. Alle anderen Parameter waren im wesentlichen mit jenen identisch, die mit der Kombination von Isoton II und Lyse S II erhalten wurden.

Patentanwälte

Dipl.-lng.EÖEder

Dipl.-ing.K. SÄhieschke

8 München«. EÄjtWstraße34

Claims

312 36^9 Patentanwälte Dlpl.-Ing. E. Eder Dipl.-Ing. K. Schieschke München 40, Elisabethstraße 34 Coulter Electronics, Inc. Verfahren, Mehrzweckblutverdünnungsmi ttel und lysierendes Reagens zur differentiellen Bestimmung der lymphoiden-myeloiden Population von Leuko zyten Patentansprüche Verfahren zur differentiellen Bestimmung von lymphoiden und myeloiden Populationen von Leukozyten sowie zur Bestimmung von Hämogrammwerten, insbesondere mit einem automatischen Zählgerät, g ekennz eichnet durch folgende Kombination: A. Ein isotonisches Verdünnungsmittel in Form einer wässrigen Lösung aus einem Gemisch von

2. organischen Puffern; und

3. keimtötenden Mitteln;

das auf pH 7,0 + 0,1 erforderlichenfalls mit einer Natriumhydroxid- oder Chlorwasserstofflösung und auf eine Osmolalität von 320+5 Milliosmol pro kg mit Natriumsulfat und Natriumchlorid eingestellt ; ist. · '

B. Ein lysierendes Reagens in Form einer wässrigen Lösung aus einem Gemisch von wenigstens einem quarternären Ammoniumsalz mit oberflächenaktiven Eigenschaften und einem Alkalimetallcyanid in einem Konzentrationsbereich, der Leukozytenhistogramme mit zwei Volumina liefert.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch folgende Kombination:

A. Einem isotonischen Verdünnungsmittel in Form einer wässrigen Lösung aus einem Gemisch von 1 . Procainhydrochlorid
. 2. N-(2-acetamido ,)-Iminodiessigsäure (ADA),

3. Chlorhexidendiacetat,

4. Dimethylolharnstoff,

5. Natriumsulfat und Natriumchlorid.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch Natrium-!-hydroxipyridin-2-thion als antibakterielles Mittel.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennz eichnet, daß das lysierende Reagens ein oder mehrere quarternäre Ammoniumsalzdetergentien umfaßt, die aus einer Gruppe von Verbindungen mit der

■nachstehenden Formel ausgewählt werden:

R.

wobei R₁ ein langkettiger Alkylrest mit 10 bis 18 • Kohlenstoffatomen ist und R₉, R^ und R. kurzkettige Alkylreste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind.und X eine salzbildende Gruppe dar.stellt, .wie Cl, Br, J, PO., HSO., und CH₃SO₄,ferner ein Alkälimetallcyanid in einem Konzentrationsbereich, der Leukozytenhistogramme mit zwei Volumina liefert.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennz e ichnet, daß das quarternäre Ammoniumsalz aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus Hexadecyltrimethylammoniumchlorid, Hexadecyltrimethylammoniumchlorid, Hexadecyltrimethylammoniumbromid, Tetradecyltrimethylammoniumchlorid, Tetradecyltrimethylammoniumbromid und Dodecyltrimethylammoniumchlorid sowie Gemischen davon besteht".

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das quarternäre Ammoniumsalz ein Gemisch aus Dodecyltrimethylammoniumchlorid und Tetradecyltrimethylammoniumbromid ist..

7. Isotonisches Mehrzweckverdünnungsmittel, gekennzeichnet durch eine wässrige Lösung von

1. organischen Puffern;

• ' 2.. anästhetischen Mitteln, einschließlich 4-Ammino-

benzoesäureesterderivaten; "und 3. keimtötenden Mitteln,

•welches Verdünnungsmittel auf pH 7,0 + 0,1 erforderlichenfalls mit einer Natriumhydroxid- oder Chlorwasserstoffsäurelösung sowie auf eine Osmolalität von 3 20+5 Milliosmol pro kg mit Natriumchlorid und Natriumsulfat eingestellt wird.

8. Isotonisches Verdünnungsmittel nach Anspruch 7, g e kennzeichnet durch eine wässrige Lösung von 1 . Procainhydrochlorid;

2. N-(2-Acetamido)-iminodiessigsäure (ADA);

3. Chlorhexidendiacetat;

4. Dimethylolharnstoff; und

5. Natriumsulfat und Natriumchlorid.

9. Isotonisches Verdünnungsmittel nach Anspruch 7 öder 8, gekennzeichnet durch Natrium.-1-Hydroxipyridin-2-thion als antibakterielles Mittel.

10. Isotonisches Verdünnungsmittel nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem lysierenden Reagens kombiniert wird, das aus einem Gemisch von Dodecyltrimethylammoniumchlorid und Tetradecyltrimethylammoniumbromid besteht.

. Verwendung des isotonischen Verdünnungsmittels sowie des lysierenden Reagens nach Anspruch 10 bei einem Coulter Counter-Gerät, Modell S Plus, das mit einem externen Ghannelyzer und einem X-Y-Aufzeichnungsgerät versehen ist, zur Herstellung von Hämatogrammen sowie

geändert

zur Erytrozytenzählung, Blutplättchenzählung und GrößenbeStimmung, zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration, des mittleren Zellenvolumens, des Hämatokrits, des mittleren Körperchenhämoglobins·, der mittleren Körperchenhämoglobinkonzentration, der Erytrozytenverteilungsbreite, des mittleren Blutplättchenvolumens, zur Leukozytenzählung und relativen Bestimmung der lymphoiden und myeloiden Populationen von Leukozyten in einer einzigen Blutprobe.

12. Verfahren zur Bestimmung der Leukozyten und des Hämoglobins im Blut, bei dem ein lysierendes Reagens, das in Form einer wässrigen Lösung ein quarternäres Ammoniumsalz mit oberflächenaktiven Eigenschaften sowie ein Alkalimetallcyanid enthält, verwendet wird, um die. Erytrozyten und Blutplättchen zu stromatolisieren und das Hämoglobin in ein Chromagen umzuwandeln, wobei an den Stickstoff des quarternären Ammoniumsalzes drei kurzkettige Alkylgruppen und eine langkettige Alkylgruppe gebunden sind, dadurch g ek e'nn ζ e ic hn e t, daß das quarternäre Ammoniumsalz und das Alkalimetalin einem Konzentrationsbereich vorliegen, der Leukozytenhistogramme mit zwei Volumina liefert und eine routinemäßige Berechnung des Lymphoid/Myeloid-Histogramms der Leukozyten und deren relative Konzentrationen ermöglicht, insbesondere mit einem automatischen Zählgerät.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das quarternäre Ammoniumsalz ein Gemisch aus Dodecyltrimethylammoniumchlorid und Tetradecyltrimethylammoniumchlorid und Tetradecyltrimethylammoniumbromid ist.

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